DE19951734A1

DE19951734A1 - Regioselektiv substituierte Ester von Oligo- und Polysacchariden und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Publication number: DE19951734A1
Application number: DE19951734A
Authority: DE
Inventors: Erik-Andreas Klohr; Wolfgang Koch; Dieter Klemm; Rene Dicke
Original assignee: Wolff Walsrode AG
Current assignee: Dow Produktions und Vertriebs GmbH and Co oHG
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2000-09-07
Also published as: DE50008175D1

Abstract

Regioselektiv überwiegend an der C2-Position der Anhydroglukoseeinheit (AGU) substituierte Ester von Oligo- und Polysacchariden, Verfahren zu deren Herstellung durch Anwendung von Enzymen und/oder bestimmten Salzen als Katalysatoren bei der Esterbildung und deren Verwendung.

Description

Die Erfindung betrifft regioselektiv insbesondere an der C2-Position der Anhydro glukoseeinheit (AGU) substituierte Ester von Oligo- und Polysacchariden sowie ein Verfahren zu deren Herstellung durch den Einsatz von Enzymen oder bestimmter Salze als Katalysatoren bei der Esterbildung. Derartige regioselektiv substituierte Ester unterscheiden sich in wesentlichen Eigenschaften von herkömmlichen, statistisch funktionalisierten Produkten.

Es ist bekannt, daß bei Anwendung herkömmlicher Veresterungsverfahren auf Oligo- und Polysaccharide Produkte mit statistischer Verteilung der Estergruppen innerhalb der AGU sowie entlang der Kette entstehen. Diese Statistik ist abhängig von der elektronischen bzw. räumlichen Zugänglichkeit der einzelnen Hydroxylgruppen. So ist z. B. bei Stärke die Hydroxylgruppe der C6-Position eine primäre Gruppe, die sterisch gut zugänglich ist und die damit speziell bei heterogenen Umsetzungen die höchste Zugänglichkeit besitzt. Die Hydroxylfunktion der C2-Position unterliegt dem elektronischen Einfluß der benachbarten glycosidischen Bindung sowie dem Elektronenzug des Ringsauerstoffs. Gerade bei homogenen Verfahren hat sich ge zeigt, daß die C2-Position aus diesem Grund zuerst umgesetzt wird. In keinem der genannten Fälle aber wird eine vollständige Umsetzung nur einer Hydroxylgruppe erreicht.

Unter Ausnutzung solcher Zugänglichkeitsunterschiede können mit Hilfe von Schutzgruppen, die meist räumlich anspruchsvoll und leicht abspaltbar sind, selektiv Hydroxylgruppen blockiert werden, so daß in Folgereaktionen regioselektive Derivate gebildet werden.

Solche Schutzgruppen sind z. B. Triphenylmethylgruppen oder großvolumige organische Siliziumverbindungen, wie Thexyl- oder tert-Butyl-dimethylsilylgruppen.

Diese Art der Synthese hat aber den entscheidenden Nachteil, daß mit der Einführung der Schutzgruppe und deren Abspaltung mindestens zwei zusätzliche Reaktionschritte erforderlich sind. Weitere Nachteile bestehen in der, teilweise un vollständigen, Schutzgruppenabspaltung, der restlosen Entfernung der dabei ent stehenden, z. T. toxischen, Spaltprodukte sowie eines unter den Spaltbedingungen möglichen und die Produkteigenschaften verändernden Kettenabbaus der Poly saccharide.

Enzyme sind in der Lage, beim Vorliegen mehrerer reaktiver Zentren an einem Molekül, z. B. Hydroxylgruppen, direkte selektive Veresterungen zu katalysieren. Dabei hat jedes Enzym eine bestimmte gefaltete (native) Struktur, die essentiell für die spezifische biokatalytische Aktivität im jeweiligen physiologischen Medium ist. In zahlreichen Publikationen wurde jedoch gezeigt, daß viele Enzyme auch in organischen Lösungsmitteln aktiv sind, d. h. unabhängig von ihrer nativen Struktur, Größe und Funktion. In unpolaren Lösungsmitteln zeigen Enzyme meist hohe Aktivität, wo-hingegen in relativ polaren Medien nur sehr geringe Aktivität gefunden wird (Biotechnol. Bioteng. 30 (1987), 81-87). Die Enzyme sind in diesen organischen Lösungsmitteln unlöslich.

Derartige enzymkatalysierte Reaktionen sind an niedermolekularen Mono- und Di sacchariden in organischen Lösungsmitteln schon zahlreich durchgeführt worden (FEMS Microbiol. Rev. 16 (1995), 193-211; J. prakt. Chem. 335 (1993), 109-127; Synthesis 1992, 895-910; WO 97/36000; WO 95/23871). Dabei wurden vorrangig Lipasen, aber auch Esterasen und Proteasen, als Enzyme und Lösungsmittel wie Tetrahydrofuran, Pyridin und N,N-Dimethylformamid eingesetzt. Enzymatische Ver esterungen sind auch in wäßriger Pufferlösung durchführbar. Nachteilig ist hierbei, daß das Acylierungsreagens, welches fettsäureähnlichen Charakter hat, nicht in wäß riger Pufferlösung löslich ist und damit nur suspendiert werden kann. Das zu ver esternde Substrat liegt dabei gelöst vor (DE-A-24 30 944, 1992; JP-A-63191802).

