KR101837718B1

KR101837718B1 - 웰 플레이트용 형광패치 제조방법 및 형광패치

Info

Publication number: KR101837718B1
Application number: KR1020160160955A
Authority: KR
Inventors: 한성일; 이다희
Original assignee: (주) 동국이노텍
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2018-03-12

Abstract

본 발명에 따른 웰 플레이트용 형광패치 제조방법은 복수의 웰을 포함하는 웰 플레이트의 웰내에서 세포대사의 결과로 산출되는 용존산소 또는 수소에 감응한 결과로 발생하는 빛을 제공할 수 있는 고상형광염료를 생성하기 위한 전처리 단계로서 액상형광염료를 합성하는 액상형광염료 합성 단계와; 웰내측바닥면에 직접 접촉하여 부착되는 접착면을 가진 접착제층과, 접착면과는 반대되는 면에 결합된 베이스 필름을 포함하는 접착시트를 마련하는 단계와; 베이스 필름 상에 액상형광염료를 일정두께로 도포하는 액상형광염료 도포단계와; 고상형광염료를 형성하는 액상형광염료 경화단계와; 베이스 필름과 고상형광염료를 적어도 포함하는 형광염료판재를 형성하는 단계와; 형광염료판재를 펀칭하여 일정크기 및 일정 모양으로 형성하는 형광패치 형성단계를 구비하며, 접착시트를 마련하는 단계에서, 베이스 필름 상에 일정모양의 요철을 형성하는 단계를 더 포함하고, 액상형광염료 도포단계에서는 양쪽에 접착테이프로 도포두께의 높이를 조절한 도포용 막대를 이용하여 베이스 필름 상에 일정한 두께로 액상형광염료를 도포한다. 따라서, 웰 플레이트 내에 형광염료를 일정치수 및 일정위치에 큰 접착력을 가지고 신속하게 셋팅할 수 있다.

Description

웰 플레이트용 형광패치 제조방법 및 형광패치{FLUORESCENCE PATCH MANUFACTURING METHOD FOR WELL PLATE AND FLUORESCENCE PATCH}

본 발명은 형광패치 제조방법 및 형광패치에 관한 것으로서, 특히 세포배양용 웰 플레이트에 사용되는 세포대사량 측정을 위한 형광염료가 고상(固相)으로 형성되어 웰내측바닥면에 직접 부착이 가능하도록 구성된 형광패치를 제조하기 위해 제안된 세포대사량 측정을 위한 웰 플레이트용 형광패치 제조방법 및 그 제조방법에 따른 형광패치에 관한 것이다.

종래, 세포배양용 웰 플레이트에서 세포 대사량을 측정하기 위해서는 웰 플레이트의 각각의 웰 내에 배치되는 세포에서 그 세포대사로 인해 발생하는 용존산소(DO) 및 pH 변화량(또는 H 발생량 등)을 측정하게 되며, 이러한 DO 및 pH를 측정하는 방법으로서는 용존산소 또는 수소와 결합하는 형광염료의 빛의 변화량을 측정하여 세포대사량을 측정하는 방식이 있다. 따라서, 형광염료를 어떤 형태로든지 웰 플레이트에 배치하여 세포대사의 부산물로 산출되는 용존산소 또는 수소를 형광염료에 감응시켜야 한다.

