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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Extrakten aus
Wurzeln von Pelargonium sidoides und/oder Pelargonium reniforme
zur topischen Anwendung für
die Prophylaxe und Behandlung von kutanen Infektionen bei Mensch
und Tier, die durch Herpesviren oder andere Viren, die sich in der
Haut vermehren, hervorgerufen werden.
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Beim
Menschen können
Infektionen der Haut durch verschiedene Herpesviren hervorgerufen
werden, am häufigsten
sind jedoch kutane Infektionen durch die Herpes-simplex-Virus Serotypen
1 und 2 (HSV-1 und HSV-2) sowie das Varizella-Zoster-Virus (VZV).
Läsionen
an Haut und Schleimhäuten
sind auch kennzeichnend für
zahlreiche Herpesvirus-Infektionen bei Tieren, wie z.B. das feline
Rhinotracheitisvirus, das equine Rhinopneumonitisvirus, das bovine
Rhinotracheitits/pustulöse
Vulvovaginitis- und das Mammillitisvirus, das Pseudorabiesvirus
oder die Erreger der infektiösen
Laryngotracheitis des Geflügels
und der Enten.
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Symptome
einer Erstinfektionen mit HSV-1 und HSV-2 reichen von klinisch inapperaten
Manifestationen über
leichte orofaciale oder genitale Entzündungen bis zu potentiell lebensbedrohlichen
Zuständen,
wie z.B. einer Enzephalitis oder neonataler Sepsis. Obwohl beide
Herpes simplex Subtypen prinzipiell an zahlreichen Lokalisationen
Beschwerden hevorrufen können,
führen
Infektionen mit dem vorwiegend sexuell übertragenen HSV-2 deutlich
häufiger
zu urogenitalen Symptomen, während
sich HSV-1-Infektionen in der Regel oberhalb der Gürtellinie
manifestieren.
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Herpesviren
infizieren zunächst
vor allem Epithelzellen (z.B. Haut- oder Schleimhautzellen), in
denen es zu einer starken Virusvermehrung kommt. Bevor die körpereigene
Abwehr die Infektion unter Kontrolle bringen kann, gelangen die
Viren aber auch in sensorische oder autonome Ganglien, in denen
sie für
das Immunsystem nicht zugänglich
sind und für
den Rest des Lebens persistieren. Durch bestimmte Einflüsse (z.B.
Immunsuppression, Stress, Krankheit, Hormonschwankungen, UV-Strahlung)
wird diese latente Infektion wieder aktiv, die Nervenzellen werden
zerstört
und Epithelzellen werden erneut befallen, mit der Folge einer wiederaufflammenden
akuten Herpeserkrankung.
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Charakteristisch
für Herpesinfektion
ist die Entzündung,
die unmittelbar nach einem Ausbruch der Virusreplikation erfolgt
und mit Kardinalsymptomen wie Rötung,
Schwellung, Juckreiz und Schmerzen sowie Hautläsionen einhergeht. Etwa die
Hälfte
der Patienten erfahren Prodromalsymptome wie Schmerzen, Brennen
und Juckreiz an der Stelle der späteren Hautentzündung.
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Durch
HSV-1 und HSV-2 ausgelöste
Infektionen treten in verschiedenen, nach dem Erscheinungsort benannten
Unterformen auf: Herpes labialis, auch als Fieberbläschen bezeichnet
(im Bereich der Lippen), Herpes nasalis (ähnlich Herpes labialis, jedoch
im Bereich der Nase), Herpes genitalis (im Bereich der Geschlechtsorgane
und Genitalschleimhäute,
auch Herpes sexualis genannt), Herpes perianalis und Herpes glutealis
(im Bereich des Anus und Perineums bzw. des Gesäßes), Keratoconjunctivitis
herpetica (in der Augenbindehaut), Stomatitis herpetica (eine Infektion
der Mundschleimhaut) und Herpes facialis und Herpes buccalis (im
Gesicht bzw. an den Wangen).
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Der
Zustand ist in der Regel selbst begrenzend und eine typische Episode
heilt gewöhnlich
innerhalb von ca. 10 Tagen ab. Die Virusreplikation in den Epitheizellen
erfolgt sehr früh
und eine maximale Viruslast ist etwa 24 Stunden nach Beginn der
Reaktivierung erreicht. Die Viruskonzentration fällt anschließend rasch
ab und ca. 3 Tage nach dem Ausbruch ist eine Virusisolierung nur
noch selten möglich.