Bei Glucanen entstehen dabei in der Mehrzahl Ester an primären Hydroxylgruppen. In einigen Fällen tritt die Veresterung auch an sekundären Hydroxylgruppen ein (J. Am. Chem. Soc. 109 (1987), 3977-3981; Enzyme Microb. Technol. 20 (1997), 225-228). Für die genannten enzymatische Veresterungen werden in allgemeinen reaktive Esterverbindungen mit elektronenziehenden Gruppen verwendet, wie Vinyl ester (Biotechnol. Lett. 19 (1997), 511-514) oder Trihalogenethylester (Tetrahedron 54 (1998), 3971-3982), wobei die Veresterung mit einem Vinylester eine irreversible Reaktion darstellt, da der entstehende Vinylalkohol als Acetaldehyd dem Reaktions gleichgewicht entzogen wird. Weitere reaktive Verbindungen sind Carbonsäurean hydride und Ester der Kohlensäure.

Desweiteren wurden Dicarbonsäurediester für die Reaktion mit Mono- und Disacchariden eingesetzt. Auf diese Weise konnten neue Copolymere auf Sacharid basis aufgebaut werden, wie in den US-A-5,270,421 und US-A-5,618,933 gezeigt.

In den beschriebenen Publikationen werden im allgemeinen das Substrat und das Acylierungsreagens in einem organischen Lösungsmittel gelöst, in dem dann das Enzym suspendiert wird. Mit den oben genannten Verfahren sind keine enzymatischen Veresterungen an Polysacchariden, speziell an Glucanen, durchführbar, da das ungelöste und nicht gequollene Polymer dem Enzym bzw. der Enzymkatalyse unzugänglich ist. In heterogener Phase sind Polysaccharide jedoch enzymatisch veresterbar. (WO 96/13632, DE-A-34 30 944). Diese heterogenen Reaktionen verlaufen nur an der Oberfläche der Polymerpartikel, wodurch inho mogen veresterte Polysaccharidderivate entstehen, d. h. Polysacchariderivate, bei denen die Substituentenverteilung entlang der Polymerkette ungleichmäßig ist. Weitere Nachteile dieser Veresterungsverfahren bestehen darin, daß geringe Produkt ausbeuten erzielt werden und Produkte mit geringer Selektivität bezüglich des Substitutionsortes in der Anhydroglucoseeinheit entstehen.

Konventionelle heterogene Veresterungen werden oftmals in Wasser als Suspensionsmittel durchgeführt (US-P. 5,703,226, 1997). Homogene Umsetzungen erfolgen in organischen Lösungsmitteln oder direkt im Acylierungsreagens (US-P. 5,714,601, 1998; WO 96/14342). Als Acylierungsmittel finden im allgemeinen die entsprechenden Carbonsäureanhydride oder die Vinylester Verwendung. Derartige Veresterungen bzw. Umesterungen werden meist alkalisch katalysiert, wobei als Katalysator Alkalihydroxide, Mineralsäuresalze oder organische Amine in Frage kommen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, den Zugang zu homogenen regioselektiv an der C2-Position der Anhydroglukoseeinheit (AGU) substituierte Ester von oligo- und Polysacchariden zu ermöglichen. Erfindungsgemäß gelang es nun, homogen und regioselektiv überwiegend an der C2-Position der AGU substituierte Ester von Oligo- und insbesondere Polysacchariden herzustellen. Gegenstand der Erfindung sind daher Oligo- und Polysaccharidester, die regio selektiv, vorzugsweise zu mindestens 90%, besonders bevorzugt zu 90 bis 98%, der gesamten Substitution mit Estergruppen an der C2-Position der AGU verestert sind (partieller durchschnittlicher Substitutionsgrad DS an der C2-Position der AGU bezogen auf den Gesamt-DS). Gemäß der Erfindung besonders bevorzugte, an der C2-Position regioselektiv substituierte Oligo- und Polysaccaridester sind Ester von Stärke oder Stärkederivaten, insbesondere Hydroxyethylstärke oder Hydroxypropyl stärke. Gegenstand der Erfindung sind auch an der C2-Position reioselektiv substituierte Ester von Cellulose, Celluloseestern oder Celluloseethern, insbesondere Hydroxyethylcellulose oder Methylcellulose, Pullulan oder Maltose. Die erfindungsgemäßen Oligo- und Polysaccharidester sind durch die durch Umsetzung mit Veresterungsreagenzien aus der Gruppe der Vinylester, der Carbonsäurehydride, Trihalogenethylester sowie der Lactone, die im folgenden bei der Beschreibung des Verfahrens genauer beschrieben werden erhältlich sind. Erfindungsgemäß besonders bevorzugte, an der C2-Position regioselektiv substituierte Oligo- und Polysaccharidester sind 2-0-Propionylstärke, 2-0-Butyrylstärke, 2-0-Benzoylstärke, 2-0-Laurylstärke, 2-0-Methoxycarbonylstärke, 2-0-Acryloylstärke und 2-0- Methacryloylstärke und ganz besonders bevorzugt 2-0-Acetylstärke. Erfindungs gemäß können die regioselektiv an der C2-Position substituierten Oligo- und Poly saccharidester an den übrigen OH-Gruppen der AGU mit weiteren Estergruppen verestert sein, die nicht mit den Estergruppen an der C2-Position identisch sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen in Gegenwart, eines organischen Lösungsmittels welches enzym- oder salzkatalysiert am in gelösten oder hochgequollenen Oligo- oder Polysaccharid durchgeführt wird.

