DE19916417A1 - Amyloidspezifisches Aptamer - Google Patents
Amyloidspezifisches AptamerInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft amyloidspezifische Substanzen. Gelehrt wird ein gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiertes Aptamer, welches amyloid spezifisch ist, oder Allele oder Derivate eines solchen Aptamers.
Description
Die Erfindung betrifft amyloidspezifische Substanzen.
Amylolde bezeichnet im Rahmen der Erfindung unlösli
che Peptide, welche sich insbesondere im extrazellulä
ren Bereich eines Gewebes ablagern und so Plaques bil
den kännen. Mit der Amyloid-Plaquebildung gehen ver
schiedenste Krankheitsbilder einher, so beispielsweise
insbesondere Alzheimer, Spongiforme Encephalopathien
und Typ II Diabetes Mellitus. Im Falle von Alzheimer
kommt dem Amyloid βA4 besondere Bedeutung zu. Das βA4
ist ein Peptid aus 39-43 Aminosäuren mit einem Moleku
largewicht von ca. 4 kDa. βA4 ist ein Fragment des so
genannten Amyloidvorläuferproteins APP (Amyloid
Precursor Protein), welches ein Transmembran-Glycopro
tein ist. APP wird von 3 unterschiedlichen Proteasen,
den sogenannten α-, β- und γ-Sekretasen gespaltet. Im
Falle der α-Sekretasen entsteht ein lösliches APP-
Fragment mit neuroprotektiven Eigenschaften. Im Falle
der β- und γ-Sekretasen entsteht dagegen das βA4, wel
ches außerhalb der Zellen zu löslichen Plaques aggre
giert. Ähnliche Plaqueablagerungen wurden auch bei der
Parkinson-Krankheit, Chorea Huntington oder den Prion
krankheiten nachgewiesen.
Jedenfalls im Falle der Alzheimer-Krankheit beruht die
Plaquebildung letztendlich vermutlich auf Gendefekten,
in denen der APP-Metabolismus so verändert wird, daß
das βA4(1-42) und das βA4(1-40) Amyloid entstehen.
Das βA4(1-40) lagert sich bevorzugt an den bereits
gebildeten Keimen des extrem unlöslichen βA4(1-42) ab
und bildet so die eigentlichen Plaques. Die Amyloidab
lagerungen führen zu einer dauerhaften Mikrogliaakti
vierung mit der Folge chronischer Entzündungen, wo
durch auch gesunde Neuronen geschädigt werden. Aber
auch Apoptose wird vermutlich durch βA4 ausgelöst.
Apoptose führt zwangsläufig zum Schrumpfen des Ge
hirns, da Neuronen im Gegensatz zu anderen Zellen
nicht mehr nachwachsen.
Aus pharmazeutischer und medizinischer Sicht ist es
von besonderem Interesse, Substanzen zu entwickeln,
mittels welcher β-Amyloide im Körper nachgewiesen wer
den können. Denn bisher konnte die Alzheimer-Krankheit
nur durch Gespräche und Lerntests diagnostiziert wer
den, weshalb eine Therapie erst einsetzen konnte, wenn
sich die Demenz bereits bemerkbar gemacht hat und der
irreversible Abbau des Gehirns fortgeschritten ist.
Mittels Substanzen, welche an β-Amyloide binden, könn
te dem gegenüber sehr frühzeitig die Krankheit diagno
stiziert und therapiert werden, so daß der Abbau des
Gehirns verhindert oder zumindest erheblich verzögert
wird. Auch für eine Therapie ist es wichtig, Substan
zen zu finden, welche an β-Amyloide binden.
Substanzen der eingangs genannten Art sind bekannt aus
der Literaturstelle DE 197 25 619 A1. Hierbei handelt es
sich um relativ kurze Peptide, welche die Amyloidbil
dung hemmen. Nachteilig bei den insofern bekannten
Substanzen ist, das solche Peptide, insbesondere kurze
Peptide, meist eine relativ geringe Affinität für
Zielsubstanzen haben. Im Falle von kurzen Peptiden
liegen die apparenten Dissoziationskonstanten typi
scherweise im µMol-Bereich. Ebenfalls bekannt sind
monoklonale Antikörper gegen βA4, die eine Quantifi
zierung des Amyloids ermöglichen. Solche monoklonalen
Antikörper sind jedoch nur mit sehr großem Aufwand,
und zwar unter Einschluß von in-vivo Verfahrenstufen,
herstellbar und folglich vergleichsweise teuer.
Demgegenüber liegt der Erfindung das technische Pro
blem zugrunde, amyloidspezifische Substanzen zu fin
den, welche gleichzeitig hochaffin und einfach her
stellbar sind.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Er
findung ein gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabi
lisiertes Aptamer, welches amyloidspezifisch ist, oder
Allele und/oder Derivate eines solchen Aptamers. Als
Aptamere sind Nukleinsäuren bezeichnet, welche an ein
Protein als Zielmolekül binden. Dabei kann ein Aptamer
eine DNA- oder eine RNA-Struktur aufweisen. Aptamere
werden gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabili
siert durch Modifikation. Die Stabilisierung berührt
die Affinität der modifizierten Aptamere praktisch
nicht, verhindert jedoch die schnelle Zersetzung der
Aptamere in einem Organismus durch RNasen oder DNasen.
Ein Aptamer wird im Rahmen der Erfindung als stabili
siert bezeichnet, wenn die Halbwertszeit in biologi
schen Seren größer als eine Minute, vorzugsweise grö
ßer als eine Stunde, höchst vorzugsweise größer als
ein Tag ist. Demgegenüber werden beispielsweise unmo
difizierte RNA-Aptamere in Sekundenschnelle abgebaut.
Allele sind Zustandformen von Nukleinsäuren, welche
durch Mutationen ineinander überführt werden können.
Hierfür kommen in Frage: Translolcation von affinen
Teilsequenzen, Punktmutation innerhalb oder außerhalb
einer affinen Teilsequenz, Deletion innerhalb oder
außerhalb einer affinen Teilsequenz. Derivate bezeich
net chemische Abkömmlinge, die durch Abtrennung, Ein
führung oder Austausch von Atomen oder Atomgruppen
eines oder mehrerer Nukleotide aus einer Nukleinsäure
erhalten werden. Wesentlich ist, daß auch die Derivate
und/oder Allele gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme
stabilisiert und amyloidspezifisch sind. Die Eigen
schaft des Allels oder Derivats lcann jeweils für sich
oder gleichzeitig vorliegen.
Ein erfindungsgemäßes Aptamer ist herstellbar durch
folgende Verfahrensschritte: a) es wird ein randomi
sierter DNA-Pool geschaffen, b) aus dem randomisierten
DNA-Pool wird ggf. ein RNA-Pool erzeugt und in einen
Selektionskreislauf mit folgenden Schritten aufgege
ben: c) an das Amyloid oder eine Teilsequenz des Amy
loids bindende RNA des RNA-Pools bzw. DNA des DNA-
Pools wird selektiert, d) selektierte RNA bzw. DNA
wird amplifiziert, e) die RNA bzw. DNA aus Stufe d)
wird dem RNA-Pool bzw. DNA-Pool in der Stufe c) zuge
geben, wobei die Stufen c) bis e) sooft wiederholt
werden, bis der Anteil in Stufe c) selektierter RNA
bzw. DNA um weniger als 50%, vorzugsweise weniger als
10% ansteigt. Bei diesem Verfahren handelt es sich um
ein aus anderen Zusammenhängen bekanntes in vitro Ver
fahren zur Selektion von Aptameren. Zu den Verfahrens
stufen ist im Einzelnen folgendes auszuführen. Für die
Stufe a) kann eine Nukleinsäure-Bibliothek mit großer
Komplexität erhalten werden mit chemisch-synthetisier
ten DNAs. Dazu wird mit Hilfe der automatischen Fest
plattensynthese eine randomisierte Sequenz syntheti
siert, die von 2 konstanten Primerregionen mit
beispielsweise 20 ±5 Nukleotiden flankiert wird. Die
Selektionen werden beispielsweise mit randomisierten
Bereichen zwischen 30 und 80 Nukleotiden durchgeführt.
Die beiden flankierenden konstanten Regionen dienen
dazu, einzelsträngige DNA mit Hilfe der Polymerase-
Ketten-Reaktion (PCR) zu Doppelstrang-DNA zu komplet
tieren und zu vervielfältigen. Durch Einsatz von Pri
mern, die über den Hybridisierungsbereich hinausragen,
ist es möglich, die DNAs weiter zu verlängern. Dadurch
kann der Erkennungsbereich für die T7-RNA-Polymerase,
der T7-Promotor, eingeführt werden, der für die ggf.
anschließende Transkription von DNA in RNA benötigt
wird (Stufe b). Die Selektion (Stufe c) kann mit Hilfe
der Affinitätschromatographie durchgeführt werden.
Hierbei wird das Zielmolekül am Säulenmaterial immobi
lisiert, wodurch nichtbindende Aptamere abgetrennt
werden. Es kann sich hierbei empfehlen, eine Vorsäule
mit Säulenmaterial, jedoch immobilisiertes Zielmolekül
herzustellen und vorzuschalten. Hierdurch wird eine
Anreicherung von Säulenmaterial-affinen Aptameren ver
hindert. Es versteht sich, daß die Aptamere vor Aufga
be in den Selektionskreislauf gegebenenfalls renatu
riert werden, damit sie in einer reproduzierbaren Kon
formation vorliegen. Zur Ablösung von selektierten
Aptameren von der Affinitätschromatographiesäule emp
fiehlt es sich im Einzelnen die Affinitätselution zu
verwenden. Dabei wird mit in Bindungspuffern gelöstem
Zielmolekül eluiert. Eine andere Verfahrensweise ist
die reversible Immobilisierung des Zielmoleküls. So
kann das Zielmolekül z. B. über eine freie Sulfidgruppe
unter Ausbildung von Disulfidbrücken an das Säulenma
terial gekoppelt werden. Nachdem die Aptamere gebunden
haben, werden die Disulfidbrücken reduktiv gespalten,
so daß das Zielmolekül zusammen mit dem Aptamer elu
iert wird. Schließlich ist eine Elution mit einem de
naturierenden Puffer möglich. Durch Denaturierung än
dern die Aptamere ihre Konfirmation und werden vom
Zielmolekül gelöst. Dies ist auch relativ unproblema
tisch, da Aptamere, anders als Proteine, leicht rena
turierbar sind. Die Amplifikation (Stufe d) kann wie
folgt durchgeführt werden. Das selektierte Aptamer
wird gegebenfalls durch reverse Transkriptionen in DNA
umgeschrieben. In jedem Fall erfolgt die Amplifikation
mittels der gut bekannten PCR-Methode, welche hier
nicht im Detail näher erläutert werden soll. Nach der
Amplifizierung erfolgt wiederum gegebenenfalls eine
T7-Transkription zum Erhalt eines RNA-Aptamers, wel
ches dann dem RNA-Pool wieder zugeführt wird. Dieser
Vorgang wiederholt sich in Zyklen, wobei die affinen
Aptamere exponentiell angereichert werden. Die Komple
xität eines Startpools wird nach 5 Zyklen typischer
weise um den Faktor 1010-1015 reduziert. So lassen sich
Bibliotheken von 1015 und mehr unterschiedlichen Apta
meren mit geringem Arbeitsaufwand und großer Effizienz
durchsuchen. Bei einer Komplexität des Startpools von
1015 werden in der Regel 6-15 Selektionsrunden benö
tigt, um die gewünschten Aptamere anzureichern. Für
die Identifizierung der Aptamere: werden in der Stufe
d) DNAs des letzten Zyklus in Plasmide ligiert, klo
niert und sequenziert. Die ermittelten Sequenzen wer
den miteinander verglichen, um Gemeinsamkeiten in der
Primär- und Sekundärstruktur und damit die Bindungsmo
tive zu identifizieren. Auch ist es möglich, an den
vorbeschriebenen Prozeß eine in vitro Evolution anzu
schließen. Im Rahmen des vorstehenden Verfahrens sind
die RNA-Aptamere wichtigerer, ebenso können auf
entsprechende Weise selbstverständlich auch DNA-Apta
mere hergestellt werden. Es entfallen dann die
T7-Transkriptionen sowie die reverse Transkription.
Bei der Stabilisierung der Aptamere gegen Nukleinsäu
re-spaltende Enzyme kann grundsätzlich zwischen 2 An
sätzen unterschieden werden, nämlich die nachträgliche
Modifikation der Aptamere und die Selektion mit be
reits modifizierter RNA bzw. DNA. Der Vorteil der
nachträglichen Modifikation ist die Durchführung der
Selektion unter normalen Bedingungen. Dabei sollten
allerdings in der Regel nicht alle Nukleotide, sondern
nur ausgewählte Stellen der RNA bzw. DNA modifiziert
werden, damit es zu keinen unerwünschten Veränderungen
der Bindungseigenschaften kommt. Umgehen läßt sich
dieses Problem, indem man die Modifikationen schon im
Ausgangspool einführt. Es versteht sich, daß die modi
fizierten Bausteine von den während der Selektion ver
wendeten Enzyme (DNA-, RNA-Polymerasen) toleriert wer
den müssen. Im Einzelnen ist es bevorzugt, wenn die
2'Hydroxylgruppe der Zuckergruppe eines oder mehrerer
Pyrimidin-Nukleotide durch eine Flourid-, Amino- oder
Methoxygruppe substituiert ist und/oder wenn in termi
nalen Phosphatgruppen ein Sauerstoffatom durch ein
Schwefelatom substituiert ist und/oder wenn das Apta
mer ein Spiegelmer ist. In dem letzt genannten Fall
erfolgt die Selektion der Aptamere gegen ein Enantio
meres Zielmoleküls. Die insofern spiegelbildliche Nu
kleinsäure wird dann Spiegelmer genannt und bindet an
das eigentliche Zielmolekül, kann aber, als in der
Natur nicht auftretendes Molekül, von den Enzymen
nicht erkannt und daher nicht abgebaut werden. Diese
Methode läßt sich allerdings nur auf Zielmoleküle
anwenden, die nicht chiral sind und bei denen das En
antiomer erhältlich ist.