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Eine
primäre
Infektion mit Varizella-Zoster-Virus (VZV) verursacht Windpocken
und selten eine Meningitis oder Enzephalitis. Wie bei HSV persistiert
das Virus nach der Ausheilung lebenslang in sensiblen Nervenzellen.
Bei Immunschwächezuständen kann
es dann zu einer Zweiterkrankung in Form einer Gürtelrose (Zoster) kommen. Zoster
führt in
der Regel zu Hautausschlag und intensiven, akuten Schmerzen. Nach
dem Ausheilen der Hautveränderungen
können
bei etwa einem Drittel der Patienten die Schmerzzustände noch
Wochen und Monate anhalten. VZV kann außer Entzündungen an der Haut und Schleimhäuten auch
eine Keratitis auslösen,
die bei wiederholtem Auftreten zu Blindheit führen kann.
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Neben
Herpesviren können,
insbesondere bei immundefizienten Patienten und bei Kindern, auch
andere Viren kutane Erkrankungen auslösen. Als wesentliche Erreger
kommen dafür
das Molluscum-contagiosum-Virus (MCV) und die große Gruppe
der Papillomaviren in Frage. Humane Papillomaviren (HPV) werden in über 150
verschiedene Subtypen eingeteilt. Sie befallen Epitheizellen der
Haut oder verschiedener Schleimhäute
und verursachen ein unkontrolliertes tumorartiges Wachstum. Die
Tumoren sind meist gutartig und führen zur Warzenbildung an der
betroffenen Haut- oder Schleimhautstelle. Abhängig von der Lokalisation,
dem jeweiligen HPV-Subtyp sowie dem Immunstatus des Patienten werden
charakteristische Hautmanifestationen beobachtet (z.B. Verruca vulgares,
Plantarwarzen, Mosaikwarzen, Verruca planae juvenalis, orale fokale
Hyperplasie, Epidermodysplasia verruciformis, Larynx-Papillome).
Wenn die Infektion im Genital- oder Analbereich erfolgt (i. d. R.
durch Geschlechtsverkehr), dann kommt es zur Bildung von Genitalwarzen
(z.B. Feigwarzen). Einige HPV-Typen können jedoch auch bösartige
Veränderungen
hervorrufen, insbesondere Gebärmutterhalskrebs.
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Eine
Infektion von Hautzellen mit dem MCV führt zur Bildung von Dellwarzen,
stecknadelkopf- bis
erbsengroße,
weiße,
rötliche
oder hautfarbene Knötchen
mit glatter und oft glänzender
Oberfläche,
die stets multipel auftreten. Gelegentlich kann es zu einer lokalen
Entzündung
bzw. Ekzembildung in der Umgebung der Dellwarzen kommen.
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Für die Behandlung
von Herpesviren stehen neben der Lokaltherapie der Entzündung und
der Anwendung von Analgetika eine Reihe von antiviralen Substanzen
zur Verfügung,
wie z.B. Aciclovir, Valaciclovir, Penciclovir. Diese zeigen bei
der Therapie von wiederkehrenden Herpesinfektion häufig aber
nur einen begrenzten klinischen Erfolg, was damit zusammenhängt, dass
Reinfektionen sich in einer Reihe von wichtigen Aspekten von primären Infektionen
unterscheiden. Die Replikation und Freisetzung von infektiösen Viren
bei einer primären
Infektion hält
deutlich länger
an (etwa 10 Tage bei labialer und 3 Wochen bei einer genitalen Infektion) als
bei einer Zweiterkrankung (3–4
Tage für
beide Formen). Nach Beendigung der Virusvermehrung heilen die kutanen
Läsionen
bei einer Erstinfektion innerhalb weniger Tage ab. Im Gegensatz
dazu halten die Entzündungsreaktionen
bei einer Zweitinfektionen noch über
eine Woche nach Beendigung der Virusreplikation an. Offensichtlich
hat die Reduktion der Virusvermehrung also keinen wesentlich Einfluß auf den
weiteren klinischen Verlauf eines wiederkehrenden Herpesinfektion.