도 10은 종래 세포대사량 측정에 이용되는 형광염료의 사용방법을 도시한 도면이다. 도 10을 참조하면, 종래의 형광염료 사용방법의 경우, 액상형광염료 제공툴(90)을 사용하여 액적형광염료(91)를 웰 플레이트(300)(도 9 참조)의 각각의 웰(310) 내에 낙하시킨다(도 10의 액적형광염료(91) 참조). 이때, 액상형광염료 제공툴(90)을 떠난 액적형광염료(91)는 가능한 회로기판(350) 상의 pH 센서부(320) 및 DO 센서부(330)가 위치한 부분에 대응하는 웰내측바닥면(311) 상의 영역(대체로 반경 6mm 정도이며, 웰 플레이트의 종류에 따라서, 센서의 종류에 따라서 다소 크기가 다를 수 있다)(센서대응영역(312, 313) 참조)에 맞추어 낙하되어야 한다. 그래야만, pH 센서부(320)의 LED(322) 및 pH 센서(321)와 DO 센서부(330)의 LED(332) 및 DO 센서(331)가 형광염료와 서로 빛을 주고받기에 적합한 위치가 되기 때문이다. 이후, 센서대응영역(312, 313)에 낙하한 액상형광염료, 즉 액적을 낙하시켜 형성된 종래 형광염료(92)는 고형화 또는 경화 과정을 거친후 LED(322, 332)로부터 빛을 받고, 또한 웰(310) 내의 배양세포에서 대사결과로 나오는 용존산소 또는 수소와 결합하고 그 형광염료와의 감응량에 따른 광량의 변화량을 pH 센서(321) 또는 DO 센서(331)가 감지하고 전기적인 신호로 반영하여 산출하게 된다. 여기서 pH 센서(321) 또는 DO 센서(331)는 일반적으로는 광량에 반응하여 전기적 신호를 생성하는 포토다이오드가 사용된다. 이와 같이 센서부(320, 330)에서 산출한 전기적인 신호를 기초로 웰 플레이트(300)에서 DO와 pH를 측정하여 결과적으로 세포대사량을 측정하게 된다.

그러나, 이러한 종래 형광염료 사용방법의 경우 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 액상의 형광염료를 센서대응영역(312, 313)에 낙하시켜 형광염료를 사용하기 때문에, 숙련자라 하여도 각각의 웰(310)마다 형광염료를 일정한 크기로 균일하게 맞추는 것이 어렵고(직경방향 치수의 균일화에 관한 어려움), 도포된 형광염료가 일반적으로 가운데가 볼록하고 가운데에서 가장자리로 갈수록 두께가 얇아지는 모양이 되기 때문에 전체적으로 형광염료의 두께를 균일하게 형성하기 어렵고(두께의 균일화에 관한 어려움), 액상형광염료를 낙하시키는 방식이기 때문에 모든 웰 마다 센서대응영역에 맞추어 형광염료를 균일하게 도포하기가 어렵고(위치조절의 어려움), 모양을 균일하게 형성하기가 어렵다(모양의 균일화에 관한 어려움).

둘째, 각각의 웰(310) 내의 배지액 및 기타 용액과 형광염료가 함께 공존할때 웰내측바닥면(311)에 도포된 형광염료가 센서대응영역(312, 313)으로부터 쉽게 떨어지는 문제가 발생하는경향이 있다.

셋째, 이러한 기하학적 균일성의 어려움 및 이탈 문제로 인해 동일 세포배양조건에서 균일한 측정 데이터를 반복, 재현하는 것이 어려우며, 결과적으로 얻어지는 데이터의 신뢰도가 떨어지는 문제가 있다.

넷째, 웰(310)마다 형광염료를 낙하시켜 센서대응영역에 도포하고 일정시간 고형화 또는 경화하는 방식이기 때문에 형광염료를 셋팅하는 전체시간이 많이 소요되고, 불편함도 크다.

다섯째, 도포된 형광염료를 고형화한 이후, 필요에 따라서 빛산란이나 반사차단을 위해 다시, 예를 들면, 폴리카보네이트+티타늄으로 이루어지는 멤브레인을 코팅할 수도 있으며, 이 경우에도 작은 형광염료마다 대응하는 크기의 멤브레인을 코팅하는 작업역시 까다로운 작업이 되어 불편하다.

