DE19928073A1

DE19928073A1 - Transkonjugationsplasmid für die Mutagenese von Pasteurellaceae

Info

Publication number: DE19928073A1
Application number: DE1999128073
Authority: DE
Inventors: Gerald-F Gerlach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-14
Filing date: 1999-06-14
Publication date: 2000-12-21
Anticipated expiration: 2019-06-15
Also published as: DE19928073B4

Abstract

Es wird ein Transkonjugationsplasmid, das die Einführung von unmarkierten Mutationen in das Chromosom von Bakterien der Familie Pasteurellaceae ermöglicht, zur Verfügung gestellt. Die Erfindung stellt darüber hinaus eine einfache Methode zum Einbau unmarkierter Deletionen in das Chromosom von Bakterien der Familie Pasteurellaceae zur Verfügung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Transkonjugationsplasmid zur Mutage nese von Bakterien der Familie Pasteurellaceae. Genauer gesagt handelt es sich um ein Transkonjugationsplasmid für die Einführung unmarkierter Dele tionen in diese Bakterien.

Actinobacillus (A.) pleuropneumoniae, ein Bakterium aus der Familie der Pa steurellaceae, ist ein hoch infektiöser Krankheitserreger im Respirationstrakt von Schweinen, der weltweit zu erheblichen ökonomischen Verlusten führt (Sebunya und Saunders 1983: Haemophilus pleuropneumoniae infection in swine: a review. J. Am. Vet. Med. Assoc. 182: 1331-1337; Fenwick und Hen ry 1994: Porcine pleuropneumonia. J. Am. Vet. Med. Assoc. 204: 1224-1340). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind 12 Serotypen, (basierend auf Po lysaccharidantigenen) identifiziert (Perry et al. 1990: Structural characteri stics of the antigenic capsular polysaccharides and lipopolysaccharides in volved in the serological classification of Actinobacillus pleuropneumoniae strains. Serodiag. Immunother. Infect Dis. 4: 299-308). Die auf den Seroty pen basierende Differenzierung korreliert mit Ergebnissen, die sowohl durch Untersuchungen zur elektrophoretischen Mobilität von Äußere- Membranproteinen und Enzymen (Multilokusenzymelektrophorese; Musser et al. 1987: Clonal diversity in Haemophilus pleuropneumoniae. Infect. Im mun. 55: 1207-1215), als auch durch Toxintypisierung (Frey et al. 1995: De velopment of an efficient PCR method for toxin typing of Actinobacillus pleu ropneumoniae strains. Mol. Cell. Probes 9: 277-282) und Analyse der Ver wandschaftsbeziehungen aufgrund von Restriktionsenzympolymorphismen (Chevallier et al. 1998: Chromosome sizes and phylogenetic relationships between serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae. FEMS Microbiol. Lett. 160: 209-216) erzielt wurden.

Eine Impfung gegen A. pleuropneumoniae schützt erfolgreich gegen die kli nische Erkrankung. Konventionelle Vakzinen sind jedoch in ihrer protektiven Wirkung auf den Serotyp, der für die Bakterin-Produktion eingesetzt wurde, beschränkt und verhindern darüber hinaus nicht eine Besiedlung durch den Erreger (Nielsen 1974: Pleuropneumonia of swine caused by Haemophilus pleuropneumoniae. Studies on the protection obtained by vaccination. Nord. Vet. Med. 28: 337-338; Rosendal et al. 1981: Vaccination against pleurop neumonia in pigs caused by Haemophilus pleuropneumoniae. Can. Vet. J. 22: 34-35; Higgins et al. 1985: Evaluation of a killed vaccine against porcine pleuropneumonia due to Haemophilus pleuropneumoniae. Can. Vet. J. 26: 86-89). Im Gegensatz dazu sind Tiere, die eine natürliche oder experimen telle Infektion mit einem A. pleuropneumoniae-Serotyp überstanden haben, unabhängig vom jeweiligen Serotyp vor klinischen Symptomen geschützt (Nielsen 1984: Haemophilus pleuropneumoniae serotypes - cross protection experiments. Nord. Vet. Med. 36: 221-234; Prideaux et al. 1999: Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of Actinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the APXII operon. Infect. Immun. 67: 1962-1966), obwohl eine Besiedlung mit heterologen Serotypen noch durchaus möglich ist (Cruijsen et al. 1995: Convalescent pigs are protected completely against infection with a homolo gous Actinobacillus pleuropneumoniae strain but incompletely against a he terologous serotype strain. Infect. Immun. 63: 2341-2343). In neueren Ar beiten wurde gezeigt, daß eine Kreuzprotektion auch durch Impfung mit ei ner attenuierten Lebendvakzine zu erreichen ist (Prideaux et al. 1999: Vac cination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of Actinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the APXII operon. Infect. Immun. 67: 1962-1966).