Es ist daher nicht verwunderlich, dass Virostatika in klinischen
Studien bei primären
Infektionen generell eine deutlich bessere Wirkung zeigen als bei
Reinfektionen. Wegen der schnellen Selbstbegrenzung der Virusreplikation
bei Zweitinfektionen beschränkt
sich der klinische Effekt von antiviralen Substanzen deshalb vor
allem auf eine Verkürzung
der Heilungszeit um etwa 1 Tag. Durch den weit verbreiteten Einsatz
von Aciclovir hat außerdem
die Häufigkeit
von resistenten HSV zugenommen. Da Aciclovir auch in die zelluläre DNA eingebaut
werden kann, sollte es als potentielles Mutagen nicht während einer
Schwangerschaft verwendet werden. Die häufigsten Nebenwirkungen sind örtliche Irritationen an
der Einstichstelle, Kopfschmerzen bei oraler Verabreichung und stechende
und brennende Empfindungen bei äußerlicher
Anwendung.
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Auch
bei Infektionen mit VZV werden Virostatika verwendet. Wichtig ist
die frühzeitige
medikamentöse Behandlung
mit Virostatika bei sehr ausgedehnten Entzündungen, z.B. mit Beteiligung
des Auges oder Ohres und bei vorbestehender Abwehrschwäche (z.B.
Tumorerkrankung, Diabetes mellitus oder AIDS). Üblicherweise erfolgt die Behandlung
mit Aciclovir, Brivudin, Famciclovir oder Valaciclovir in Tablettenform.
In komplizierteren Fällen
(Beteiligung der Augen, der Ohren, des Rückenmarks) ist eine intravenöse Behandlung
erforderlich. In der Regel ist die zusätzliche Gabe von starken Schmerzmitteln
angezeigt. Seit einigen Jahren ist ein Lebendimpfstoff gegen das
Virus erhältlich.
Eine höher
dosierte Variante des gleichen Impfstoffes ist in den USA zugelassen
worden. Sie soll bei Risikogruppen die Wahrscheinlichkeit des Auftretens
einer Gürtelrose nach
stattgehabter Erstinfektion senken.
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Eine
spezifische Therapie für
Papillomvirus-Infektionen gibt es bisher nicht. Bei vorliegenden
Läsionen kommen
im wesentlichen chirurgische Eingriffe oder lokale Verätzungen
in Frage. Üblich
ist auch eine lokale Keratolyse durch topische Anwendung von Salicylsäure in Kombination
mit einer mehrwöchigen
Applikation des Pyrimidinantagonisten 5-Fluorouracil. Systemische
oder lokale Therapien mit Immunmodulatoren (z.B. Imiquimod), Interferonen
und anderen Zytokinen haben bisher zu keinen durchschlagenden Erfolgen
geführt. Die
früher übliche Behandlung
mit Podophylotoxin gilt wegen der potentiell gravierenden Nebenwirkungen
(lokale Reizung, systemische Toxizität, karzinogene Eigenschaften)
als obsolet. Zur vorbeugenden Immunisierung gegen einige Gebärmutterhalskrebs-auslösende HPV
steht inzwischen eine Impfstoff zur Verfügung. Neben der mechanischen
Entfernung werden für
die Behandlung von Dellwarzen auch Lokaltherapeutika mit irritativer
Wirkung verabreicht, die das Immunsystem anregen sollen (z.B. Tretinoid
oder KOH-Lösung).
Auch die Verwendung von Imiquimod oder von Virustatika wird versucht.
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Zusammenfassend
lässt sich
sagen, dass es bisher nur wenige überzeugende klinische Erfolge
bei der medikamentösen
Behandlung von kutanen Virusinfektionen gibt. Dies trifft insbesondere
zu für
wiederkehrende Infektionen mit Herpesviren. Es besteht daher ein
großer
Bedarf an wirksamen und gut verträglichen Medikamenten für die Behandlung
dieser Erkrankungen. Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch
die Verwendung von Extrakten aus Wurzeln von Pelargonium sidoides
und/oder Pelargonium reniforme zur Herstellung einer Zubereitung
bzw. durch einen Extrakt aus Wurzeln aus Pelargonium sidoides und/oder
Pelargonium reniforme in Form einer Zubereitung zur topischen Anwendung
gelöst.