따라서, 종래 형광염료 사용방법에서는 개선해야할 문제점이 많이 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해소하기 위한 것으로서, 도포되는 모든 형광염료의, 치수(넒이), 두께, 배치되는 위치, 모양을 보다 균일하게 조절할 수 있고, 센서대응영역에서의 이탈 또는 분리도 종래기술에 비해 더욱 억제할 수 있으며, 형광염료의 셋팅시간도 단축할 수 있으면서 편리함도 함께 제공할 수 있고, 그 결과 동일 세포배양조건에서도 균일한 측정 데이터를 반복, 재현할 수 있어 획득한 데이터의 신뢰성을 높일 수 있는 세포배양용 형광패치 제조방법 및 그 제조방법에 따른 형광패치를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 실현하기 위한 본 발명의 일양태는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법으로서, 복수의 웰을 포함하는 웰 플레이트 내에서 배양되는 세포의 대사량 측정용 DO(용존산소) 센서부 및 pH 센서부와 빛을 주고받을 수 있으며, 웰 플레이트의 각각의 웰내에서 배양되는 세포에서 세포대사의 결과로 산출되는 용존산소 및 수소 중 적어도 하나에 감응할 수 있고, 상기 감응의 결과로 발생하는 빛을 세포대사량 정보로서 상기 DO 센서부 및 pH 센서부 중 적어도 하나에 제공할 수 있는 고상형광염료를 생성하기 위한 전처리 단계로서 액상형광염료를 합성하는 액상형광염료 합성 단계와; 상기 웰 플레이트의 웰의 웰내측바닥면에 직접 접촉하여 부착되는 접착면을 가진 접착제층과, 상기 접착면과는 반대되는 면에 결합된 베이스 필름을 포함하는 접착시트를 마련하는 단계와; 상기 베이스 필름 상에 상기 액상형광염료를 일정두께로 도포하는 액상형광염료 도포단계와; 도포된 상기 액상형광염료를 일정기간 경화하여 고상형광염료를 형성하는 액상형광염료 경화단계와; 상기 경화단계로 액상형광염료가 고상형광염료로 형성되면, 상기 베이스 필름과 고상형광염료를 적어도 포함하는 형광염료판재를 형성하는 단계와; 상기 형광염료판재를 펀칭하여 일정크기 및 일정 모양으로 형성하는 형광패치 형성단계를; 구비하며, 상기 접착시트를 마련하는 단계에서, 상기 베이스 필름 상에 일정모양의 요철을 형성하는 단계를 더 포함하고, 상기 일정모양의 요철은 격자무늬 요철 또는 물결무늬 요철이고, 상기 액상형광염료 도포단계에서는 양쪽에 접착테이프로 도포두께의 높이를 조절한 도포용 막대를 이용하여 베이스 필름 상에 일정한 두께로 상기 액상형광염료를 도포한다.
바람직하게는, 상기 액상형광염료 경화단계에서 경화시간은 상온에서 24시간 자연건조, 건조용 오븐 내에서 60℃에서 24시간 건조 및 다시 상온에서 2시간 방치를 포함하고, 상기 액상형광염료 경화단계 이후, 경화된 고상형광염료 상에 빛산란 및 반사를 방지하는 멤브레인층을 형성하는 멤브레인층 형성단계를 더 포함한다.
바람직하게는, 상기 멤브레인층 형성단계에서, 상기 고상형광염료 상에 실리콘본드를 도포한 후 상기 멤브레인을 상기 고상형광염료에 부착하여 멤브레인층을 형성한다.
바람직하게는, 액상형광염료 합성 단계이후 24시간 방치단계를 더 포함하고, 상기 형광패치의 일정크기는 DO 센서부 또는 pH 센서부와 마주하는 웰의 웰내측바닥면의 센서대응영역의 크기이거나 적어도 센서대응영역의 면적보다 90% 이상 크며, 상기 일정모양은 원형이고, 상기 액상형광염료 도포단계에서 도포되는 액상형광염료의 일정두께는 50㎛±10㎛ 범위이다.
바람직하게는, 상기 형광염료판재를 펀칭하여 일정크기 및 일정 모양으로 형성하는 형광패치 형성단계 이후, 형성된 형광패치를 일정 용기에 담아서 어두운 곳에 보관하는 단계를 더 포함하고, 상기 형광패치의 일정크기는 직경 6mm ±0.6mm 범위이고 두께는 0.2mm 이상 1mm 이하 범위이며, 상기 일정 용기는 알루미늄 호일로 이루어진 용기이다.
상기 목적을 실현하기 위한 본 발명의 제2양태는 상기 제조방법에 따라 제조된 웰 플레이트용 형광패치를 제공한다.

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이상과 같은 구성에 따라서, 본 발명은 다음과 같은 효과를 제공할 수 있다.

첫째, 웰 플레이트에 배치되는 형광염료가 미리 제조된 일정한 두께, 크기 및 모양으로 형성될 수 있어 모든 웰 내에서 획득한 세포대사량 측정 데이터에 신뢰성을 높일 수 있다.