US 5,801,018 offenbart Vakzinen gegen Actinobacillus pleuropneumoniae. Die Vakzinen enthalten zumindest ein Transferrin-bindendes Protein und/ oder ein Zytolysin von Acfinobacillus pleuropneumoniae und/oder einen Actinobacillus pleuropneumoniae APP4. Darüberhinaus werden die für diese Proteine kodierende DNA-Sequenzen, die Vektoren, die diese Sequenzen beinhalten, sowie die Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert sind, offenbart. Die Vakzinen können zur Behandlung oder zur Vorbeugung von respiratorischen Infektionen bei Schweinen eingesetzt werden.

US 5,429,818 beschreibt unbekapselte Mutanten von normal bekapselten Actinobacillus pleuropneumoniae Stämmen im Einsatz als Impfstoff. Im Be sonderen ist eine unbekapselte Mutante von Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae beschrieben, die vor der Pleuropneumonie beim Schwei ne schützt.

Bereits beschriebene Methoden für die Actinobacillus pleuropneumoniae- Mutagenese beschränkten sich auf die Insertions-Knockout-Mutagenese (Jansen et al. 1995: Knockout mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 that are devoid of RTX toxins do not activate or kill porcine neu trophils. Infect. Immun. 63: 27-37; Fuller et al. 1996: A riboflavin auxotroph of Actinobacillus pleuropneumoniae is attenuated in swine. Infect. Immun. 64: 4659-4664; Prideaux et al. 1999: Vaccination and protection of pigs against pleuropneumonia with a vaccine strain of Actinobacillus pleuropneumoniae produced by site-specific mutagenesis of the APXII operon. Infect. Immun. 67: 1962-1966) oder Transposon-Shuttle-Mutagenese-Techniken (Tascon et al. 1993: Transposon mutagenesis in Actinobacillus pleuropneumoniae with a Tn10 derivative. J. Bact 175: 5717-5722; Tascon-Cabrero et al. 1997: Actinobacillus pleuropneumoniae does not require urease activity to produce acute swine pleuropneumonia. FEMS Microbiot Lett. 148: 53-57). Darüber hinaus stehen keine selektierbaren Marker für den Gebrauch dieses Bakteri ums zur Verfügung. Es ist daher wünschenswert, attenuierte und phänoty pisch unterscheidbare Mutanten ohne Antibiotika-Marker als Kandidaten impfstoffe zu entwickeln. Die Gegenselektion mit Hilfe des sacB-Gens von Bacillus subtilis ist bei einer Reihe von gramnegativen Bakterien erfolgreich etabliert (Reyrat et al. 1998: Counterselectable markers: Untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect. Immun. 66: 4011-4017).

Aufgabe der vorgelegten Erfindung ist es daher, ein einfaches und effektives genetisches Werkzeug zur Einführung unmarkierter Deletionen in das Chro mosom von Bakterien der Familie Pasteurellaceae und hierbei im Besonde ren der Gattung Actinobacillus zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird durch ein Transkonjugationsplasmid gelöst, welches aus einer mobilisierenden Region mobRP4, einem Polylinker, einem Replikon des Col E1 Typs, einem resistenzvermittelnden Gen und einer transkriptio nellen Fusion zwischen dem Bacillus subtilis-sacB-Gen und dem omlA- Promotor von Actinobacillus pleuropneumoniae besteht. Zur einfacheren Be schreibung der vorgelegten Erfindung wird das genannte Plasmid als pBMK1 bezeichnet.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekenn zeichnet, daß ein Segment exogener DNA in den Polylinker des Plasmids eingesetzt wurde. Dieses Segment exogener DNA beinhaltet z. B. ein modifi ziertes Actinobacillus pleuropneumoniae-ureC-Gen in dem beschriebenen Polylinker.

Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein einfaches und effektives Verfahren zur Einfügung unmarkierter Deletionen in das Chromo som von Bakterien der Familie Pasteurellaceae und hierbei im besonderen der Gattung Actinobacillus zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zur Mutagenese von Bakterien der Familie Pasteurellaceae gelöst, welche erfin dungsgemäß die Schritte der Transkonjugation des Plasmids von einem Escherichia coli-Mobilisierungsstamm in den zu mutagenisierenden Bakteri enstamm aus der Familie Pasteurellaceae umfaßt sowie die positive Selekti on oder das Screening auf Auxotrophie des Pasteurellaceae-Stamms, wel cher das transkonjugierte Plasmid stabil im Chromosom integriert hat, als auch mittels Gegenselektion mit Saccharose und Screening des Saccharo se-resistenten Stamms auf einen Stamm, welcher eine unmarkierte Deletion an der entsprechenden Stelle des Chromosoms besitzt.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß dieses Plasmid pBMKΔ1 ist. Dieser Vektor kann z. B. als ein positives Testsystem für das erfinderische Verfahren verwendet werden. In einer wei teren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gehören die zu mutierenden Bakterien zu der Gattung Actinobacillus. Am meisten bevor zugt ist ein Stamm von Actinobacillus pleuropneumoniae.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen gekennzeichnet.

Um ein universelles System zur Einführung unmarkierter Mutationen in Actinobacillus pleuropneumoniae zur Verfügung zu stellen, wurde der Vektor pBMK1 konstruiert. Für den Einsatz dieses Vektors sind Transkonjuganten notwendig, die stabile Plasmidkointegrate enthalten und basierend auf ihrer Antibiotikaresistenz selektiert sind. Die folgende Gegenselektion benötigt nur ein einziges Crossover-Ereignis um eine unmarkierte Deletionsmutante her vorzubringen. Dieses erfindungsgemäße System erleichtert die effektive Einführung einer unmarkierten uret-Deletion in das Genom von Actinob acillus pleuropneumoniae. Im Prinzip ermöglicht es auch die konsekutive Einführung von verschiedenen unmarkierten Mutationen. Dieses System er leichtert die Konstruktion einer nicht attenuierten Actinobacillus pleuropneumoniae-Lebendvakzine, die, um zusätzlich einen bestimmbaren und leicht detektierbaren Phänotyp zu besitzen, eine Differenzierung zwi schen geimpften und infizierten Tieren möglich macht.

Um ein erfindungsgemäßes Transkonjugationsplasmid zur Verfügung zu stellen, wurde eine transkriptionelle Fusion zwischen dem Actinobacillus pleuropneumoniae omlA-Promotor und dem Bacillus subtilis sacB-Gen durchgeführt. Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß ein Esche richia coli-Actinobacillus pleuropneumoniae-Shuttlevektor, der dieses Kon strukt beinhaltet, in Anwesenheit von 10% Saccharose effektiv aus den Actinobacillus pleuropneumoniae-Transformanten kuriert werden konnte. Dieses bedeutet, daß sacB als gegenselektiver Marker in Actinobacillus pleuropneumoniae benutzt werden kann, während in der Literatur beschrie ben ist, daß dieses bei Pasteurella (P.) multocida, ebenfalls ein Angehöriger der Familie Pasteurellaceae, nicht der Fall ist (Jost et al. 1997: The sacB- gene cannot be used as a counter-selective marker in Pasteurella multocida. Mol. Biofechnol. 8: 189-191).

Überraschenderweise konnte gezeigt werden, daß die Methode, basierend auf einer transkriptionellen Fusion zwischen dem sacB-Gen und dem Actin obacillus pleuropneumonia-omlA-Promotor einschließlich einer nachfolgen den positiven und negativen Selektion, dazu benutzt werden kann, unmar kierte Knockout-Mutanten in Actinobacillus pleuropneumoniae, einem Ange hörigen der Familie Pasteurellaceae, zu konstruieren.

Die Erfindung wird durch die folgende detaillierte Beschreibung der vorlie genden Erfindung, im Zusammenhang mit den angefügten Ansprüchen, der Beschreibung und den beiliegenden Figuren, besser verständlich, worin:

Fig. 1 die physikalische Karte des im Rahmen der Erfindung konstruierten Plasmids zeigt. Die Konstruktion der Plasmide pJUK04, pJUOK14 und pJUOK27 erforderte einige zwischengeschaltete Klonierungsschritte. Kurz gesagt, ein BamHI-PstI-Fragment (welches das sacB-Gen enthält) wurde in die BamHI-PstI-Schnittstelle des pBluescript-SK-Vektor ligiert; dann wurde das PstI-Fragment aus pUC4K (welches die Kanamycin-Resistenz (km^r) trägt) in die PstI-Schnittstelle ligiert und ergab damit das Plasmid pSB5. Schließlich wurde der omlA-Promotor mittels PCR unter Einsatz der Primer olp1B und olp2 amplifiziert, das PCR-Produkt mit BamHI und BglII geschnit ten und in die einzige BamHI-Schnittstelle in beiden Orientierungen ligiert, was im Plasmid pSOP12 (Gegenrichtung) und pSOP15 (transkriptionelle Fusion) resultierte. Danach wurde die ureC-sacB-km^r-Kassette konstruiert. Kurz gesagt, das ureC-Gen wurde mittels PCR unter Einsatz der Primer ureC2 und ureX amplifiziert, das PCR-Produkt mit BamHI und SalI ge schnitten und in einen mit BamHI und SalI geschnittenen pBluescript-SK- Vektor ligiert. Danach wurde das Sphl-BstEII-Fragment aus dem ligierten ureC-Gen entfernt, die Enzymschnittstellen wurden stumpfendig gemacht und ein stumpfendig gemachtes Xbal-SalI-Fragment, das die sacB-km^r- Kassette aus pSB5, pSOP12 oder pSOP15 enthielt, wurde eingefügt. Aus diesen pBluescript-Derivaten wurde die ureC-sacB-km^r-Kassette auf einem stumpfendig gemachten ApaI-SacI-Fragment liegend und in die stumpfendig gemachte ClaI-Schnittstellen von pJFF244 ligiert, was zu den Plasmiden pJUK04, pJUOK14 und pJUOK27 führte. Die Plasmide pRUOK23 und pRUOK29 enthalten dasselbe ApaI-SacI-Fragments, wie es in pJUOK27 vorhanden ist; es wurde in beiden Orientierungen in die stumpfendig ge machte EcoRI-Schnittstelle von pBOR8 ligiert. Die Konstruktion des Plas mids pBMK1 benötigte ebenfalls einige zwischengeschaltete Klonierungs schritte. Die sacB-km^r-Kassette wurde von pSOP15 auf einem SacI-SalI- Fragment liegend entfernt, stumpfendig gemacht, und in die stumpfendig gemachte EcoRI-Schnittstelle von pBOR8 kloniert, was zu dem Plasmid pROKB1 führte. Ein BamHI-Fragment aus pBOR, (welches mobRP4 enthält) wurde stumpfendig gemacht und in den SacI-geschnittenen und stumpfendig gemachten pBluescript-SK ligiert, wodurch der Vektor pBluescript-RP4 ent stand. Danach wurde ein stumpfendig gemachtes BamHI-SacI-Fragment aus pROKB1 (welches die sacB-km^r-Kassette enthält) in eine stumpfendig ge machte KpnI-Schnittstelle von pBluescript-RP4 ligiert und somit das pBMK1 konstruiert. Die mit "C" markierten offenen Kästen und die Pfeile bezeichnen die Position und Orientierung der ureC-Sequenz. Der mit sacB und km^r be zeichnete offene Pfeil bezeichnet den Ort und die Orientierung des sacB- Gens und der Kanamycin-Resistenz vermittelten Determinanten. Die gefüll ten Pfeilspitze an dem einen Ende des sacB-Gens markiert den Ort und die Orientierung des omlA-Promotors (omlA-P). Die nur einmal vorkommenden Restriktionsenzym-Schnittstellen in pBMK1 sind mit einem Stern markiert.

Fig. 2 zeigt die Resultate des Plasmid-"curing"-Experiments mit Actinobacil lus pleuropneumoniae AP76 Transformanten, die in PPLO-Bouillon ohne (a, b) und mit (c, d) Saccharose angezüchtet wurden. Die Transformanten wur den auf PPLO-Agarplatten ohne (a, c) und mit (b, d) Kanamycinselektion ausplattiert. Die gefüllten Symbole zeigen die arithmetischen Mittel aus vier unabhängigen Experimenten, die Balken dokumentieren die Standardabwei chung.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung der einzelnen Crossover- Ereignisse, die zu Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 41 (unmarkiert ureasenegativ) führten. Die gefüllten Kästen am intakten ureC-Gen weisen auf die vorhandene Sequenz; die offenen Kästen weisen auf das Teilstück, welches in ureC deletiert wurde. Die unterbrochene Linie markiert die ho mologen Rekombinationsereignisse.

Fig. 4 zeigt die PCR-Analyse von Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 (1), AP76 41 (2) und der Negativkontrolle (3). (A) PCR mit den Primern ureC2 und ureX; (B) Southern Blot-Analyse mit BstEII- und SphI-verdauter DNA unter Benutzung des ureC-Gens als Sonde; (C) Pulsfeldgelelektropho rese von ApaI, AscI und NotI-verdauter DNA; die weiße Pfeilspitze markiert das Apal-Fragment, auf dem ureC-Gen kartiert werden konnte.

Basierend auf den Ergebnissen des Plasmid-"curing"-Experiments wurde der Konstruktion einer unmarkierten, ureasenegativen Mutante nachgegangen.