Ausgehend von den beschriebenen Nachteilen bekannter Verfahren, wie z. B. geringe Produktausbeuten und Regioselektivitäten, gelingt es dabei, durch Katalyse mittels Enzymen Oligo- und Polysaccharide, die in organischen Lösungsmitteln gelöst bzw. stark gequollen sind, regioselektiv an der sekundären Hydroxylgruppe der C2- Position sowie in Kombination mit der primären Hydroxylgruppe der C6-Position der AGU zu verestern. Das Verfahren führt zu sehr hohen Produktausbeuten, wobei die partiellen Substitutionsgrade in breiten Grenzen variiert und eingestellt werden können. Besonders hohe Regioselektivitäten werden bei α-(1,4)-glycosidisch verknüpften Oligo- und Polysacchariden, insbesondere Stärke, erzielt. Das Verfahren ist aber auch auf β-(1,4)-glucosidisch verknüpfte Oligo- und Polysaccharide anwendbar. Als organische Lösungsmittel grundsätzlich geeignet sind solche, in denen die eingesetzten Oligo- und Polysaccharide stark quellen oder sich lösen und das verwendete Enzym ausreichende Aktivität zeigt. Als organische Lösungsmittel daher können dabei Dimethylsulfoxid (DMSO) N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMA), Pyridin, N-Methylmorpholin-N-oxid (NMMO) sowie Mischungen der genannten Lösungsmittel verwendet werden. Bevorzugt ist DMSO. Überraschenderweise besitzen die Enzyme, insbesondere in DMSO, eine hohe Aktivität und man gelangt in einer einstufigen Reaktion zu streng regioselektiv veresterten Produkten. Durch gezielte Folgereaktionen können diese Ester zu regio selektiv substituierten Mischderivaten, wie z. B. Estern und Ethern, umgesetzt werden.

Die Veresterung kann an Polysacchariden, wie vorzugsweise Stärken aus verschiedenen natürlichen Quellen mit unterschiedlichem Amylosegehalt und Molekulargewicht und Stärkederivaten, insbesondere Hydroxyethylstärken oder Hydroxypropylstärken, aber auch an Cellulose, Cellulosederivaten, Pullulan und Pullulanderivaten und Oligosacchariden durchgeführt werden.

Als Enzyme können Proteasen aller Typen, wie vorzugsweise Serin-, Cystein-, Asparagin- und Metalloproteasen sowie Esterasen Verwendung finden. Dabei werden die Proteasen vorzugsweise in Phosphat-Puffer, alternativ in Carbonat- Puffer, im pH-Bereich 4-9, abhängig vom Enzym, aber vorzugsweise pH = 7-8, gelöst und anschließend lyophiliziert. Geeignete Proteasen sind vorzugsweise Proteinase N und Subtilisin von Bacillus subtilis, Proteinase 2A von Aspergillus oryzae, Proteinase 6 von Aspergillus sp., a-Chymotrypsin, Papain, Rennin und Thermolysin.

Als Veresterungsreagenzien kommen vor allem Ester der allgemeinen Formel:

zum Einsatz, wobei R² vorzugsweise Alkyl mit 2 bis 6 C-Atomen, gesättigt, oder un gesättigt sowie verzweigt oder unverzweigt oder gesättigtes Trihalogenalkan mit 2 bis 4 C-Atomen, insbesondere Vinyl, Trihalogenethyl oder Alkyl sein kann. R¹ ist vorzugsweise Alkyl mit 2-18 C-Atomen, gesättigt, ungesättigt, geradkettig, ver zweigt oder zyklisch und gegebenenfalls substituiert und Aryl (gegebenenfalls substituiert). Besonders bevorzugt ist R¹ ausgewählt aus der Gruppe Acetyl, Propyl, butyryl, Vinyl, Methacryl, Cinamoyl, Pivaloyl und Cyclohexyl. Beim Einsatz von Alkensäureestern können die Doppelbindungen noch zur Polymerisation genutzt werden, um Netzwerkstrukturen aufzubauen. Diese Möglichkeit besteht auch bei Nutzung von Dicarbonsäurediestern mit dem Rest R², wie z. B. Adipinsäuredivinyl ester, wobei im speziellen Polysaccharide einheitlich vernetzt werden können.

