DE19903506A1

DE19903506A1 - Verfahren, Gefäß und Vorrichtung zur Überwachung der Stoffwechselaktivität von Zellkulturen in flüssigen Medien

Info

Publication number: DE19903506A1
Application number: DE19903506A
Authority: DE
Inventors: Andreas Katerkamp; Key Goeran; Gabriele Chemnitius
Original assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Current assignee: 02-SCAN GMBH, 48149 MUENSTER, DE
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2019-01-30
Also published as: DE19903506C2; ATE222951T1; CA2361119A1; DK1144586T3; EP1144586B1; WO2000044876A3; DE50000413D1; JP2002534997A; US6730471B1; EP1144586A2; WO2000044876A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung der Stoffwechselaktivität von Zellen in flüssigen Medien, ein geeignetes Gefäß und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Mit der erfindungsgemäßen Lösung sollen die Meßgenauigkeit erhöht und die erforderlichen Kosten für die Überwachung des Sauerstoffverbrauches und damit der Stoffwechselaktivität kultivierter Zellen verringert werden können. Hierfür wird die Sauerstoffkonzentration optisch mit Sensormembranen in einem flüssigen Medium, das in teilweise für Sauerstoff durchlässigen Gefäßen aufgenommen ist, bestimmt. Dabei werden die gemessenen Sauerstoffkonzentrationen, die in Gefäßen, die kultivierte Zellen in einem flüssigen Medium enthalten, mit einer gemessenen Sauerstoffkonzentration, in einem Gefäß, in dem lediglich ein solches flüssiges Medium, ohne Zellen enthalten ist und/oder einer mit Meßwerten anderer Parameter berechneten Sauerstoffkonzentration einem Wertevergleich unterzogen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung der Stoffwechselaktivität von Zellen in flüssigen Medien, ein hierfür besonders geeignetes Gefäß und entsprechende Vorrichtung zur Durchführung des Ver fahrens.

In den Gefäßen sind zu kultivierende Zellen sowie ein flüssiges Medium enthalten, wobei es sich bei letzte rem, um eine herkömmlich gegebenenfalls der verwende ten Zellen entsprechende Nährlösung handelt. Die er findungsgemäße Lösung kann für die verschiedensten Zellen und die verschiedensten Untersuchungen, ins besondere im pharmakologischen Bereich eingesetzt werden, wobei die Stoffwechselaktivität der Zellen über einen längeren Zeitraum beobachtet werden kann. Es kann z. B. eine Wirkungsüberwachung bei Cytotoxizi täts- und Biokompatibilitätstests durchgeführt wer den, oder die Optimierung der Kulturbedingungen für die Produktion von Biomolekülen.

Die Hauptnährstoffquelle für Zellkulturen ist übli cherweise Glukose, die durch aerobe Glukolyse zu Lak tat oder oxidativ unter Sauerstoffverbrauch und Koh lendioxid-Bildung umgewandelt werden kann. Dabei wir ken sich viele Einflüsse der Physiologie einer Zelle in ihrer Stoffwechselaktivität aus, so daß auch der Sauerstoffverbrauch entsprechend schwanken kann. Aus gehend vom Zusammenhang Stoffwechselaktivität der Zellen in bezug zum Sauerstoffverbrauch und z. B. dem Glukose, L-Glutamin Verbrauch oder der Erzeugung von Laktat kann aus deren Kenntnis auf den Zustand der überwachten Zellen und demzufolge auf den Einfluß der jeweiligen Kulturbedingungen geschlossen werden.

Auf diesen Erkenntnissen aufbauend ist von Lisa Ran ders-Eichhorn u. a. in "Noninvasive Oxygen Measure ments and Mass Transfer Cosiderations in Tissue Cul ture Flasks", veröffentlicht in Biotechnology and Bioengineering, Vol. 51, Seiten 466 bis 478 beschrie ben worden, wie der Sauerstoffverbrauch von in T-Fla schen kultivierten Zellen durch optische Messung be stimmt werden kann. Dort wird vorgeschlagen, Fluores zenzindikatoren enthaltende Sensormembranen unmittel bar auf dem Flaschenboden und im Gasraum oberhalb der Nährlösung in einer solchen T-Flasche anzuordnen. Bei der Sauerstoffkonzentrationsmessung mit solchen Sen sormembranen wird das bekannte physikalische Phänomen der Fluoreszenzlöschung bekannter Fluoreszenzfarb stoffe, wie z. B. Ruthenium (II)-Komplexe, infolge von Sauerstoffeinfluß ausgenutzt, wobei sich die jeweili ge Fluoreszenzintensität, bei konstanter Anregung entsprechend der Sauerstoffkonzentration bzw. des Sauerstoffpartialdruckes verändert. Zur Bestimmung der Sauerstoffkonzentration kann die jeweilige Fluo reszenzintensität unmittelbar aber auch die Fluores zenzlebensdauer gemessen werden und anhand einer be kannten Kalibration die Sauerstoffkonzentration be stimmt werden.

Die in diesem Dokument beschriebene Meßanordnung, insbesondere die Anordnung der Sensormembran auf dem Boden der T-Flaschen und die vernachlässigte Bestim mung einiger wichtiger Einflußgrößen, eignet sich nicht dazu, über den Sauerstoffverbrauch auf die Stoffwechselaktivität der kultivierten Zellen zu schließen.

Der Eintrag von Sauerstoff in die Nährlösung erfolgt zum größten Teil über die Grenzfläche der Nährlösung zum Gasraum, hier also zum Gasraum in der T-Flasche und der Verbrauch erfolgt durch die auf dem Boden der T-Flasche befindlichen Zellen. Die maximal mögliche Sauerstoffkonzentration, die in der Nährlösung er reicht werden kann, ist die Sauerstoffsättigungskon zentration C_sat (in mg/l), die nach der Gleichung