Das ureG-Gen wurde als geeignetes Ziel ausgewählt, da ureasenegative Mutanten sehr schnell aufgrund ihres Phänotyps identifiziert werden können. Dieses erschien nicht nur vorteilhaft, um die Mutageneseprozedur zu etablie ren, sondern auch der Verlust der Ureaseaktivität ist ein exzellenter phäno typischer Marker für bekannte attenuierte Actinobacillus pleuropneumoniae- Lebendimpfstoffe, die durch chemische Mutagenese gewonnen wurden (Inzana et al. 1993: Safety, stability and efficacy of noncapsulated mutants of Actinobacillus pleuropneumoniae for use in live vaccines. Infect. Immun. 61: 1682-1686; Byrd und Hooke 1997: Temperature-sensitive mutants of Actin obacillus pleuropneumoniae induce protection in mice. Infect. Immun. 65: 2206-2210); so ist die überwiegende Mehrheit der klinischen Actinobacillus pleuropneumoniae-Isolate ureasepositiv und das Fehlen der Ureaseaktivität beeinflußt die Virulenz von Actinobacillus pleuropneumoniae nicht (Tascon- Cabrero et al. 1997: Actinobacillus pleuropneumoniae does not require urea se activity to produce acute swine pleuropneumonia. FEMS Microbiol Lett. 148: 53-57).

Der ursprüngliche Ansatz, eine unmarkierte ureC-Mutante zu konstruieren, basierte auf dem für Actinobacillus pleuropneumoniae beschriebenen ge richteten Mutagenesesystem (Mulks und Buysse 1995: A targeted mutage nesis system for Actinobacillus pleuropneumoniae. Gene 165: 61-66). Die Transkonjugationsvektoren pRUOK23 und pRUOK29 trugen die sacB-km^r- Kassette im ureC-Gen und spiegelten so die allgemeinen Eigenschaften der Plasmide wider, die zuvor für die Einführung unmarkierter Mutationen in an dere Bakterien genutzt worden sind (Blomfield et al. 1991: Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature- sensitive pSC101 replicon. Mol. Microbiol. 5: 1447-1457; Copass et al. 1997: Introduction of unmarked mutations in the Helicobacter pylori vacA gene with a sucrose sensitivity marker. Infect. Immun. 65: 1949-1952). Dieser Ansatz setzt eine initiale doppelte Crossover-Rekombination voraus, wie auch einen zweiten Transkonjugationsschritt vor der Gegenselektion. Unser vergebli ches Bemühen eine einzige ureasenegative, kanamycinresistente und sac charosesensitive Actinobacillus pleuropneumoniae-Serotyp 7-Mutante zu erhalten, weist auf eine niedrige Rekombinationsaktivität hin.

Beispiel 1 B. subtilis sacB-Genvermitteltes Plasmid-"curing" in Actinobacillus pleuropneumoniae

Das klinische Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 7 Isolat AP76 wurde mit den als pJUKO4, pJUOK14 und pJUOK27 bezeichneten Plasmiden elektrotransformiert (Fig. 1). Alle drei Plasmide basieren auf dem Shuttle vektor pJFF224, einem Plasmid mit einer niedrigen Kopieanzahl ("Low copy plasmid"), das sich in Actinobacillus pleuropneumoniae repliziert (Frey 1992: Consturction of a broad range shuttle vector for gene cloning and expression in Actionobacillus pleuropneumoniae and other Pasteurellaceae. Res. Micro biol. 143: 263-269). Alle Plasmide trugen eine Kassette, die das sacB-Gen von B. subtilis (Gay et al. 1983: Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase of Bacillus subtilis: expression of the gene in Escherichia coli. J. Bacteriol. 153: 1424-1431), sowie die im ureC-Gen von Actinobacillus pleuropneumoniae lokalisierte, von Tn903 stammende Ka namycinresistenz-Determinante (km^r) enthält (Bosse und McInnes 1997). Der einzige Unterschied zwischen den Plasmiden war die Anwesenheit und Orientierung des von Actinobacillus pleuropneumoniae stammenden omlA- Promotors (Gerlach et al. 1993: Molecular characterization of a protective outer membrane protein (OmlA) from Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1. Infect. Immun. 61: 565-572; Fig. 1; Tabelle 1). Um die Effizienz des Plasmid-"curing" bei der transkriptionellen Fusion zwischen dem sacB- Genprodukt und dem omlA-Promotor zu überprüfen, wurden die Actinob acillus pleuropneumoniae-Transformanten in Flüssigkultur mit und ohne Zu satz von 10% Saccharose angezüchtet und anschließend auf Platten mit und ohne Kanamycin ausplattiert (Fig. 2). Die Gesamtzahl koloniebildender Ein heiten (KbE) blieb über einen Inkubationszeitraum von 4 Stunden konstant bei ca. 5 × 10⁷ KbE/ml, unabhängig von der Anwesenheit von 10% Saccha rose (Fig. 2a, c). Während dieser Inkubationszeit konnte eine Abnahme der plasmidenthaltenen Zellen sogar in Abwesenheit von Saccharose beobach tet werden, da die Anzahl der kanamycinresistenten (km^r) koloniebildenden Einheiten von 1 × 10⁷ KbE/ml auf 1 × 10⁵ KbE/ml absank (Fig. 2b). In Anwe senheit von Saccharose nahm die Anzahl plasmidtragenden Bakterienzellen signifikant von 1 × 10⁷ KbE/ml auf unter 40 KbE/ml innerhalb von 60 Minuten bei den Transformanten ab, die die transkriptionelle sacB-omlA-Promotorfu sion beinhalteten. Im Gegensatz dazu wurde kein erhöhter Plasmidverlust während dieser Zeit bei Bakterien beobachtet, die sacB ohne transkriptio nelle Fusion mit dem Actinobacillus pleuropneumoniae-omlA-Promotor ent hielten (Fig. 2d).

