DE2000820A1 - Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler Prothease - Google Patents
Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler ProtheaseInfo
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Description
PATENTANWÄLTE β MÜNCHEN 2. HILBLESTRASSE
• Pr. Um Dtyl-Irifl. Kopf. I MQwchwi 8, Hllblwtrofl« 20 ·
BuZticiMn
19
9. Januar 1970
Monsanto Company .800 North Lindbergh Boulevard St. Louis, Miss. 63166/ USA
"Mundpflege-Produkte mit einem Gehalt an neutraler
Protease"
Die Erfindung betrifft Mundpflege-Zubereitungen mit einem Gehalt an Enzymen und insbesondere Mundpflege-Zubereitungen
mit einem Gehalt an neutraler Protease.
χ/χ 009930/1964
Es sind viele unerwünschte Affektionen bekannt, welche von einer ungenügenden Zahnhygiene herrühren, wie Zahnkaries,
Infektionen, periodontale Krankheiten, etc. Einer dieser Zustände, der sich sehr rasch nach ein- bis
zweitägigem Michtbürsten der Zähne entwickelt, ist die Bildung einer weichen Masse an der Zahnoberfläche, welche
als Belag erwähnt zu v/erden pflegt. Der Belag scheint in IP mehreren Stufen zu entstehen, wovon die erste eine Ablagerung
von Speichelschleirastoff en auf der Zahnot^rfläche
ist, welche anschließend überzogen v/ird un". später tief von Bakterien durchdrungen wird, v/elche in Cav iiuncihöhle
zugegen sind. Diese Bakterien pflanzen sie Ί kontinuierlich
fort und in Abhängigkeit von der Bakterienart können sie Nebenprodukte ausscheiden, v/elche schädlich
für die Zähne und das Zahnfleisch sind. Eine gu^e Nflhr-
stoffquelle für ihre Portpflanzung sind irgendwelche
I
A ! Nahrungsteilchen, welche im Mund verbleiben. Während der späteren Stufen der Belag-Bildung wird die Ablagerung gleichfalls mit merklichen Mengen von Hydroxylapatit imprägniert, welcher allmählich unter Steinbildung verhärtet. Meistens pflegt ein Zahnarzt diesen Stein durch Abkratzen zu entfernen.
A ! Nahrungsteilchen, welche im Mund verbleiben. Während der späteren Stufen der Belag-Bildung wird die Ablagerung gleichfalls mit merklichen Mengen von Hydroxylapatit imprägniert, welcher allmählich unter Steinbildung verhärtet. Meistens pflegt ein Zahnarzt diesen Stein durch Abkratzen zu entfernen.
Es wurden verschiedene Versuche zur Eindämmung der Bela;~-
Bildung gemacht, beispielsweise die Einbeziehung von
009830/1964
1-Aiz; .Λ-Ιlischungen in herkömmliche Mundpflege-Produkte.
Dieije Produkte enthielten Multi-Enzym-Komponenten, wie
E.B. Proteasen, Lipasen und Amylasen zur Spaltung oder Zersetzung der verschiedenen Komponenten der Belages,
wie Proteil.e, Stärke und Fette. Jedoch werden viele dieser Idschungen aus Tieren und Pflanzen erhalten und im Hinblick
auf das große, für Dental-Produkte benötigte VoIufaen
sind sie nicht in genügenden '!engen verfügbar, und ferner sind die Kosten dieser Mischungen wegen der begrenzten
Lieferbarkeit hoch. Andere Mischungen, verfügbar aus ükroorganisi.ien, besitzen Komponenten, von denen die
eine wiederum eine andere unter Herabsetzung der Aktivi-. tat der Enzyme inaktivieren kann. Desgleichen weisen
vieT.e Mischun^an Komponenten mit extremen ρ -Werten für
oinu optimale Aktivität auf, wodurch deren Wirksamkeit
i:. Bereich der lundhöhle herabgesetzt wird.
Line Mundpflege-Zubereitung, welche nur ein einzelnes unzyn enthalt, das wirksam hinsichtlich einer Verzögerung
de: Ul iuriis oder einer Entfernung des 3elages ist, würde
ua'.ii r einen Fortschritt des Standes der Technik bear,!,
en.
In übereinstiiuT-ung r.it der vorliegenden Erfindung wurde
;:;*■ "*u>-d:"-r., daß Zubereitungen, welche eine neutrale Protease
009830/1964 " k "
-H-
und einen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbaren Träger enthalten, wirksam in der Verzögerung der Bildung
oder in der Entfernung eines Belages sind. In diesen Zubereitungen sind nicht mehr als Spurenmengen an alkalischer
Protease und Amylase vorhanden. Es ist völlig unerwartet, daß ein einzelnes, in eine Mundpflege-Zubereitung
einbezogenes Enzym genauso oder noch wirksamer als eine Mischung von in diesen Zubereitungen enthaltenen I
Enzymen sein würde. Darüber hinaus ist ein einzelnes Enzym nicht empfindlich gegenüber einem Angriff durch >
andere Enzyme, wie dies der Fall bei Enzym-Mischungen sein kann. ·
Eine neutrale Protease, wie sie in dieser Anmeldung ver- ,
wendet wird, bezieht sich auf ein Metallo-Enzym, welches ! y
seine optimale Aktivität bei einem pH~Wert von etwa 6 *·'
bis etwa 8 besitzt, wird inhibiert durch Metall-Chelatbildner, jedoch nicht angegriffen durch solche Inhibitoren,
wie Diisopropylfluorphosphat (DPP), und hydrolysiert Substrate, wie z.B. Purylacryloylglycyl-L-leucinamid
(PAGLA), besitzt jedoch keine Aktivität gegenüber Estern, wie z.B. p-Nitrophenylacetat oder N-CBZ-Glycinp-nitrophenylester.