Besonders geeignete Veresterungsreagenzien sind Vinylacetat, Vinylpropionat, Vinyllaurat, Vinylbutanoat, Vinylstearat, Vinylbenzoat, Vinylacrylat, Vinylmeth acrylat, Vinylcrotonat, Vinylpivalat und Divinylpivalat.

Weitere Veresterungsreagenzien sind Carbonsäureanhydride, vorzugsweise Acetan hydrid, Propionsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Itakonsäureanhydrid, sowie reaktive Lactone, vorzugsweise Propiolacton und a-Angelicalacton. Im Falle von Carbonsäureanhydriden erfolgt die Substitution außer an der C2-Position auch an der C6-Position der AGU.

N-Isopropylidenverbindungen der allgemeinen Formel:

sind gleichfalls als Veresterungsreagenzien einsetzbar, wobei die entsprechenden Kohlensäureester der Oligo- und Polysaccharide entstehen. R¹ ist vorzugsweise Alkyl mit 2-18 C-Atomen, gesättigt, ungesättigt, geradkettig, verzweigt oder zyklisch und gegebenenfalls substituiert und Aryl (gegebenenfalls substituiert). Besonders bevor zugt ist R¹ ausgewählt aus der Gruppe Acetyl, Propyl, Butyryl, Vinyl, Methacryl, Cinamoyl, Pivaloyl und Cyclohexyl.

Besonders geeignete Veresterungsreagenzien aus der Gruppe der N-Isopropyliden verbindungen sind N-Isopropyliden-O-methylcarbonat, N-Isopropyliden-O-ethyl carbonat und N-Isopropyliden-O-benzylcarbonat.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Substrate in einem geeigneten organischen Lösungsmittel - im Fall von Stärke in DMSO - löst, Enzym und Umesterungsreagens zugibt und anschließend inkubiert. Die Inkubations temperatur liegt zwischen 20°C und 85°C, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 45°C und insbesondere im Intervall von 35 bis 45°C, dem Temperaturoptimum der ver wendeten Enzyme. Die Reaktionszeiten liegen zwischen 2 und 100 h, wobei bezogen auf das Acylierungsreagens ein etwa 50%iger Umsatz stattfindet. Alternativ kann die Aktivierung des Umesterungsreagens durch das Enzym in einem vorgelagerten Schritt erfolgen. Die Enzymabtrennung nach Beendigung der Reaktion erfolgt durch Flüssig-Fest-Trennung (z. B. Zentrifugation, Filtration). Das Produkt wird durch Ausfällen isoliert, gewaschen und getrocknet. Die anfallenden Lösungsmittel sind destillativ aufarbeitbar und anschließend dem Veresterungsprozeß wieder zuführbar. Das Enzym kann dabei ohne Aktivitätsverlust im Kreisprozeß eingesetzt werden.

Bei Durchführung der Reaktion bei einer Temperatur von 40°C erfolgt im genannten System außer der enzym-katalysierten zu geringen Prozentzahlen, bis zu einem maximalen Gesamtsubstitutionsgrad von DS = 0,25, auch eine chemische Ver esterung, die aber zu statistisch veresterten Produkten führt. Dies führt dazu, das weitere im Molekül vorhandene Hydroxylgruppen verestert werden. Diese chemische Veresterung läßt sich weitgehend unterdrücken, wenn die Reaktion bei niedrigeren Temperaturen (20-25°C) durchgeführt wird, oder vorzugsweise in nahezu (< 0,01% Wassergehalt) wasserfreien Systemen gearbeitet wird.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich bei Oligo- und Polysacchariden ein partieller Substitutionsgrad von bis zu DS = 1,0 an der C2-Position der AGU ein stellen. Über die eingesetzten Molequivalente Acylierungsreagens läßt sich ein ge wünschter partieller DS ≦ 1.0 an der C2-Position der AGU einstellen (Tab. 1).

Tab. 1. Molequivalente Vinylacetat und erreichbarer DS_Acetat bei der Herstellung von 2-O-Acetylstärke mit Proteinase N in DMSO bei 39°C und 70 h Reaktionszeit

Der partielle DS an der C2-Position der AGU ist außer über die Molequivalente auch über die Reaktionskinetik einstellbar, d. h. je nach Abbruchzeit der Reaktion lassen sich gewünschte DS ≦ 1,0 erzielen (Tab. 2).

Tab. 2. Reaktionszeit und erreichbarer DS_Acetat bei der Herstellung von 2-O-Acetyl stärke mit Proteinase N in DMSO bei 39°C und 2,3 Molequivalente Vinylacetat

Der Nachweis der Regioselektivität der enzymatisch katalysierten Veresterungs reaktion erfolgte am intaktem Oligo- oder Polysaccharid durch ein- und mehr dimensionale NMR-Spektroskopie. Dafür wurden die restlichen freien Hydroxyl gruppen mit einem geeigneten Carbonsäureanhydrid verestert, beispielsweise Propionsäureanhydrid bei Saccharidacetaten oder Acetanhydrid bei Saccharid benzoaten bzw. anderen Saccharidacylaten. Diese gemischten Ester sind in Chloro form löslich und können NMR-spektroskopisch untersucht werden. Nach Signalaus wertung der AGU-Protonen wie Kohlenstoffe über ¹H/¹H und ¹H/¹³C-Korrelation sind die entsprechenden Acylgruppen mit Hilfe der ¹H-detektierten ¹H/¹³C-Mehrfach bindungskorrelation (HMBC-Technik) ihrer Position an der AGU zuordenbar (Carbohydr. Res. 224 (1992), 277-283).