Ein erfindungsgemäßes Aptamer zeichnet sich gegenüber
Peptiden durch eine sehr hohe Affinität aus. Typi
scherweise werden apparente Dissoziationskonstanten im
Bereich unter 1 µMol, insbesondere im Bereich 1
nmMol-100 nmMol, erhalten, während kurze Peptide (< 30
Aminosäuren) typischerweise Werte im µMol-Bereich zei
gen. Vorteilhaft gegenüber monoklonalen Antikörpern
ist, daß die erfindungsgemäßen Aptamere lediglich in
vitro-Selektionsmethoden erfordern, während die Gewin
nung von monoklonalen Antikörpern den Einsatz von Ver
suchstieren oder Zellinien mit der Gefahr von uner
wünschten Variationen erfordert. Im Gegensatz zu mono
klonalen Antikörpern können Aptamere zudem chemisch
synthetisiert werden, wodurch eine hohe Reproduzier
barkeit gewährleistet ist. Auch ist der Einbau von
Reportermolekülen an genau definierten Positionen im
Rahmen der chemischen Synthese einfacher. Zudem lassen
sich Aptamere erheblich einfacher als monoklonaler
Antikörpern reversible zu denaturieren. Schließlich
ist aufgrund der in vitro Arbeitsweise die Entwicklung
von Aptameren gegen Toxine oder wenig immonogene Sub
stanzen möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
das Aptamer gegen das Alzheimer β-Amyloid 4 (1-42) oder
Teilsequenzen hiervon, insbesondere (1-40) spezifisch.
Vorzugsweise handelt es sich um ein RNA-Aptamer. Im
Falle eines gegen Alzheimer β-Amloid 4 spezifischen
erfindungsgemäßen Aptamers ist es bevorzugt, daß das
Aptamer eine Loopstruktur aufweist. Die Loopstruktur
kann insbesondere aus 4 Basen, vorzugsweise 4 Uridinen
oder 3 Uridinen und einem Cytidin bestehen oder die
genannten Basen aufweisen. Im Rahmen der Loopstruktur
ist es bevorzugt, wenn die selektierte Sequenz eine
Teilsequenz GUUU oder GUCU aufweist. Die Loopstruktur
kann dann dadurch gebildet sein, daß dieser Sequenz
gegenüberliegend eine Primersequenz AUUC liegt, wobei
die jeweilig mittleren Basen ungepaart und jeweilig
äußeren Basen gepaart sind. Im Einzelnen kann ein er
findungsgemäßes Aptamer eine Sequenz aufweisen aus der
Gruppe bestehend aus den Sequenzen gemäß Patentan
spruch 6.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines er
findungsgemäßen Aptamers oder einer Mischung solcher
Aptamere zur Herstellung eines Mittels zur Diagnose
und/oder Behandlung von Alzheimer, Spongiformen Ence
phalopathien, Typ II Diabetes Mellitus, Parkinson und
Chorea Huntington. Im Falle des Diagnosemittels emp
fiehlt es sich, in an sich bekannter Weise markierte
Atome und/oder Reportermoleküle in das Aptamer einzu
bauen. Es versteht sich, daß diese Atome bzw. diese
Moleküle hinsichtlich Art und Position so ausgewählt
und angeordnet werden, daß die Affinität des Aptamers
zum Zielmoleküls nicht oder nur geringfügig beeinflußt
wird. Der Einsatz als Mittel zur Behandlung kann bei
spielsweise eine Modifikation der Aptamere derart um
fassen, daß β-Amyloide komplexiert werden und so die
Plaquebildung verhindert wird oder bereits gebildete
Plaques abgebaut werden. Dann bewirken die Aptamere
selbst eine Komplexierung oder sind so modifiziert,
daß eine Komplexierung bewirkt wird, oder dienen als
Vermittlersubstanzen für komplexierende Wirkstoffe.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich
Ausführungsbeispielen darstellenden Experimenten näher
erläutert.
Der RNA-Pool für die Selektion wurde durch Transkription
eines synthetisierten DNA-Pools erhalten. Der DNA-Pool
wurde chemisch an der Festphase mit Hilfe eines Applied
Biosystems Syntheseautomaten (PCR-Mate EP 391 und 394)
hergestellt. Die Synthese beruht auf dem Phosphoramidit-
Verfahren (Beaucage & Caruthers, 1981) und wurde unter
Verwendung der kommerziell erhältlichen Phosphoramidite
mit dC-gekoppelten Säulenmaterial (CPG) der Porengröße
100 mm im 0,2 µmol-Maßstab durchgeführt. Die Phosphoramidi
te wurden in wasserfreiem Acetonitril gelöst (0,15 M). Die
Kopplungszeit der Amidite wurde beim Standardsynthesepro
tokoll von 15 s auf 35 s verlängert und die Abspaltung der
Trityl-Schutzgruppe zu Anfang jedes Zyklus um 20%
verkürzt.
Der DNA-Template-Strang besteht aus einem 110mer, welches
sich aus zwei flankierenden Primerregionen aus je 20 Basen
und bekannter Sequenz sowie einer randomisierten Region
von 70 Basen in der Mitte zusammensetzt. Für die Synthese
der randomisierten Region wurde ein Amiditgemisch verwen
det, bei dem die unterschiedliche Reaktovotät der Amidite
bereits berücksichtigt wurde. Das Verhältnis der 4 Amidite
DA : dG : dT betrug 3 : 2, 5 : 2, 5 : 2.
Die Abspaltung der Schutzgruppen nach beendeter Synthese
sowie die Abspaltung vom Säulematerial erfolgte in 1,5 ml
konz. Ammoniak (33%) für 24 h bei 55°C. Anschließend wurde
der Ammoniak in einer Vakuumzentrifuge abgezogen und die
DNA auf einem denaturierenden 8%-Polyacrylamidgel aufge
reinigt, durch UV-Shadowing identifiziert, aus dem Gel elu
iert und durch Ethanolfällung entsalzt (siehe 1.2)
Sequenz: 5'-d[CCA AGC TTG CAT GCC TGC AG-(N)70-GGT ACC GAG CTC GAA TTC CC]-3'.
Sequenz: 5'-d[CCA AGC TTG CAT GCC TGC AG-(N)70-GGT ACC GAG CTC GAA TTC CC]-3'.
Die Komplexität wurde ermittelt, indem die Stoffmenge an
DNA durch UV-Absortion bestimmt wurde (siehe 1.2.6). Da
die Wahrscheinlichkeit, daß zwei gleiche DNA-Sequenzen
synthetisiert wurden, extrem gering ist (470 = 1,4.1042 ver
schiedene mögliche Sequenzen), wird davon ausgegangen, daß
jede Sequenz unterschiedlich ist. Daraus folgt, daß die
Stoffmenge an DNA gleich der Poolkomplexität ist.
Da nicht jede Sequenz von der Polymerase während der PCR
vervielfältigt wird, weil eine für das Enzym ungünstige
Sequenz vorliegt bzw. nicht alle Schutzgruppen abgetrennt
wurden, wurde ein PCR-Zyklus mit radioaktiv markierten
dATP durchgeführt. Nach Abtrennung des überschüssigen
dATPs durch Ethanolfällung bzw. NAP-Säule kann durch Ce
renkovzählung bestimmt werden, wieviel radioaktiv markier
te DNA-Stränge synthetisiert wurden (siehe 1.2.7). Da die
DNA-Ausgangskonzentration bekannt war, und nur maximal
eine Kopie pro Molekül entstehen konnte, erhält man aus
dem Verhältnis Ausgangkonzentration DNA zu radioaktiv mar
kierter DNA den amplifizierbaren Anteil des hergestellten
Pools. 60% des Synthesepools konnten hierbei von der Po
lymerase kopiert werden.
Die beiden Primer für die Vervielfältigung des DNA-Pools
durch PCR wurden analog zur Synthese der DNA-Bibliothek
durchgeführt. Die Synthese wurde im 1 µmol-Maßstab nach
dem Standardprotokoll durchgeführt. Die Aufreinigung wurde
wie oben beschrieben durchgeführt. Es wurde Säulenmaterial
mit einer Porengröße von 50 nm verwendet.
Primer A: 5'-d[TAA TAC GAC TCA CIA TAG GGA ATT CGA GCT CGG TAC C]-3'
Primer B: 5'-d[CCA AGC TTG CAT GGC TGC AG]-3'
Primer A: 5'-d[TAA TAC GAC TCA CIA TAG GGA ATT CGA GCT CGG TAC C]-3'
Primer B: 5'-d[CCA AGC TTG CAT GGC TGC AG]-3'
Die gängigste Methode zur Aufreinigung von Nukleinsäuren
ist die Gelelektrophorese. Sie beruht auf der Wanderung
der geladenen Moleküle in einem elektrischen Feld. Man
arbeitet hier bei einem pH-Wert von ca. 8,5 an dem die
Nukleinsäuren als Polyanion vorliegen und zur positiv ge
ladenen Anode wandern. Dabei macht man sich die von der
Länge abhängige Mobilität der Nukleinsäure in einer Gelma
trix zunutze. Als Gelmatrix werden am häufigsten Agarose
und Polyacrylamid verwendet. Während man mit Agarosegelen
die Nukleinsäuren unter nativen Bedingungen auftrennt,
kann mit Polyacrylamidgelen sowohl unter nativen als auch
durch Zusatz von Harnstoff unter denaturierenden Bedingun
gen aufgetrennt werden. Agarosegele werden in der Regel
bei Molekülgrößen von 100-20000 Basenpaaren verwendet,
Polyacrylamidgele bei Molekülgrößen bis 500 Basen.
Bei der Polyacrylamidgelektrophorese (PAGE) wird die Gel
matrix durch radikalische Polymerisation von Acrylamid mit
N,N'-Methylenbis(acrylamid) als Quervernetzer hergestellt.
Als Polymerisationsstarter dient Ammonlumperoxodisulfat
(APS) und N,N,N',N-Tetramethylethylendiamin (TEMED) als
Radikalstabilisator. Die Porengröfte des Gels kann durch
die Konzentration der Monomere sowie der Konzentration des
Vernetzers eingestellt werden.
Bei der Trennung von einzelsträngigen Nukleinsäuren arbei
tet man unter denaturierenden Bedingungen, um die Ausbil
dung von Sekundär-Tertiärstrukturen, die zu unterschiedli
chen Laufverhalten im Gel führen können, zu unterbinden.
Dazu gibt man 7 M Harnstoff zu dem Polymerisationsansatz.
Die Trennung erfolgt auf einem 21,5 × 19 cm Gel mit einer
Dicke von 1 mm bei 70 mA in 1 × TBE-Puffer. Ansätze:
Der Ansatz wird auf 50 ml mit Wasser aufgefüllt und die
Polymerisation durch Zusatz von 300 µl APS (10%) und 30 µl
TEMED gestartet. Nach 45 min Polymerisation wird das Gel
für mind. 15 min bei 600 V vorlaufen gelassen, damit sich
eine konstante Temperatur einstellen kann.
Die Proben werden mit dem gleichen Volumen Formamid ver
setzt. Der Verlauf der Elektrophorese kann durch die Be
nutzung einer Lösung der beiden Farbstoffe Bromphenolblau
und Xylencyanol in Formamid beobachtet werden.
Die Trennung doppelsträngiger DNA wird unter nativen Be
dingungen durchgeführt. Dabei geht man wie oben beschrie
ben vor, jedoch entfällt der Zusatz von Harnstoff. Die
Proben werden mit dem gleichen Volumen an nativem Proben
puffer versetzt. Im Gegensatz zur denaturierenden PAGE
darf das Gel bei der nativen PAGE nicht zu warm werden
(Denaturierung der DNA). Deshalb wird bei einer Spannung
von 300-400 V aufgetrennt.
Für die Auftrennung der Produkte der radioaktiven Sequen
zierung wurden 6%ige denaturierende Gele verwendet. Diese
Gele mit den Maßen 42 × 33 cm sind lediglich 0,4 mm dick.
Damit nach beendeter Elektrophorese das Gel auf einer
Glasplatte haftet, und man die andere Platte abnehmen
kann, ist eine spezielle Behandlung der beiden Glasplatten
notwendig.
Dazu wird auf der großen, haftenden Glasplatte eine Lösung
aus 200 µl Silan A-174 (Methacryloxypropyltrimethoxysilan,
Pharmacia) und 1 ml Eisessig in 20 ml Ethanol mit einem
fusselfreiem Papiertuch gleichmäßig verteilt. Diese Proze
dur wiederholt man 20 min später. Nach 60 min wird die
Platte gründlich mit Ethanol abgerieben und für mindestens
60 min getrocknet. Die kleine, nicht haftende Glasplatte
wird mit einer 2%igen Lösung aus Dichlordimetylsilan in
1,1,1-Trichlorethan (Repel-Silan, Pharmacia) solange ein
gerieben, bis die Lösung in Form kleinster Tröpfchen auf
der Glaspatte abperlt. Diese Prozedur wurde nach 30 min
wiederholt, und nach weiteren 60 min wurde die Platte
gründlich mit Wasser abgerieben und für mindestens 60 min
trocknen gelassen.
Gellösung: 42 g Harnstoff, 12,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid
(40%/2%), 20 ml 5 × TBE, ad 100 ml mit H2O auffüllen.
Vor Zugabe von APS und TEMED wird der Polymerisationsan
satz noch einmal über einen Faltenfilter filtriert. Man
läßt das Gel mindestens 45 min polymerisieren und an
schließend für 30 min bei 55 W vorlaufen. Unter Verwendung
eines sogenannten "Haifischkamms" können 48 35S-markierte
Proben (= 12 Sequenzierungen) auf das Gel aufgetragen
werden.