Ein Metallo-Enzym ist eines, welches ein für die Aktivität erforderliches Metall enthält.
Die alkalische Protease, wie sie in der vorliegenden
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Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf ein Enzym, welches'seine optimale Aktivität bei einem p„-Wert von
etwa 8 bis etwa 11 entfaltet, das durch DPP inhibiert wird, jedoch nicht durch Metall-Chelatbildner und welches
eine Aktivität gegenüber Estern, wie z.B. N-CBZ-GIycinp-nitrophenylester,
jedoch nicht gegenüber PAGLA, besitzt.
Die in der vorliegenden Erfindung brauchbare neutrale Protease kann von Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen
gewonnen werden. Es wird bevorzugt, neutrale Proteasen mikrobiellen Ursprungs zu verwenden, weil diese in beträchtlichen
Mengen auf ökonomische Weise hergestellt werden können. Diese Mikroorganismen können entweder
vorwiegend neutrale Protease oder eine Mischung von neutraler Protease und anderen Enzymen produzieren.
Beispiele umfassen Bacillus-, Aspergillus- oder Streptomyces-Mikroorganismen,
wie z.B. verschiedenartige B. subtilis-Stämme, wie z.B. B. subtilis-Stamm NRRL B-3411
(U.S. Department of Agriculture Collection, Peoria, 111.), B. subtilis-Stamm NRRL 644, B. subtilis-Stamm IAM 1523
(Japanese Culture Collection), von denen alle eine Mischung von Proteasen und Amylaee erzeugen. Andere
Organismen umfassen B. therraoproteolyticus, Streptomyces
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OR!O«NAt
griseus, Aspergillus oryzae, Streptomyces rectus, Streptomyces
naraensis und B. subtilis var amylosacchariticus, von denen alle entweder eine Mischung von Protease und
Amyiase oder nur neutrale Protease erzeugen. Der Streptomyces griseus-Stamm K-I erzeugt vorwiegend neutrale
Protease.
Eine besonders gute Quelle für neutrale Protease ist eine Enzym-Mischung, die durch den B. subtilie-Stamm NRRL Β-3^11
erzeugt wird. Ein Verfahren zur Herstellung dieses Organismus und der Enzyme daraus wird in der US-Patentschrift
3 031 380 beschrieben. Das durch diesen Organismus erzeugte
enzymatisch aktive Material wurde allgemein als aus neutraler Protease, alkalischer Protease und Amyiase
bestehend befunden. Es sind gewöhnlich etwa 700 000 bis etwa 1,5 Millionen Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität
pro Gramm isolierten Peststoffes und etwa 350 000 bis 500 000 Kasein-Einheiten an alkalischer
Protease-Aktivität pro Oramm vorhanden, wie dies durch
die Kasein-Verdauungsmethode (nachstehend beschrieben) bestimmt wird. Ee sind etwa 300 000 bis etwa 500 000
Einheiten an Amylase-Aktivität vorhanden, bestimmt nach der Bernfeld-Methode, welche nachstehend beschrieben
wird. Wie in der zitierten Patentschrift ausgeführt wird, werden die relativen Verhältnisse von Protease zu Amyiase
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in Abhängigkeit von den exakten Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen variieren, jedoch wurde gefunden,
daß die neutrale und alkalische Protease und die Aniylase in zumindest beträchtlichen Mengen produziert werden,
beinahe ohne Rücksicht auf Veränderungen des Kulturmediums und anderer Bedingungen des Wachstums der MikroorGanismen.
Ks sind verschiedene analytische Methoden zur Bestimmung der Enzym-Aktivität verfügbar, und es' kann z.B. die·
Protease-Aktivität durch wohlbekannte Protein-Verdauungsmethoden unter Verwendung von Protein-Substraten, wie
z.B. von Kasein, Hämoglobin, Rinder-Serumalbumin oder Gelatine bestimmt werden. Entsprechend solchen Versuchen
katalysiert eine Protease die Hydrolyse eines Proteins (z.B. von Kasein) in einer bestimmten Zeiteinheit unter
kontrollierten Bedingungen von Teuperatur, p^-Wert und
Substrat-Konzentration; die Reaktion wird durch Zugabevon TrichloTcssißsäure gestoppt und die Lösung filtriert.
Die solubilisierten Bruchstücke in dem Filtrat werden entweder durch Hessen der Extinktion im Ultraviolett-Bereic3i
bestimr.it oder sichtbar durch Reaktion mit Folinphenol·
Reagenz ger.acht und die Extinktion im sichtbaren
Bereich (venessen und die Enzym-Aktivität in Form von
ii . .'iouivalenten ausgedrückt. Dieses Verfahren ist
009830/196*
vollständiger im Journal of General Physiology, 30, (19^7)
291 und in .Methods of Enzymology, Vol. 2, New York:
Academic Press 1955» 33 beschrieben.