Diese Resultate zeigen, daß Plasmide, die eine transkriptionelle Fusion zwi schen dem sacB-Gen und dem omlA-Promotor tragen, als Suizid-Vektor in Actinobacillus pleuropneumoniae verwendet werden können.

Beispiel 2 Konstruktion einer unmarkierten ureasenegativen Actinobacillus pleuropneumoniae "Knockout"-Mutante

Die ureC-km^r-sacB-Kassette von pJUOK27 wurde in beiden Orientierungen in pBOR8 (Herrero et al. 1990: Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 172: 6557-6567) klo niert und ergab pRUOK23 und pRUOK29 (Fig. 1). Beide Plasmide wurden in Actinobacillus pleuropneumoniae AP 76 mittels E. coli ß2155 als Spender stamm (Dehio und Meyer 1997: Maintenance of broad-host-range incompa tibility group P and group Q plasmids and transposition of Tn5 in Bartonella hensalae following conjugal plasmid transfer from Escherichia coli. J. Bacte riol. 179: 538-540) transkonjugiert. Obwohl insgesamt mehr als 500 km^r Actinobacillus pleuropneumoniae Transkonjuganten untersucht wurden, wurden keine ureasenegativen Transkonjuganten erhalten. Da aber Doppel- Crossover-Mutanten für die nachfolgende Gegenselektion erforderlich sind (Blomfield et al. 1991: Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon, Mol. Micro biol. 5: 1447-1457; Copass et al. 1997: Introduction of unmarked mutations in the Helicobacter pylori vacA gene with a sucrose sensitivity marker. Infect. Immun. 65: 1949-1952), wurde diese Methode als ungeeignet bewertet.

Dahingegen wurde ein weiterer Ansatz verfolgt, der nicht zwei aufeinander folgende, Doppel-Crossover-Mutationsereignisse erfordert, sondern basie rend auf zwei aufeinanderfolgenden Einzel-Crossover-Mutationen funktio niert (Fig. 3). Der Vektor pBMK1 (Tabelle 1; Fig. 1) wurde konstruiert und das ureC-Gen mit einer internen 870 bp-Deletion (ureC) neben die km^r- sacB-Kassette ligiert. Das entstehende Plasmid wurde als pBMKU1 be zeichnet (Tabelle 1, Fig. 1) und in Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 transkonjugiert. Zwischen zehn und zwanzig Transkonjuganten konnten pro Versuchsansatz erreicht werden und alle Km^r-Transkonjuganten waren ureasepositiv; 20% waren saccharosesensitiv und enthielten Plasmidkointe grate. Bei der Gegenselektion mit Saccharose waren 5% der saccharosere sistenten Kolonien auch ureasenegativ. Fünf dieser Kolonien aus unabhän gigen Experimenten enthielten alle identische Doppel-Crossover-Mutationen ohne Fremd-DNA, was durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Southern Blot bestätigt werden konnte (Fig. 4a, b). Für eine dieser als Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 41 bezeichneten Mutanten konnte in der Pulsfeld gelelektrophorese nachgewiesen werden, daß keine größeren Deletionen oder chromosomale Rearrangements stattgefunden haben (Fig. 4c). Zusätz lich ergab die Nukleotidsequenzanalyse eine identische ureC-Sequenz in pBMKU 1 und in Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 41, was beweist, daß wie erwartet eine doppelte Crossover-Mutation erfolgt ist (Fig. 3). Eine Elektrotransformation von Actinobacillus pleuropneumoniae AP76 41 mit den Plasmiden pFOKU1 und pFOKU4 (Tabelle 1) stellt die Ureaseaktivität wieder her, wenn der intakte offene Leserahmen des ureC eine transskriptionelle Fusionseinheit mit dem Vektor abgeleiteten T4-Promotor bildet. Diese Er gebnisse zeigen, daß das Plasmid pBMK1, welches mobRP4, einen Polylin ker, die Tn903-abgeleitete Kanamycin-Determinante und eine transkriptio nelle Fusion vom B. subtilis-sacB-Gen und dem Actinobacillus pleuropneu moniae-omlA-Promotor enthält, dazu verwendet werden kann, um effizient unmarkierte Mutationen in Actinobacillus pleuropneumoniae zu konstruieren.