Nach beendeter Elektrophorese wird die kleine Glasplatte
vorsichtig abgehoben. Das Gel auf der großen Glasplatte
wird zum Eluieren des Harnstoffs für 6 min mit dest. Was
ser gespült und anschließend im Trockenschrank bei 60°C
für 30 min getrocknet. Anschließend kann für die Autora
diographie ein Röntgenfilm aufgelegt werden. Man exponiert
den Film für mindestens 12 h auf dem Gel.
Bei der Verwendung eines ABI-Sequencer entfällt die Vorbe
handlung der Glasplatten. Hier werden die Glasplatten vor
der Benutzung in den Sequencer eingesetzt und überprüft,
daß keine Grundabsorption aufgrund von Verunreinigungen
vorhanden ist. Man läßt 1 h bei 55 W vorlaufen. Da die
Proben mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, entfällt
die Nachbehandlung des Gels. Nach abgeschlossener Elektro
phorese werden am Computer die Banden den Proben zugeord
nete und die Analysesoftware gestartet.
Für die Sekundärstrukturanalyse der Aptamere durch enzyma
tische RNA-Spaltung wurden 25%ige denaturierende Po
lyacrylamidgele verwendet (42 × 33 cm, 0,4 mm Dicke)
Hier wurden die beiden Monomere Acrylamid und Bisacrylamid
im Verhältnis 50 : 2 eingesetzt. Eine Vorbehandlung der
Glasplatten ist aufgrund der höheren Stabilität des Gels
nicht notwendig. Man läßt für 60 min bei 1500 V vorlaufen
und trennt die Proben anschließend bei 55 W auf. Nach be
endeter Elektrophorese wird eine Glasplatte abgehoben und
das Gel auf einen alten Röntgenfilm transferiert und in
Frischhaltefolie eingewickelt. Anschließend kann für die
Autoradiographie ein Röntgenfilm aufgelegt werden.
Gellösung: 42 g Harnstoff, 50 ml Acrylamid/Bisacrylamid
(50%/2%), 20 ml 5 × TBE.
Agarosegele werden zur Auftrennung großer DNA-Moleküle
unter nativen Bedingungen verwendet. In dieser Arbeit wur
den sie zur Analyse der Produkte nach der PCR sowie der
Analyse der Plasmid-DNA aus Minipräparationen verwendet.
Die Porengröße kann durch Verändern der Agarosekonzen
tration variiert werden und ist abhängig von der verwende
ten Agarose (Kettenlänge).
2% (w/v) Agarose wird in einem Erlenmeyerkolben in 1 ×
TBE-Puffer in der Hitze gelöst (Mikrowelle). Man läßt den
Ansatz auf ca. 50°C abkühlen und gibt dann für die Detek
tion der DNA 5 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml) auf 100 ml
Ansatz zu und gießt das Gel. Nach dem Erkalten des Gels
können die Proben, die mit dem gleichen Volumen nativen
Probenpuffer versetzt wurden, aufgetragen und bei 100-110
V elektrophoretisiert werden. Es wurden Flachgelkammern
von BioRad (Mini und Wide Mini Sub DNA Cells) verwendet.
Die durch UV-Shadowing bzw. Autoradiographie detektierte
ausgeschnittene Gelbande wird in ein Eppeldorfgefäß über
führt und mit 400 µl Wasser und 40 µl Natriumacetat (3 M,
pH 5,5) versetzt. Man schüttelt bei 4°C für mindestens
12 h oder bei 70°C für 1 h und gibt das Eluat in ein neues
Eppeldorfgefäß. Durch Ethanolfällung oder Gelfiltration
kann die Lösung von Harnstoff und Salzen befreit werden.
Die Verwendung von Ethidiumbromid ist die schnellste und
gebräuchlichste Methode für den analytischen Nachweis von
Nukleinsäuren, Ethidiumbromid ist ein heterozyklischer,
kationischer Fluoreszenzfarbstoff, der in die Nukleinsäu
ren interkaliert wird. Die Arbeiten mit dem Farbstoff
sollten sorgfältig durchgeführt werden, da Ethidiumbromid
stark mutagen ist. Polyacrylamidgele werden für 20 min in
einer Ethidiumbromidlösung (0,5 µg/ml) in 1 × TBE ange
färbt. Bei Agarosegelen wurde das Ethidiumbromid bereits
zu der Gellösung zugesetzt. Auf einem Transilluminator
kann man bei 306 nm Durchlicht die Nukleinsäuren als
leuchtende Banden erkennen.
Bei der präparativen Aufreinigung von Nukleinsäuren möchte
man Wechselwirkungen mit Farbstoffen umgehen. Für den
Nachweis macht man sich die Absorption der Nukleinsäuren
bei 260 nm zunutze. Dazu wird das Gel auf eine in Frisch
haltefolie eingewickelte Dünnschichtchromatographieplatte
gelegt, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff (60 F254) behan
delt wurde. Durch aufgestrahltes UV-Licht (254 nm) kann
man die Nukleinsäuren als dunklen Schatten erkennen und
Ausschneiden. Um eine Schädigung der Nukleinsäuren durch
das UV-Licht zu vermeiden, sollte dieser Schritt möglichst
schnell durchgeführt werden. Der Nachteil dieser Methode
ist ihre geringe Empfindlichkeit. (0,5-1 A260), weshalb sie
vor allem bei präparativen Aufreinigungen benutzt wird.
Radioaktiv markierte Nukleinsäuren (32P oder 35S) können in
Gelen, je nach ihrer spezifischen Aktivität, in geringsten
Mengen durch Schwärzung eines aufgelegten Röntgenfilms
nachgewiesen werden (<fmol).
Gele mit 32P-markierten Oligonukleotiden werden nach Abneh
men einer Glasplatte in Frischhaltefolie eingewickelt.
Möchte man die Nukleinsären aus dem Gel ausschneiden und
eluieren, wird das Gel mit drei phosphoreszierenden Punk
ten markiert. In einer Röntgenfilmkassette mit Verstärker
folie (Kodak) legt man einen Röntgenfilm (Fuji) auf das
Gel. Je nach Menge und spezifischer Aktivität der Nuklein
säure exponiert man den Film für 5 min bis 24 h. Bei län
geren Expositionszeiten friert man die Kassette bei -80°C
ein, um eine Diffusion der Oligonukleotide zu verhindern
Sequenzgele mit 35S-markierten Nukleinsäuren werden nach
der Elektrophorese auf der großen Glasplatte getrocknet.
Anschließend wird ein Röntgenfilm auf dem trockenen Gel
bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Tage exponiert.
Die exponierten Filme werden entwickelt (1-2 min. Rönt
genentwickler G150, Agfa-Gefaert N.V.), Fixiert (3 min,
Röntgenfixierer G350, Agfa-Gefaert N.V.), gewässert
(5 min) und getrocknet.
Möchte man die Nukleinsäuren eluieren, so schneide man die
schwarzen Banden auf dem Röntgenfilm aus, legt den Film so
auf das Gel, daß die 3 Marker mit den schwarzen Punkten
auf dem Film übereinstimmen, schneidet die Banden aus und
eluiert wie oben beschrieben.
Mit Hilfe der Gelfiltration können Nukleinsäurelösungen
von Salzen und anderen niedermolekularen Verbindungen ab
getrennt werden. Man macht sich dabei das unterschiedliche
Permeationsverhalten der Moleküle in die Poren des Gel
betts zunutze (Gelpermeationschromatographie). Die großen
Moleküle können im Gegensatz zu den kleinen nicht in die
Poren des Säulenmaterials eindringen und werden deshalb
sofort eluiert. Verwendet wurden vorgefertigte Säulen der
Firma Pharmacia mit Sephadex G-25 (NAP-5, NAP-10, NAP-25)
oder G-50 (NICK). Die Durchführung erfolgte nach Angaben
des Herstellers.
Nukleinsäuren können aus wäßriger Lösung durch Ethanol in
Anwesenheit von Natriumacetat bei pH 5,5 präzipitiert wer
den, während Salze und andere Verunreinigungen in Lösung
bleiben. Dazu wird die Nukleinsäurelösung mit 1/10 des
Volumens einer 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,5) und dem 2,5
fachen Volumen an Ethanol versetzt und für 10 min auf -20°C
gestellt. Anschließend zentrifugiert man 30 min bei
10000-14000 Upm/4°C, verwirft die überstehende Ethanollö
sung, wäscht das Pellet mit 400 µl 70% Ethanol und zen
trifugiert weitere 5 min. Man nimmt den Überstand ab und
trocknet das Pellet bei Raumtemperatur. Bei sehr kleinen
Nukleinsäuremengen kann die Präzipitation durch die Zugabe
von Glycogen verbessert werden. Die nach den Selektions
runden eluierte RNA wurde grundsätzlich für 1 h bei -20°C
in Anwesenheit von 40 µg Glycogen gefällt.
Zur Entfernung von Proteinen aus wäßrigen Lösungen z. B.
nach Enzymreaktionen, zur Trennung des
Peptid-RNA-Komplexes nach der Selektion oder bei der
Isolierung von Plasmiden aus Zellen, versetzt man die
Lösung mit dem gleichen Volumen Tris-gesättigten
Phenols (pH 8,0) und vortext kräftig. Man trennt die
beiden Phasen durch Zentrifugation bei 3000 Upm und nimmt
die wäßrige obere Phase vorsichtig ab. Die phenolische
Phase kann noch einmal mit dem halben Volumen Wasser
versetzt werden, geschüttelt und zentrifugiert werden. Die
vereinigten wäßrigen Phasen werden zweimal mit dem
doppelten Volumen Chloroform extrahiert, um restliches
Phenol aus der wäßrigen Lösung zu entfernen. Schon geringe
Spuren Phenol können nachfolgende Enzymreaktionen
beträchtlich einschränken oder sogar komplett inhibieren.
Die radioaktive Markierung von Nukleinsäuren ist eine
praktische Methode, um selbst kleinste Mengen noch
detektieren zu können. Die Quantifizierung erfolgt bei
32P-Markierung durch Cerenkov-Zählung. Dazu wird das
Eppendorfgefäß mit der Probe in einem Szintilations
röhrchen im Szintillationszähler (LS 6000 SC, Beckman) mit
Programm 1 (32P, Cerenkov-Zählung) eine Minute vermessen.
Man erhält die Ergebnisse in cpm (counts per minute).
Aufgrund des Absorptionsmaximums der Basen der
Nukleinsäuren im UV-Bereich bei 260 nm kann mit einem
Photometer die Konzentration von DNA- und RNA-Lösungen
bestimmt werden. Näherungsweise gelten folgende
Gleichungen:
ssDNA: Anzahl der µmole = Ges. OD260/(10 Anzahl der Basen)
dsDNA: 1 OD = 50 µg
pmol = µg.1000000/(2.Anzahl der Basen.325)
RNA: 1 OD = 40 µg
pmol = µg.1000000/(Anzahl der Basen.337)
dsDNA: 1 OD = 50 µg
pmol = µg.1000000/(2.Anzahl der Basen.325)
RNA: 1 OD = 40 µg
pmol = µg.1000000/(Anzahl der Basen.337)
Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction,
PCR) ist eine Methode zur exponentiellen Amplifikation von
DNA. Es werden neben der zu amplifizierenden DNA zwei
15-30 Basen lange Oligonukleotide (Primer) mit definierter
Sequenz benötigt, die zu den 3'-Enden des DNA-Templates
bzw. dessen Gegenstrang komplementär sind. Nach einem
Denaturierungsschritt hybridisieren diese Primer in einem
Primer-Annealing-Schritt mit dem zu amplifizierenden
DNA-Template. Dabei wird die Annealing-Temperatur so hoch
gewählt, daß keine unspezifische Hybridisierung auftritt.
Mit einer thermostabilen DNA-Polymerase erfolgt im
Extensionsschritt die Verlängerung des Primers entlang des
Templates in 5'-3'-Richtung. Im Idealfall erhält man so
aus jedem DNA-Doppelstrang zwei neue DNA-Stränge. Durch
mehrmaliges Wiederholen dieser drei Schritte (bis zu 30
Zyklen) erhält man eine exponentielle Zunahme der DNA.
Als DNA-Template kann sowohl doppel- als auch einzel
strängige DNA eingesetzt werden. Durch Verwendung von
überhängenden Primern kann eine Verlängerung der DNA
erreicht werden. Dies wurde für die Einführung des
T7-Promotors in die chemisch synthetisierte DNA
ausgenutzt. Alle Reaktionen wurden mit der Pfu Polymerase
durchgeführt, die sich von der Taq Polymerase durch ihre
Proof-Reading-Aktivität und ihre Exonukleaseaktivität
unterscheidet, die for eine niedrigere Fehlerrate sorgt.
Im Anschluß an die PCR wird eine Phenol-Chloroform-Ex
traktion und eine Ethanolfällung durchgeführt, um die Pfu
Polymerase (mit der Exonukleaseaktivität) zu entfernen.
Standardansatz | |
Temperaturbedingungen | |
10 µl 10× Pfu-Puffer | 94°C/4 min Init.denat. |
AL=L<4,8 µl MgCl2 | |
(100 mM) | |
0,5 ul BSA (2 µg/µl) | 94°C/2 min Denaturierung |
4 µl Primer A (100 µM) | 55°C/2 min Annealing |
4 µl Primer B (100 µM) | 75°C/6 min Extension |
4 µl dNTP-Mix (10 mM je dNTP) | 12-20 Zyklen |
AL=L<1 µg DNA-Template | |
AL=L CB=3<1 µl Pfu Polymerase (2,5 U/µl)@ AL=L CB=3<ad 100 µl mit H | 2 |
O auffüllen |
Für die Amplifikation der synthetisierten DNA-Bibliothek
wurde die Reaktion nicht in PCR-Reaktionsgefäßen, sondern
in 10 ml Glasgefäßen durchgeführt (6 × 5 ml), die in drei
Wasserbädern entsprechender Temperatur geschwenkt wurden.