C_sat = ([p-γ.p_w(T)]/p_o.α(T).X_o2

vom Gesamtgasdruck p (in mbar), der relativen Feuchte γ (in Werten von 0 bis 1, wobei 1 einem Wert von 100% und 0 einem von 0% entspricht), dem Wasser dampfpartialdruck p_w(T) (in mbar) in Abhängigkeit von der Temperatur T, dem Molenbruch des Sauerstoffs X₀₂ im Gasraum der T-Flasche, e dem Bunsen'schen Absorp tionskoeffizienten α(T) (in mg/l) in Abhängigkeit von der Temperatur T und dem Normaldruck p_o = 1013 mbar abhängt. Dabei ist vorausgesetzt, daß der Gasraum und die Nährlösung die gleiche Temperatur besitzen und der Gasraum mit atmosphärischer Luft, deren chemische Zusammensetzung hinlänglich bekannt ist, gefüllt wur de. Diese Voraussetzungen sind üblicherweise in Brut schränken, in denen Zellen kultiviert werden, gege ben. Diese Sauerstoffsättigungskonzentration stellt sich direkt unterhalb der Oberfläche in der Nährlö sung ein. Von dort wird der Sauerstoff durch unter schiedliche Effekte, wie Diffusion und/oder Konvek tion zu den am Boden befindlichen Zellen transpor tiert. Zwei Größen sind in einem solchen System maß gebend. Zum einen ist dieses die Verbrauchsrate k_v, mit der der Sauerstoff durch die Zellen verbraucht wird und zum anderen die Transportrate k_T, mit der der Sauerstoff zu den Zellen transportiert wird. Bei de Größen zusammen sind verantwortlich dafür, daß von der Oberfläche der Nährlösung zum Boden mit Zellen ein Sauerstoffgradient entsteht. Ist nun die Ver brauchsrate geringfügig kleiner oder gleich groß wie die Transportrate, so wird mit der Sauerstoffmembran am Boden unterhalb der Zellen eine Sauerstoffkonzen tration vom Wert Null bestimmt. Die Zellen leiden in diesem Fall aber nicht an einer Sauerstoffversorgung, da noch genügend Sauerstoff zu den Zellen transpor tiert wird, dieser aber nicht mehr zur Sensormembran unterhalb der Zellen gelangt und entsprechend auch nicht mehr gemessen werden kann. Wenn die Verbrauchs rate weiter ansteigt, z. B. durch Vermehren der Zel len, und die Verbrauchsrate größer wird als die Transportrate, so kann dieses mit der Sauerstoffmem bran am Boden unterhalb der Zellen auch nicht mehr beobachtet werden. Weiterhin ist die Sauerstoffsätti gungskonzentration neben der Verbrauchs- und Trans portrate in Abhängigkeit vom Gesamtgasdruck, der Feuchte, der Temperatur und dem Molenbruch des Sauer stoff bzw. dem Sauerstoffpartialdruck im Gasraum der T-Flasche eine sehr wichtige Größe. Eine Änderung verursacht eine Änderung des Sauerstoffgradienten und damit eine Änderung der Sauerstoffkonzentration an einer beliebigen Stelle zwischen den Zellen und der Oberfläche der Nährlösung. Da die Parameter Gesamt druck, Feuchte und Temperatur in der genannten Doku mentation nicht bestimmt oder kontrolliert wurden, ist nicht auszuschließen, daß durch Schwankungen in diesen Parametern die Meßergebnisse verfälscht wur den.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, Möglichkeiten vorzugeben, mit der die Überwachung des Sauerstoff verbrauches und damit die Stoffwechselaktivität kul tivierter Zellen kostengünstig und mit erhöhter Ge nauigkeit erreicht werden kann.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 1 für ein Verfahren und den Merkmalen des Anspruchs 11 für ein geeignetes Gefäß gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungsformen und Weiterbildungen der Erfindung, ergeben sich mit den in den unterge ordneten Ansprüchen genannten Merkmalen.

Die erfindungsgemäße Lösung geht nunmehr davon aus, daß Zellen in Gefäßen unter Verwendung eines flüssi gen Mediums, wobei es sich hier in der Regel um eine entsprechende Nährlösung handelt, kultiviert werden und deren Stoffwechselaktivität über die Messung der Sauerstoffkonzentration, an einem Ort im flüssigen Medium zwischen den Sauerstoff verbrauchenden Zellen und dem für den Sauerstoffeintrag in das flüssige Medium maßgebenden Teil, hier die Oberfläche der Nährlösung, erfolgt. Dabei wird die Sauerstoffsätti gungskonzentration im flüssigen Medium anhand von Vergleichsmessungen in einem Zellkulturgefäß ohne Zellen und/oder über die Bestimmung der Parameter Druck, Feuchte, Temperatur und bei bekannter und kon stanter chemischer Zusammensetzung des umgebenden Gasraumes, hier die Molenbrüche der Gaskomponenten bzw. deren Partialdrücke in atmosphärischer Luft be stimmt. Aus dem Vergleich zwischen der Sauerstoffsät tigungskonzentration als Sollwert und der Sauerstoff konzentration an einer Stelle des Sauerstoffgradien ten im Gefäß mit den kultivierten Zellen als Istwert wird der auf den Sauerstoffverbrauch und damit auf die Stoffwechselaktivität der Zellen geschlossen.

Für die Überwachung können hierbei, im Gegensatz zum Stand der Technik, ohne weiteres Gefäße verwendet werden, die über eine Öffnung verfügen, so daß die Oberfläche des flüssigen Mediums von der umgebenden Atmosphäre beeinflußt werden kann. Eine solche Öff nung kann in bestimmten Fällen aber auch mit einer zumindest für Sauerstoff permeablen Membran abgedeckt bzw. abgeschlossen sein, so daß beispielsweise ein Eindringen unerwünschter Keime verhindert werden kann.

Die Sauerstoffkonzentration wird, bevorzugt optisch mit einer hierfür geeigneten Sensormembran gemessen, deren optische Eigenschaften sich in Abhängigkeit von der jeweiligen Sauerstoffkonzentration verändern. Es sollte sich also in einem entsprechenden Gefäß, zu mindest eine geeignete Sensormembran befinden, die so angeordnet ist, daß sie oberhalb der auf dem Gefäßbo den kultivierten Zellkulturen, jedoch unterhalb der Oberfläche des flüssigen Mediums angeordnet ist.

Verbrauchen die auf dem Gefäßboden kultivierten Zel len Sauerstoff, wird sich entsprechend die Sauer stoffkonzentration im flüssigen Medium verringern und die tatsächlich mit der Sensormembran gemessene Sau erstoffkonzentration wird durch den Sauerstoffver brauch infolge Stoffwechselaktivität und der Sauer stoffmenge, die infolge des aufgetretenen Sauerstoff konzentrationsgradienten wieder in das flüssige Medi um hinein gelangt, bestimmt.

