DE19938703A1

DE19938703A1 - Verfahren zur Herstellung und Extraktion von Proteinen

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Publication number: DE19938703A1
Application number: DE19938703A
Authority: DE
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Mucos Pharma GmbH and Co
Priority date: 1999-08-14
Filing date: 1999-08-14
Publication date: 2001-03-01

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Extraktion von Proteinen, das sich dadurch auszeichnet, daß der pH-Wert der Fermentationslösung und des Extraktionssystems gleich sind. Ferner betrifft die Erfindung Proteine, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt sind sowie deren Verwendung in der Analytik, Medizin, Pharmazie oder Lebensmittelindustrie.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung und Extraktion von Proteinen.

Proteine finden heute eine breite Anwendung in der Medizin, Pharmazie oder der Lebensmittelindustrie. Oftmals ist ihre Gewinnung nur durch zeitaufwendige und kostenintensive Verfahren möglich, beispielsweise durch die Isolierung der gewünschten Produkte aus großen Mengen an tierischen oder menschlichen Zellen. In vielen Fällen sind die Ausbeuten dabei im Vergleich zu dem erforderlichen Aufwand vergleichsweise gering. Die Herstellung und Gewinnung solcher Proteine im großtechnischen Maßstab ist daher wünschenswert.

Für die biotechnologische Herstellung von Proteinen mit Mikroorganismen sind zahlreiche Beispiele bekannt. Auch zur fermentativen Herstellung rekombinanter Proteine sind bereits geeignete Systeme zahlreich beschrieben, beispielsweise bei Cregg, J. M. et al., Dev. Ind. Microbiol., 1988, 29: 33-41 oder Sreekrishna, K. et al., Gene, 1997, 190: 55-62.

Ein Beispiel für ein geeignetes Expressionssystem zur Produktion von rekombinanten Proteinen stellt die methylotrophe Hefe Pichia pastoris dar.

So beschreiben EP 0 510 678, EP 0510 693 und US 5,330,901 Beispiele zur Expression von HSA (human serum albumin) mit Pichia pastoris. US 5,002,876 offenbart die Produktion von hTNF (human tumor necrosis factor). US 5,324,639 beschreibt die Herstellung von ILGF1 (insuline-like growth factor 1) mit Hilfe methylotropher Hefen. Eine wirtschaftliche Produktion im großtechnischen Maßstab ist bisher jedoch lediglich für das Protein HSA bekannt.

Von besonderem wirtschaftlichen Interesse ist das Protein Chymotrypsinogen (CTRB), das als inaktive Vorstufe einer pankreatischen Protease als orales Therapeutikum Anwendung findet. Bisher kann Chymotrypsinogen nur durch Isolierung aus Rinderpankreas gewonnen werden. Eine biotechnologische Produktion von humanem Chymotrypsinogen durch Fermentation ist bisher nicht offenbart.

Problematisch bei der fermentativen Herstellung von extrazellulären Proteinen sind die hohen exoproteolytischen Aktivitäten der Mikroorganismen. Auch Pichia pastoris weist eine hohe exoproteolytische Aktivität auf, die selbst bei der Verwendung von Protease A-negtiven Stämmen zu nicht unerheblichen Verlusten bei der Ausbeute führt.

Nachteilig, insbesondere für die Isolierung des gewünschten Produkts, ist die an die fermentative Produktion gekoppelte Bildung hoher Biofeuchtmassekonzentrationen, die z. T mehr als 30% an der gesamten Kulturlösung ausmachen können. Dies erfordert eine Abtrennung der hohen Feststoffanteile von der die sekretierten Proteine enthaltenden Kulturlösung. Dies stellt jedoch ein Problem dar, da klassische mechanische Trennoperationen, wie beispielsweise Filtration oder Zentrifugation aufgrund des mangelhaften Sedimentationsverhaltens der Zellen und der damit verbundenen hohen Produktverluste ausscheiden.