In dieser Anmeldung soll in dem Fall, wo die neutrale Protease-Aktivität in Kasein-Einheiten ausgedrückt ist,
verstanden 3ein, daß eine derartige Aktivität bei einem p„-Wert von 7 bestimmt ist und in dem Fall, wo die
alkalische Protease in Kasein-Einheiten ausgedrückt ist,
soll verstanden sein, daß eine derartige Aktivität bei einem p„-Wert von 10 bestimmt wurde.
Andere Verfahren zur Bestimmung der Protease-Aktivität
machen Gebrauch von Substraten mit niederem Molekulargewicht in spektrophotometrischen Untersuchungen, z.B.
ist das Substrat FAGLA spezifisch für neutrale Protease und es wird zur Bestimmung der Aktivität der neutralen
"Protease verwendet, wie dies in Biochemical Biophysical
Research Communications, 32, 326 (1968), beschrieben ist.
Die Amylase-Aktivität wird allgemein durch die wohlbekannte
Dinitrosalicylsäure-Methode von Bernfeld, beschrieben in Methods of Enzymology, Academic Press, 1955,
Vol. I, Seite 149, bestimmt. Gemäß diesem Test katalysiert
- 9 009330/1984
COpV
2000320
Amylase die Hydrolyse von Stärke zu reduzierendem Zucker
bei einer gegebenen Zeit und Temperatur. Die Reaktion wird gestoppt und die Farbe durch Zugabe von Dinitrosalicylsäure
entwickelt. Die optische Dichte der Lösung wird nach einer Standard-Kurve, hergestellt mit bekannten
Mengen von Maltosehydrat, abgeschätzt. In dieser Anmeldung ist in den Fällen, wo Aktivitätseinheiten von Amylase
festgesetzt sind, darunter zu verstehen, daß die Bernfeld-Technik zur Bestimmung einer derartigen Aktivität angewandt
wurde.
Die neutralen Proteasen besitzen als Gruppe genommen eine, von den alkalischen Proteasen, als Gruppe genommen, verschiedenartige
Spezifizität. Zum Beispiel besitzen alkalische Proteasen Esterase-Aktivität, offensichtlich
infolge ihree Wirkungsmechanismus und nicht infolge ihres
p„-Optimum3, wohingegen die3 bei neutralen Proteasen
ni-cht der Fall ist. Versuche, welche diese Tatsache beweisen,
3ind vollständiger in Arch. Biochem. Biophy3. 123» (1968) 572, beschrieben. Da die Spezifizität von neutralen
und alkalischen Proteasen verschiedenartig 3ind, werden verschiedene Werte erhalten werden, wenn z.B. in
den Untersuchungen Hämoglobin oder Rinder-Serumalbumin anstelle von Kasein eingesetzt wird. Beispielsweise haben
eine neutrale. Protease, erhalten aua B. thermoproteolyticua
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- Io -
und eine alkalische Protease, erhalten aus B. subtilis,
Aktivitäten von 12 800 000 und 3 500 000 Einheiten/g, der Reihe nach, falls Kasein das Substrat ist; wenn jedoch
bei sonst gleichen Bedingungen Hämoglobin eingesetzt wird, sind die Aktivitäten 240 000 und 400 000 Einheiten/g,
der Reihe nach, d.h., die Aktivitäten von beiden sind geringer gegenüber Hämoglobin. Dementsprechend kann die
Angabe der Enzym-Einheiten in verschiedenen Typen von Einheiten erfolgen und deshalb können bei den Anwendungen
Enzyme auf Basis von gleichem Gewicht, gleicher Kasein-Aktivität oder gleicher Hämoglobin-Einheit, etc. verwendet
werden.
Verschiedene Techniken können zur Abtrennung von neutraler Protease aus Enzym-Mischungen angewandt werden, wie z.B.
die Ionenaustauschchromatographie, beschrieben im Journal of Biological Chemistry, 239, 3706 (1964) und in
Agr. Biol. Chem. 30, 651 (I966). Eine andere Methode wird
in der schwebenden Anmeldung No. 752 460, eingereicht am 14. August 1968 und auf den gleichen Rechtsnachfolger wie
die vorliegende Anmeldung übertragen, offenbart. Das Ausgangsmaterial für diese Technik ist wasserklares
Gärungsbier, enthaltend die Enzym-Mischung, erhalten durch Filtration oder Zentrifugieren, oder einen wässerigen
Extrakt der Enzym-Mischung, erhalten durch Wiederauflösen
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der rohen, lösungsmittelgefällten Enzym-Mischung. Die '
Amylase wird durch Lösungsmittel-Praktionierung in Anwesenheit
eines Calciumsalzes oder durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung, gefolgt durch Stärke-Absorption, in Anwesenheit
von wässerigem Äthanol zur Entfernung der letzten Spuren von Amylase, entfernt. Pigment wird durch Adsorption
unter Verwendung von DEAE-Cellulose oder anderer Anionaußtauscher-Harze
entfernt. Die zwei in Lösung zurückbleibenden Proteasen werden durch selektive Adsorption
unter Verwendung von Hydroxylapatit als Adsorber fraktioniert. Die neutrale Protease wird adsorbiert und nachfolgend
eluiert, wohingegen die alkalische Protease nicht adsorbiert wird.
Andere Methoden zur Stabilisierung von neutraler Protease in der Mischung können unter Verwendung von spezifischen
Inhibitoren, wie z.B. von DPP oder einem Kartoffel-Inhibitor zur Inaktivierung der alkalischen Protease und
sorgfältiger Lösungemittel-Fraktionierung zur Entfernung der Amylase durchgeführt werden.