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Pelargonium
sidoides und Pelargonium reniforme sind Geraniaceen, die im südlichen
Afrika traditionell als Arzneimittel verwendet wurden. Die volksmedizinische
Verwendung umfasst die orale Behandlung von Diarrhöe, gastrointestinalen
Beschwerden, Dysmenorrhoe und Lebererkrankungen. Üblich ist
aber auch die Anwendung bei Atemwegserkrankungen und insbesondere
bei Lungentuberkulose. Entsprechend der traditionellen Verwendung
ist heute ein kommerzieller Extrakt aus Pelargonium sidoides auf
dem Markt, der vor allem zur Behandlung verschiedener akuter und
chronischer Erkrankungen der Atemwege und des Hals-Nasen-Ohrenbereichs
wie Rhinopharyngitis, Tonsillitis, Sinusitis und Bronchitis eingesetzt
wird.
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In
der internationalen Patentanmeldung
WO2006/002837 wird offengelegt,
dass Extrakte aus den Wurzeln von Pelargonium sidoides/reniforme
neben antimykobakteriellen und immunmodulierenden Eigenschaften
zusätzlich
die Infektion von menschlichen Lymphozyten mit dem Human Immundefizienz
Virus Typ 1 (HIV-1) hemmen. Indirekte antivirale Effekte von Extrakten
aus P. sidoides und P. reniforme werden auch in einer Reihe von
Publikationen beschrieben. Diese indirekten antiviralen Wirkungen
beruhen vor allem auf einer Stimulation von Immunmechanismen, wie
z.B. der erhöhten
Synthese von Interferonen und Zytokinen oder der Aktivierung von
natürlichen
Killerzellen. Kutane virale Infektionen treten besonders häufig bei
Patienten mit einer vorübergehenden
oder permanten Immunschwäche
auf, wie z.B. Stress, Krankheit, Hormonschwankungen, UV-Strahlung,
bei angeborenen Immunschwächen,
bei hämatologischen
oder onkologischen Erkrankungen oder nach Behandlung mit Immunsuppressiva
oder Zytostatika. In diesem Fall kommen die bekannten immunmodulierenden
Effekte von Extrakten aus Wurzeln von P. sidoides und P. reniforme
wegen des Fehlens oder der eingeschränkten Funktionsfähigkeit
wesentlicher Elemente des Immunsystems nicht oder nur unzureichend
zum Tragen, insbesondere wenn eine topische Anwendung erfolgt. Unter
diesen Bedingungen stellt sich nun die Aufgabe, Substanzen mit direkten
antiviralen Eigenschaften bereitzustellen.
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Es
wurde nun überraschend
beobachtet, dass Extrakte aus P. sidoides und P. reniforme nicht
nur über indirekte
sondern auch über
potente direkte antivirale Effekte gegenüber Herpesviren verfügen und
deshalb besonders gut zur Behandlung von kutanen Viruserkrankungen
geeignet sind, wobei die Behandlung nicht nur oral, sondern insbesondere
topisch erfolgen kann, ein Applikationsweg der bisher für solche
Zubereitungen nicht üblich
ist. Wegen der bekannt guten Verträglichkeit sind Zubereitungen
aus P. sidoides/reniforme deshalb eine äußerst interessante Alternative
zur Prophylaxe und Behandlung von kutanen Virusinfektionen, insbesondere
von Infektionen mit Herpes-, Varizella-Zoster-, humanen Papilloma-
und Mollusca-contagiosa-Viren. Ein weiterer Vorteil von Extraken
aus P. sidoides und P. reniforme besteht darin, dass sie die Aktivität der humanen Leukozytenelastase
hemmen und über
ausgeprägte
antioxidative Eigenschaften verfügen.
Damit wirken sie den nachteiligen Wirkungen einer überschießenden Entzündungsreaktion
entgegen und verfügen über zytoprotektive
Eigenschaften.