DE 26 39 129 beschreibt ein flüssig-flüssig-Extraktionsverfahren zur Abtrennung von Enzymen von Zelltrümmern oder Zellen. Allgemein beruhen Zweiphasensysteme auf der Unverträglichkeit zweier Polymere oder einem Polymer und einem geeigneten Salz in wässriger Lösung. Die sich beim Überschreiten der Grenzkonzentrationen ausbildenden zwei Phasen weisen einen hohen Wassergehalt von ca. 65-90% auf. Dadurch ist eine schonende Verteilung der Proteine gewährleistet. Die Verteilung von Proteinen in einem solchen Zweiphasensystem ist dabei von verschiedenen Faktoren, wie Art der Polymere und Salze, Molekulargewicht und Molekulargewichtsverteilung, pH-Wert, Art und Konzentration der zugesetzten Salze, Temperatur etc., abhängig (Kula M.-R. et al., 1999, Protein purification, aqueous liquid extraction in: Encyclopedia of bioprocess technology, Flickinger, M. C. et al., John Wiley & Sons, New York: 2179-2191).

EP 477 284 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von natürlich produziertem Chymosin, das aus den Mägen von Kälbern, Rindern, Ziegen oder Schweinen isoliert wird und das bei der Käseherstellung eingesetzt wird. Eine biotechnologische Herstellung des Chymosins mit Hilfe von Mikroorganismen ist in diesem Patent nicht beschrieben. Vielmehr wird hier ein Zweiphasensystem offenbart, das vor allem auf eine Trennung des Chymosins aus einem wässrigen Gemisch, das zusätzlich Pepsin enthält, abgestimmt ist.

Die beschriebenen Verfahren zur Extraktion von Enzymen aus wässrigen Systemen sind vorrangig auf die Bedürfnisse des Produktes abgestimmt. Demgegenüber ist die Fermentation von Proteinen in der Regel auf den eingesetzten Mikroorganismus und seine Bedürfnisse sowie eine hohe Produktausbeute ausgerichtet. Bei der Überführung der Fermentationslösung in das Extraktionssystem ergibt sich somit eine Reihe von Problemen.

Neben erheblich unterschiedlichen Anforderungen an den pH-Wert oder die Temperatur in den zuvor beschriebenen Systemen stellt vor allem die Aufarbeitung hoher Biomassekonzentrationen ein gravierendes Problem dar.

Zusätzlich ist vor allem die weitere Isolierung des Zielproteins aus der Produktphase häufig mit Problemen behaftet. Hier müssen oftmals weitere Extraktionsschritte oder eine Ultra-/Diafiltration durchgeführt werden, bevor eine weitere Reinigung z. B. mittels chromatographischer Methoden erfolgen kann. Dies hat zur Folge, daß beim Übergang von der Fermentation zur Feinreinigung des Zielproteins über die Extraktion hinaus zusätzliche Arbeitsschritte erforderlich werden. Diese sind z. T. kostenintensiv und infolge der benötigten Hilfsstoffe umweltbelastend und können zudem nicht unerhebliche Produktverluste nach sich ziehen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung und zur Extraktion von Proteinen zur Verfügung zu stellen, das die genannten Nachteile nicht mehr aufweist.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß der pH-Wert der Fermentationslösung und des Extraktionssystems gleich sind. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß Fermentation und Extraktion übergangslos, also ohne zusätzliche Verfahrensschritte miteinander kombiniert sind. Ein wesentlicher Vorteil der Extraktion ist hierbei ferner, daß diese in einem wässrigen Zweiphasensystem erfolgt und die erhaltene Produktphase dabei so beschaffen ist, daß auch sie ohne weitere Zwischenschritte direkt weiter aufgereinigt werden kann. Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden somit apparatetechnisch entscheidende Vereinfachungen erreicht.

Erfindungsgemäß zeichnet sich das Verfahren dadurch aus, daß sowohl die Produktion der Proteine als auch deren Extraktion bei einem pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,5 erfolgt. Bevorzugt ist ein pH-Wert zwischen 2,8 und 3,2. Besonders bevorzugt pH 3.

Erfindungswesentlich ist hierbei, daß durch die Fermentation bei niedrigen pH- Werten eine nahezu titrationsfreie Überführung der Fermentationslösung in ein wässriges Zweiphasensystem möglich ist. Überraschenderweise kann ferner durch die Erniedrigung des pH-Wertes, insbesondere in der Produktionsphase der Fermentation, eine deutlich gesteigerte Nettoproduktivität erreicht werden.

Erfindungsgemäß ist die Extraktion dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der extrazellulären Proteine von der zeilhaltigen Fermentationslösung in einem wässrigen Zwei-Phasensystem erfolgt.

Hierbei kann die Trennung der Phasen durch Sedimentation im Erdschwerefeld erfolgen oder durch Zentrifugation beschleunigt werden.