Die Bakterienstämme, Plasmide und Primer, die in der vorliegenden Erfin dung verwendet wurden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die E. coli-Stämme wurden in Luria-Bertani-Medium (Sambrook et al. 1989: Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour, NY) unter Zusatz der ent sprechenden Chemotherapeutika (Ampicillin 100 µg/ml; Kanamycin 50 µg/ml; Chloramphenicol 25 µg/ml) angezüchtet. Zur Kultivierung von E. coli ß2155 (dap) wurde Diaminopimelinsäure (1 mM, Sigma Chemical Company, Deisenhofen) hinzugefügt. Actinobacillus pleuropneumoniae-Stämme wur den in PPLO-Medium (Difco GmbH, Augsburg) kultiviert, das mit Nikotina middinukleotid (NAD 10 µg/ml, Merck, Darmstadt), L-Glutamin (100 µg/ml, Serva, Heidelberg), L-Cysteinhydrochlorid (260 µg/ml, Sigma), L- Cysteindihydrochlorid (10 µg/ml, Sigma) und Dextrose (1 mg/ml) supplemen tiert wurde. Für die Selektion von Actinobacillus pleuropneumoniae- Transkonjuganten wurde Kanamycin (25 µg/ml) zugesetzt. Für die Saccha rose-Gegenselektion wurde eine salzfreie Stocklösung (2×) zum Einsatz in Flüssig- und Plattenkultur hergestellt. In Kurzform beschrieben wurde Bacto Beef Heart For Infusion® (37 g/l, Difco) 1 h bei 50°C inkubiert, für 3 Minuten gekocht und filtriert, um feste Bestandteile zu entfernen. Es wurde Bacto Pepton® (7,5 g/l, Difco) hinzugegeben; die Lösung wurde auf einen pH von 7.4 eingestellt und sterilfiltriert. Vor Gebrauch wurde diese Stocklösung wie oben beschrieben angereichert, das entsprechende Antibiotikum hinzugege ben und dann mit einem gleichen Volumen 20%iger Saccharose oder zur Bereitung fester Nährböden mit 20%iger Saccharose und 3% Bacto Agar® (Difco) vermischt.

Die Ureaseaktivität wurde folgendermaßen bestimmt: Bakterienkolonien wurden auf Nitrozelluloseplättchen transferriert; diese wurden dann in leere Petrischalen überführt und mit Indikatoragarose (0.5% Agarose abgekühlt auf 50°C und angereichert mit Harnstoff (20 mg/ml) und Phenolrot (100 µg/ml)) überschichtet. Die Ureaseaktivität kennzeichnende rote Färbung entwickelte sich nach 2 bis 10 Minuten.

Zur Modifizierung der DNA wurden DNA-modifizierenden Enzyme von New England Biolabs (Bad Schwalbach) bezogen und gemäß den Herstellerin struktionen verwendet. Die DNA bzw. Plasmid-DNA wurde für den Einsatz in der PCR und im Southern Blot nach Standardprotokollen präpariert (Sambrook et al. 1989). Transformationen, Gelelektrophorese, PCR und Southern Blots wurden gemäß entsprechender Standardprozeduren durch geführt (Sambrook et al. 1989).

Die Elektrotransformation wurde mit einem Gene Pulser (BioRad, München) gemäß den Anweisungen des Herstellers, allerdings unter Zusatz von Tween 80 (0.02%, Roth, Karlsruhe), Trypton und Hefeextrakt in das Elektrotrans formationsmedium (Tung und Chow 1995), durchgeführt. DNA von E. coli ß2155 wurde auf Actinobacillus pleuropneumoniae per Filtermating-Technik nach Dehio und Meyer (1997) übertragen.