In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Herstellung nur salzkatalysiert ohne weitere Enzymzugabe durchgeführt. Es werden dabei Substitutionsgrade < 1,0 an der C2-Position erreicht.

Im Unterschied zur enzymischen Katalyse erfolgt die Steuerung der Regioselektivität über den Lösungszustand der Oligo- und Polysaccharide in einem polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in DMSO. Die Wechselwirkungen zwischen den Lösungsmittelmolekülen und den AGU-Bausteinen erhöhen die Acidität des Protons der Hydroxylgruppe in der C2-Position der AGU (J. Am. Chem. Soc. 98 (1976), 4386). Mit Hilfe eines geeigneten Salzes als Katalysator kann nun eine vollständige Veresterung dieser Position durchgeführt werden, wobei entweder eine kinetische Reaktionskontrolle oder eine Kontrolle über die Art und die Menge des Katalysators möglich ist (Tab. 3). Das Salz liegt üblicherweise in einer Konzentration von 1-10 Gew.-%, bevorzugt 2-5 Gew.-%, bezogen auf das Edukt vor.

Tab. 3: Abhängigkeit der Regioselektivität der Acetylierung von Stärke (Hylon VII) mit Vinylacetat (2,3 Molequivalente) von Reaktionszeit sowie Typ und Menge des Katalysators

Das Verfahren führt zu hohen Produktausbeuten, wobei der partielle Substitutionsgrad definiert eingestellt werden kann. Geeignete Lösungsmittel zur Durchführung dieses Verfahrens sind Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N- Dimethylformamid (DMF) sowie N,N-Dimethylacetamid (DMA).

Das Verfahren kann auf Polysaccharide, wie vorzugsweise Stärke mit unterschiedlichen Amylosegehalt und Molekulargewichten, Stärkederivate, wie Hydroxyethylstärke oder Hydroxypropylstärke, Pullulan und Pullulanderivate und Oligosaccharide, wie Cyclodextrine, angewand werden.

Als Katalysatoren eignen sich anorganische Mineralsäuresalze, Carbonsäuresalze sowie Carbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle. Geeignete Salze sind vorzugsweise Na₂HPO₄, CaHPO₄, Na₂CO₃, MgCO₃ (NH₄Cl)₂CO₃, Na₂SO₂, NH₄Cl, NaBr, NaCl oder LiCl sowie Natriumcitrat. Um die Veresterung an anderen Hydroxylgruppen, z. B. in der C₃- oder C₆-Position zu unterdrücken, darf beim Einsatz der Salze von schwachen Säuren als Katalysatoren nur maximal 10 Mol%, bezogen auf die umzusetzende Masse an Oligo- oder Polysaccharid eingesetzt werden und gleichzeitig muß eine definierte Reaktionszeit eingehalten werden.

Als Veresterungsreagenzien kommen vor allem Ester der allgemeinen Formel:

zum Einsatz, wobei R² beispielsweise Vinyl, Trihalogenethyl oder Alkyl sein kann. Beispiele für R¹ sind Alkyl mit 2-18 C-Atomen, gesättigt, umgesättigt, geradkettig, verzweigt oder zyklisch (gegebenenfalls substituiert, und Aryl (gegebenenfalls substituiert). Beim Einsatz von Alkensäureestern können die Doppelbindungen noch zur Polymerisation genutzt werden, um Netzwerkstrukturen aufzubauen. Diese Möglichkeit besteht auch bei Nutzung von Dicarbonsäuredieestern mit dem Rest R², wie z. B. Adipinsäuredivinylester, wobei im speziellen Polysaccharide einheitlich vernetzt werden können.

Weitere Veresterungsreagenzien sind Carbonsäureanhydride, beispielsweise Acetanhydrid, Propionsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Itakonsäureanhydrid, sowie reaktive Lactone, beispielsweise Propiolacton und α-Angelicalacton. Im Falle von Carbonsäureanhydriden kann die Substitution außer an der C2-Position auch an der C6-Position der AGU erfolgen.