Aufgrund des großen Volumens wurden die Reaktionszeiten
verlängert und die Temperaturen um 2°C erhöht und die
Zyklenzahl auf 10 beschränkt. Ferner wurde die Dauer der
letzten Extensionphase verdoppelt.
präparativer Ansatz | |
Temperaturbedingungen | |
300 µl 10 × Pfu-Puffer | 96°C/4 min Init.denat. |
AL=L<1440 µl MgCl2 | |
(100 mM) | |
15 µl BSA (20 µg/µl) | 96°C/5 min Denaturierung |
1200 µl Primer A (120 nmol) | 56°C/5 min Annealing |
1200 µl Primer B (120 nmol) | 77°C/12 min Extension |
480 µl dNTP-Mix (100 mM je dNTP) | 10 Zyklen |
30 µl Pfu Polymerase | 75°C/12 min Zusatzext. |
AL=L<ad 30 ml mit H2 | |
O auffüllen. |
Im Anschluß an die PCR wurde eine Phenol-Chloroform-
Extraktion durchgeführt. Zur Bestimmung der DNA-Konzen
tration wurde eine Probe (30 µl) über ein 8%
denaturierendes Polyacrylamidgel aufgereinigt, eluiert und
entsalzt. Durch Vergleich der Absorption bei 260 nm vor
und nach der Aufreinigung kann die Konzentration des Pools
berechnet werden.
Der Ansatz der reversen Transkription wurde auf vier 100
µl Ansätze verteilt. Die Zeiten der drei Schritte wurden
etwas verlängert, um auch die Vervielfältigung schlecht
amplifizierbarer DNA-Sequenzen zu gewährleisten. Die
Anzahl der Zyklen wurde an die Menge an eluierte RNA nach
der Selektion angepaßt. Nach der Phenol-Chloroform-Ex
traktion und der Ethanolfällung wurde die DNA in 200 µl
Wasser gelöst.
Reaktionsansatz | |
Temperaturbedingungen | |
20 µl aus rev. Transkription | 94°C/4 min Init.denat. |
AL=L<40 µl 10 × Pfu-Puffer | |
19,2 µl MgCl2 (100 mM) | 94°C/2 min Denaturierung |
16 µl Primer A (100 µM) | 55°C/2 min Annealing |
16 µl Primer B (100 µM) | 75°C /10 min Extension |
2 µl BSA (2 µg/µl) | 6-16 Zyklen |
AL=L<16 µl dNTP-Mix (10 nM je dNTP) | |
AL=L CB=3<4 µl Pfu Polymerase@ AL=L CB=3<ad 400 µl mit H | 2 |
O auffüllen |
Nach der Klonierung und Isolierung der Plasmide wurde die
Insert-Sequenz durch PCR aus dem vollständigen Vektor
heraus amplifiziert. Die Aufreinigung erfolgt wie oben
beschrieben.
Standardansatz | |
Temperaturbedingungen | |
40 µl 10 × Pfi-Puffer | 94°C/4 min ID |
AL=L<19,2 µl MgCl2 | |
(100 mM) | |
2 µl BSA (2 µg/µl) | 94°C/2 min Denaturierung |
16 µl Primer A (50 µM) | 94°C/2 min Annealing |
16 µl Primer B (50 µM) | 75°C/6 min Extension |
16 µl dNTP-Mix (10 mM je dNTP) | 25 Zyklen |
AL=L<2 µl Vektor (1/10 Volumen der Minipräp) | |
AL=L CB=3<4 µl Pfu Polymerase (2,5 U/µl)@ AL=L CB=3<ad 400 µl mit H | 2 |
O auffüllen |
Mit Hilfe der in vitro-Transkription kann eine zu einer
DNA-Sequenz komplementäre RNA hergestellt werden. Dazu muß
die DNA-Matrize einen 3'-terminalen Erkennungsbereich aus
17 Basen, den T7-Promotor, enthalten. Unmittelbar hinter
diesem Promotor wird die Transkription durch die
T7-RNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7 gestartet. Man
kann die Effizienz der Polymerase erhöhen, indem man das
Transkript mit zwei Guanosinnukleotiden beginnen läßt.
Standardansatz:
10 µl 10 × Transkriptionspuffer
10 µl DTT (100 mM)
6 µl BSA (2 µg/µl)
16 µl NTP-Mix (100 mM je NTP)
50 µl DNA-Matrize (ca. ¼ eines PCR-Ansatzes)
2 µl T7-Polymerase (50 U/µl)
ad 100 µl mit H2O auffüllen.
10 µl 10 × Transkriptionspuffer
10 µl DTT (100 mM)
6 µl BSA (2 µg/µl)
16 µl NTP-Mix (100 mM je NTP)
50 µl DNA-Matrize (ca. ¼ eines PCR-Ansatzes)
2 µl T7-Polymerase (50 U/µl)
ad 100 µl mit H2O auffüllen.
Durch Zugabe von a-32P-CTP kann die RNA radioaktiv markiert
werden. Nach 2-3 h Inkubation bei 37°C wird die RNA auf
einem 6% denaturierenden Polyacrylamidgel aufgereinigt,
eluiert und durch Ethanolfällung entsalzt. Nach der
Ethanolfällung wurde nur noch mit silikonisierten
Eppendorfgefäßen gearbeitet, um einen Verlust der RNA
durch Adsorption an der Gefäßwand zu minimieren.
Zur Herstellung des RNA-Startpools für die Selektion wurde
eine präparative Transkription mit 3,8 ml Volumen
angesetzt (19 × 200 µl). Außerdem wurde die DNA-Konzen
tration erhöht auf 40 µmol/100 pl Ansatz. Es wurden 1,6
nmol DNA eingesetzt, entsprechend einer Pool-Komplexizität
von 1 × 1015. Die Reaktionszeit wurde auf 5 h erhöht.
Präparative Transkriptionsansatz:
320 µl DNA-Pool (1,6 nmol)
380 µl 10 × Transkriptionspuffer
380 µl DTT (100 mM)
22,5 µl BSA 120 µg/µl)
600 µl NTP-Mix (100 mM je NTP)
10 µl α-32P-CTP
75 µl T7-Polymerase
ad 3,8 ml mit H2O auffüllen.
320 µl DNA-Pool (1,6 nmol)
380 µl 10 × Transkriptionspuffer
380 µl DTT (100 mM)
22,5 µl BSA 120 µg/µl)
600 µl NTP-Mix (100 mM je NTP)
10 µl α-32P-CTP
75 µl T7-Polymerase
ad 3,8 ml mit H2O auffüllen.
Soll radioaktiv markierte RNA durch Zugabe von α-32P-CTP
hergestellt werden, so nimmt man von dem Reaktionsansatz
ein kleines Aliquot (1/50 des Ansatz) als Vergleichswert
ab, um die spezifische Radioaktivität der RNA bestimmen zu
können. Die Radioaktivität in dieser Probe entspricht 1/50
der zugesetzten Menge an CTP. Die Stoffmenge des
zugesetzten radioaktiven CTPs ist aufgrund der hohen
Aktivität vernachlässigbar gering. Aus der Aktivität
der Vergleichsprobe cpmVergleich und der eigentlichen Probe
cpmProbe kann man die Stoffmenge des eingebauten Cytidins nC
in der Probe berechnen. Durch Division durch die Anzahl
der Cytidinnukleotide in der RNA erhält man die Stoffmenge
der RNA nRNA. Zur Berechnung der Anzahl der Cs geht man im
randomisierten Bereich davon aus, daß jede vierte Base ein
Cytidin ist. Zuzüglich der Cyticlinbasen in den beiden
Primerregionen sind statistisch 31,5 Cs in der RNA
enthalten.
Für eine spätere Amplifikation durch PCR wurde die RNA
nach jeder Selektionsrunde mit der Reverse Transkriptase
in cDNA umgeschrieben. Verwendet wurde eine Transkriptase
mit einer RNase H-Deletion, d. h. die RNA wird bei der
Transkription nicht verdaut, und es ist möglich, mehrere
DNA-Kopien von einem RNA-Strang herzustellen. Ähnlich wie
bei der PCR wird auch hier ein zum 3'-Ende komplementäres
Oligonukleotid benötigt, um ein DNA-RNA-Hybrid zu bilden,
welches anschließend von der Reversen Transkriptase
verlängert wird.
Hybridisierung | |
Reverse Transkription | |
10 µl RNA (selektiert) | 12 µl Annealingansatz |
2 µl Primer B (100 µM) | 4 µl 5 × RT-Puffer |
Inkubation bei 70°C/10 min | 2 µl DTT (100 mM) |
1 µl dNTP-Mix (10 mM/dNTP) | |
AL=L<Inkubation bei 46°C/2 min | |
1 µl Rev.Trans. (200 U/µl) |
Man inkubiert eine Stunde bei 46-48°C und fährt dann
sofort mit der PCR fort (1.3.1).
Die Sequenzierung erfolgt durch Anlagerung eines
Sequenzierungsprimers an die einzelsträngige DNA, der dann
von einer DNA-Polymerase entlang des Plasmids verlängert
wird. Durch Zugabe von Didesoxyribonukleotiden, an die
keine weiteren dNTPs gekoppelt werden können, kommt es
statistisch zu einem Abbruch der Kettenverlängerung hinter
jeder einzelnen Base.
Bei der radioaktiven Sequenzierung mit 35S wird zusätzlich
zu den dNTPs auch noch 35S-dATP (oder 35S-dCTP) eingebaut,
um eine Detektion durch Autoradiographie zu ermöglichen.
Die Sequenzierung wurde mit dem Sequenzierungs-Kit der
Firma Pharmacia durchgeführt. Durch Verwendung des
Universal- und des Reverse-Primers wird sowohl der Strang
als auch der Gegenstrang sequenziert, wodurch man eine
fehlerhafte Sequenzierung z. B. durch Ausbildung einer
stabilen Sekundärstruktur besser erkennen kann. Damit die
DNA einzelsträngig vorliegt, wird sie im ersten Schritt
denaturiert. Nach der Hybridisierung des Primers wird die
Probe rür die Sequenzierungsreaktion auf vier Eppendorf
gefäße entsprechend der vier Basen verteilt und das
jeweilige Didesoxynukleotid zugegeben. Man läßt genau 5
min bei 37°C reagieren und bricht die Polymerisation
durch Zugabe der StopLösung auf Eis ab. Die Hälfte jeder
Probe wird zur Auftrennung auf ein 6%-Sequenzierungsgel
aufgetragen (siehe 3.2.1). Von dem Gel wird ein
Autoradiogramm erstellt, auf dem die jeweilige Sequenz
abgelesen werden kann.
1.) Denaturierung | |
2.) Hybridisierung | |
10 µl Plasmid-DNA | 10 µl Plasmid, denat. |
2,5 µl NaOH (2 M, frisch) | 2 µl Annealing-Puffer |
Inkubation für 10 min/RT | 2 µl Primer (5 pmol/µl) |
Inkub. 20 min/37°C und 10 min/kT |
3,75 µl Natriumacetat (3 M, pH 5,5)
8,75 µl H2
8,75 µl H2
O
75 µl Ethanol
Ethanolfällung, Aufnehmen in 10 µl H2
75 µl Ethanol
Ethanolfällung, Aufnehmen in 10 µl H2
O
3.) Markierung | |
4.) Abbruchreaktion | |
14 µl Annealing-Ansatz | 2,5 µl je A, C, G oder T-Mix |
3 µl Labelling-Mix (A-Mix) | 4,8 µl Labelling-Ansatz |
1 µl [α-35S]-dATP (10 µCi/µl) | 37°C/5 min |
2 µl T7-DNA Polym. (1,5 U/µl) | 6 µl Stop-Lösung |
AL=L<4 min/RT |
Die Detektion der DNA-Fragmente erfolgt beim ABI-Sequencer
durch Fluoreszenzmessung. Dazu arbeitet man mit
Didesoxynukleotiden, die mit vier unterschiedlichen
Fluoreszenzfarbstoffen modifiziert wurden und daher bei
verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren. Dadurch muß die
Reaktion und die Auftrennung auf dem Gel für die einzelnen
Basen nicht getrennt durchgeführt werden, wodurch sich die
Zahl der Proben um 75% verringert. Die Sequenzierung
wurde mit dem Kit von Perkin-Elmer nach der Methode des
Cycle-Sequencing im Thermocycler durchgeführt. Wie bei
einer normalen PCR bildet die Polymerase den Gegenstrang
zur Template-DNA, nur daß beim Cycle-Sequencing lediglich
ein Primer vorhanden ist, also nur ein Strang verviel
fältigt wird, und daß durch Einbau der ddNTPs die
Kettenverlängerung statistisch an jeder Stelle des
Templates abgebrochen wird. Dadurch verringert sich die
benötigte Menge an DNA auf 1/10 einer Plasmidisolierung.
Sequenzierungsansatz | |
Temperaturbedingungen | |
5 µl Plasmid | 96°C/2 min Init.denat. |
AL=L<5 µl Primer (5 µmol/µl) universal/reverse | |
10 µl Sequenzierungsmix | 96°C/15 sec Denat. |
50°C/15 sec Annealing | |
60°C/4 min Extension | |
25 Zyklen |
Da der Überschuß der fluoreszenzmarkierten ddNTPs bei der
fluorometrischen Analyse stört, werden diese durch
Gelfiltration mit Spin Columns vorher abgetrennt. Dabei
wurden CentriSep (Princeton Separation) bzw. Centriflex
(Advanced Genetic Technologies Corp.) Spin Columns
entsprechend der Anleitung verwendet. Die Centriflex-
Säulen haben den Vorteil, daß sie bereits vorgequollen
sind und daher direkt einsatzbereit sind. Eine Abtrennung
der ddNTP durch eine Ethanolfällung ist ebenfalls möglich.