Die neutrale Protease wird in einer solchen Menge verwendet,
daß die Mundpflege-Zubereitungen der vorliegenden Erfindung etwa 50 Kasein-Aktivitätseinheiten bis etwa
800 000 Kasein-Aktivitätseinheiten pro Gramm der Mundpflege-Zubereitungen und vorzugsweise etwa 100 Kasein-
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Aktivitätseinheiten bis etwa 400 000 Kasein-Aktivitätaeinheiten
pro Gramm der Mundpflege-Zubereitungen enthalten. Die Mundpflege-Zubereitungen geben beim allgemeinen
Gebrauch eine einseine Gebrauchsdoaia von etwa 1000 Xasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität bis
etwa 40 000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität
und vorzugsweise etwa 5000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität bis etwa 20 000 Kasein-Einheiten
neutraler Protease-Aktivität ab. Zum Beispiel wird ein Tropfen eines Mundwasser-Konzentrates mit etwa 200 0OO
Kasein-Einheiten an neutraler Proteaee-Aktivität pro Gramm des Konzentrates mit etWt 50 ecm bis 100 ecm Wasser Ver
dünnt und gibt als Mundwasser verwendet etwa 10 000 Einheiten neutraler Protease-Aktivität pro Einzel-Anwendung
ab. In einem anderen Beispiel gibt eine Zahnpasta τοη
etwa 8000 Kasein-Einheiten an neutraler Protetar-Aktivität pro Gramm Zahnpasta bei der Verwendung turn Bürsten der
tähne etwa 8000 Kasein-Einheiten neutraler Protease-Aktivität pro Einsel-Anwendung ab. In noch einem anderen
Beispiel geben 50 ecm eines Mundwassers, welches etwa
400 Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität
pro Gramm Mundwasser aufweist, bei der Verwendung etwa 20 000 Einheiten neutraler Proteaee-Aktivität pro Eineel-Anwendung ab.
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COPY
In den oralen Zubereitungen der vorliegenden Erfindung sind nicht mehr als Spuren-Mengen pro Gramm Zubereitung
an alkalischer Protease und Amylase zugegen. Eine Spuren-Menge ist als weniger als 50 000 Kasein-Einheiten an
alkalischer Protease-Aktivität und 50 000 Einheiten an Amylase-Aktivität pro 1 000 000 Kasein-Einheiten an neutraler
Protease-Aktivität definiert. Es wird vorgezogen, weniger als 20 000 Kasein-Einheiten an alkalischer Protease-Aktivität
und 20 000 Einheiten an Amylase-Aktivität pro 1 000 000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease-Aktivität
zu haben.
Die Anwendung oder der Gebrauch der Zubereitungen der Erfindung erfolgt, selbstverständlich in herkömmlicher
Weise, indem man eine wirksame Menge an neutraler Protease-Zubereitung in Kontakt mit der Mundhöhle oder mit dem für
eine besondere Anwendung interessierenden Teiles derselben bringt.
Die Produkte, in welchen neutrale Protease mit vorteilhaften Wirkungen verwendet werden kann, schließen Zahncremen,
Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate,
Gurgelwä3ser, Kaugummis, flüssige Konzentrate etc. ein. Beispiele von typischen Rezepturen werden in der nachstehenden
Tabelle I gegeben.
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copy
Paste | Pulver | Flüssig- keiten |
Gummi | |
Komponente | 51» % | 95 % | ||
Poliermittel | 20 % | ι ;i | 10 ;{ | |
Anfeuchter | 2 % | |||
Verdickungs mittel oder Bindemittel |
2 % | 3 % | 2 ^ · | G % |
Grenzflächen aktive Stoffe |
20 % | 68 % | ||
Wasser | 0,52 | 0,12 | 12 Si | |
Süßstoffe | 20 JS | 56 % | ||
Alkohol | 0,52 | 0,9# | H % | |
Aromastoffe | 20 ^ | |||
Basis-Gummi | ||||
Poliermittel umfassen Tricalciumphosphat, Dicalciumphosphat und Calciumpyrophosphat. Anfeuchter umfassen Glycerol,
Sorbitol oder Propylenglykol. Erläuternde Verdickungsmittel und Bindemittel umfassen Natriumcarboxymethylcellulose,
Traganth-Gummi, Carrageenan-Gummi und Vinyl-PoIymere.
Grenzflächenaktive Stoffe umfassen quartäre Ammoniumverbindungen und Dioctylnatriumsulfosuccinat. Süßstoffe
umfassen Glucose oder künstliche Süßstoffe, wie z.B. Saccharin. Aromastoffe umfassen Anisol, Spearmint-Öl oder
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Nelkenöl. Das Basis-Gummi umfaßt Chicle oder synthetische Harze.
Diese Hundpflege-Zubereitungen können in üblicher Weise,
B.B. gemäß der Beschreibung in Kirk und Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Ί, New York: Interscience,
(1951I) 928 bis 931, hergestellt werden.