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Die
erfindungsgemäßen bzw.
erfindungsgemäß verwendeten
Extrakte aus Pelargonien oder deren Pflanzenteile können nach
bekannten Herstellungsverfahren in variabler Zusammensetzung mit
Lösungsmitteln
wie z.B. Wasser, Methanol, Ethanol, Aceton, etc., und deren Gemische
bei Temperaturen von Raumtemp. bis 60°C unter gelinder bis heftiger
Durchmischung oder durch Perkolation innerhalb von 10 Min. bis 24
Std. erhalten werden. Bevorzugte Extraktionslösungsmittel sind dabei Gemische
von Ethanol und Wasser, besonders bevorzugt im Verhältnis Ethanol/Wasser
= 10/90 bis 15/85 (G/G). Zur Anreicherung wirksamkeitsbestimmender
Komponenten können
weitere Konzentrierungsschritte durchgeführt werden, wie z.B. flüssig-flüssig-Verteilung
mit z.B. 1-Butanol/Wasser oder Ethylacetat/Wasser, Adsorption-Desorption
an Ionenaustauscher, LH20, HP20 und andere Harze oder chromatographische
Abtrennungen über
RP18, Kieselgel, etc.. Falls die Weiterverarbeitung zu Trockenextrakten
(Definition gemäß European
Pharmacopoeia 6.0, general monograph „extracts") erwünscht ist, erfolgt diese nach
an sich bekannten Verfahren durch Abziehen des Lösungsmittels bei erhöhter Temperatur
und/oder reduziertem Druck oder durch Gefriertrocknung.
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Die
erfindungsgemäßen Extrakte
können
in Form von Salben (halbfeste Wasser in Öl-Emulsionen), Cremes (halbfeste Öl in Wasser-Emulsionen),
Gelen, Lotionen, Lippenstiften, Vaginalzäpfchen, Pflastern oder anderen
geeigneten Applikationsformen zur lokalen Anwendung auf die Haut
oder Schleimhaut verabreicht werden. Salben und Cremes sind halbfeste
Emulsionen, die aus einer lipophilen Phase und einer hydrophilen Phase
bestehen und durch einen oder mehrere Emulgatoren stabilisiert sind.
Pharmazeutisch übliche
Bestandteile der lipophilen Phase sind z.B. Vaseline, Paraffin,
Isopropylmyristat, mittelkettige Triglyceride und pflanzliche Öle. Die
hydrophile Phase besteht aus Wasser, dem verschiedene Stoffe zugesetzt
werden können,
wie z.B. Glycerol, Propylenglycol, Ethanol und 2-Propanol. Pharmazeutisch übliche Emulgatoren,
die zur Stabilisierung der Emulsion eingesetzt werden, sind z.B.
Wollwachsalkohole, Wollwachs, Cetylstearylalkohol, Cetylstearylsulfat,
Polyoxyethylen- 40-hydriertes
Rizinusöl
und Lezithin. Gele sind halbfeste, dreidimensionale Netzwerke aus
einem Gelbildner wie z.B. Polyacrylat (Carbomer), Hydroxypropylcellulose
oder Carboxymethylcellulose und einer eingebetteten flüssigen Phase,
die meist aus Wasser und verschiedenen Zusätzen wie z.B. Ethanol, 2-Propanol,
Glycerol und/oder Propylenglycol besteht.
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Die
Dosierung erfolgt dabei in Abhängigkeit
vom Extraktgehalt der Zubereitung so, dass pro Anwendung 1 bis 1000
mg, bevorzugt 2 bis 50 mg Extrakt appliziert werden.
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Die
Herstellung eines erfindungsgemäßen Extrakts
sowie daraus hergestellter topischer Zubereitungen wird nachfolgend
beispielhaft anhand von Pelargonium sidoides erläutert. Das mit diesem verwandte
Pelargonium reniforme kann alternativ oder zusätzlich verwendet werden und
führt zu
Extrakten bzw. Zubereitungen mit vergleichbarer Wirkung.
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Beispiel 1: Extrakt aus Pelargonium sidoides
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Getrocknete
und gemahlene Wurzeln aus Pelargonium sidoides wurden mit ca. der
zehnfachen Gewichtsmenge Ethanol/Wasser 11/89 (v/v) bei Raumtemperatur
extrahiert. Nach Filtration wurde das Filtrat aufkonzentriert und
im Vakuum getrocknet (6.3% Trockenextrakt bezogen auf die Droge).