Da die Gesetzmäßigkeiten für die Sättigungskonzentra tion von Sauerstoff in flüssige Medien relativ genau bekannt sind, besteht die Möglichkeit, bei Berück sichtigung bekannter Parameter, hier insbesondere der entsprechenden Temperatur, Druck und Feuchte die ent sprechende Sauerstoffsättigungskonzentration in einem flüssigen Medium zu berechnen, so daß dieser berech nete Sauerstoffkonzentrationswert einem Wertever gleich mit der tatsächlich gemessenen Sauerstoffkon zentration für die Bewertung des Sauerstoffkonsums bzw. der Stoffwechselaktivität der Zellkulturen un terzogen werden kann.

Es besteht aber auch die Möglichkeit, eine Referenz messung durchzuführen, wobei ein zweites Gefäß ver wendet wird, in dem lediglich ein Nährmedium, das bezüglich der Sauerstoffeindiffusionseigenschaften mit den verwendeten Nährlösungen völlig identisch ist, verwendet wird. In einem solchen Referenzgefäß ist wiederum, bevorzugt an gleicher Stelle eine ent sprechende Sensormembran angeordnet, mit der die un beeinflußte Sauerstoffkonzentration gemessen werden kann. Auch die so gemessene Referenzsauerstoffkonzen tration kann mit der durch Stoffwechselaktivität be einflußten Sauerstoffkonzentration einem entsprechen den Wertevergleich unterzogen werden, um die Stoff wechselaktivität der kultivierten Zellen zu beurtei len.

Selbstverständlich kann ein solcher Wertevergleich auch gemeinsam für die berechnete Sauerstoffkonzen tration und das Sauerstoffkonzentrationsmeßsignal im Referenzgefäß mit der unter von kultivierten Zellen moderierten Stoffwechsel gemessenen Sauerstoffkonzen tration gleichzeitig durchgeführt werden.

Die Aussagekraft bei der Bewertung der Stoffwechsel aktivität von kultivierten Zellen kann außerdem er höht werden, wenn zusätzlich Sensormembranen in den Gefäßen und diese hier wiederum so angeordnet werden, wie die sauerstoffsensitiven Membrane, die eine Oxidoreductase auf einer sauerstoffsensitiven Membran enthalten und mit denen die Sauerstoffkonzentrations änderung durch Substratumsatz des Enzyms gemessen werden kann.

Günstigerweise sollten diese beiden verschiedenen Sensormembranen im zumindest nahezu gleichen Abstand von den Zellkulturen innerhalb des flüssigen Mediums angeordnet sein. Zur Ermittlung der Konzentration des Oxidoreductasesubstrats und damit der Stoffwechsel aktivität werden die Floreszenzsignale der Sauer stoffmembran und der zweiten Sauerstoffmembran, die mit der zusätzlichen Membran belegt ist, verglichen. Dabei kann es notwendig sein, das Signal der ersten Sensormembran von dem Signal der zweiten Sensormem bran abzuziehen, um so die Sensorantwort auf den en zymatischen Versuch des Sauerstoffs zu erhalten und damit die Substratkonzentration zu bestimmen. Dabei kann auch die Einführung eines Faktors vorteilhaft sein, durch den die unterschiedlichen Sauerstoff transportverhältnisse an den beiden Sensormembranen berücksichtigt sind. Es kann außerdem auch notwendig sein, zur Auswertung des Signals des enzymatischen Sensors je nach Sauerstoffkonzentration in der Lösung verschiedene Kalibrationskurven zu verwenden, da Sau erstoff ein Cosubstrat der enzymatischen Reaktion ist. In jedem Fall kann durch eine Bestimmung der Enzymaktivität die Stoffwechselaktivität der Zellen im weiteren unabhängig vom Sauerstoffverbrauch der kultivierten Zellen bestimmt werden.

Da sich die Stoffwechselaktivität der kultivierten Zellen relativ langsam über größere Zeiträume verän dert, genügt es, die jeweiligen Konzentrationen in größeren Zeitabständen, beispielsweise in Intervallen von mehreren Minuten zu messen, um mit ausreichender Genauigkeit, die Stoffwechselaktivität der jeweiligen Zellkulturen zu überwachen, was zur Folge hat, daß sich der erforderliche Aufwand für einen geeigneten Meßaufbau durch einen möglichen Mulitplexbetrieb ver ringern läßt.

Da die Konzentration vorteilhaft optisch gemessen werden soll, ist es erforderlich, Gefäße zu verwen den, die zumindest in bestimmten Bereichen optisch transparent sind, so daß die entsprechende Lichtin tensitätsänderung, beispielsweise mit Lichtwellenlei tern (Glasfasern) und einem geeigneten optischen Sen sor gemessen werden kann. Dabei muß ein solcher Lichtwellenleiter nicht unmittelbarer Bestandteil eines verwendeten Gefäßes oder mit diesem unmittelbar verbunden sein, sondern er kann so angeordnet und ausgerichtet sein, daß er lediglich mit seiner Aper tur den Bereich oder Teile einer Sensormembran erfas sen kann. Meßort und Meßgefäß können demzufolge ohne weiteres örtlich voneinander getrennt sein.

Es besteht weiterhin die Möglichkeit, wie bereits mit der Möglichkeit der multiplexen Messung angedeutet, mehrere Gefäße, in denen gleiche oder verschiedene Zellen kultiviert werden, gemeinsam zu überwachen, wobei diese jeweils einzeln nacheinander durch ent sprechende Schaltung zumindest eines Multiplexers berücksichtigt werden können. Es kann daher eine qua si ortsaufgelöste Messung von Konzentrationen durch geführt werden. Es können z. B. Sensormembranen ver wendet werden, die sauerstoffkonzentrationsabhängig ihre Absorptions- bzw. Reflexionseigenschaften ändern. Es besteht aber auch die Möglichkeit, aufbau end auf bekannten Lösungen, das Phänomen der Fluores zenzlöschung auszunutzen und Sensormembranen zu ver wenden, in denen bekannte Fluoreszenzfarbstoffe ent halten sind, die in der Lage sind, bei Anregung mit Licht bestimmter Wellenlängen zu fluoreszieren, wobei die Wellenlänge des Anregungslichtes und die Wellen länge des Fluoreszenzlichtes unterschiedlich sind.

Im letztgenannten Fall kann die Konzentration einmal durch direkte Messung der jeweiligen Fluoreszenzin tensität gemessen werden. Günstiger ist es aber, die Fluoreszenzlebensdauer zu bestimmen, da in diesem Fall die Alterung und demzufolge auch das bekannte Ausbleichverhalten die Meßgenauigkeit nicht beein flußt.