N-Isopropylidenverbindung der allgemeinen Formel:

sind gleichfalls als Veresterungsreagenzien einsetzbar, wobei die entsprechenden Kohlensäureester der Oligo- und Polysaccharide entstehen. Beispiele für R¹ sind Alkyl mit 2-18 C-Atomen, gesättigt, ungesättigt, geradkettig, verzweigt oder zyklisch (gegebenenfalls substituiert, und Aryl (gegebenenfalls substituiert).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass Oligo- oder Polysaccharide mit aktiven Estern in polaren organischen Lösungsmittel - vorzugsweise DMSO - unter Anwendung von Salzen zur Katalyse regioselektiv an der Hydroxylgruppe der Position C2 der Anhydroglucoseeinheit acyliert werden. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 20°C und 100°C, vorzugsweise im Bereich von 30°C und 50°C. Die Reaktionszeiten liegen zwischen 0,5 und 100 h, abhängig von er Reaktionstemperatur und vom eingesetzten Katalysator. Die Katalysatorabtrennung erfolgt durch Flüssig-Fest-Trennung (z. B. Zentrifugation, Filtration). Alternativ kann auch dem Fällungsmittel eine definierte Menge Wasser zugegeben werden, um den Katalysator herauszulösen. Der entstehende Ester wird durch Ausfällen isoliert, gewaschen und getrocknet. Die anfallenden Lösungsmittel sind destillativ aufarbeitbar und anschließend dem Veresterungsprozeß wieder zuführbar.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich ein partieller Substitutionsgrad an der C2-Position der AGU von bis zu DS = 1,0, wahlweise über die Reaktionskinetik oder die eingesetzten Molequivalente Umesterungsreagenz einstellen.

Der Nachweis der Regioselektivität erfolgte mittels zweidimensionaler NMR Spektroskopie. Hierfür muß das acylierte Polysaccharid vollständig propionyliert, im Fall von Acetaten, oder acetyliert, im Fall von anderen Polysaccaharidestern, werden. Mittels Mehrfachbindungskorrelation (HMBC-Technik, Carbohydr. Res 224 (1992), 277-283), kann auf diese Weise der Substitutionsort zweifelfrei nachgewiesen werden.

Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Produkte, wie z. B. Stärke acetate, sind durch Amylasen abbaubar. Bei geeignetem Molekulargewicht der Stärke und streng regioselektiver Substitution an der C2-Position eignen sich Stärke acetate als Blutplasmaexpander. Für diese Anwendung besonders geeignet ist 2-0- Acetylstärke. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung von 2-0-Acetylstärke als Blutplasma-Expander. Darüberhinaus können aus Stärke acylaten bioabbaubare Kunststoffe aufgebaut werden. Durch Vernetzungsprozesse lassen sich Membranen weitgehend einheitlicher Struktur aufbauen. Bei weiterer Derivatisierung könnten auch Absorber für verschiedenste Anwendungen entstehen. Stärkeacylate mit thermoplastischen Eigenschaften sind in der Pharmaindustrie zum Einsatz als Wirkstoffretarda denkbar.

Regioselektiv substituierte Cyclodextrinester können in der pharmazeutischen Industrie als Carrier für Pharmawirkstoffe eingesetzt werden. Desweiteren können hochmolekulare Verbindungen, im Sinne von Copolymeren, aufgebaut werden, die sich zur Chromatographie (z. B. Enantiomerentrennung) eignen könnten.

Beispiele Beispiel 1

40 g Stärke (Hylon VII, hochamylosehaltige, native Maisstärke, Fa. National Starch & Chemical) werden in 2 l DMSO auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen werden 54 ml Vinylacetat und 750 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease-Aktivität durch Lösen in Phosphat-Puffer (pH = 7,8; c = 0,15 M) und anschließende Lyophilisierung, dadurch beträgt die tatsächlich einge wogene Enzymmenge 1,5 g) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C ge schüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. Die 2-O-Acetylstärke wird abgesaugt, gewaschen und abschließend im Vakuum ge trocknet.

Man erhält 46 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 1,0.

Beispiel 2

40 g Stärke (Hylon VII) werden in 2 l DM50 auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Dann werden 54 ml Vinylacetat und 750 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Proteaseaktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 20 h bei 80°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. die 20-Acetylstärke wird abgesaugt, gewaschen und ab schließend im Vakuum getrocknet.

Man erhält 46 g einer 2-O-Acetylstärke mit einem DS von 1,0.

Beispiel 3

2 g b-Cyclodextrin (Fa. Fluka) werden in 20 ml DMSO gelöst, und anschließend 2,7 ml Vinylacetat und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease-Aktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat eingeengt, ausgefällt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,1 g Heptakis-2-O-acetyl-b-cyclodextrin.

Beispiel 4

2 g b-Cyclodextrin werden in 20 ml DMF gelöst, und anschließend 2,7 ml Vinyl acetat und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease- Aktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat eingeengt, ausgefällt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,1 g Heptakis-2-O- acetyl-b-cyclodextrin.

Beispiel 5

2 g Stärke (Hylon VII) werden in 40 ml DMSO auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen werden 12,5 g 2,2,2-Trichlorethylacetat und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease-Aktivität siehe Bei spiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. Die 2-O-Acetyl stärke wird abgesaugt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,0 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 0,4.

Beispiel 6

2 g Stärke (Hylon VII) werden in 40 ml DMSO auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen werden 1,9 g N-Isopropyliden-O-methyl-carbonat und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease-Aktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. Das Stärkederivat wird abgesaugt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet.