Nach der Transkonjugation wurden Km^r Actinobacillus pleuropneumoniae Kolonien auf das Vorhandensein von Crossoverereignissen in der PCR mit den Primerpaaren ureC2 und ureX (Reaktion 1) und den Primern ureC2 und kan2 (Reaktion 2, Tabelle 1) untersucht. Kolonien mit dem korrekten PCR- Profil wurden mittels Southern Blot Analyse unter Verwendung der Kanamy cin-Determinante und des ureC-Gens als Sonden bestätigt.

Für die Gegenselektion wurde das supplementierte PPLO-Medium mit 1/10 Volumen einer Übernachtkultur einer bestätigten, einzelnen Crossover- Mutante beimpft und für 2 h unter Schütteln inkubiert. Die Bakterien wurden pelletiert, auf einen saccharosehaltige Nährboden ausplattiert und über Nacht bebrütet. Saccharoseresistente Kolonien wurden auf Nitrozellulose plättchen transferriert und auf Ureaseaktivität getestet.

Ureasenegative Mutanten wurden in der PCR und im Southern Blot wie oben beschrieben analysiert. Eine zusätzliche Bestätigung wurde durch Pulsfeld gelelektrophorese (Chevailler et al. 1998: Chromosome sizes and phyloge netic relationships between serotypes of Actinobacillus pleuropneumoniae. FEMS Microbiol. Lett. 160: 209-216) unter Einsatz der Restriktionsendonu kleasen ApaI, AscI und NotI, sowie durch Nukleotidsequenzanalyse des ureC-Gens erhalten.

Claims

1. Transkonjugationsplasmid für die Einführung unmarkierter Deletionen in das Chromosom von Bakterien der Familie Pasteurellaceae, beste hend aus:

a) der Mobilisierungsregion mobRP4,
b) einem Polylinker,
c) einem Replikon des Col E1 Typs,
d) einer Resistenzdeterminante und
e) einer transskriptionellen Fusion des Bacillus subtilis sacB-Gens mit dem Actinobacillus pleuropneumoniae omlA-Promotor.

2. Plasmid gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Resi stenzdeterminante die von Tn903 stammende Kanamycin- Resistenzdeterminante ist.

3. Plasmid gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pBMK1 ist.

4. Plasmid gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, daß ein Segment exogener DNA in den Polylinker inse riert ist.

5. Plasmid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das in den Polylinker inserierte exogene DNA-Segment mutiert ist.

6. Plasmid gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Seg ment exogener DNA ein modifiziertes Actinobacillus pleuropneumoniae - ureC-Gen enthält, das in den Polylinker inseriert ist.

7. Plasmid gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pBMKU1 ist.

8. Verfahren zur Mutagenese eines Bakteriums der Familie Pasteurel laceae, umfassend die Schritte

a) einer Transkonjugation des Plasmids gemäß Anspruch 4 aus einem Escherichia coli Mobilisierungsstamm in einen zu mutagenisie renden Stamm eines Bakteriums der Familie Pasteurellaceae,
b) einer positiven Selektion oder Screening auf Auxotrophie des Pasteurellaceae Stamms, der das transkonjugierte Plasmid stabil im Chromosom integriert trägt,
c) einer Gegenselektion mit Saccharose und
d) eines Screenings der saccharoseresistenten Stämme auf einen Stamm, der eine unmarkierte Deletion an der interessierenden Stelle des Chromosoms trägt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pBMKUΔ1 ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß der zu mutagenisierende Bakterienstamm ein Actinobacillus pleuropneu moniae Stamm ist.

11. Bakterium der Familie Pasteurellaceae, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium mit dem Plasmid gemäß Anspruch 4 transformiert ist.

12. Bakterium gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium eine durch die Transformation hervorgerufene Auxotrophie enthält.

13. Bakterium gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium mit dem Plasmid pBMKUΔ1 transformiert ist.

14. Bakterium gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterium ein Stamm der Gattung Actinobacillus ist.

15. Wirtszellen, stabil transformiert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 1.

16. Wirtszellen, stabil transformiert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 3.

17. Wirtszellen, stabil transformiert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 4.

18. Kit zur Einführung unmarkierter Deletionen in das Chromosom eines Bakteriums der Familie Pasteurellaceae, welches das Plasmid gemäß Anspruch 3 enthält.

19. Kit zur Einführung unmarkierter Deletionen in das Chromosom eines Bakteriums der Familie Pasteurellaceae, welches das Plasmid gemäß Anspruch 4 enthält.

20. Kit gemäß Anspruch 18, welches weiterhin das Plasmid gemäß An spruch 4 enthält.

21. Kit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, welches weiterhin das Plasmid pJUK04 und/oder pJUOK14 und/oder pJUOK27 enthält.