Die sauerstoffsensitiven Sensormembranen können mit tels verschiedenster Techniken auch nachträglich in, für die erfindungsgemäße Lösung verwendbare Gefäße eingebracht werden. Solche Sensormembranen können durch Dispensieren, Sprühen, Tauchen oder auch Kleben lokal gezielt aufgebracht werden. Geeignete Anbrin gungsorte in solchen Gefäßen sind z. B. die Gefäßin nenwand in einem bestimmten Abstand vom Gefäßboden und besonders geeignet sind über die Gefäßbodenfläche hinausragende podestartige Elemente, auf deren oberer Stirnfläche eine entsprechende Sensormembran ausge bildet bzw. aufgebracht werden kann. In diesem Fall sind zumindest die podestartigen Elemente aus einem für die relevanten Wellenlängen transparenten Materi al gebildet, so daß das entsprechende Monitoring von unten durch den Gefäßboden erfolgen kann. Die übrigen Gefäßbestandteile müssen dann nicht zwingend aus ei nem transparenten Material bestehen.

In einem erfindungsgemäß verwendbaren Gefäß können in einem Abstand voneinander zwei solcher podestartigen Elemente angeordnet sein, auf denen einmal eine aus schließlich sauerstoffsensitive Sensormembran aufge bracht ist und zum anderen eine solche, die mit einer enzymatischen Oxidase beschichteten Membran gegenüber dem flüssigen Medium abgeschlossene Zusatzmembran ausgebildet ist, aufgebracht sein kann.

Besonders günstig ist es, wenn beispielsweise eine größere Anzahl von Proben gleichzeitig überwacht wer den soll, ein erfindungsgemäßes Gefäß, analog zu den bekannten Mikrowellplatten auszubilden, bei dem in einer solchen Mikrowellplatte eine größere Anzahl von Aufnahmeräumen (Kavitäten) für die zu kultivierenden Zellen mit dem flüssigen Medium in mehreren Reihen nebeneinander angeordnet sind. Eine so ausgebildete Mikrowellplatte kann dann beispielsweise in einem Brutschrank zur Zellkultivierung untergebracht sein, wobei das Anregungslicht und das Fluoreszenzlicht über Lichtwellenleiter von einer geeigneten Licht quelle auf die Sensormembranen und das Fluoreszenz licht von den Sensormembranen zu einem geeigneten optischen Sensor geführt werden kann. Dabei besteht die Möglichkeit, daß sowohl das Anregungslicht, wie auch das Fluoreszenzlicht durch einen einzigen Licht wellenleiter geführt wird. Selbstverständlich kann auch eine entsprechende Lichtführung für die beiden verschiedenen Lichtarten in zwei gesonderten Licht wellenleitern durchgeführt werden. Die Lichtwellen leiter müssen hierfür lediglich so fixiert und posi tioniert werden, daß ihre Aperturen eine optimale Fluoreszenzanregung und eine nahezu vollständige Er fassung des Fluoreszenzlichtes sichern. Dabei können zur Fixierung und Positionierung der Lichtwellenlei ter gesonderte Halteplatten verwendet werden, die entsprechend der erfindungsgemäß zu verwendenden Ge fäße dimensioniert und ausgerichtet werden, so daß die Lichtwellenleiter in bezug zu den Sensormembranen angeordnet und ausgerichtet sind. Diese Ausführung bietet sich insbesondere für mikrowellplattenförmig ausgebildete Gefäße an. Günstigerweise ist eine Kavi tät (Well) eines solchen mikrowellplattenförmigen Elementes für die bereits eingangs erwähnte Referenz messung, d. h. lediglich mit flüssigem Medium, aber ohne Zellkulturen befüllt, verwendbar.

Die Ausführungsform für erfindungsgemäß ausgebildete und verwendbare mikrowellplattenförmige Elemente oder auch andere geeignete Gefäße können entsprechend der üblichen Laborstandards ausgebildet sein, so daß sie auch in herkömmlicher Form mit den verschiedenen be kannten Laborgeräten benutzt werden können.

Die ortsaufgelöste Messung verschiedener Proben kann aber nicht nur mit den den einzelnen Sensormembranen zugeordneten Lichtwellenleitern erfolgen, sondern es besteht außerdem die Möglichkeit eine Endoskopie anordnung zu verwenden, über die das mit ihr erfaßte Abbild einer größeren Anzahl von Sensormembranen auf beispielsweise eine CCD-Kamera gerichtet werden kann, so daß eine zeitgleiche ortsaufgelöste Messung der verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen möglich wird.

Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft näher beschrieben werden.

Dabei zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung eines Bei spiels eines Gefäßes für die Überwachung der Stoffwechselaktivität von kultivierten Zellen in flüssigen Medien mit Sensormem branen und Lichtwellenleiter;

Fig. 2 ein Diagramm mit dem schematisch die Sauer stoffkonzentration im flüssigen Medium vom Boden, auf dem sich die kultivierten Zellen befinden, des Gefäßes bis zur Oberfläche des Mediums, das im Gefäß enthalten ist, unter drei verschiedenen Bedingungen, wie dergegeben ist;

Fig. 3 schematische Darstellungen von podestarti gen Elementen mit sauerstoffsensitiven Mem branen und alternativ einer zusätzlichen Oxidoreductase/Membran;

Fig. 4 schematisch eine Möglichkeit für einen op tischen Meßaufbau zur Fluoreszenzsignal- Erzeugung und Detektion an einer Vorrich tung gemäß Fig. 1;

Fig. 5 eine schematische Darstellung eines weite ren Beispiels eines Gefäßes mit sauerstoff permeabler Abdeckung zur Überwachung der Stoffwechselaktität von kultivierten Zellen in flüssigen Medien;

Fig. 6 ein Diagramm mit dem die Sauerstoffkonzen tration im flüssigen Medium vom Boden, auf dem sich die kultivierten Zellen befinden, eines mit einer sauerstoffdurchlässigen Membran abgedeckten Gefäßes, unter drei verschiedenen Bedingungen, bis zur Oberflä che eines flüssigen Mediums, und weiter bis zur Umgebung in der das Gefäß enthalten ist, wiedergegeben ist;

Fig. 7 eine schematische Darstellung eines in ei nem Brutschrank aufgenommenen Gefäßes, ge mäß Fig. 1;

Fig. 8 ein Multigefäß in Verbindung mit einer Hal teplatte für Lichtwellenleiter, die an eine Vorrichtung gemäß Fig. 4 angeschlossen sind;

Fig. 9 eine schematische Darstellung für eine Mul tiplexerfassung mehrerer Proben;

Fig. 10 ein Beispiel einer erfindungsgemäßen Vor richtung, bei der eine Multiwellplatte mit tels einer abbildenden, z. B. Endoskopiean ordnung, Optik überwacht wird;

Fig. 11 den optischen Teil einer Vorrichtung gemäß Fig. 10 zur Fluoreszenzsignal Erzeugung und Detektion;

Fig. 12 ein Beispiel eines optischen Systems zur Fluoreszenzsignal Erzeugung und Detektion an einer Multiwellplatte zur gleichzeitigen Überwachung mehrerer Zellkulturen.