Man erhält 2,0 g 2-O-Methoxycarbonylstärke mit einem DS = 0,4.

Beispiel 7

2 g Stärke (Hylon VII) werden in 40 ml DMSO auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen werden 2,7 ml Vinylacetat und 37 mg Thermolysin (Herstellung der Protease-Aktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. Die Acetylstärke wird abgesaugt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet.

Man erhält 2,4 g 2,6-O-Diacetylstärke mit einem DS = 1,0 an der C2-Position und DS = 0,4 an der C6-Position.

Beispiel 8

2 g Stärke (Hylon VII) werden in 40 ml DMSO auf 80°C erhitzt, bis eine klare Lösung entsteht. Nach Abkühlen werden 2,7 ml Acetanhydrid und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease-Aktivität siehe Bei spiel 1) zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 39°C geschüttelt. Nach Ab zentrifugieren des Enzyms wird das klare Zentrifugat ausgefällt. Die Acetylstärke wird abgesaugt, gewaschen und abschließend im Vakuum getrocknet.

Man erhält 2 g Acetylstärke mit einem DS = 0,7 an der C2- und C6-Position der AGU.

Beispiel 9

0,3 g enzymatisch hergestelltes Stärkeacetat (Beispiel 1) wird in 5 ml Pyridin suspendiert. Zu dieser Suspension werden 0,1 g Dimethylaminopyridin (DMAP) und 5 ml Propionsäureanhydrid gegeben. Es wird 20 h bei 90°C gerührt. Das propiony lierte Stärkeacetat wird in Ethanol ausgefällt, intensiv mit Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Man erhält eine vollständig substituierte 2-O-Acetyl-3,6-O-Dipropionyl-stärke.

Das getrocknete Produkt enthält keine OH-Valenzschwingungen im IR-Bereich 3200-3600 cm^-1 und ist Chloroform löslich, woraus sich folgende NMR-Daten ergeben:
AGU: d = 5,22(H1), 4,72(H2), 5,36(H3), 3,91-3,95(H4, H5), 4,53(H6), 4,24(H6')
Propionyl an Pos. 6: d = 1,18(CH₃), 2,45(CH₂)
Propionyl an Pos. 3: d = 1,05(CH₃), 2,20(CH₂)
Acetyl an Pos. 2: d = 1,98(CH₃)
(Bruker DRX 400 NMR-Spektrometer, 323 K)

Beispiel 10

2 g in N-Methylmorpholin-N-oxid (NMMNO) gelöste Cellulose wird bei einer Temperatur von T = 80-90°C mit DMSO (Volumenverhältnis: VDMSO : VNMMO/1 : 1) verdünnt. Anschließend werden zur Celluloselösung 2,7 ml Vinylacetat und 37 mg Proteinase N von Bacillus subtilis (Herstellung der Protease- Aktivität siehe Beispiel 1) zugegeben. Diese Mischung wird bei einer Temperatur von T = 80°C über einen Zeitraum von 24 h geschüttelt. Nachdem in warmen Wasser ausgefällt wurde, wird mehrfach mit Wasser gewaschen und das Produkt ab schließend im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,2 g Acetylcellulose mit einem DS von 0,3.

Beispiel 11

106 g Stärke (Hylon VII, hochamylosehaltige, native Maisstärke, Fa. National Starch & Chemical) werden in 1 l DMSO bei 80°C gelöst. Nach Abkühlen auf 40°C werden langsam 140 ml Vinylacetat und 5 g Na₂HPO₄ zugegeben. Die Mischung wird 70 h gerührt und das unlösliche Na₂HPO₄ abzentrifugiert. Nach Ausfällung des Produktes in Ethanol wird abgesaugt, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 116 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 1,0.

Beispiel 12

106 g Stärke (Hylon VII, hochamylosehaltige, native Maisstärke, Fa. National Starch & Chemical) werden in 1 l MDSO bei 80°C gelöst. Nach Abkühlen auf 40°C werden langsam 63 ml Vinylacetat und 5 g Na₂HPO₄ zugegeben. Die Mischung wird 70 h gerührt und das unlösliche Na₂HPO₄ abzentrifugiert. Nach Ausfällung des Produktes in Ethanol wird abgesaugt, gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Man erhält 102 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 0,7.

Beispiel 13

2 g β-Cyclodextrin (Fa. Fluka) werden in 20 ml DMSO gelöst und anschließend 2,7 ml Vinylacetat und 20 mg Na₂HPO₄ zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 40°C gerührt. Nach Abzentrifugieren des anorganischen Salzes wird das Zentrifugat eingeengt, in Ethanol ausgefällt, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,1 g Heptakis-2-O-Acetylstärke.

Beispiel 14

2 g Dextrin 20 (Fa. Fluka) werden in 40 ml DMF bei 80°C gelöst und anschließend 2,7 ml Vinylacetat und 20 mg Na₂HPO₄ zugegeben. Die Mischung wird 70 h bei 40°C gerührt. Nach Abzentrifugieren des anorganischen Salzes wird in Ethanol ausgefällt, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2 g 2-O-Acetyldextrin 20 mit einem DS = 1,0.