Die Wirksamkeit der neutralen Protease kann durch in vitro- oder in vivo-Methoden bestimmt werden. Ein in vitro-Test
ist vorteilhafter dadurch, daß keine Versuchsgegenstände
und keine merklichen Mengen an Material erforderlich sind und er in einem viel kürzeren Zeitraum durchgeführt werden
kann. Ein wirksamer Test wird durch Herstellung eines synthetischen Belages, Deponieren eines Films dieses Belages
auf einer Glasplatte, Zugeben einer Enzym-Lösung auf den Film und Prüfung auf Film-Entfernung durchgeführt. Auf
diese Weise, kann eine große Anzahl von Enzymen auf Belag-Entfernung „geprüft werden.
Zusammenfassend darf somit gesagt werden, daß die vorliegende Erfindung Mundpflege-Zubereitungen betrifft,
welche neutrale Protease und einen Träger enthalten, beispielsweise ein Mundwasser-Konzentrat, enthaltend eine
neutrale Protease, erzeugt durch B. subtilis.
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., λ -f ν ORfQlNAL INSPECTED
- 1 -ι -
Die folgenden 3ei3piele werden zur Erläuterung und keinesfalls zur Beschränkung dieser Erfindung vorgelegt. Alle
Teile bedeuten Gewichtsprozente, bezogen auf die Gesamtzubereitung, es sei denn, daß etwas anderes ausdrücklich
■gesagt wird.
Neutrale Protease wird durch Impfen einer Kultur von B. subtili3 HRRL No. 3*111 in eine sterile Aufschlämmung
von Getreidekörnern oder anderem Nährmaterial (wie z.B. Reiskleie, Maismehl, Fischmehl, Weizenkleie, Enzose (etwa
50 bis 802 Dextrose und der Rest höhere Saccharide, welche die getrockneten Mutterlaugen, die von der Dextrose-Herstellung duch enzymatische Hydrolyse von Maisstärke
übrigbleiben, darstellen), lösliche Destillat-Rückstände, Mais-Einweichflüssigkeit etc.), enthaltend Protein, Kohlehydrate, Mineralien und Wachstumsfaktoren, erhalten, wobei
der Behälter gerührt und durch sprudelndes Einleiten von steriler Luft durch die geimpfte Aufschlämmung belüftet
wird. Der pH-Wert kann-geregelt sein oder sich selbst überlassen bleiben, um seinen eigenen naturgemäßen p„-Wert zu
erreichen. Aliquote Teile des Bieres werden zu verschiedenen Zeiten für Prüfungszwecke entfernt und, nachdem die
Enzym-Produktion offensichtlich ein Maximum erreicht hat,
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das Wachstum beendet und anschließend neun (S) Liter des Gärungsbieres durch Z'entrifugation geklärt und anschließend
mit 200 g DEAE-Cellulose (Diäthylaminoäthylcelluloseacetat
ergibt einen p„-Wert von 6,4) bei einem p^-Wert von 6,4
30 Minuten lang zur Entfernung irgendwelchen Pigmentes gerührt. Das Cellulose-Harz wird durch Filtration entfernt
und das Filtrat wiederum mit einer weiteren 100 g-Menge von DEAE-Cellulose in der gleichen Weise behandelt. 80 g
Calciumacetat werden zu dem Filtrat von 8 Litern zugegeben, der powert auf 7»5 eingestellt und 2 240 g Ammoniumsulfat
unter Rühren zugefügt. Nach Rühren bei 5°C während 30 Minuten wird der Niederschlag durch Filtration entfernt und
eine weitere 900 g-Menge Ammoniumsulfat zu dem überstand zugegeben und der.Niederschlag durch Zentrifugieren gesammelt
und in etwa 1 Liter einer 0,1^-igen Calciumacetat-Lösung
wieder aufgelöst. 100 g gepulverte Weizenstärke- und 120 ml Äthanol werden zugegeben, die Lösung 20 Minuten
lang gerührt und filtriert. 2 Liter kaltes (5°) Aceton wird ' zu dem Filtrat zugegeben und der1 Niederschlag durch Zentrifugieren
gesammelt, wiederum in 500 ml von 0,1^-igem CaI-ciumacetat
gelöst und lyophilisiert.
250 mg dieses teilweise gereinigten Enzym-enthaltenden
Feststoffes werden in 25 ml 0,02^-iger Calciumacetat-Lösung
gelöst, der pH-Wert auf 7»2 eingestellt und die Lösung auf
- 18 009930/1964
eine 1,2 χ 7,Ocm-Säule von Hydroxylapatit aufgebracht,
und mit 0,l#-igem Calciumacetat gewaschen. Nachdem die Enzym-Lösung auf der Säule mit ein wenig Calciumacetat-Lösung
gewaschen worden ist, wird die Säule mit 0,2 M-Phosphatpuffer vom p„-Wert 7,0 e.luiert. Das eluierte Protein-Material
(geprüft durch die Extinktion bei 280 mm) wird bei 5° gegen eine O,ljS-ige Calciumacetat-Lösung über Nacht
dialysiert, zentrifugiert und lyophilisiert.
Das obiger Verfahren ergab anschließend 17 g eines teilweise gereinigten Enzym-enthaltenden Peststoffes. Zehn
250 mg-Teile dieses Peststoffes wurden unter Verwendung
von Hydroxylapatit in der angezeigten Weise gereinigt und ergaben etwa 570 mg einer neutralen Protease, welche eine
Aktivität von etwa 12,5 x 10 Kasein-Einheiten pro Gramm aufwies.