In der Fig. 1 ist eine schematische Darstellung ei nes Beispiels eines Gefäßes 1 für die Überwachung der Stoffwechselaktivität von Zellkulturen in flüssigen Medien 2 gezeigt.

Das hier dargestellte Gefäß 1 ist überwiegend zylin derförmig ausgebildet hat eine optisch transparente Bodenplatte und ist an seiner Oberseite offen und demzufolge dort auch für Sauerstoff transparent ins flüssiges Medium 2 durchlässig. Das flüssige Medium 2 ist mit einer bestimmten Füllhöhe F_H befüllt, in dem die Zellen kultiviert werden können. Am Boden des Gefäßes 1 sind bei diesem Beispiel zwei podestartige Elemente 5, aus einem optisch transparenten Material ausgebildet, deren obere Stirnflächen in einem be stimmten Abstand H von der Bodenfläche des Gefäßes 1 angeordnet sind. Dabei ist H generell kleiner als F_H.

Auf der Stirnfläche des linken podestartigen Elements 5 ist eine Sensormembran 3 für die ausschließliche Messung der Sauerstoffkonzentration im flüssigen Me dium 2 ausgebildet.

Auf der Stirnfläche des rechten podestartigen Ele ments 5 ist auf eine sauerstoffsensitive Sensormem bran 3' zusätzlich eine Oxidoreductase Membran 4 aus gebildet.

Unterhalb des Gefäßes 1 sind jeweils für eine der Sensormembranen 3 und 3' Lichtwellenleiter 6, mit de ren auf die Sensormembranen 3 ausgerichteten Licht strahlen (gestrichelt dargestellt) angeordnet. Durch die Lichtwellenleiter 6 kann Licht zur Fluoreszenz anregung eines in den Sensormembranen 3 und 3' ent haltenen fluoreszierenden Farbstoffes auf die Sensor membranen 3 und 3' gerichtet werden. Gegenläufig kann das Fluoreszenzlicht der Sensormembranen 3 und 3' durch die Lichtwellenleiter 6 aufgefangen werden.

In der Fig. 2 ist in einem Diagramm die Sauerstoff konzentration im flüssigen Medium 2 mit am Boden be findenden kultivierten Zellen, ausgehend vom Boden eines Gefäßes 1 bis zur Oberfläche des flüssigen Me diums 2, unter drei verschiedenen Bedingungen, im Gefäß 1 dargestellt. Die unterste Kurve zeigt den Verlauf bei hohem Sauerstoffkonsum der kultivierten Zellen auf dem Boden und die oberste Kurve bei gerin gem Sauerstoff.

Dem Diagramm ist deutlich zu entnehmen, daß mit einer oberhalb des Gefäßbodens angeordneten Sensormembran 3 wesentlich höhere Werte einer Sauerstoffkonzentration im flüssigen Medium gemessen werden können, wohinge gen die Sauerstoffkonzentration am Boden eines Gefä ßes 1 gegen null strebt. Dies ist durch den Sauer stoffkonsum der kultivierten Zellen bedingt. Es wird so deutlich, daß eine Messung am Boden in unmittel barer Nähe zu den Zellen nicht sinnvoll ist. Außerdem gibt dieses Diagramm den Sachverhalt wieder, daß bei einem Sauerstoffverbrauch der kultivierten Zellen mit einer Sensormembran oberhalb des Bodens eine Nachfüh rung von Sauerstoff in das flüssige Medium 2 über deren Oberfläche bis zu den Zellen hin erfaßt werden kann. Es wird so deutlich, daß eine Sauerstoffmessung nur sinnvoll an einer Position zwischen den kulti vierten Zellen und den Orten, an denen der Sauerstoff in das flüssige Medium 2 gelangt, ist.

In der Fig. 3 ist schematisch die Ausbildung podest artiger Elemente 5 dargestellt, wobei die linke Dar stellung ein podestartiges Element 5 zeigt, das aus schließlich mit einer sauerstoffsensitiven Membran 3 versehen ist. Das podestartige Element 5 ist hier kegelstumpfförmig ausgebildet und besteht aus einem transparenten und für Sauerstoff zumindest nahezu undurchlässigem Material, mit dem erreicht werden kann, daß das Meßergebnis nicht durch über das Mate rial eindringenden Sauerstoff verfälscht wird.

Analog hierzu ist auch das in Fig. 3 rechts darge stellte podestartige Element 5 ausgebildet, wobei lediglich über der sauerstoffsensitiven Membran 3' eine zusätzliche Oxidoreductase-Membran 4 vorhanden ist.

Selbstverständlich sind die Membranen 3, 3' und 4 nicht, wie hier dargestellt, oberhalb, sondern unmit telbar auf den podestartigen Elementen 5 ausgebildet. Dabei überdeckt die Oxidoreductase-Membran 4 die sau erstoffsensitive Membran 3'.

In der Fig. 4 ist schematisch ein optischer Aufbau dargestellt, mit dem über einen Lichtwellenleiter 6 das Licht einer Lichtquelle 20 auf eine, hier nicht dargestellte, sauerstoffsensitive Membran 3 in einem Gefäß 1 bzw. einer Kavität 7, 7' gerichtet werden kann. Die Lichtquelle 20 strahlt bevorzugt nahezu monochromatisches Licht einer fluoreszenzanregenden Lichtwellenlänge über eine entsprechende Linse 27, gegebenenfalls einen Filter 21, der im wesentlichen Licht mit der Anregungslichtwellenlänge durchläßt auf einen dichroidischen Strahlteiler 22. Das Licht wird von dort über eine Linse 23 in den Lichtwellenleiter 6 einkoppelt. Selbstverständlich können auch andere bekannte Einkoppeloptiken für Lichtwellenleiter 6 Verwendung finden. Es kann auch eine multispektrale Lichtquelle in Verbindung mit einem geeigneten Filter verwendet werden, wobei ausschließlich der Filter die Monochromatisierung bewirkt.