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Beispiel 2: Erfindungsgemäße extrakthaltige
Salbe (halbfeste Wasser-in-Öl-Emulsion)
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Zusammensetzung:
| Position
Nr. | Bestandteil | Funktion | Massenanteil
[%] |
| 1 | Vaseline | lipophile
Phase | 40,00 |
| 2 | Dickflüssiges Paraffin | lipophile
Phase | 20,00 |
| 3 | Wollwachsalkohole | Emulgator | 2,00 |
| 4 | Cetylstearylalkohol | Emulgator | 0,20 |
| 5 | Wollwachs | Emulgator | 15,00 |
| 6 | Gereinigtes
Wasser | hydrophile
Phase | 20,80 |
| 7 | Pelargonium-Extrakt
gemäß Beispiel
1 | Wirkstoff | 2,0 |
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Herstellung der Salbe:
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Die
lipophile Phase wird hergestellt aus den Bestandteilen 1.–2. (Vaseline,
dickflüssiges
Paraffin) unter Zugabe der Emulgatoren 2.–5. (Wollwachsalkohole, Cetylstearylakohol,
Wollwachs) durch Erwärmen
auf 70°C und
gleichzeitigem Mischen in einem beheizbaren Ansatzbehälter mit
geeignetem Rührwerk
bis eine homogene flüssige
Mischung entsteht. Der erfindungsgemäße Extrakt wird durch Rühren in
der hydrophilen Phase (gereinigtes Wasser) dispergiert. Die homogene,
flüssige,
lipophile Phase wird vorlegt und die wässrige Extraktdispersion portionsweise
in kleinen Anteilen unter intensivem Mischen zugefügt. Dabei
bildet sich eine homogene, halbfeste Wasser-in-Öl-Emulsion, d.h. eine Salbe.
Die Salbe wird unter leichtem Mischen auf 25°C abgekühlt und in geeignete Behältnisse
(z.B. Tuben) abgefüllt.
Durch Auftragen einer Menge von 1 g Salbe auf die Haut oder Schleimhaut
werden 20 mg Extrakt appliziert.
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Beispiel 3: Erfindungsgemäße extrakthaltige
Creme:
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Zusammensetzung:
| Position
Nr. | Bestandteil | Funktion | Massenanteil
[%] |
| 1 | Isopropylmyristat | lipophile
Phase | 8,00 |
| 2 | Mittelkettige
Triglyceride | lipophile
Phase | 10,00 |
| 3 | PEG-40
hydriertes Rizinusöl | Emulgator | 36,00 |
| 4 | Propylenglykol | hydrophile
Phase | 8,00 |
| 5 | Benzylalkohol | Konservierungsmittel | 1,0 |
| 6 | Gereinigtes
Wasser | hydrophile
Phase | 35,0 |
| 7 | Pelargonium-Extrakt
gemäß Beispiel
1 | Wirkstoff | 2,0 |
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Herstellung der Creme:
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Die
lipophile Phase wird hergestellt aus den Bestandteilen 1.–3. (Isopropylmyristat,
mittelkettige Triglyceride, PEG-40 hydriertes Rizinusöl) durch
Erwärmen
auf 60°C
und gleichzeitigem Mischen in einem beheizbaren Ansatzbehälter mit
geeignetem Rührwerk
bis eine homogene flüssige
Mischung entsteht. Der erfindungsgemäße Extrakt wird durch Rühren in
der hydrophilen Phase (gereinigtes Wasser, Propylenglykol, Benzylalkohol)
dispergiert. Die homogene, flüssige,
lipophile Phase wird vorlegt und die wässrige Extraktdispersion portionsweise
in kleinen Anteilen unter intensivem Mischen zugefügt. Dabei
bildet sich eine homogene, halbfeste Öl-in-Wasser-Emulsion, d.h.
eine Creme. Die Creme wird unter leichtem Mischen auf 25°C abgekühlt und
in geeignete Behältnisse
(z.B. Tuben) abgefüllt.
Durch Auftragen einer Menge von 1 g Salbe auf die Haut oder Schleimhaut
werden 20 mg Extrakt appliziert.