Erfindungswesentlich ist dabei, daß die Verteilung der Feststoffe in der einen Phase, also eine Abtrennung von der Fermentationslösung, bei gleichzeitiger Anreicherung des Zielproduktes in der entgegengesetzten, zellfreien, Phase erfolgt.

Erfindungsgemäß erfolgt die Extraktion bei Temperaturen zwischen 16°C und 30°C, bevorzugt zwischen 24°C und 26°C, besonders bevorzugt bei 25°C.

Als erfindungsgemäß wässriges Zweiphasensystem wird eine Zusammensetzung aus einem Polymer und anorganischen Salzen eingesetzt.

Bevorzugt wird als Polymer eine Substanz aus der Gruppe Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol oder Polyvinylpyrrolidone eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Polyethylenglykole. Als anorganische Salze werden erfindungsgemäß bevorzugt Sulfatsalze eingesetzt. Besonders bevorzugt ist Natriumsulfat.

Dabei enthält das erfindungsgemäß wässrige Zweiphasensystem 6 bis 10 Gew.-% an Natriumsulfat. Bevorzugt sind 10 Gew.-% Natriumsulfat. Besonders bevorzugt sind 9,5 Gew.-% an Natriumsulfat.

Darüber hinaus enthält das wässrige Zweiphasensystem erfindungsgemäß 15 bis 30 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 400-6000 g/mol. Bevorzugt ist ein Molekulargewicht zwischen 400-4000 g/mol. Besonders bevorzugt ist ein Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 400 g/mol.

Ferner enthält das wässrige Zweiphasensystem erfindungsgemäß 60 bis 79 Gew.-% Fermentationslösung mit einem Biofeuchtmasseanteil im Bereich von 10 bis 80%. Bevorzugt ist ein Biofeuchtmasseanteil von 40 bis 70%, besonders bevorzugt von 50 bis 65%.

Bei der Extraktion in dem erfindungsgemäßen wässrigen Zweiphasensystem sammeln sich die Zellen, Zellbruchstücke und Proteinverunreinigungen in der Unterphase, während das Zielprodukt in der Polymer-haltigen Oberphase angereichert wird.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die bei dieser Extraktion gewonnene Oberphase nahezu zellfrei ist, und somit direkt, also ohne weitere Reineigungsschritte, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation, auf einen Ionenaustauscher gegeben werden kann. D. h., mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird in einem einzigen Arbeitsschritt eine fest-flüssig Trennung der unbehandelten Fermentationslösung bei gleichzeitiger Anreicherung des Zielproduktes erreicht. Zeit- und kostenintensive Mehrschritt-Aufarbeitungsverfahren zur Zell- und Produktabtrennung entfallen vorteilhafterweise.

Als Trägermaterialen für die sich an die Extraktion anschließende Chromatographie eignen sich Ionenaustauscherharze. Besonders bevorzugt sind hier Kationenaustauscher mit makroporöser Struktur, die mit Flüssigkeiten erhöhter Viskosität beaufschlagt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Proteinen und deren anschließende Extraktion zeichnen sich erfindungsgemäß durch die folgenden Verfahrensschritte aus:

a) Die Fermentation zur Produktion der Proteine erfolgt bei einem pH-Wert im Bereich von zwischen 2,5 und 4,5, vorzugsweise zwischen 2,8 bis 3,2 und besonders bevorzugt bei pH 3,
b) anschließend wird die Fermentationslösung mit den Komponenten des Zwei-Phasensystems bei einem pH-Wert in den unter a) genannten Bereichen gemischt,
c) das Gemisch zur Ausbildung der zwei Phasen auf eine Temperatur im Bereich zwischen 16°C und 30°C, bevorzugt zwischen 24°C und 26°C und besonders bevorzugt bei 25°C temperiert,
d) nach der Ausbildung der zwei Phasen werden diese getrennt,
e) die Oberphase wird gegebenenfalls verdünnt,
f) anschließend wird die Oberphase direkt auf ein geeignetes Chromatographie-Trägermaterial, vorzugsweise einen Ionenaustauscher, aufgebracht und
g) nach erfolgter Adsorbtion werden die gewünschten Proteine mit geeigneten Elutionsmitteln eluiert und
h) abschließend wird das Eluat durch Diafiltration und/oder Lyophilisation aufgearbeitet.