Das Fluoreszenzlicht gelangt dann gegenläufig zum Anregungslicht durch den Lichtwellenleiter 6 über die Linse 23, einen Strahlteiler 22, durch einen entspre chend wellenlängenselektierten Filter 24, der nur Fluroreszenzlicht passieren läßt, gegebenenfalls über eine weitere Linse 25 auf einen optischen Detektor 26, mit dem die Intensität des Fluoreszenzlichtes, in Abhängigkeit von der jeweiligen Sauerstoffkonzentra tion gemessen werden kann.

Das in der Fig. 5 dargestellte Gefäß 1, entspricht in wesentlichen Punkten, dem bereits in Fig. 1 dar gestellten und entsprechend beschriebenen Gefäß.

Es ist lediglich mit einer Abdeckung 28 versehen, die zwar für Sauerstoff durchlässig ist, jedoch Kontami nationen verhindert und demzufolge die Sterilität sichert. Außerdem kann mit einer solchen Abdeckung 28 das Austrocknen des Gefäßes 1 verhindert werden.

In Fig. 5 ist außerdem erkennbar, daß sich der Füll stand F_H unterhalb der Gefäßhöhe G_H befindet. G_H gibt gleichzeitig den Abstand der Abdeckung 28 des Gefäßes 1 vom Boden wieder.

Durch die Abdeckung 28 wird der Sauerstoffgradient beeinflußt.

Dieser Sachverhalt ist in dem Diagramm, gemäß Fig. 6 wiedergegeben und es wird deutlich gemacht, daß die Sauerstoffkonzentration zwischen Füllstandshöhe F_H und Gefäßhöhe G_H ebenfalls einen bestimmten Sauer stoffkonzentrationsgradienten, der durch die Abdeckung 28 hervorgerufen wird, bei Sauerstoffverbrauch durch Stoffwechselaktivität unterliegt.

Bei dem in Fig. 7 gezeigten Beispiel ist ein Gefäß 1 nach Fig. 1 bzw. 5 in einem typischen Brutschrank 9 aufgenommen worden, in dem bekanntermaßen besonders optimale Bedingungen für die Zellkultivierung einge halten werden können. Unter optimalen Bedingungen wird allgemein eine Temperatur von ca. 37°C, eine relative Luftfeuchtigkeit von 100% bei normalem at mosphären Druck und einem Sauerstoffpartialdruck im Gasraum, der der Umgebungsluft entspricht, verstan den. Die Lichtwellenleiter 6 für die beiden Sensor membranen 3 können aus dem Brutschrank 9 herausge führt werden, so daß eine lokale Trennung von Meßort und Meßwerterfassung erreicht werden kann. In dieser Figur ist außerdem eine Gaszufuhr 10 für den Brut schrank 9 dargestellt, durch die beispielsweise atmo sphärische Luft mit entsprechendem konstantem Sauer stoffgehalt nachgeführt werden kann. Brutschränke der beschriebenen Art werden standardgemäß zur Kultivie rung von Zellen eingesetzt.

In der Fig. 8 ist ein Beispiel für ein erfindungs gemäß zu verwendendes Gefäß 1' dargestellt, das als Multiwellplatte, wie diese sehr häufig zur Kultivie rung von Zellen mit einer Mehrzahl von Kavitäten 7, 7' ausgebildet ist. In den Kavitäten 7, 7' sind je weils wieder zwei Sensormembranen 3 und 3', wobei jeweils die Sensormembran 3' zusätzlich mit einer Oxidoreductase-Membran 4 versehen ist, analog zum Gefäß 1, wie es in Fig. 1 beschrieben und gezeigt worden ist, angeordnet und ausgebildet.

Eine solche Multiwellplatte 1' kann wiederum in einem Brutschrank 9 aufgenommen werden und die Zellkulturen in den Kavitäten 7 entsprechend kultiviert werden. Im Brutschrank 9 kann unterhalb der Multiwellplatte 1' eine Halteplatte 8 angeordnet werden, mit der die Lichtwellenleiter 6 fixiert und positioniert werden können. Dabei sind die Lichtwellenleiter 6 an der Halteplatte 8 entsprechend der Anordnung der Sensor membranen 3 und 3' in den Kavitäten 7 und 7' des Ge fäßes 1' gehalten. Die Halteplatte 8 kann dann im Brutschrank 9 in einem solchen Abstand zur Multiwell platte 1' und hier insbesondere zu dessen Bodenfläche angeordnet werden, daß die Lichtstrahlen aus den Lichtwellenleitern 6 den gesamten Flächenbereich der jeweiligen, ihnen zugeordneten Sensormembranen 3 und 3' erfassen können. Die Verwendung der Halteplatte 8 erlaubt einen für die Zellkultivierung ungestörten Betrieb. Im Brutschrank werden die Zellen keiner wei teren Behandlung unterzogen. Zu solchen Zwecken wird die Multiwellplatte 1' aus dem Brutschrank und damit aus der Halterung 8 entnommen. Außerhalb des Brut schrankes kann dann die Behandlung der Zellkulturen im üblichen Sinne, wie z. B. Wechsel des flüssigen Mediums 2 oder Beobachtung der Zellen mit einem Mi kroskop, ohne Einschränkung erfolgen.

Zumindest eine Kavität 7' einer solchen Multiwell platte 1' kann für die bereits erklärte Referenzmes sung verwendet werden, indem diese Kavität 7' ohne Zellen nur mit flüssigem Medium 2 befüllt wird.

In der Darstellung nach Fig. 9 ist schematisch ein optischer Multiplexbetrieb, mit dem neben der zeit auch eine ortsaufgelöste Messung mehrerer Proben, die in verschiedenen Gefäßen 1 bzw. Kavitäten 7 und 7' enthalten sind, möglich ist, gezeigt. Fig. 9 zeigt damit einen komplexen Aufbau zur Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens.