Das ist gerade bei einer großen Anzahl von Proben
schneller und kostengünstiger, jedoch gelingt die
Abtrennung der ddNTPs nicht quantitativ, weshalb die
Auftrennung der ersten 20 Basen auf dem Sequenzgel nicht
sauber gelingt. Da aber die Sequenzierungsprimersequenz in
einem größeren Abstand von dem Insert liegt, ist dies kein
großer Nachteil. Die gereinigten Proben werden in der
Vakuumzentrifuge zur Trockne eingeengt und in 2 µl
Probenpuffer gelöst. 1-1,5 µl dieser Probe werden
anschließend auf das 6% denaturierende Sequenzierungsgel
aufgetragen. Nach beendeter Elektrophorese erfolgt die
Zuordnung der Proben sowie die Überprüfung der Auswertung
des Computers.
Die radioaktive 3'-Markierung erfolgt durch Veresterung
der freien 3'-Hydroxylgruppe der RNA mit der
5'-Monophosphatgruppe eines Cytidin-3'-[5'-32P]-di
phosphats (pCp). Diese Ligation wird durch die
T4-RNA-Ligase unter ATP-Hydrolyse katalysiert.
Nach einer 18-stündigen Inkubation bei 4°C wird der
Reaktionsansatz über ein 12%iges denaturierendes
Polyacrylamidgel aufgereinigt, eluiert und mit Ethanol
gefällt.
Reaktionsansatz:
12 µl RNA (2 µmol/µl)
12 µl 3 × Ligase-Puffer
3 µl ATP (150 µM, frisch verdünnt)
10 µl [5'-32P]pCp
3 µl T4-RNA-Ligase (10 U/µl)
12 µl RNA (2 µmol/µl)
12 µl 3 × Ligase-Puffer
3 µl ATP (150 µM, frisch verdünnt)
10 µl [5'-32P]pCp
3 µl T4-RNA-Ligase (10 U/µl)
Die Markierung des 5'-Endes der RNA erfolgt durch
Kinasierung einer radioaktiven Phosphatgruppe an die
5'-Hydroxylgruppe. Dazu muß zuerst die nach der
Transkription vorhandene Triphosphatgruppe der RNA mit
Hilfe der alkalischen Phosphatase abgespalten werden. Es
wurde die alkalische Phosphatase aus Shrimps verwendet, da
sie durch Erhitzen auf 80°C für 10 min für die
anschließende Kinasierung inaktiviert werden kann. Die
T4-Polynukleotid-Kinase kann nun den radioaktiven
Phosphatrest vom [γ-32P]-ATP auf die RNA übertragen. Nach
beendeter Reaktion reinigt man über ein 12%iges
denaturierendes Polyacrylamidgel auf und fällt die RNA mit
Ethanol.
Dephosphorylierung:
7 µl RNA (2 µmol/µl)
1 µl 10 × Phosphatase-Puffer
2 µl alkalische Phosphatase, Shrimps (1 U/µl)
Inkubation bei 37°C/1 h
3 µl EDTA (0,1 M)
80°C/10 min. anschließend 0°C/5 min
7 µl RNA (2 µmol/µl)
1 µl 10 × Phosphatase-Puffer
2 µl alkalische Phosphatase, Shrimps (1 U/µl)
Inkubation bei 37°C/1 h
3 µl EDTA (0,1 M)
80°C/10 min. anschließend 0°C/5 min
Kinasierung:
23 µl Dephosphorylierungsansatz
3 µl H2O
5 µl 10 × Kinase-Puffer
1,6 µl DTT (100 mM)
3 µl MgCl2 (100 mM)
10 µl [y-32P]-CTP
4 µl T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/µl)
23 µl Dephosphorylierungsansatz
3 µl H2O
5 µl 10 × Kinase-Puffer
1,6 µl DTT (100 mM)
3 µl MgCl2 (100 mM)
10 µl [y-32P]-CTP
4 µl T4-Polynukleotid-Kinase (10 U/µl)
Es gibt viele Ribonukleasen, die RNA in Abhängigkeit von
ihrer Sekundärstruktur schneiden. Aus dem Spaltungsmuster
einer limitierten Spaltung mit diesen RNasen sollte daher
eine Aussage über die Sekundärstruktur der zu
untersuchenden RNA möglich sein. Die Enzymkonzentration
und die Inkubationsdauer müssen dabei so gewählt werden,
daß kein vollständiger Verdau der RNA auftritt. Etwa 50%
der eingesetzten RNA sollte unverdaut bleiben, damit
statistisch nur eine Spaltung pro Molekül auftritt.
Vor der enzymatischen Spaltung wurde die RNA wie auch
während der Selektion für 5 min bei 90°C in
Bindungspuffer denaturiert und anschließend in 20 min auf
RT abgekühlt. Die Spaltungsreaktionen wurden in einem
Volumen von 6 µl in silikonisierten Eppendorfgefäßen
durchgeführt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 6 µl
Probenpuffer gestoppt und die Proben auf Eis gestellt. 54
des Reaktionsansatzes werden auf einem 25%igen
denaturierenden Polyacrylamidgel aufgetrennt und
anschließend durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Ribonuklease T1 (aus Aspergillus oryzae) spaltet spezifisch
einzelsträngige RNA auf der 3'-Seite von Guanosin
nukleotiden (Gp ↓ Np). Diese Nuklease ist in der Lage unter
nativen als auch unter denaturierenden Bedingungen (7 M
Harnstoff) zu spalten. Die Spaltung unter denaturierenden
Bedingungen ermöglicht eine spätere Zuordnung der Basen
auf dem Autoradiogramm, während man aus der nativen
Spaltung Aufschluß über einzelsträngige Regionen erhalten
kann.
denaturierende Spaltung | |
native Spaltung | |
2 µl RNA (ca. 150000 cpm) | 2 µl RNA (ca. 150000 cpm) |
1 µl t-RNA (6 µg/µl) | 3 µl t-RNA (6 µg/µl) |
2 µl T1-Spaltungspuffer | 0,7 µl H2O |
0,4 µl H2O | 0,3 µl RNase T1 |
0,6 µl RNase T1 | 20 min/Raumtemperatur |
AL=L<20 min/55°C |
Ribonuklease T2 (aus Aspergillus oryzae) spaltet
sequenzunabhängig einzelsträngige RNA unter Freisetzung
von Oligonukleotiden mit 3'-Phosphatgruppen. RNase T2 kann
daher in Kombination mit RNase 51 für die Identifizierung
nicht basengepaarter Bereiche eingesetzt werden.
native Spaltung:
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,7 µl H2O
0,3 µl RNase T2 (5,75 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,7 µl H2O
0,3 µl RNase T2 (5,75 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
Die Nuklease S1 (aus Aspergillus oryzae) spaltet wie die
RNase T2 sequenzunabhängig einzelsträngige Bereiche der
RNA. Im Gegensatz zur RNase T2 werden hier jedoch
Oligonukleotid-5'-phosphate freigesetzt.
native Spaltung:
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,7 µl H2O
0,3 µl RNase S1 (0,4 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,7 µl H2O
0,3 µl RNase S1 (0,4 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
Mit der Ribonuklease V1(Cobra Venom) lassen sich bevorzugt
doppelsträngige Bereiche der RNA sequenzunabhängig
spalten. Wie bei der Spaltung mit RNase 5' werden auch
hier Oligonukleotid-5'-phosphate freigesetzt.
native Spaltung:
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,6 µl H2O
0,4 µl RNase V1 (0,72 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
2 µl RNA (ca. 150000 cpm)
3 µl t-RNA (6 µg/µl)
0,6 µl H2O
0,4 µl RNase V1 (0,72 U/µl)
20 min/Raumtemperatur
Unter alkalischen Bedingungen ist RNA im Gegensatz zur DNA
instabil. Über einen zyklischen 2',3'-Phosphat-
Übergangszustand entstehen Spaltprodukte mit einer 5'-
Hydroxylgruppe. Durch eine zeitliche Begrenzung der
alkalische Hydrolyse kann man die RNA so spalten, daß
Oligoribonukleotide jeder möglichen Länge entstehen. Trägt
man dieses Reaktionsgemisch auf ein denaturierendes
Polyacrylamidgel auf so erhält man nach der
Autoradiographie eine Alkalileiter, die für die Zuordnung
der Spaltprodukte der enzymatischen RNA-Spaltung verwendet
werden kann. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 6 µl
Probenpuffer gestoppt und bis zum Auftragen auf das Gel
auf Eis gestellt.
Reaktionsansatz:
3 µl RNA (ca. 150000 cpm)
1,5 µl t-RNA(6 µg/µl)
4,5 µl Alkali-Puffer (50 mM NaOH, 1 mM EDTA, frisch angesetzt)
45-60 sec/120°C
3 µl RNA (ca. 150000 cpm)
1,5 µl t-RNA(6 µg/µl)
4,5 µl Alkali-Puffer (50 mM NaOH, 1 mM EDTA, frisch angesetzt)
45-60 sec/120°C
Für die affinitätschromatographische Selektion müssen die
Peptide auf einem Trägermaterial immobilisiert werden. Die
Immobilisierung soll reversibel sein, um eine Elution
der spezifisch bindenden RNA als RNA-Peptid-Komplex zu
ermöglichen. Daher sollen Peptide über Disulfidbrücken an
Thiopropyl-Sepharose 6B gekoppelt werden. Um das zu
ermöglichen, müssen die Peptide eine freie Thiolgruppe
besitzen, weshalb das βA4(1-40) und βA4(1-16) mit einem
Cystein am N-terminalen Ende synthetisiert wurden und
folglich bzw. 17 Aminosäuren enthalten.
Zum Quellen suspendiert man 1,4 g Thiopropyl-Sepharose 6B
in 30 ml Wasser und schwenkt für 15 min. Alle verwendeten
Lösungen sollten vor der Benutzung durch 10 min.
Ultraschallbehandlung entgast werden, um eine Oxidation
der Sulfidgruppen durch Luftsauerstoff zu vermeiden. Man
filtriert ab und wäscht mit 3 × 50 ml Wasser. Das
gequollene Gel wird in 25 ml einer Lösung aus 88 µM
βA4 (1-16), 12 µM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA
suspendiert und für 1,5 h bei Raumtemperatur unter
Schwenken inkubiert. Bei der Immobilisierung des βA4(1-40)
muß aufgrund der großen Tendenz zur Aggregation und der
damit verbundenen Unlöslichkeit die Immobilisierung in
einer 60%igen Hexafluorisopropanollösung (LTFIP)
durchgeführt werden. Dazu suspendiert man das in 25 ml
einer Lösung aus 45 µM βA4(1-40), 10 mM Tris-HCl, pH 7,7
und schwenkt für 1,5 h bei RT.
Man filtriert das Gel ab und wäscht mit 2 × 50 ml einer
0,1 M Natriumacetatlösung, pH 6,0. Um von nicht reagierten
Thiolgruppen des Gels die Schutzgruppen abzuspalten und
reaktiven Thiolgruppen zu blockieren, wurde das Gel für 45
min unter Schwenken in 20 ml 2-Mercaptoethanol (5 mM, 0,1 M
NaOAc, pH 6) suspendiert. Das Säulenmaterial wird zweimal
mit 50 ml Bindungspuffer gewaschen und bei 4°C unter
Bindungspuffer aufbewahrt.
Für die Vorsäule wurde das Säulenmaterial wie oben
beschrieben behandelt, jedoch ohne die Zugabe des Peptids.
Hier wurden alle Thiopyridylgruppen durch
2-Mercaptoethanol substituiert.
Zur Bestimmung der Beladung des Säulenmaterials wurde das
Peptid von 100 µl Säulenmaterial durch reduktive Spaltung
der Disulfidbrücken abgespalten. Dazu eluiert man das
Peptid von der Säule, indem man zweimal 500 µl
Elutionspuffer langsam durch die Säule fließen läßt (30
µl/min). Die Konzentration des Peptids im Eluat wurde auf
zwei Arten bestimmt.
Die Konzentration des Peptids im Eluat konnte beim
βA4(1-16) durch den Coomassie-Protein-Assay bestimmt
werden. Dazu gibt man 500 µl des Eluats mit 500 µl
Coomassielösung (Pierce) zusammen, schüttelt und mißt die
Absorption in einer 1 ml Einwegküvette bei 595 nm. Die
Konzentration erhält man bei Vergleich mit einer
Eichkurve, die bei verschiedenen bekannten Konzentrationen
aufgenommen wurde. Da die Absorption nicht zeitlich
konstant ist, ist es wichtig, daß die Messung immer nach
der gleichen Zeit nach der Zugabe der Coomassielösung
durchgeführt wird. Aufgrund der Aggregation in wäßrigen
Lösungen, konnte die Peptidkonzentration des βA4(1-40)
nicht durch den Proteinassay bestimmt werden und wurde
deshalb durch Aminosäureanalyse ermittelt.
200 µl des Eluats (1 ml) wurden in einem Dansylgläschen
zur Trockne eingeengt und durch Gasphasenhydrolyse sauer
hydrolisiert. Dazu stellt man das Dansylgläschen in ein 40
ml Gefäß mit Schraubverschluß und Hahn zu etwa 3 ml 5,7 M
Salzsäure. Durch Evakuieren des Gefäßes und Erhitzen auf
150°C für 1 h wird die Probe hydrolisiert. Man engt die
Probe im Vakuum ein und nimmt sie in 100 µl Wasser auf. 20
µl dieser Lösung wurden für die Aminosäureanalyse nach den
Kopplungsschritten des Edman-Ahhaus mit
Phenylisothiocyanat derivatisiert. Die Auftrennung der
Aminosäuren erfolgte durch HPLC auf einer ABT PTH RP
C18 Säule (5 µm, 220 × 2,1 mm) mit einem binären
Gradientensystem (Puffer A: H2O, Puffer B: 5% w/v
Tetrahydrofuran, 6 mM Natriumacetat, pH 4,2). Die
Stoffmengen der Aminosäuren des Peptids wurden durch
Vergleich der Peakhöhe der Aminosäuren mit einer
Referenzsubstanz bekannter Konzentration berechnet. Nach
Division der Stoffmenge durch die Anzahl der Reste im
Peptid und Mittelung über 10 Aminosäuren erhält man die
Konzentration des Peptids im Eluat und damit die Beladung
des Säulenmaterials. Die Aminosäureanalyse wurde von Dr.