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Beispiel 4: Erfindungsgemäßes extrakthaltiges
Gel:
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Zusammensetzung:
| Position
Nr. | Bestandteil | Funktion | Massenanteil
[%] |
| 1 | Cetomacrogol | Stabilisator | 5,00 |
| 2 | Glycerol
85% | Feuchthaltemittel | 8,00 |
| 3 | Gereinigtes
Wasser | Quellmittel | 40,40 |
| 4 | Carbomer | Gelbildner | 2,00 |
| 5 | Pelargonium-Extrakt
gemäß Beispiel
1 | Wirkstoff | 2,00 |
| 6 | 2-Propanol | Quellmittel | 25,00 |
| 7 | Ethanol | Quellmittel | 12,00 |
| 8 | Konzentrierte
Ammoniaklösung | Alkalisierungsmittel | 0,60 |
| 9 | Gereinigtes
Wasser | Quellmittel | 5,00 |
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Herstellung des Gels:
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Bestandteil
1. (Cetomacrogol) wird unter Rühren
auf ca. 55°C
erwärmt
und wieder auf 30°C
abgekühlt. Die
Bestandteile 2.–4.
(Glycerol 85%, gereinigtes Wasser und Carbomer) werden unter Rühren hinzugefügt. Der
erfindungsgemäße Extrakt
(Bestandteil 5.) wird zugefügt
und in der wässrigen
Phase durch Rühren
suspendiert. Zu der Suspension werden die Bestandteile 6. und 7.
(2-Propanol, Ethanol) zugefügt
und durch Rühren
gemischt. Anschließend
wird die Suspension durch intensives Rühren homogenisiert. Bestandteil
8. (Ammoniaklösung)
wird im restlichen gereinigten Wasser (Bestandteil 9.) gelöst und der
wässrigen
Suspension unter Rühren
zugemischt. Das Gel wird noch 10 min gerührt und in geeignete Behältnisse
(z.B. Tuben) abgefüllt. Durch
Auftragen einer Menge von 1 g Gel auf die Haut oder Schleimhaut
werden 20 mg Extrakt appliziert.
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Beispiel 5: Wirksamkeit des Extraktes
gemäß Beispiel
1
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Die
Wirksamkeit von ethanolisch-wäßrigen Extrakten
aus Pelargonium sidoides bei Herpesinfektionen wird durch die nachstehenden
Experimente belegt.
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Für die Untersuchungen
wurde HSV-1 (Stamm: Mclntyre, Quelle: ATCC) verwendet. Um die Zugabe einer
definierten Virusmenge im eigentlichen Test zu gewährleisten,
wurden quantitative Bestimmungen der infektiösen Virusdosis durchgeführt. Hierzu
wurden Verdünnungsstufen
der urspünglichen
Virussuspension auf Indikatorzellen in 96-Loch-Platten (im achtfach-Parallelansatz) gegeben
und nach Ablauf der Inkubationszeit und Auszählung der infizierten Zellen,
die Anzahl infektiöser
Viren als Titer angegeben.
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Für die Untersuchungen
wurde der erfindungsgemäße Extrakt
aus Wurzeln von P. sidoides gemäß Beispiel
1 in einer Konzentration von 100 mg/ml in Dimethylsulfoxid (DMSO)
zu einer Stammlösung
verdünnt.
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Der
Test zur Bestimmung der "viruziden" Aktivität (Inaktivierungstest)
beruht darauf, daß die
verwendeteten, replizierenden Viren bei geeigneten Indikatorzellen
cytopathogene Veränderungen
(CPE) verursachen, die in Form von Plaques im Zellrasen sichtbar
werden. Es wurden drei verschiedene, definierte Mengen an Testsubstanz
für 1 Stunde
mit der Virussuspension inkubiert. Anschließend folgt eine Verdünnungsreihe dieser
Suspension (Virustitration) und das Aufbringen auf den geschlossenen
Zellrasen. Die Auswertung erfolgte durch mikroskopische Analyse
virusspezifischer CPE.
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Im
einzelnen wurden 20 μl
der verschiedenen Extraktkonzentration mit 980 μl Virussuspension gemischt und
diese Suspension anschließend
in Stufen von jeweils 1:10 verdünnt
(Virustitration). Nach 1 Stunde wurden 50 μl dieser Virus-/Extraktsuspension
auf eine Mikrotiterplatte mit 3 Tage alten, konfluenten Verozellen (Affennierenzelle)
aufgebracht, die bereits mit 50 μl
Zellkulturmedium bedeckt waren. Die Inkubation der Platten erfolgte
für 5 Tage
im Brutschrank bei 37°C.
Abschließend
wurde eine visuelle Ablesung der Zellkulturen nach HSV-1-spezifischen
CPE vorgenommen.