Eine Anordnung aus Lichtquelle 20, Detektor 26, Lin sen 23, 25, 27, Filtern 21, 24 und Strahlteilern 22, wie in Fig. 4 dargestellt, ist in einer Sende- und Meßeinheit 13 außerhalb eines Brutschrankes 9 ange ordnet. Das Anregungslicht wird aus dieser Sende- und Meßeinheit 13 über einen einzigen Lichtwellenleiter 12 in einen optischen Multiplexer 11, an dem weitere Lichtwellenleiter 6 angeschlossen sind, geführt. Der optische Multiplexer 11 führt das Fluoreszenzanre gungslicht sequentiell durch die einzelnen Lichtwel lenleiter 6 zur Fluoreszenzanregung zu den verschie denen Sensormembranen 3 und 3'.

Das Fluoreszenzlicht der verschiedenen Sensormembra nen 3 und 3' gelangt wieder über die Lichtwellenlei ter 6 zum optischen Multiplexer 11 und wird von die sem wiederum sequentiell, den jeweiligen Meßorten, also den jeweiligen Sensormembranen 3 und 3' entspre chend dem jeweiligen Probengefäß 7 bzw. 7' über den Lichtwellenleiter 12 auf einen optischen Detektor, der in der Einheit 13 enthalten ist, gerichtet. Die so ermittelten Signale können entsprechend orts- und zeitaufgelöst, zur Bestimmung der jeweiligen Sauer stoffkonzentration und der Oxidoreductase-Substrat konzentration genutzt werden.

Von der Einheit 13 gelangen die erfaßten Meßwerte zu einer Auswerte- und Steuereinheit 14, hier ein Perso nalcomputer, mit dem die Auswertung der erfaßten Meß singnale und dabei insbesondere, der im allgemeinen Teil der Beschreibung bezeichnete Wertevergleich durch Messung am Referenzgefäß 7' durchgeführt werden kann. Mit der Auswerte- und Steuereinheit 14 können aber auch die Sende- und Meßeinheit 13 sowie der op tische Multiplexer 11 gesteuert werden.

Außerdem sind im Inneren des Brutschrankes 9 Sensoren 15 für die Erfassung von Temperatur, relativer Feuch tigkeit, dem Gasdruck und gegebenenfalls der chemi schen Zusammensetzung mit jeweiligem Partialdruck der beteiligten Gase der Gasatmosphäre angeordnet. Die von den Sensoren 15 erfaßten Meßwerte werden wiederum über eine gesonderte Leitung 16 in die Sende- und Meßeinheit 13 und von dort in die Auswerte- und Steu ereinheit 14 geleitet, so daß damit der im allgemei nen Teil der Beschreibung bezeichnete Wertevergleich durchgeführt werden kann. Es besteht aber auch die Möglichkeit, die Leitung 16 unmittelbar von den Sen soren 15 zur Auswerte- und Steuereinheit 14 zu füh ren. Anhand der Sensordaten kann, wie im allgemeinen Teil der Beschreibung dargestellt, die Sauerstoffsät tigungskonzentration im Referenzgefäß 7' berechnet werden und damit der Werteausgleich erfolgen.

In der Fig. 10 ist ein Beispiel zur gleichzeitigen Überwachung mehrerer Proben, die in einer Mehrzahl von Kavitäten 7 und 7' einer Multiwellplatte 1' ent halten sind, wiedergegeben. Dabei ist unterhalb der Multiwellplatte 1' eine fokussierende Linse 17 ange ordnet, mit der zumindest der Teil der Multiwellplat te 1' auf dem die Membranen 3 und 3' angeordnet sind, einmal mit Anregungslicht bestrahlt und zum anderen, das jeweilige Fluoreszenzsignal als Abbildungen in ein hier als Lichtwellenleiterbündel 6' verwendeten Lichtleitsystems einkoppelbar ist, abgebildet und weitergeleitet werden kann.

Die Fluoreszenzsignal Anregung und Detektion an den Membranen 3 und 3' in den Kavitäten 7 und 7' kann dann beispielhaft, wie in Fig. 11 gezeigt, erfolgen. Hierzu wird wieder Licht einer Lichtquelle 20, über eine Linse 27, einen Filter 21 und eine Einkoppelop tik 23 in mindestens einem Teil des Lichtwellenlei terbündels 6' eingekoppelt und auf die Membranen 3 und 3', die wie bereits mehrfach beschrieben, auf po destartigen Elementen 5 in den Kavitäten 7 und 7' angeordnet sind, gerichtet, wobei durch den Filter 21 nur Licht aus der Lichtquelle 20 einer fluoreszenz anregenden Wellenlänge genutzt wird.

Das Fluoreszenzlicht der verschiedenen Membranen 3 und 3' gelangt wieder, wie hier schematisch darge stellt, aus dem anderen Teil des Lichtleiterbündels 6' über zwei Linsen 23, 25 und einen entsprechend geeigneten Filter 24 auf einen optischen Detektor 26', der hier eine für eine ortsaufgelöste Messung geeignete Kamera ist. Damit kann wieder ortsaufgelöst das Fluoreszenzsignal der einzelnen Membranen 3 und 3' der Kavitäten 7 und 7' erfaßt werden.

In der Fig. 12 ist ein weiteres Beispiel eines opti schen Aufbaus für eine gleichzeitige Überwachung ver schiedener Proben, die in mehreren Kavitäten 7 und 7' einer Multiwellplatte 1' aufgenommen sind, darge stellt.

Dabei wird wieder Licht einer Lichtquelle 20 über einen Filter 21 zur Fluoreszenzanregung auf die ver schiedenen sauerstoffsensitiven Membranen 3 und 3' durch den Boden des Gefäßes 1', der zumindest im Be reich der podestartigen Elemente 5 transparent ausge bildet ist, gerichtet. Zur Strahlformung und Strahl führung werden wieder verschiedene Linsen 27 und 29 sowie ein dichroidischer Strahlteiler 22 verwendet.

Das Fluoreszenzlicht der verschiedenen Membranen 3 und 3' gelangt über die Linse 29 durch den dichroidi schen Strahlteiler 22 und gegebenenfalls einen geeig neten Filter 24 auf einen optischen Detektor 26', der hier wiederum eine für eine ortsaufgelöste Messung geeignete Kamera 26' sein kann. Die Abbildung des Fluoreszenzlichtes kann mittels einer zusätzlichen Linse 25 auf die Kamera 26' erfolgen.