Ein Mundwasser-Konzentrat wird durch Zugabe einer neutralen Protease zu einer Mischung aus 80 Gew.-Ji Glycerin, und
20 Gew.-% Alkohol hergestellt, so daß die Aktivität etwa 8OOO Kasein-Einheiten/ccm der Mischung beträgt. Diese
Mischung wird als ein Konzentrat hergestellt, welches bei der Anwendung zu verdünnen ist und als Mundwasser angewandt
wird. · .
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ORIGINAL INSPECTED
Die Wirkung der neutralen Protease auf den Belag wird durch Abschätzen der Belagfläche auf den Zähnen der Versuchspersonen
vor, während und nach dem Gebrauch eines Mundwassers;
enthaltend die obige Mischung, bestimmt. Eine Versuchsgruppe von Freiwilligen wurde ausgesucht und deren Zähne überprüft
und die Belagfläche durch ein numerisches Bewertungsverfahren einmal während 2 aufeinanderfolgenden Wochen zur
Festsetzung eines Belag-Standardwertes für jeden für die j Bilanz des Versuches abgeschätzt. Zunächst wurden die Zähne
fachmännisch gereinigt, um alle weichen Ablagerungen zu entfernen. Die Versuchspersonen verwenden dann täglich
während eines Zeitraumes von 6 Wochen ungefähr 50 ecm Wasser
mit einem Gehalt von 20 Tropfen der obigen Mischung als Mundwasser. Ihre Zähne werden in wöchentlichen Intervallen
auf die GröAe dee Belages überprüft.
Die Belagfläche wird mit Hilfe einer erschließenden Tafel, hergestellt durch die Amural Company, abgeschätzt. Jeder
sichtbare Zahn wird in 6 Segmente eingeteilt, 3 in der oberen Hälfte und 3 in der unteren Hälfte. Für jedes Segment
wird eine Bewertung von 1 gegeben für eine Spur von Ablagerung, eine Bewertung von 2 für eine Ablagerung, welche
weniger als die Hälfte des Segmentes bedeckt und eine
Bewertung von 3 für eine Ablagerung, welche mehr als die Hälfte bedeckt. Auf diese Weise wird eine Gesamtbewertung ·
für jeden sichtbaren Zahn nach jeder überprüfung abgeleitet. '
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- 2o ORIGINAL INSPECTH)
Eine andere Gruppe von· Freiwilligen unterzog sich der
gleichen Prozedur, jedoch enthielt das von diesen Versuchspersonen verwendete Mundwasser eine Enzym-Mischung, bestehend
aus etwa 8000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease, JJOOO Kasein-Einheiten an alkalischer Protease und
4000 Einheiten an Amyläse. Diese Enzym-Mischung wird in der
gleichen Weise von B. subtilis NRRL B-3^11 erhalten, mit
der Ausnahme, daß die alkalische Protease und die Amyläse
nicht entfernt" werden. Die Belagsbewertung für jeden sichtbaren Zahn wird dann bestimmt.
Ein Hundwasser-Konzentrat, enthaltend neutrale Protease,
wurde" gemäß dem obigen Verfahren hergestellt und an 8 Versuchspersonen verteilt. Diese Versuchspersonen verwendeten
die Zubereitung in der erwähnten Weise und deren Belagsbewertungen sind in Tabelle II widergegeben. Ein
anderes Mundwasser-Konzentrat wurde hergestellt, welches die Enzym-Mischung gemäß dem obigen Verfahren enthielt und
an 8 Versuchspersonen abgegeben, welche die obige Anwendungsvorschrift
befolgten. Deren Belagsbewertung ist in Tabelle III wiedergegeben.
- 21 -
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Tabelle II
Verbleibender Anteil des ursprünglichen Belages nach 6 Wochen |
Prozentuale Reduktion nach 6 Wochen |
|
Versuchsperson Nr. |
62 | 38 |
1 | 37 | 63 |
2 | 35 | 65 |
3 | 38 | 62 |
4 | 62 | 38 |
5 | 27 | 73 |
6 | 33 | 67 |
7 ' | 35 | 65 |
8 | Tabelle III | |
Verbleibender Anteil des ursprünglichen Belages nach 6 Wochen |
Prozentuale Reduktion nach 6 Wochen |
|
Versuchsperson Nr. |
53 | 47 |
1 | 38 | 62 |
2 . | 34 | 66 |
3 | 33 | 61 |
4 | 42 | 58 |
5 | 30 .. | 70 |
6 | 40 | 60 |
7 | 40 | 60 |
8 | ||
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- 22 -
Aus den vorstehenden Daten ist leicht zu ersehen, daÄ die
neutrale Protease den Belag wesentlich verringert.
Andere geeignete Mundwasser-Konzentrate wurden hergestellt, indem man die neutrale Protease des Beispiels 1, bei der
gleichen Aktivitätsstufe durch eine neutrale Protease, erhalten von B. subtilis NRRL No. 91Il, eine neutrale Protease
von B. subtilis IAM No. 1523 (Japanese culture collection),
eine neutrale Protease erzeugt durch Streptomyces griseus, eine neutrale Protease, erhalten von B. thermoproteolyticus und eine neutrale Protease, erhalten von B. Äubtilis
var amylosacchariticus, ersetzt.
Um die Wirksamkeit von verschiedenen neutralen Protease-Enzymen zu untersuchen, wurde ein synthetischer Belag
hergestellt. Eine Gruppe von Freiwilligen, welche ihre Zähne 2 Tage nicht gebürstet hatte, bürstete sich mit einer
sauberen trockenen Zahnbürste und sammelte den Speichel und die Zahnbürsten in einem sterilen Pläschchen.