Erfindungsgemäß wird die abgetrennte zellfreie Oberphase des vollständig getrennten Zweiphasensystems zur weiteren Aufarbeitung mit Wasser im Verhältnis 1 : 2 bzw. 1 : 3 verdünnt. Denkbar ist auch eine stärkere Verdünnung bis zu einem Verhältnis von 1 : 10. Gegebenenfalls wird der pH auf einen Wert in den zuvor genannten Bereichen, z. B. mit Salzsäure nachjustiert. Die Verdünnung der Oberphase, die das gewünschte Zielprodukt enthält ist notwendig, um die Kapazität des Chromatographie-Trägermaterials vollständig ausnutzen zu können.

Als Trägermaterial für die Chromatographie sind alle Materialien denkbar, die eine effiziente Adsorption des gewünschten Zielproduktes erlauben. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Ionenaustauscherharze und hierbei insbesondere Kationenaustauscherharze mit makroporöser Struktur, die mit Flüssigkeiten erhöhter Viskosität beaufschlagt werden können. Höchst bevorzugt sind Sepharose Big Beads (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Diese können vorzugsweise als Säule gepackt, also im Festbett eingesetzt werden.

Erfindungsgemäß werden bei der vorliegenden Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen Mikroorganismen eingesetzt, deren Zellen bei den zuvor genannten erfindungsgemäßen pH-Werten stabil sind.

Vorzugsweise werden hier zur Fermentation von hCTRB Hefen oder hefeartig wachsende Pilze und besonders bevorzugt methylotrophe Hefen eingesetzt. Unter den methylotrophen Hefen finden bevorzugt Hefen der Gattung Pichia Einsatz. Besonders bevorzugt wird zur Fermentation die Hefe Pichia pastoris eingesetzt. In besonderen Ausführungsvarianten der vorliegenden Erfindung können Protease-A- defiziente, Protease-B-defiziente oder zweifach Protease-defiziente Produktionsstämme von Pichia pastoris eingesetzt werden.

Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Expressionssystemen handelt es sich um Genkonstrukte die nach gängigen Methoden des Standes der Technik hergestellt und in die entsprechenden Mikroorganismen übertragen werden können. Die Kombination von Expressionssystem und Produktionsstamm ist erfindungsgemäß frei wählbar und ermöglicht dadurch Freiheiten bei der fermentativen Prozeßführung oder hinsichtlich des einsetzbaren Substratspektrums.

Erfindungsgemäß kann die Expression der Zielprodukte bei Wachstum auf Glukose ausgehend von dem konstitutiv exprimierten Promoter pGAP (Waterham H. R. et al., Gene, 186, 1997: 37-44) erfolgen. Hier sollte die Anpassung des pH-Wertes an die Aufarbeitungsbedingungen, also pH 3, gegen Ende der Fermentation erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante erfolgt die Expression des/r für das gewünschte Zielprodukt kodierenden Gene bei Wachstum auf Methanol ausgehend von dem induzierbaren Promoter pAOX (Cregg, J. M. et al., 1988, Dev. Ind. Microbiol., 29: 33-41). Hierbei kann der Einsatz zusätzlicher Substrate oder Induktoren sinnvoll sein. Beispielhaft sind hier Zucker, mit Ausnahme von Glukose, ein- oder mehrwertige Alkohole, insbesondere Glyzerin, Zuckeralkohole, organische Säuren, insbesondere Fettsäuren und deren Ester sowie Aminosäuren und Peptide zu nennen. Allerdings sollte gewährleistet sein, daß diese in solch geringen Konzentrationen vorliegen, daß sie das Zellwachstum nicht inhibieren. Die Kultivierung kann in konventionellen Rührkesselsystemen, Umwurfsystemen oder Blasensäulen erfolgen und als Batch-Fermentation oder in kontinuierlicher Kultur betrieben werden.

Ferner bezieht sich die Erfindung auf Proteine, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden können. Bevorzugt sind hierbei Proteasen und deren Zymogene (inaktive Vorstufen). Besonders bevorzugt sind Serinproteasen und deren Zymogene. Höchst bevorzugt sind gastrointestinale Enzyme und hierbei vor allem humanes Chymotrypsinogen.

Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung der zuvor genannten Proteine.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Proteine in Bereichen der Analytik oder zum kontrollierten Abbau von Proteinen. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine zur Herstellung von Therapeutika, insbesondere im Rahmen der oralen Enzymtherapie, Nahrungs- oder Lebensmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.

Unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel wird die vorliegende Erfindung näher erläutert ohne diese jedoch zu limitieren:

1. Herstellung eines rekombinanten Hefestamms von Pichia pastoris

Der Akzeptorstamm Pichia pastoris GS 115 (Invitrogen Corp., San Diego, Californien) wird nach gängigen Methoden mit dem Shuttlevektor pHiIS1 (Invitrogen Corp., San Diego, Californien) transformiert. Dieser Shuttlevektor enthält das Chymotrypsinogen-B-Gen aus Menschen (Fa. Mucos-Pharma GmbH & Co, Geretsried) unter Kontrolle des induzierbaren Promotors pAOX (Cregg, J. M. et al., 1988, Dev. Ind. Microbiol. 29: 33-41). Ferner trägt dieser Vektor die Sekretionssequenz der sauren Phosphatase aus Saccharomyces cerevisiae, die eine Sekretion des exprimierten humanen Chymotrypsinogens in die Fermentationslösung ermöglicht.

2. Fermentation der rekombinanten Hefe Pichia pastoris zur Herstellung von humanem Chymotrypsinogen

Die Anzucht des rekombinanten Hefestamms Pichia pastoris GS 115:pHiIS1-hCTRB erfolgt auf Mineralsalzmedium mit Glycerin als Kohlenstoffquelle (Tab. 1). Der anfängliche pH-Wert in der Wachstumsphase wird durch Zusatz an wässriger Ammoniaklösung auf pH 5 eingestellt. Durch Zugabe von Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wird die Expression des hCTRB ausgehend von dem Promotor pAOX induziert. In dieser Produktionsphase liegt der pH-Wert bei 3 oder wird ggf. durch Zudosierung an Ammoniaklösung auf pH 3 justiert. Die Fermentation erfolgt nach einem konventionellen Zulaufverfahren bei 25°C über einen Zeitraum zwischen 80 und 120 Stunden.

Tab. 1

Zusammensetzung des Mineralsalzmediums zur Kultivierung der rekombinanten Hefe Pichia pastoris

Von der Spurensalz-Lösung werden 8 ml/l Mineralsalzmedium eingesetzt. Außerdem enthält das Mineralsalzmedium 1,6 mg/l D(+)-Biotin (Vitamin H).

3. Extraktionsverfahren

Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf Gewichtsprozente [w/w].

3.1. Ansatz des wässrigen Zweiphasensystems

25,3 kg Fermentationslösung (enthaltend 12,65 g hCTRB) mit einer Biofeuchtmasse von 50% [v/v] werden mit 10% Na₂SO₄ und 20% Polyethylenglykol, mit einem Molekulargewicht von 400 g/mol (PEG 400) unter starkem Rühren vermischt. Das Gemisch wird auf 25°C temperiert. Nach einer Rührdauer von 2 Stunden erfolgt innerhalb von 1,5 Stunden die vollständige Trennung des wässrigen Zweiphasensystems in einem Absetztank. Zellen und Zellbruchstücke sowie Proteinverunreinigungen sammeln sich in der Unterphase. Das hCTRB wird quantitativ in der PEG-haltigen Oberphase angereichert. Von der Oberphase werden 14,13 l abgezogen und zur Kationenaustauscher-Chromatographie eingesetzt.

3.2. Kationenaustauscher Chromatographie

Eine Säule wird mit 2 Liter SP-Sepharose Big Beads befüllt und mit 20 mM Na- Citratpuffer, pH 3 equilibriert. Die hCTRB enthaltenden Oberphase (9,54 g hCTRB; Ausbeute 75%) wird im Verhältnis 1 : 2 mit Wasser verdünnt. Der Auftrag der verdünnten Oberphase erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 300 cm/h. Anschließend wird die Säule mit 20 mM Na-Citratpuffer, pH 3 gewaschen. Die Elution des hCTRB erfolgt durch die Zugabe von 20 mM Na-Citratpuffer + 0,6 M NaCl. Es werden 11 Liter Eluat (7,07 g hCTRB; Ausbeute 55%) erhalten. Die Säule wird mit 2 M NaCl regeneriert.