Claims

1. Verfahren zur Überwachung der Stoffwechselakti vität von in flüssigen Medien kultivierten Zel len, wobei diese in für den Stofftransport von Sauerstoff in das flüssige Medium (2) teilweise durchlässigen Gefäßen (1, 7) aufgenommen sind, bei dem die Sauerstoffkonzentration optisch mit Sensormembranen (3) im flüssigen Medium (2) zwi schen den kultivierten Zellen und dem für den Sauerstofftransport in das flüssige Medium (2) maßgebend durchlässigen Teil des Gefäßes gemes sen wird;
und die im flüssigen Medium (2) gemessene Sauer stoffkonzentration mit einem in einem nur mit flüssigem Medium ohne Zellen befüllten Ver gleichsgefäß (7') gemessenen Konzentrationswert und/oder mittels einer mit Meßwerten anderer Parameter berechneten Sauerstoffkonzentration einem Wertevergleich unterzogen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des flüssigen Mediums (2) im Gefäß (1, 7) und/oder einem Vergleichsgefäß (7') bestimmt wird und die relative Feuchtigkeit und der Druck außerhalb der Gefäße (1, 7, 7') gemes sen und mit den jeweiligen Meßwerten eine dem entsprechende Sauerstoffkonzentration berechnet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des flüssigen Mediums (2) direkt in den Gefäßen (1, 7, 7') gemessen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß indirekt über die Umgebungstemperatur die Temperatur in den Gefä ßen (1, 7, 7') gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei variabler chemi scher Zusammensetzung der Umgebungsatmosphäre der Gefäße (1, 7, 7'), deren Zusammensetzung mit den jeweiligen Stoffkonzentrationen bestimmt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem zweiten mit einer geeigneten Oxidoreductase (4) be schichteten Sauerstoff-Sensormembran (3') in ei ner Position zwischen den kultivierten Zellen und den für den Sauerstofftransport maßgebend durchlässigen Teil des Gefäßes im flüssigen Me dium (2) die Konzentration des Substrates der Oxidoreductase im flüssigen Medium (2) bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der ersten (3) und zweiten (3') Sauerstoffsensor-Membran in einem Gefäß (1, 7, 7') gemessenen Sauerstoffkon zentrationen, zur Bestimmung der Oxidoreductase- Substratkonzentration miteinander in Beziehung gesetzt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stoffwechselak tivität der kultivierten Zellen über eine zeit aufgelöste Messung der Sauerstoffkonzentration mit dem daraus bestimmten Sauerstoffverbrauch der kultivierten Zellen und/oder der Oxidoreduc tase-Substratkonzentrationsänderung überwacht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß an den Sensormembra nen (3, 3') die Fluoreszenzintensität oder Fluo reszenzabklingzeit eines in den Sensormembranen (3) enthaltenen fluoreszierenden Stoffes, bei dem eine der Sauerstoffkonzentration entspre chende Fluoreszenzlöschung zu verzeichnen ist, gemessen wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sauerstoffkon zentration in flüssigen Medien (2) mehrerer Ge fäße (1, 7, 7') ortsaufgelöst gemessen wird.

11. Gefäß zur Überwachung der Stoffwechselaktivität von kultivierten Zellen in flüssigen Medien, das zumindest teilweise aus einem optisch transpa renten Material besteht und teilweise für den Sauerstofftransport durchlässig ist und in dem mindestens eine Sensormembran zur optischen Mes sung der Sauerstoffkonzentration im flüssigen Medium angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Sensormembran (3) oder (3') im Inneren des Gefäßes (1, 7, 7') zwischen den kultivierten Zellen und den für den Sauerstoff transport maßgebend durchlässigen Teil des Ge fäßes im flüssigen Medium (2) angeordnet ist.

12. Gefäß nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensormembranen (3, 3', 4) an der Innen wandung und/oder auf am Gefäßboden angeordneten, zumindest teilweise transparenten, podestartigen Elementen (5) aufgebracht sind.

13. Gefäß nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung des/der Gefäße(s) (1, 7, 7') mit einer sauerstoffperme ablen Membran abgedeckt ist/sind.

14. Gefäß nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Gefäße (7, 7') in Form einer Multiwellplatte (1') ausgebil det sind.

15. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß über mindestens einen ersten Lichtwellenlei ter (6) Licht einer nahezu monochromatischen Lichtquelle oder mit einem optischen Filter (21) entsprechend beeinflußtes Licht einer Lichtquel le (20) mit einer Fluoreszenz anregenden Wel lenlänge auf die Sensormembranen (3, 3') ge richtet ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß Fluoreszenzlicht über den ersten oder einen zusätzlichen zweiten Lichtwellenleiter (6) (über einen optischen Fil ter (24)) auf einen optischen Detektor (26) ge richtet ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß den ersten und/oder zweiten, unterschiedlichen Sensormembranen zu geordnete Lichtwellenleiter (6) mit einem opti schen Multiplexer (11) verbunden sind und der Multiplexer (11) mit einer nahezu monochromati schen Lichtquelle oder über einen Filter (21) mit einer Lichtquelle (20) und einem optischen Detektor (26) verbunden ist.

18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtwellenlei ter (6) mittels einer Halteplatte (8) in bezug zu den Sensormembranen (3, 3') in den Gefäßen (1, 7, 7') positioniert sind.

19. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß über einen abbilden den Lichtwellenleiter (6'), ähnlichen Lichtfüh rungssystemen oder optischen Elementen (20, 21, 22, 23, 27, 29) Licht einer nahezu monochromati schen Lichtquelle oder mit einem optischen Fil ter (21) entsprechend beeinflußtes Licht einer Lichtquelle (20) mit einer Fluoreszenz anregen den Wellenlänge auf die Sensormembran (3, 3') gerichtet ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensormem bran(en) (3, 3') mittels eines abbildenden Lichtleiters (6'), ähnlicher Lichtführungssyste me oder optische Elemente (22, 24, 25, 29) be trachtet und deren Abbildungen auf einer linea ren oder flächenhaften Anordnung von lichtemp findlichen Detektoren (26') gerichtet sind.

21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Gefäße (1, 7, 7') in einem Brutschrank (9) auf genommen sind.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß in unmittelbarer Nähe zu den Gefäßen (1, 7, 7') oder im Brut schrank (9) Sensoren (15) zur Bestimmung der Temperatur, der relativen Feuchtigkeit und des Druckes der Gasatmosphäre vorhanden sind.