Zur übertragung der Speichelproben auT sterile Plattenkultureri von Nähr-;Agar (Difco, 31 g/Liter, sterilisiert
und in sterile Plastik-Petrischalen gegossen) wurde eine geglühte Impföse verwendet.
- 23 -009830/1964
Die geimpften Platten wurden bei 370C 48 Stunden lang
inkubiert und ein reichliches, mikrobielles Wachstum be^
obachtet. Visuell unterschiedliche Kolonien wurden entfernt, Objektträger mit Färbungen nach Gram hergestellt
und geprüft. Ausgewählte Kolonien wurden auf sterile Nähr-Agar-Schrägkulturen
für eine Beibehaltung in einer Kultursammlung sekundärkultiviert.
Große Mengen an ausgewählten Qrganismen wurden durch Impfen
einer .Platinöse voll der Organismen aus den Schrägkulturen in Kolben mit steriler Nährbouillon (Difco, 9 g/Liter,
100 ml in 500 ml Stauflaschen (baffled flasks)) und Inkubieren in einer rotierenden Schüttelapparatur (New Brunswick
Scientific Co.) bei 37° 3 Tage lang, erhalten. Die ! Organismen wurden dann durch Zentrifugieren bei 5° in
rostfreie Stahlflaschen (Sorvall, SS-3 Zentrifuge mit GSA-
Kopf, 9 600 Upm während 30 Minuten.) gesammelt und in dem :
Minimal-Volumen Wasser zur Überführung in einen Glasbehälter
wieder'suspendiert. Die gemischte Aufschlämmung von oralen Mikroorganismen wird im Kühlraum aufbewahrt.
Der Speichel wird in einem Becherglas gesammelt und mit einem gleichen Volumen der gekühlten bakteriellen Suspension
vermischt. Sucrose wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 1% zu erhalten.
009830/1964
Ein ml der bakteriellenVSpeichel-Mischung wird auf eine
17,78 χ 17,78 cm (7 χ 7 inch) Glasplatte (mit durch Sandstrahlen
angerauhter Oberfläche) placiert und die Mischung mit einem gebogenem Glasstab, verwendet für das Ausstreichen
von Bakterien auf Platten, ausgestrichen. Der Film wird so lang ausgestrichen, bis er durch visuelle überprüfung als
einheitlich beurteilt wird.
Die Platte wird' dann durch Inkubation bei 37°C über Nacht
getrocknet. Enzym-Lösungen werden in destilliertem Wasser hergestellt und 1 Tropfen einer jeden Enzym-Lösung sorgfältig
auf die Platte placiert und die Platte wieder bei 37°C während einer halben Stunde inkubiert. Die Platten
werden dann über einem Bunsen-Brenner zur wiederholten Trocknung des Filmes sanft erwärmt. Die Filme werden durch
sorgfältiges Gießen einer 1^-igen wässerigen Lösung von
Kristallviolett (lg/100 ml) auf die Platte gefärbt. Nach Färben während 5 Minuten wird der Überschuß der Farbe abgegossen
und die Platte behutsam in ein Bad mit kaltem Leitungswasser eingetaucht, sanft geschwenkt, anschließend
entfernt und zur Beobachtung luftgetrocknet.
Das obige Verfahren wurde an den in Tabelle IV gezeigten Enzymen mit den dort angeführten Resultaten durchgeführt.
009830/1964 " 25 "
Ein Tropfen Enzymlösung, enthaltend unten angegebene Einheiten, wird auf die Belag-Platte getropft.
Ergebnisse sind angegeben als - (keine Pilmentfernung)
bis +++ (vollständige Pilmentfernung)
Enzym
Aktivität
u/mg (Substrat)
u/mg (Substrat)
Verdünnung mg/ml
Ergebnis
O
O
O
to
B, subtilis NRRL B-3411,
Neutrale Protease
B. subtilis NRRL B-3411,
Alkalische Protease
B..subtilis var amyloäacchariticus,
Neutrale Protease
B. thermoproteolyticus, Neutrale Protease
B. subtilis NRRL B-3411,
Anyläse
110 (Albumin)
270 (Albumin)
270 (Albumin)
195 (Albumin)
240 (Albumin)
15 000 (Stärke)
240 (Albumin)
15 000 (Stärke)
0,5
0,5
1
0,5
1
ro
CD CD O OO
Aus den obigen Daten kann leicht entnommen werden, daß die neutralen Proteasen Belag entfernen.
Beispiel 3
Eine Zahnpasta wird hergestellt, enthaltend etwa 7000 Kasein-Einheiten von neutraler Protease-Aktivität pro Gramm
Zahnpasta. Die neutrale Protease wird durch B. subtilis NRRL B-3^11 hergestellt und wird in der gleichen Weise wie
in Beispiel 1 erhalten. Die Zahnpasta enthält zusätzlich zu dem Enzym die folgenden Bestandteile:
Sorbital-Wasser Mischung 43 %
Traganthgummi
Saccharin
Dioctylnatriumsulfosuccinat
Dicalciumphosphatdihydrat
Insgesamt 100 %
Geeignete Zahnpasten werden hergestellt, indem man für die vorstehende neutrale Protease bei der gleichen Aktivitätsschwelle
eine neutrale Protease, erhalten aus B. thermoproteolyticus und eine, erhalten aus B. subtilis NRRL
einsetzt.