Schröder durchgeführt.
Um die Adsorption der RNA an der Oberfläche der Säulen
bzw. der Fritten möglichst gering zu halten, wurden diese
vor der Benutzung silanisiert. Dazu spült man die Säulen
mit Toluol und füllt sie anschließend mit einer 5%igen
Lösung aus Dichlordimethylsilan in Toluol. Nach ein bis
zwei Stunden wird diese Lösung entfernt, die Säulen mit
Toluol und anschließend mit Wasser mehrmals gründlich
gewaschen.
Um nichtspezifische Wechselwirkungen der RNA zu
unterdrücken, wurden die Salzkonzentrationen im
Bindungspuffer auf das Säulenmaterial abgestimmt. Dazu
wurde die NaCl-Konzentration zwischen 150-500 mM und die
MgCl2-Konzentration im Bereich von 5-50 mM variiert. Die
Bedingungen, unter denen am wenigsten RNA auf der Säule
gebunden wurde, sollten für die Selektion verwendet
werden.
Die Selektion der hochaffinen RNA-Moleküle wurde
affinitätschromatographisch auf kleinen Säulen (Mobicols,
Mo Bi Tec) mit 100 µl Säulenvolumen durchgeführt. In jeder
Selektionsrunde wurde eine Vorsäule (ohne Peptid) und eine
Hauptsäule (Affinitätssäule) verwendet. Die radioaktiv
markierte RNA wurde in Bindungspuffer auf eine
Konzentration von 2,5 µM eingestellt. Damit die RNA in
ihrer stabilen Konformation vorliegt, denaturiert man für
5 min bei 90°C und renaturiert durch 20 minütiges
Abkühlen auf Raumtemperatur. 200 µl dieser RNA trägt man
auf die Vorsäule auf. Lediglich in der ersten
Selektionsrunde wurde aufgrund der großen RNA-Menge von
diesem Protokoll abgewichen und bei einer doppelt so
großen Konzentration ca. 2,5 nmol RNA eingesetzt. Das
Säulenvolumen der Hauptsäule wurde auf 250 µl vergrößert.
Die Vor- und Hauptsäule wurde in der ersten Runde mit 3 ml
Bindungspuffer gewaschen, während sie in allen folgenden
Runden nur noch mit 2 ml Puffer gewaschen wurde. Im
Anschluß wurde das Peptid mit der bindenden RNA nach
Entfernung der Vorsäule mit 1 ml Elutionspuffer von der
Säule in ein silikonisiertes Eppendorfgefäß eluiert.
Um einen möglichst konstanten Fluß durch die Säule zu
erhalten, wurde eine Peristaltikpumpe eingesetzt. Der
Bindungspuffer wurde in 500 µl Portionen auf die Säule
gegeben und gelangt durch Anlegen eines leichten
Überdrucks mit Hilfe der Pumpe durch die Vorsäule auf die
Hauptsäule. Nun wird die Pumpe erst an die Hauptsäule
angeschlossen, bevor die nächste Portion Puffer auf die
Vorsäule aufgetragen werden kann. Der Fluß durch die
Säulen soll etwa 33-35 µl/min betragen.
Nach beendeter Elution wird die RNA-Konzentratiän der
Wasch- und Elutionslösung sowie der Säulen durch
Cerenkov-Zählung bestimmt. Das Fluat wird in einer
Vakuumzentrifuge auf ca. 400 µl eingeengt und zur
Entfernung des Peptids mit Phenol und Chloroform
extrahiert. Mit Ethanol unter Zusatz von Glycogen (40 µg)
wird die RNA gefällt und anschließend revers
transkribiert. Die DNA wird durch PCR amplifiziert und für
die nächste Selektionsrunde durch Transkription in RNA
umgeschriehen. Wenn kein weiterer Anstieg der spezifisch
eluierten RNA mehr beobachtet wird, kann die Selektion
abgebrochen werden. Um das Gemisch der unterschiedlichen
Sequenzen analysieren zu können, separiert man die
Sequenzen durch Klonierung in Bakterienzellen.
Die affinitätschromatographische Bestimmung der
Dissoziationskonstanten wurden mit Hilfe von Econo-Säulen
(Bio-Rad) durchgeführt, da diese ein größeres Volumen
besitzen, als die während der Selektion verwendeten
Mobicols. Ein genügend großes Säulenbettvolumen ist
entscheidend, damit die aufgetragene Menge RNA (10 µl, 100
nM) als scharfe Bande durch die Säule wandern kann. Es
wurde mit 800 µl Säulenmaterial gearbeitet, wodurch sich
ein Säulenvolumen von 810 µl ergibt (Volumen des Hahns
etc.). Nach Auftragen der radioaktiv markierten RNA wäscht
man die Säule solange mit Bindungspuffer, bis keine
Radioaktivität mehr auf der Säule detektiert werden kann.
Anfangs fängt man das Eluat tropfenweise auf um das
Totvolumen möglichst genau bestimmen zu können. Später
genügen 500 µl Fraktionen. Durch Einsatz einer Pumpe und
eines Fraktionssammlers kann die Bestimmung automatisiert
werden.
Für die Transformation von Epicurian Coli Zellen muß die
DNA in einen Vektor ligiert werden. Verwendet wurde hier
der pPCR-Script Amp SK(+) cloning vector (Stratagene), ein
Abkömmling des pBluescript II SK(+) phagemids, der ein Gen
für Ampicillinresistenz sowie einen lac Promotor und einen
T7-RNA Polymerase Promotor enthält. Innerhalb des SK
multiple cloning siles befindet sich eine seltene Srf
I-Schnittstelle (5'-GCCC/GGGC-3'), die eine Ligation der
blunt-ended PCR-Produkte der Selektion mit dem
geschnittenen Vektor ermöglicht. Da für die PCR
standardmäßig die Pfu DNA Polymerase verwendet wurde, ist
eine Aufarbeitung der DNA nicht nötig. Anders wäre das bei
Verwendung von Taq Polymerase, da diese häufig eine
weitere Base an das Kettenende hängt. Die
Restriktionsspaltung des Vektors, sowie die Ligation des
DNA-Inserts können gleichzeitig in einem Gefäß
durchgeführt werden. Durch die gleichzeitige Aktivität des
Restriktionsenzyms und der Ligasee liegt ein Gleichgewicht
zwischen geschnittenem und ungeschnittenem Vektor vor, bis
durch Ligation des Inserts die Srf I Restriktions
schnittstelle verloren geht, und der Vektor nicht mehr
gespalten werden kann.
Diese Plasmide werden nun in superkompetente Epicurian
Coli Zellen XLI-Blue MRF' Kan (Stratagene) eingeführt und
auf Agarplatten ausgestrichen, die X-Gal
(5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β,D-galactopyranosid), IPTG
(Isopropylthio-β,D-galactosid) sowie das Antibiotikum
Ampicillin enthalten. Aufgrund des Antibiotikums können
nur die Zellen auf dem Medium wachsen, die durch Aufnahme
eines Plasmids eine Ampicillinresistenz besitzen. Die
Zellen, die ein nicht rekombinantes Plasmid aufgenommen
haben, besitzen ein intaktes Gen für die β-Galactosidase,
die durch Spaltung des X-Gals einen blauen Farbstoff
freisetzt. Diese Zellen färben sich blau. Die weißen
Kolonien stellen die transformierten Bakterien dar, die
genau ein rekombinantes Plasmid enthalten, das beliebig
vermehrt werden kann.
Vor der Ligation wird die DNA unter Zugabe des gleichen
Volumens einer 4 M Ammoniumacetatlösung (anstelle des
Natriumacetats) und des 2,5fachen Volumens an Ethanol
gefällt. Das Pellet wird in TE-Puffer aufgenommen.
Das Verhältnis von Insert. Plasmid soll zwischen 40 : 1
und 100 : 1 liegen. Es wurde ein Verhältnis von 70 : 1
gewählt, was einer Menge von 364 fmol Insert pro
Standardansatz entspricht.
Ligationsansatz:
1 µl pPCR-Script Amp SK(+) cloning vector (10 ng/µl)
1 µl 10 × PCR-Script-Puffer
0,5 µl ATP (10 mM)
3 µl PCR Produkt (364 fmol)
1 µl SrfI Restriktionsenzym (5 U/µl)
1 µl T4-DNA-Ligase (5 U/µl)
ad 10 µl mit H2O auffüllen
1 µl pPCR-Script Amp SK(+) cloning vector (10 ng/µl)
1 µl 10 × PCR-Script-Puffer
0,5 µl ATP (10 mM)
3 µl PCR Produkt (364 fmol)
1 µl SrfI Restriktionsenzym (5 U/µl)
1 µl T4-DNA-Ligase (5 U/µl)
ad 10 µl mit H2O auffüllen
Man läßt eine Stunde bei RT reagieren, erhitzt für 10 min
auf 65°C und stellt die Probe bis zur Transformation auf
Eis.
Durch eine spezielle Salzbehandlung ist es möglich,
Zellmembranen DNA-permeabel (kompetent) zu machen und zu
einer Aufnahme eines Plasmids zu bringen. Für die
Transformation wurden jedoch käuflich erhältliche
kompetente Zellen verwendet. Diese sind schon gegenüber
kleinen Temperaturschwankungen sehr empfindlich und
müssen deshalb immer bei -80°C gelagert werden bzw.
während des Aliquotierens permanent auf Eis stehen.
Weiterhin ist es wichtig, die Dauer des 45 s
Temperaturintervalls genau einzuhalten. Etwa ½ h vor dem
Ausstreichen der Zellen sollten die ampicillinhaltigen
Agarplatten (100 µg/ml) mit 20 µl IPTG (0,2 M) und 20 µl
X-Gal (10% (w/v) in DMF) überschichtet werden. Man
bereitet je Transformationsansatz drei Agarplatten vor,
trägt jeweils 100, 150, bzw. 200 µl Ansatz auf und
verstreicht ihn mit einem gebogenen Glasstab auf der
Agaroberfläche. Die Agarplatten läßt man etwa 18 h im
Brutschrank bei 37°C inkubieren.
Transformationsansatz:
40 µl Epicurian Coli XLl-Blue MRF' Kan supercompetente Zellen
0,7 µl b-Mercaptoethanol (1,5 M)
10 min auf Eis inkubieren, alle 2 min schütteln
2 µl Ligationsansatz
30 min auf Eis inkubieren
45 sec/42°C, direkt anschließend auf Eis
450 µl SOC-Medium (vorgewärmt auf 42°C)
37°C/1 h schütteln
auf Agarplatten mit X-Gal, IPTG und Ampicillin ausstreichen, 37°C/18 h inkubieren.
40 µl Epicurian Coli XLl-Blue MRF' Kan supercompetente Zellen
0,7 µl b-Mercaptoethanol (1,5 M)
10 min auf Eis inkubieren, alle 2 min schütteln
2 µl Ligationsansatz
30 min auf Eis inkubieren
45 sec/42°C, direkt anschließend auf Eis
450 µl SOC-Medium (vorgewärmt auf 42°C)
37°C/1 h schütteln
auf Agarplatten mit X-Gal, IPTG und Ampicillin ausstreichen, 37°C/18 h inkubieren.
Die nach der Transformation auf der Agarplatte erhaltenen
weißen Klone werden mit Hilfe eines sterilen Holzstäbchens
(Zahnstocher) gepickt und in 3 ml Übernachtkultur bei 37°C
im Schüttelwasserbad vermehrt. Von jeder Kultur wird
eine Glycerinkultur für eine eventuelle spätere Verwendung
aufbewahrt. Dazu homogenisiert man 0,5 ml einer Kultur mit
dem gleichen Volumen Glycerin, friert die Probe in
flüssigem Stickstoff ein und lagert sie bei -80°C. Die
restlichen 2,5 ml werden in zwei Portionen in ein
Eppendorfgefäß überführt und die Zellen bei 13000 Upm, 2
min lang abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und
die Zellen in 500 µl STE-Puffer unter Schütteln
suspendiert. Man pelletiert erneut und suspendiert
anschließend für 10 min in 100 µl Lysatlösung I. Man gibt
200 µl Lysatlösung 11 zu und schwenkt die Proben
vorsichtig während der 20 minütigen Inkubation auf Eis. In
diesem Schritt erfolgt die Lysis der Zellen. Durch Zugabe
von 150 µl Lysatlösung ITT wird die chromosomale DNA bei
0°C/15 min gefällt. Dabei dürfen die Proben nur
vorsichtig gemischt werden (nicht vortexen), um ein
Zerreißen der DNA durch die Scherkräfte zu vermeiden. Die
Zelltrümmer und die chromosomale DNA werden bei 13000 Upm
/15 min abzentrifugiert und der Überstand in ein neues
Eppendorfgefäß überführt. Man extrahiert mit Phenol (pH
4,5-5) und Chloroform, fällt mit Ethanol und löst das
Pellet in 50 µl TE-Puffer. Da in diesen Proben die mRNA
der Zelle noch enthalten ist, diese das Ergebnis der
Sequenzierung auf einem ABI-Sequencer jedoch stört, muß
noch ein RNA-Verdau durch Zugabe von 250 µl ST-Puffer aus
dem Plasmid-Isolierungskit (siehe unten) durchgeführt
werden. Man fällt erneut mit Ethanol und löst die Probe in
50 µl Wasser.
Alternativ zu dieser Isolierung wurde auch ein Kit
(Nucleobond AX20, Macherey-Nagel) verwendet. Hierbei wurde
entsprechend der Vorschrift vorgegangen.
Die Reinheit und die Größe der Plasmide wurden
gelelektrophoretisch auf einem 1%igem Agarosegel
überprüft (siehe 1.2.1).