3.3. Diafiltration und Lyophilisation

Die Diafiltration und Lyophilisation erfolgt nach bekannten Methoden gemäß dem Stand der Technik. Hierbei wird das Eluat bis zu einer Leitfähigkeit von 0,5 mS bei 20°C entsalzt. Das Retentatvolumen beträgt 2 Liter. Nach der Einengung des Retentatvolumens durch Lyophilisation liegt das hCTRB in fester und lagerfähiger Form vor. Es werden 7,18 g hCTRB erhalten. Dies entspricht einer Ausbeute von 56% bezogen auf den hCTRB-Gehalt in der Fermentationslösung. Es wird ein Reinheitsgehalt von über 90% erreicht.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen durch Fermentation und anschließende Extraktion dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Fermentationslösung und des Extraktionssystems gleich sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 2,5 und 4,5 liegt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert zwischen 2,8 und 3,2 liegt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei etwa 3 liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion in einem wässrigen Zwei-Phasensystem erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verteilung der Feststoffe in einer Phase bei gleichzeitiger Anreicherung des Zielproduktes in der entgegengesetzten, zellfreien Phase erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei Temperaturen zwischen 16°C und 30°C erfolgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei Temperaturen zwischen 24°C und 26°C erfolgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei 25°C erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fermentation Mikroorganismen eingesetzt werden, deren Zellen bei pH- Werten gemäß Anspruch 2-4 stabil sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fermentation Hefen, bevorzugt methylotrophe Hefen oder hefeartig wachsende Pilze eingesetzt werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fermentation methylotrophe Hefen der Gattung Picha eingesetzt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fermentation Pichia pastoris eingesetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß als wässriges Zwei-Phasensystem eine Zusammensetzung aus einem Polymer und anorganischen Salzen eingesetzt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymer eine Substanz aus der Gruppe Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Methoxypolyethylenglykol oder Polyvinylpyrrolidone eingesetzt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß als anorganische Salze Sulfatsalze, vorzugsweise Natriumsulfat eingesetzt werden/wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Zwei-Phasensystem 6-10 Gew.-%, bevorzugt 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 9,5 Gew.-% Natrium-Sulfat enthält.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Zwei-Phasensystem 15 bis 30 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht im Bereich von 400 bis 6000 g/mol, bevorzugt 400 bis 4000 g/mol, besonders bevorzugt 400 g/mol enthält.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das wässrige Zwei-Phasensystem 60 bis 79 Gew.-% Fermentationslösung mit einem Biofeuchtmasseanteil im Bereich von 10 bis 80%, bevorzugt 40 bis 70%, besonders bevorzugt 50 bis 65% enthält.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die bei der Extraktion gewonnene Oberphase direkt und ohne weitere Reinigungsschritte auf einen Ionenaustauscher gegeben wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß

a) die Fermentation zur Produktion der Proteine bei einem pH-Wert im Bereich von zwischen 2,5 und 4,5, vorzugsweise zwischen 2,8 bis 3,2 und besonders bevorzugt bei pH 3 erfolgt,
b) anschließend die Fermentationslösung mit den Komponenten des Zwei- Phasensystems bei einem pH-Wert in den unter a) genannten Bereichen gemischt wird,
c) das Gemisch zur Ausbildung der zwei Phasen auf eine Temperatur im Bereich zwischen 16°C und 30°C, bevorzugt zwischen 24°C und 26°C und besonders bevorzugt bei 25°C temperiert wird,
d) nach der Ausbildung der zwei Phasen diese getrennt werden,
e) die Oberphase ggf. verdünnt wird,
f) anschließend die Oberphase direkt auf ein geeignetes Chromatographie- Trägermaterial, vorzugsweise einen Ionenaustauscher, aufgebracht wird und
g) nach erfolgter Adsorption die gewünschten Proteine mit geeigneten Elutionsmitteln eluiert werden und
h) abschließend das Eluat durch Diafiltration und/oder Lyophilisation aufgearbeitet wird.

22. Proteine dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 hergestellt sind.

23. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung von Proteasen und deren Zymogene, bevorzugt von Serinproteasen und deren Zymogenen, besonders bevorzugt von gastrointestinalen Enzymen und höchst bevorzugt von humanem Chymotrypsinogen.

24. Verwendung der Proteine hergestellt gemäß einem Verfahren nach Anspruch 1 bis 21 in Bereichen der Analytik, des kontrollierten Abbaus von Proteinen oder zur Herstellung von Therapeutika, bevorzugt im Rahmen der oralen Enzymtherapie, Nahrungs- bzw. Lebensmitteln oder Nahrungsergänzungsmitteln.