Beispiel 15

2 g Stärke/Hylon VII, hochamylosehaltige, native Maisstärke, Fa. National Starch & Chemical) werden in 40 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach Abkühlen auf 40°C werden langsam 2,7 ml Vinylacetat und 20 mg Nacl zugegeben. Die Mischung wird 70 h gerührt und das unlösliche NaCl abzentrifugiert. Nach Ausfällung des Produktes in Ethanol wird abgesaugt, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,1 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 1,0.

Beispiel 16

2 g Stärke (Hylon VII, hochamylosehaltige, native Maisstärke, Fa. National Starch & Chemical) werden in 40 ml DMSO bei 80°C gelöst. Nach Abkühlen auf 40°C werden langsam 2,7 ml Vinylacetat und 20 mg Na₂CO₃ zugegeben. Die Mischung wird 70 h gerührt und das unlösliche NaCl anzentrifugiert. Nach Ausfällung des Produktes in Ethanol wird abgesaugt, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2,1 g 2-O-Acetylstärke mit einem DS = 1,0.

Claims

1. Regioselektiv substituierte Oligo- und Polysaccharidester mit einem partiellen durchschnittlichen Substitutionsgrad DS an der C2-Position der Anhydro glucoseeinheit (AGU) des Oligo- oder Polysaccharids bezogen auf den Gesamt-DS von mindestens 90%.

2. Oligo- und Polysaccharidester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich den bei Oligo- und Polysaccharidestern um Stärke oder Stärkederivate handelt.

3. Oligo- und Polysaccharidester nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um 2-O-Propionylstärke, 2-O-Butyrylstärke, 2-O-Benzoylstärke, 2-O- Laurylstärke, 2-O-Methoxycarbonylstärke, 2-0-Acrylolylstärke, 2-O- Methacrylolylstärke oder 2-O-Acetylstärke handelt.

4. Oligo- und Polysaccharidester nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Oligo- und Polysaccharidestern um Cellulose oder Cellulosederivate handelt.

5. Verfahren zur Herstellung von regioselektiv an der C2-Position substituierten Oligo- und Polysaccharidestern, dadurch gekennzeichnet, daß die Veresterung am gelöstem oder hochgequollenen Oligo- oder Polysaccharid enzym katalysiert erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Oligo- oder Polysaccharide Stärke aus verschiedenen natürlichen Quellen mit unterschied lichstem Amylosegehalt und Molekulargewicht, Stärkederivate, Cellulose, Cellulosederivate, Pullulan oder Pullulanderivate, eingesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme Proteasen, insbesondere Proteinase N, Subtilisin, Protease 2A, Protease 6, a-Chymotrypsin, Rennin, Papain, Thermolysin, oder Esterasen eingesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem organischen Lösungsmittel ausgewählt aus Dimethylsulfoxid (DMSO), N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMA), Pyridin, N-Morpholin-N-oxid (NMMO) oder Mischungen dieser Lösungs mittel durchgeführt wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymkomponente nach Durchführung der Veresterung isoliert und wieder im Verfahren eingesetzt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß daß als Veresterungsreagenzien Vinylester, insbesondere Vinylacetat, Vinyl propionat, Vinyllaurat, Vinylbutanoat, Vinylstearat, Vinylbenzoat, Vinyl acrylat, Vinylmethacrylat, Vinylcrotonat, Vinylpivalat, Divinyladipat, einge setzt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Veresterungsreagenzien Carbonsäureanhydride, insbesondere Acetanhy drid, Propionsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Itakonsäureanhydrid, oder Trihalogenethylester oder Lactone, insbesondere Propiolacton und Butylrolacton, a-Angelicalacton oder O-substituierte N-Isopropyliden- carbonate, N-Isopropyliden-O-methyl-carbonat, insbesondere N-Isopropyli den-O-ethyl-carbonat, N-Isopropyliden-O-benzyl-carbonat eingesetzt werden.

12. Verfahren zur Herstellung von regioselektiv an der C2-Position veresterter Oligo- und Polysaccharide, dadurch gekennzeichnet, dass der Substitutiongsgrad < 1,0 ist und die Veresterung an im organischen Lösungsmittels gelöstem oder hochgequollenem Oligo- oder Polysaccharid salzkatalysiert durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung in Gegenwart eines Salzes aus der Gruppe Na₂HPO₄, Na₂CO₃, MgCO₃, (NH₄)₂CO₃, NH₄Cl, NaCl, NaBr, LiCl, Natriumcitrat durchgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz in einer Konzentration von 1-10 Gew.-%, bezogen auf das Edukt, vorliegt.

15. Verwendung von Estern gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung von Mischderivaten mit regioseleektiver Substituentenverteilung durch gezielte Folgereaktionen.

16. Verwendung von 2-O-Acetylstärke nach Anspruch 3 als Blutplasma- Expander.