Die Primärstrukturen der Aptamere wurden mit Hilfe eines
Computerprogramms auf homologe Bereiche untersucht. Dazu
wurde ein Programm in Pascal geschrieben, das die
Sequenzen als Textdatei einliest und auf Motive variabler
Länge hin vergleicht. Es werden alle Motive, die mehrmals
auftreten, mit der Nummer der Sequenzen, in denen sie
vorgefunden wurden, in einer Textdatei ausgegeben. Diese
Datei kann mit einem Textverarbeitungsprogramm bearbeitet
oder ausgedruckt werden.
Die große Bedeutung des Amyloids im Verlauf der
Alzheimerschen Krankheit ist unbestritten, obwohl die
Ursachen der Krankheit immer noch unbekannt sind. Es
konnte jedoch gezeigt werden, daß die Ablagerungen dieses
Peptids in den Gehirnen der Patienten neurotoxisch wirken.
Durch Einsatz der PNA-Technologien wurden mit Hilfe der in
vitro-Selektion hochaffine RNA-Moleküle gegen das Amyloid
und ein Amyloidfragment. Diese Aptamere können
beispielsweise als Hilfsmittel zur weiteren Erforschung
der Krankheit dienen, können aber auch Hilfsmittel für die
Diagnose von Alzheimer sein. Es existieren Studien, die
besagen, daß der Amyloidgehalt im Blut von
Alzheimer-Patienten sich von dem gesunder Menschen
unterscheidet (Li et al., 1995, Rosenberg et al., 1997, Di
Luca et al., 1998). Dies zeigt, daß für diese
weitverbreitete Krankheit mit der Erfindung eine Diagnose
und wirkungsvolle Medikamente eröffnet werden.
Aptamere besitzen ähnliche Eigenschaften wie Antikörper,
haben den Antikörpern gegenüber aber einige Vorteile. Sie
sind kleiner und können durch chemische Synthese in hoher
Reinheit produziert werden. Die chemische Synthese erlaubt
auch eine gezielte Modifizierung bzw. den Einbau von
Reportermolekülen, was für einen Einsatz in der Forschung
und Diagnose von großem Interesse ist.
In den Amyloid-Plaques in den Gehirnen von
Alzheimer-Patienten findet man das Amyloid in der
unlöslichen β-Faltblattstruktur vor. Der Übergang von der
löslichen α-Helix- bzw. Knäuelform in die
β-Faltblattstruktur verläuft in wäßriger Lösung relativ
schnell und ist abhängig von einigen Parametern, wie z. B.
der Salzkonzentration und dem pH-Wert. Es konnte gezeigt
werden, daß die Änderung der Konformation von den
unpolaren Aminosäuren am C-terminalen Ende des Amyloids
ausgeht. Durch Verkürzen des Amyloids kann man daher
Peptide erzeugen, die sich wesentlich langsamer bzw. fast
gar nicht in die unlösliche β-Faltblattstruktur umwandeln.
Da diese verkürzten Peptide deutlich einfacher zu
handhaben und zudem auch noch kostengünstiger sind, sind
in den Ausführungsbeispielen auch Aptamere gegen ein
Fragment des Amyloids vorgestellt. Da nicht gewährleistet
ist, daß das Aptamer gegen das Fragment auch das Amyloid
erkennt, ist aber auch gegen das komplette ßA4 selektiert
worden. Es wäre denkbar, daß man auf diese Weise auch
Aptamere gegen die lösliche und unlösliche Konformation
gewinnen könnte. Die beiden Pepride wurden chemisch
synthetisiert und von Schering AG zur Verfügung gestellt.
Cys-βA4(1-16):
NH2-Cys-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser- Gly-Tyr-Glu-Val-His-His Gln-Lys-COOH
Cys-βA4(1-40):
NH2-Cys-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser- Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys- Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly- Val-Val-COOH
Cys-βA4(1-16):
NH2-Cys-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser- Gly-Tyr-Glu-Val-His-His Gln-Lys-COOH
Cys-βA4(1-40):
NH2-Cys-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser- Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val- Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys- Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly- Val-Val-COOH
Für die Selektion durch Affinitätschromatographie wurden
die beiden Peptide reversibel auf einer Matrix
immobilisiert. Dazu wurden die Peptide mit einem Cystein
am N-terminalen Ende synthetisiert, um eine
Immobilisierung auf Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia)
über Disulfidbrücken zu ermöglichen. Die freie Thiolgruppe
des Peptids substituiert die Pyridylgruppe, die durch
Umwandlung in das stabile 2-Thiopyridon eine sehr gute
Abgangsgruppe darstellt. Durch Waschen mit Dithiothreitol
(DTT) kann die Disulfidbrücke reduktiv gespalten werden
und das Peptid wieder von der Matrix eluiert werden.
Da das bei der Immobilisierung freigesetzte 2-Thiopyridon
bei 343 nm absorbiert, sollte eine Bestimmung der
Konzentration des Peptids auf dem Säulenmaterial durch
photometrische Konzentrationsbestimmung des freigesetzten
Thiopyridons möglich sein. Diese Methode führte
jedoch zu hohen, nicht reproduzierbaren Werten. Daher
wurde das Peptid von 100 µl Säulenmaterial mit DTT eluiert
und die Konzentration im Eluat mit Hilfe des Coomassie
Proteinassays bestimmt. Da der Assay nicht linear ist,
mußte zuvor eine Standardkurve mit verschiedenen
Peptidkonzentrationen aufgenommen werden. Durch
Messung der Absorption bei 595 nm und Vergleich mit der
Standardkurve wurde beim βA4(T-16) eine Beladung von 46 µM
ermittelt.
Aufgrund der hohen Tendenz zur Aggregation konnte dieser
Assay beim βA4(1-40) nicht verwendet werden. Deshalb
wurde die Konzentration des Peptids im Eluat durch
Aminosäureanalyse bestimmt. Dazu wurde das Eluat
hydrolysiert und auf einen Proteinsequencer aufgetragen.
Durch Mittelung der Peakflächen der einzelnen Aminosäuren
und Vergleich mit einer Probe bekannter Konzentration
konnte die Konzentration auch beim βA4(1-40) bestimmt
werden. Die Beladung des Säulenmaterial mit βA4(1-16) lag
bei dieser Bestimmung bei 40 µM, während sie beim
βA4(1-40) 4 µM entsprach.
Die RNA-Bibliothek entsteht durch in vitro-Transkription
aus einer DNA-Bibliothek, die chemisch an einer Festphase
synthetisiert wurde. Sie wurde mit Hilfe einer
Synthesemaschine als einzelsträngige DNA, bestehend aus
zwei Primern aus jeweils 20 Nukleotiden und einer 70
Nukleotide langen randomisierten Region, erstellt. Für die
Synthese von 3' in 5' Richtung wurde die übliche
Phosporamiditchemie verwendet. Den zufälligen
Einbau der vier Nukleotide erreicht man durch Verwendung
einer Lösung aus allen vier DNA-Phosporamiditen, wobei
die unterschiedliche Reaktivität im Mischungsverhältnis
berücksichtigt wurde (dA : dG : dC : dT = 3 : 2, 5 : 2, 5 : 2). Bei einem
randomisierten Bereich aus 70 Nukleotiden sind theoretisch
470 oder 1,4.1042 verschiedene Moleküle denkbar. Dies
entspricht allerdings 2,3.1018 mol oder 8,2.1019 kg. Dagegen
ist die tatsächlich synthetisierte Menge von ca. 1015
Molekülen so gering, daß es statistisch sehr
unwahrscheinlich ist, daß zwei gleiche Moleküle
synthetisiert wurden. Die Ausbeute jeder einzelnen
Kopplung der Synthese lag über 99% und konnte durch die
Abspaltung der Trityl-Schutzgruppe verfolgt werden. Jedoch
lag die Gesamtausbeute aufgrund der vielen Kopplungen und
der großen Verluste bei der Aufreinigung über ein
Polyacrylamidgel lediglich bei knapp 2% oder 3,8 nmol.
Von dieser DNA müssen die Moleküle abgezogen werden, die
aufgrund von Fehlern bei der Synthese (z. B. keine
vollständige Abspaltung der Schutzgruppe, Abspaltung der
Basen etc.) nicht durch PCR amplifizierbar sind. Dazu
wurde eine Probe dieser DNA in einem PCR-Zyklus mit
radioaktiv markierten Desoxynukleotid umgesetzt und die
Menge an produzierten Gegenstrang quantifiziert. Der
Anteil an durch PCR amplifizierbarer DNA lag bei 42% oder
1,6 nmol. Daraus ergibt sich eine Komplexität von ca. 1.1015
Molekülen.
Die einzelsträngige DNA-Bibliothek wurde durch PCR zum
Doppelstrang komplettiert und vervielfältigt. Dabei wurde
zusätzlich durch Verwendung eines verlängerten Primers die
17 Nukleotide lange T7-Promotorsequenz eingefügt, die für
eine Transkription in RNA benötigt wurde. Bei dieser
PCR-Reaktion lag das Ziel in einer kleinen Vermehrung
einer sehr großen DNA-Menge. Der DNA-Pool wurde um den
Faktor 13 vervielfältigt.
Die Selektion für das βA4(1-16) und das βA4(1-40) wurden
unter gleichen Bedingungen durchgeführt. Der verwendete
Bindungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, T50 mM NaCl, 5
mM MgCl2, 1 mM EDTA) wurde so an die Selektionsbedingungen
angepaßt, daß in einer Testselektion die unspezifischen
Wechselwirkungen auf der Selektionssäule minimiert wurden.
Die Selektion wurde in Kunststoffsäulen mit einer kleinen
Fritte am unteren Ende und einer großen Fritte über dem
Säulenmaterial durchgeführt. Die Säule sowie die Fritten
wurden vor der Selektion silikonisiert, um eine Adsorption
der RNA so gering wie möglich zu halten. Weiterhin wurde
nach der Ethanolfällung der RNA im Anschluß an die
T7-Transkription nur noch mit silikonisierten
Eppendorfgefäßen gearbeitet. In jeder Selektionsrunde
wurde mit einer Vorsäule mit Säulenmaterial ohne Peptid
gearbeitet, um RNA-Moleküle abzutrennen, die spezifisch an
das Säulenmaterial binden. Da die RNA-Menge, die in der
ersten Runde auf die Säule aufgetragen wurde, um ein
Vielfaches größer war als in den folgenden Runden, wurde
das Säulenvolumen der Hauptsäule auf 250 µl vergrößert,
während das Volumen der Vorsäule in allen folgenden Runden
konstant bei 100 µl gehalten wurde. In der ersten Runde
wurden 2,3 nmol des hybridisierten RNA-Pools, entsprechend
durchschnittlich 1,4 Kopien pro Sequenz, mit einer
Konzentration von 5 µM auf die Säule aufgetragen und mit 3
ml Bindungspuffer gewaschen. Durch anschließendes Waschen
mit 1 ml Elutionspuffer wurden die Disulfidbrücken
gespalten und das Peptid mit der spezifisch bindenden RNA
eluiert. Das Peptid wurde durch Phenol/Chloroform-Ex
traktion abgetrennt, die RNA mit Ethanol gefällt und in
cDNA revers transkribiert, durch PCR amplifiziert und für
die nächste Runde in RNA transkribiert. In der ersten
Runde konnte die Komplexität des Pools bereits so weit
herab gesetzt werden, daß in allen weiteren Runden nur
noch 500 µmol renaturierte RNA mit einer Konzentration von
2,5 pH auf die Säule aufgetragen wurden. Außerdem wurde
das Säulenbettvolumen der Hauptsäule auf 100 µl verringert
und nur noch mit 2 ml Bindungspuffer gewaschen. Bei beiden
Selektionen wurde ein Anstieg der spezifisch eluierten RNA
in der 4. Runde beobachtet. Nach der 8. Runde konnte die
Selektion abgebrochen werden, da kein weiterer Anstieg der
spezifisch eluierten RNA beobachtet werden konnte (Tab. 1).
Auffällig ist, daß der Anteil der auf der Vorsäule
bindenden RNAs von Runde zu Runde zunimmt, obwohl in jeder
Runde eine Vorsäule verwendet wurde (Tabelle 1). Ebenfalls
ansteigend ist der Anteil der RNA, der nicht von der Vor-
und Hauptsäule eluiert werden kann.
Die Eluate nach der achten Selektionsrunde wurden revers
transkribiert und durch PCR amplifiziert. Man erhält so
ein Gemisch aus Aptamersequenzen, die für eine Analyse
separiert werden müssen. Durch Klonierung in kompetenten
Bakterienzellen, die genau ein DNA Plasmid aufzunehmen
vermögen, und anschließendes Ausstreichen auf einer
Agarplatte erhält man einzelne Kolonien, die eine
Aptamersequenz enthalten. Für die Transformation
wurde die DNA in den pPCR-Script Amp SK(+) cloning vector
(Stratagene) ligiert. Dieser Vektor enthält ein Gen für
Ampicillinresistenz sowie einen lac Promotor. Nach
Transformation des Vektors in Epicurian Coli XLT-Blue
MRF'Kan Zellen wurden die Zellen auf Agarplatten
mit X-Gal, IPTG und dem Antibiotikum Ampicillin
ausgestrichen. Aufgrund des Ampicillins können nur
transformierte Zellen wachsen, wobei sich jene mit einem
Vektor ohne Insert aufgrund des X-Gals und des intakten
β-Galactosidase-Gens blau färben. Es wurden zu jeder
Selektion etwa 100 weiße Klone ausgewählt und die Plasmide
isoliert. Sequenziert wurden die Inserts nach der
Didesoxymethode von Sanger et al (Sanger et al., 1977),
wobei ein Teil radioaktiv mit 35S und ein Teil unter
Verwendung eines ABI-Sequencers sequenziert wurde.
Durch Verwendung des Universalprimers und des reversen
Primers wurden beide Stränge des Inserts sequenziert.
Insgesamt wurden für das βA4(T-40) und das βA4(1-16)
jeweils 75 Proben sequenziert.