1 | ,5 % |
1 | ,6 % |
1 | ,1055 |
Rest |
009830/1964
Beispiel *J
Eine Kaugummi-Zubereitung wird hergestellt, enthaltend etwa 2000 Kasein-Einheiten an neutraler Protease pro Gramm
Kaugummi. Die neutrale Protease wird durch B. subtilis
B-3^11 erzeugt und wird in der gleichen Weise wie in Beispiel
1 erhalten. Zusätzlich zu der neutralen Protease enthält das Kaugummi :
Teile
Chicle · 100 ·
Gelatine kO
Wasser 60
Aromastoffe 20
Sucrose Rest
Insgesamt 520
Andere geeignete Kaugummis werden durch Ersatz der vorstehend erwähnten Protease bei der gleichen Aktivitätsschwelle durch eine neutrale Protease," erzeugt durch
B. subtilis IAM 1523 und eine neutrale Protease, erzeugt durch B. thermoproteolyticus, hergestellt.
Beispiel 5 Ein Zahnpulver wird hergestellt, enthaltend 7000 Kasein-
- 28 009830/1964
Einheiten an neutraler.Protease pro Gramm Pulver. Die
neutrale Protease wird durch B. subtilis NRRL Β-3Ί11 erzeugt und wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1
erhalten. Zusätzlich zu der neutralen Protease enthält das Zahnpulver :
Teile
Insgesamt 500
Ein anderes geeignetes Zahnpulver wird durch Ersatz der obigen neutralen Protease bei der gleichen Aktivitäteschwelle durch eine neutrale Protease, erzeugt durch
B. subtilis var amylsacchariticus, hergestellt.
009830/1964 " 29 "
Claims (1)
- Patentansprüche1. Mundpflege-Zubereitung, enthaltend einen für die Mundhöhle pharmakologisch annehmbaren Träger und eine neutrale Protease, welche in einer Menge anwesend ist, um etwa 50 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 800 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen und"wobei die erwähnte Zubereitung nicht mehr als eine Spurenmenge von Amylase. oder alkalischer Protease enthält.2. Zubereitung nach.Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.3..· Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, jdaß die erwähnte neutrale Protease duroh einen Mikroorganismus erzeugt wird.4. Zubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Mikroorganismus ein Bacillus-Mikroorganis raus, AspergillUe-Mikroorganiemus und/oder Streptomyces-f IMikroorganismus ist. ,009930/1994- 3o -ORIGINAL INSPECTS)5. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease durch einen Mikroorganismus der Gruppe B. subtilis, Streptomyces griseus, B. thermoproteoliticus, Aspergillus oryzae, Streptomyces rectus und/oder Streptomyces naraensis erzeugt wird.6. Zubereitung nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch einen B; subtilis aus der Gruppe B. subtilis NRRL B-3411, B. subtilis NRRL 644, B. subtilis IAM 1523 und/oder B. subtilis var amylosacchariticue erzeugt wird.7. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch B. subtilis NRRL B-3411 erzeugt wird.8. Zubereitung nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.9. Zubereitung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease ih einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa J009130/1964- 31 - .ORIGINAL INSPECTEDi|OO 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.Io.. Zubereitung nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease durch B. subtilis NRRL erzeugt wird.11. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe der Zahnpasten, Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate, flüssigen Konzentrate und/oder Kaugummis ausgewählt ist.12. Zubereitung gemäß Anspruch 11, dadurch, gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa l|00 000 Kaeein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.13* Zubereitung nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten, Zahnpulver, Mundwässer, Mundwässer-Konzentrate, flüssige Konsentrate und/oder Kaugummis ausgewählt ist.1*1. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten,009830/19)54- 32 -Zahnpulvern, Hundwässern, Mundwässer-Konzentraten, flüssigen Konzentraten und/oder Kaugummis ausgewählt ist.15. Zubereitung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger aus der Gruppe von Zahnpasten, Zahnpulvern, Mundwässern, Mundwässer-Konzentraten, flüssigen Konzentraten und/oder Kaugummis ausgewählt ist.16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease durch B. subtilis NRRL B-3^11 erzeugt wird.17. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger eine Zahnpasta ist.18. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der erwähnte Träger ein Mundwasser-Konzentrat ist.19. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 1IOO 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.20. Zubereitung nach Anspruch l6, dadurch gekennzeichnet,- 33 009830/1964daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.21. Zubereitung nach Anspruch 17 3 dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um etwa 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 000 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.22. Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte neutrale Protease in einer Menge anwesend ist, um 100 Kasein-Einheiten der Aktivität bis etwa 400 Kasein-Einheiten der Aktivität pro Gramm der erwähnten Zubereitung sicherzustellen.
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Cited By (3)
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---|---|---|---|---|
FR2090333A2 (de) * | 1970-05-28 | 1972-01-14 | Dainippon Pharmaceutical Co | |
DE102006004079A1 (de) * | 2006-01-28 | 2007-08-09 | Henkel Kgaa | Mund- und Zahnpflege und -reinigungsmittel mit Enzymen |
DE102006001148B4 (de) * | 2006-01-06 | 2008-03-27 | Henkel Kgaa | Mund- und Zahnpflege und -reinigungsmittel mit Enzym(en) |
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