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Das
Prinzip der Bestimmung der "virostatischen" Aktivität (Inhibitionstest)
beruht darauf, daß die
Testsubstanz, in verschiedenen Konzentrationen bereits 1 Stunde
vor Zugabe einer definierten Menge des HSV-1 auf den geschlossenen
Zellrasen aufgebracht wird. Die Auswertung erfolgt nach 48–72 h unter
Verwendung monoklonaler Antikörper
(MAK) und einer spezifischen Färbemethode.
Dazu wurde zunächst
eine Verdünnungsreihe
(1:2) des erfindungsgemäßen Extraktes
hergestellt (Ausgangskonzentration 100 μg/ml in Zellkulturmedium; weitere
Verdünnsstufen:
50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 und 0,78 μg/ml). Die Testdurchführung erfolgte
in 96-Mikrotiterplatten mit einen konfluenten Rasen von Verozellen.
Pro Well wurden zunächst
je 50 μl Extraktlösung und
1 h später
je 50 μl
Virus-Suspension (3.000 TCID50/mL = 150
TCID50/Well) zugegeben. Die Platten wurden
nachfolgend bei 37°C
und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert. Die
Auswertung erfolgte nach 48–72
Std.
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Die
Bestimmung der Zytotoxizität
des erfindungsgemäßen P. sidoides-Extraktes
erfolgte mittels MTT-Test. Methodisch wurde dabei analog dem oben
beschriebenen Prozedere vorgegangen. Die Auswertung erfolgte nach
7 Tagen.
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Die
Berechnung der zytotoxischen Konzentration (TC50)
und virusinhibitorischen Konzentration (IC50) erfolgte
mittels linearer Regression. Zur Berechnung des therapeutischen
Index (TI) wurde die Formel TC50/IC50 eingesetzt. Der IC50-Werte
stellt die Substanzkonzentration dar, bei der eine 50%ige Reduktion
der Virus-Replikation erreicht wird. Der TC50-Wert
kennzeichnet hingegen die Substanzkonzentration, bei der 50% der
Indikatorzellen durch toxische Einflüsse zerstört werden.
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Ergebnisse
der Untersuchungen auf viruzide Wirkung gegenüber HSV-1 sind in der nachfolgenden
Tabelle zusammengestellt.
| Eingesetzte
Extraktkonzentration (μg/ml) | 100 | 50 | 10 |
| Virustiter
(TCID50/ml)* | Kein
Virusnachweis | 3,6 × 105 | 1,5 × 107 |
| Virusinaktivierung
(%)# | 100 | 97,6 | 0 |
- * Die eingesetzte Ausgangsvirusmenge betrug
1,5 × 107 TCID50/ml
- # Die "Virusinaktivierung" berechnet sich als
prozentuale Hemmung der Ausgangsvirusmengen und der bei den verschiedenen
Extraktkonzentrationen nachgewiesenen Virusmengen.
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Im
Virusinhibitionstest wurde für
den erfindungsgemäßen Extrakt
selbst bei der höchsten
getesteten Konzentration von 100 μg/ml
keine gravierende Zytotoxizität
beobachtet (TC50 > 100 μg/ml).
Im Gegensatz dazu wurde die Virusreplikation sehr effizient gehemmt.
Es wurde ein 1050-Wert von nur 3,32 μg/ml bestimmt. Daraus
errechnet sich ein TI von > 30.
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Zusammenfassend
ist also festzuhalten, dass der erfindungsgemäße Extrakt aus den Wurzeln
von P. sidoides gegenüber
HSV-1 eine sehr starke virusinaktivierende Aktivität entfaltete.
Sie lag bei einer Stoffkonzentration von 100 μg/ml bei > 7 Log10-Stufen,
d.h. bei dieser Stoffkonzentration konnte kein infektiöses Virus mehr
nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse erscheint die Verwendung
des Extraktes für
eine topische kurative Applikation besonders aussichtsreich. Die
starke prophylaktische Wirksamkeit in Verbindung mit einer guten
Verträglichkeit
wird aber auch aus dem Virusinhibitionstest deutlich. Selbst bei
der höchsten geprüften Konzentration
von 100 μg/ml
war keine zytotoxische Wirkung nachweisbar. Gleichzeitig wurden
Verozellen nach einer einstündigen
Vorinkubation mit dem Extrakt aber äußerst effizient vor einer nachfolgenden Infektion
mit HSV-1 geschützt.