Die Primärstrukturen des randomisierten Bereichs der
Aptamere, bestehend aus etwa 70 Nukleotiden, wurden auf
homologe Bereiche untersucht. Die Existenz von
konservierten Bereichen kann Aufschluß geben, welche
Nukleotide an einer Bindung an das Zielmolekül
beteiligt sind. Es wurde ein Computerprogramm geschrieben,
das die Suche nach gleichen Motiven unterschiedlicher
Länge durchgeführt hat. Die 75 ermittelten Sequenzen der
Selektion gegen das βA4(1-40) können in 5 Gruppen
eingeteilt werden, die für sich in hohem
Maße konserviert sind (Fig. 1). 13 der 75 Sequenzen können
in keine der Gruppen eingeteilt werden und besitzen auch
untereinander keine konservierten Regionen. In allen
anderen Sequenzen ist das Motiv b1 mit bis zu 11 Basen
vertreten (Tabelle 2). Drei weitere Motive, die
in einem Großteil der Sequenzen auftreten, sind in Tabelle
2 aufgeführt.
Wie bei den Sequenzen für das βA4(T-40) können auch die
Sequenzen der Aptamere gegen das βA4(1-16) in Gruppen
eingeteilt werden, die sehr stark konserviert sind (Fig. 2).
Anders als bei den Sequenzen der βA4(1-40)-Selektion
gibt es nur ein Motiv, das in mehr als zwei Gruppen
auftritt. Das Motiv a1 mit 9 Basen tritt jedoch in über
der Hälfte der Sequenzen auf (Tabelle 3). Es wurden fünf
weitere Motive aus 6 bis 11 Basen gefunden.
Die Aptamere gegen das βA4(1-40) wurden auch hinsichtlich
ihrer Sekundärstruktur analysiert, wobei die
Sekundärstrukturmodelle mit Hilfe des Computerprogramms
RNADraw berechnet wurden (Matzura & Wennborg, 1996).
Erwartungsgemäß zeigte sich, daß innerhalb einer
Familie die Strukturen der Aptamere ähnlich sind. In den
Fig. 3-6 sind die Strukturen einiger Aptamere aus
unterschiedlichen Familien dargestellt. Beim Vergleich der
Strukturen fällt auf, daß das Motiv b2 (Tabelle 2) bei
allen Aptameren mit dem Anfang des Primer A basengepaart
auftritt. Da nicht alle Basen des Motivs komplementär zum
Primer sind, tritt ebenfalls in jeder Struktur ein Loop
auf. Dies läßt vermuten, das diese Stem-Loop Region
entscheidend für die Wechselwirkung mit dem Amyloid ist.
Dabei besitzt der Stamm vermutlich nur eine
stabilisierende Funktion, während eine Bindung an das
Peptid über die ungepaarten Basen des Loops stattfinden
könnte. Unterstützt wird diese Annahme dadurch, daß
bei allen Sequenzen immer vier Uridine bzw. drei Uridine
und ein Cytidin diesen Loop bilden. Beim Aptamer β61 in
Fig. 3 sind dies die Basen U6, U7, U72 und U73.
Obwohl zu einer anderen Gruppe gehörig, ähnelt das Aptamer
β124 dem β61 sehr. Neben dem Primer-gepaarten Motiv und dem
Loop findet man bei beiden auch noch einen Hairpin mit der
Basenfolge AAG (Fig. 3, A50-G52, Fig. 4, A46-G48).
Während die Anordnung des Motivs b2 in allen Sequenzen
ähnlich ist, sind die Gemeinsamkeiten beim Motiv b1 nicht
so eindeutig zu erkennen. Zwar tritt bei der Sequenz des
β61 wie auch beim β124 die ungepaarte Basenreihenfolge UAAG
auf (Fig. 4, C32-G35), doch sind bei anderen Sequenzen
diese Basen gepaart. Dennoch scheint dieses Motiv bei der
Bindung des Peptids eine Rolle zu spielen, da ein Aptamer,
β19, gefunden wurde, in dem die Reihenfolge der Motive b1
und b2 vertauscht ist (Abb. 15). In der Nähe des 5'-Endes
liegt das Motiv b2, das auch hier wieder mit dem Primer A
basengepaart vorliegt, während das Motiv b1 nahe des
3'-Endes angeordnet ist. Eine strukturelle Ähnlichkeit
dieses Bereichs mit den anderen Aptameren ist jedoch nicht
ohne weiteres ersichtlich.
Das Aptamer β55, mit der niedrigsten Dissoziationskon
stante, unterscheidet sich etwas stärker von den
Strukturen der anderen Aptamere, obwohl auch hier wieder
die Motive b1 und b2 vorzufinden sind (Fig. 6). Im
Gegensatz zu den anderen Strukturen sind hier weniger
Basen mit dem Primer A gepaart. Auch der Loop aus den vier
Pyrimidinen tritt in dieser Form nicht auf. Stattdessen
existiert ein Loop aus den Basen AAU. In dem Motiv b1
liegen auch nur zwei Basen U-A (Fig. 6, U28, A29)
einzelsträngig vor, was bedeuten könnte, daß diese beiden
Basen an der Bindung des Peptids beteiligt sind. Auffällig
ist, daß bei allen vier vorgestellten Strukturmodellen
die letzten drei Basen des Primers in einen Hairpin
hineinragen. Da diese Basen jedoch konserviert sind, muß
es sich nicht um ein bedeutendes Strukturmerkmal handeln.
Das Strukturmodell dieses Aptamers wurde durch
enzymatische Spaltung mit RNasen genauer untersucht. Zu
diesem Zweck wurde die RNA am 3- bzw. 5'-Ende radioaktiv
markiert und unter Verwendung verschiedener spezifisch
spaltender Nukleasen einer limitierten nukleolytischen
Hydrolyse unterzogen. Verwendet wurden die
Einzelstrang-spezifischen Nukleasen Ribonuklease T2 und
Nuklease S1, die Doppelstrang-spezifische Ribonuklease V1
sowie die Guanosin-spezifische Ribonuklease T1. Der
Vergleich der Strukturen legt die Vermutung nahe, daß das
3'-Ende der Aptamere bis zu den Basen des Motivs b2 nicht
essentiell ist für die Bindung des Peptids.
Die Bindung eines Aptamers an sein Target und damit die
Bildung eines Komplexes kann als eine Gleichgewichts
reaktion betrachtet werden. Mit Hilfe der
Affinitätschromatographie wurden die apparenten
Dissoziationskonstanten bestimmt werden. Bei dieser
Methode macht man sich das Gleichgewicht zwischen freier
und gebundener RNA zunutze, indem man durch Waschen mit
Bindungspuffer die RNA von der Säule eluiert. Je stärker
die RNA an das Peptid bindet, desto später wird die RNA
von der Säule eluiert. Das Elutionsvolumen ist daher ein
Maß für die Bindungskonstante in Abhängigkeit von der
Säulengröße sowie der Beladung der Säule mit dem Peptid
und läßt sich nach einer in folgender Literaturstelle
angegebenen Gleichung berechnen (Famulok & Szostak, 1992,
Sassanfar & Szostak, 1993). Damit diese Gleichung gültig
ist, muß das Säulenvolumen im Verhältnis zum Volumen der
autgetragenen RNA möglichst groß sein, damit wie bei einer
säulenchromatographischen Aufreinigung die RNA in einer
schmalen Bande durch die Säule läuft. Außerdem sollte die
Konzentration der RNA-Lösung kleiner sein als die zu
erwartende Bindungskonstante, um die Gleichung innerhalb
ihres Gültigkeitsbereichs anzuwenden und so den Fehler der
Dissoziationskonstante möglichst klein zu halten (Arnold
et al., 1986). Daraus folgt, daß die RNA sehr stark
radioaktiv markiert sein muß, damit selbst kleinste Mengen
im fmol-Bereich noch detektiert werden können. Es wurde
mit Mikrosäulen des Econo-Systems (Bio-Rad) gearbeitet,
die sich durch einen geringen Querschnitt auszeichnen. 10
µl einer 100 nM RNA Lösung wurden auf eine Säule mit einem
Säulenbettvolumen von 800 µl aufgetragen und
kontinuierlich mit Hilfe einer Pumpe eluiert. Das
Elutionsprofil des Aptamers β55 wies einen scharfen Peak zu
Beginn der Elution auf, welcher vermutlich auf fehlerhaft
gefaltete RNA zurückzuführen ist, die nicht mit dem Peptid
interagieren kann. Diesen Peak kann man zur Bestimmung des
Totvolumens V0 verwenden. Um das Totvolumen möglichst genau
zu bestimmen, wurde zu Beginn der Elution ein sehr kleines
Fraktionsvolumen gewählt, während später deutlich größere
Fraktionen gesammelt wurden. Um die Aktivitäten der
unterschiedlich großen Fraktionen vergleichen zu können,
wurden die Daten auf ein konstantes Volumen von 100 µl
normiert.
Um zu zeigen, daß es sich um eine spezifische Anreicherung
von bindenden Aptameren handelt, wurde zum Vergleich ein
Elutionsprofil des randomisierten. RNA-Pools aufgenommen.
Wie zu erwarten konnte hier keine Retardierung der RNA
beobachtet werden.
Durch den Einsatz einer Vorsäule mit unbeladenem
Trägermaterial in allen Selektionsrunden sollte eine
Anreicherung von Säulenmaterial-affinen RNAs bereits
verhindert worden sein. Um dennoch sicherzustellen, daß es
sich bei den selektierten RNAs um Peptid-bindende Aptamere
handelt, wurde ein Elutionsprofil der RNA auf einer
Vorsäule aufgenommen. Da bei der Elution der RNA von der
Vorsäule keine Retardierung beobachtet werden konnte, kann
geschlossen werden, daß es sich um Aptamere gegen das
Amyloid handelt.
Die Dissoziationskonstanten von vier Aptameren gegen das
βA4(1-40) konnten auf diese Weise bestimmt werden (Tabelle
4). Da die verwendete RNA-Konzentration um den Faktor 5
größer ist als die beste Dissoziationskonstante, muß ein
Fehler einkalkuliert werden, so daß die wirklichen
Dissoziationskonstanten vermutlich geringfügig größer
sind.
Obwohl die RNA vollständig von der Säule eluiert wurde,
wurde das Säulenmaterial nach maximal drei Bestimmungen
ausgewechselt, da keine Retardierung der RNA mehr
festgestellt werden konnte. Dadurch wurde das
Säulenmaterial zur limitierenden Größe, und es konnten
nicht mehr Proben vermessen werden.
Die Bestimmung der Dissoziationskonstante für die Aptamere
gegen das ßA4(1-16) wurde analog durchgeführt. Hier konnte
allerdings nur eine bindende Sequenz gefunden werden.
Claims (12)
1. Gegen Nukleinsäure-spaltende Enzyme stabilisiertes
Aptamer, welches amyloidspezifisch ist, oder Alle
le und/oder Derivate eines solchen Aptamers.
2. Aptamer nach Anspruch 1, welche gegen das Alzhei
mer β-Amyloid 4 (1-42) oder Teilsequenzen hiervon,
insbesondere (1-40), spezifisch ist.
3. Aptamer nach Anspruch 1 oder 2 mit einer
Loopstruktur.
4. Aptamer nach Anspruch 3, wobei die Loopstruktur
vier Basen, vorzugsweise vier Uridine oder drei
Uridine und ein Cytidin aufweist, vorzugsweise aus
den vier Basen besteht.
5. Aptamer nach einem der Ansprüche 1-4 enthaltend
eine Sequenz GUUU oder GUCU.
6. Aptamer nach einem der Ansprüche 1-5, enthaltend
eine Sequenz aus der Gruppe bestehend aus den Se
quenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 68
7. Aptamer nach Anspruch 6, wobei das 3'-Ende eine
Primersequenz gemäß SEQ ID NO: 69 und/oder das
5'-Ende eine Primersequenz SEQ ID NO: 70 aufweist.
8. Aptamer nach Anspruch 7, wobei die Loopstruktur
gebildet ist aus der Sequenz UUUC oder GUCU und
der hierzu gegenüberliegenden Primersequenz AUUC
und wobei die jeweilig mittleren beiden Basen un
gepaart und die jeweilig äußeren Basen gepaart
sind.
9. Aptamer nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die
2'-Hydroxylgruppe der Zuckergruppe eines oder meh
rerer Pyrimidin-Nucleotide durch eine Flourid-,
Amino- oder Methoxygruppe substituiert ist und/o
der wobei in terminalen Phosphatgruppen ein Sauer
stoffatom durch ein Schwefelatom substituiert ist
und/oder wobei das Aptamer ein Spiegelmer ist.
10. Verfahren zur Herstellung und/oder Isolierung ei
nes Aptamers nach einem der Ansprüche 1-9, mit
folgenden Verfahrensschritten:
- a) es wird ein randomisierter DNA-Pool geschaffen,
- b) aus dem randomisierten DNA-Pool wird ggf. ein RNA-Pool erzeugt und einem Selektionskreislauf mit folgenden Schritten aufgegeben:
- c) an das Amyloid oder eine Teilsequenz des Amy loids bindende RNA des RNA-Pools bzw. DNA des DNA-Pools wird selektiert,
- d) selektierte RNA bzw. DNA wird amplifiziert,
- e) die RNA bzw. DNA aus Stufe d) wird dem RNA-Pool bzw. DNA-Pool in der Stufe c) zugegeben, wobei die Stufen c)-e) so oft wiederholt werden, bis der Anteil in Stufe c) selektierter RNA bzw. DNA um weniger als 50%, vorzugsweise weniger als 10% ansteigt.
11. Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 9, erhält
lich durch ein Verfahren nach Anspruch 10.
12. Verwendung eines Aptamers nach einem der Ansprüche
1-9 oder einer Mischung solcher Aptamere zur Her
stellung eines Mittels zur Diagnose und/oder Be
handlung von Alzheimer, Spongiformen Enzephalopa
tien und Typ II Diabetes Mellitus.
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Family
ID=7904255
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