둘째, 액적형 형광염료를 웰 플레이트에 낙하하는 방식이 아니라 접착 방식으로 수행하기 때문에, 배치하기도 쉽고, 액상형광염료를 경화하는 시간도 필요없기 때문에 형광염료를 웰 플레이트에 배치하는 작업을 더욱 간소화, 신속화, 편리화 할 수 있다.

셋째, 형광패치에 멤브레인층을 미리 함께 결합되도록 구성할 수 있기 때문에, 종래 액적 또는 액상형광염료를 낙하한 후 경화하고, 이어서 다시 작은 멤브레인층을 덮어 씌우는 번거로운 작업을 모두 생략할 수 있어 이 부분에서의 작업의 편리성을 얻을 수 있음은 물론이고 작업시간도 한층 단축할 수 있다.

넷째, 접착제를 이용한 부착방식이기 때문에, 웰내측바닥면 상에 부착되는 부착강도가 상대적으로 높아 종래 액적낙하식 형광염료보다 웰내측바닥면에서 이탈될 확률이 낮아서, 더욱 안정된 데이터 획득 환경을 제공할 수 있다.

본 발명의 이상의 효과 및 그 밖의 장점 또는 특징은 다음의 첨부도면과 함께 설명하는 발명의 구체적인 설명을 통해 보다 더 명확히 이해할 수 있다.

도 1의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일실시예에 따라서 형광염료를 제조하는 과정을 나타낸 설명도로서 (a)는 일부 조성물과 함께 초기 졸-겔용액의 형성과정을 나타낸 도면이고, (b)는 전체 조성물과 함께 액상형광염료의 합성을 나타낸 도면이다.
도 2의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일실시예로서 형광염료가 배치되는 접착시트를 형성하는 과정을 나타낸 설명도로서 (a)는 접착시트의 베이스 필름을 가공하는 과정을 나타낸 평면도이고 (b)는 (a)의 A-A선 단면도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예로서 액상형광염료를 접착시트에 도포하는 과정 중 일부를 나타낸 설명도로서 (a)는 도포용 막대에서 도포 높이 조절을 위한 접착 테이프 부착을 나타낸 도면이고, (b)는 액상형광염료를 베이스 필름에 내려서 부어놓은 상태를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예로서 액상형광염료를 접착시트에 고르게 도포한 이후 경화하는 과정을 나타낸 설명도이다.
도 5의 (a)는 본 발명의 일실시예로서 도포된 액상형광염료가 경화된 이후의 고상형광염료 상에 멤브레인층을 배치한 상태를 나타낸 형광염료판재의 평면도이고, 도 5의 (b)는 설명의 편의상 단면방향 길이를 과장하여 나타낸 도 5의 (a)의 A-A선 개략 단면도이다.
도 6의 (a)는 본 발명의 일실시예로서 펀치될 부분을 나타낸 형광염료판재의 평면도이고, 도 6의 (b)는 펀치될 부분을 대응시켜 비교하기 위해 나타낸 개략 단면도이다.
도 7의 (a)는 형광염료판재를 펀칭가공하기 위한 펀치장치에서 상부다이와 하부다이가 결합된 상태를 나타낸 사시도이고, 도 7의 (b)는 상부다이가 분리되고 하부다이에 형광염료판재가 배치된 상태를 나타낸 사시도이다.
도 8은 본 발명의 형광패치가 적용될 수 있는 웰 플레이트의 일예를 나타낸 사시도이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라서 형광패치를 적용한 일예를 나타낸 설명도이다.
도 10은 종래 액적낙하방식으로 웰 플레이트에 형광염료가 배치되는 과정을 나타낸 설명도이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 첨부도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 각 도면에서의 치수는 정밀한 축척이 아니며 각 구성요소는 단지 설명의 편의상 축척이 과장되거나 축소되어 나타낸 것일 수 있다. 따라서, 도면에서의 각 구성요소는 외관상의 축척에 따른 상관관계가 아닌 기능적 특성을 기초로 파악되어야 한다.

본 발명의 형광패치는 기본적으로 이미 고형화된 형광염료를 일정한 크기, 일정한 두께, 일정한 모양으로 형성하여 웰 플레이트의 각각의 웰내측바닥면(311)(도 9 참조) 내에 부착하는 방식으로 사용할 수 있다. 따라서, 종래 액적형광염료 낙하방식에 비하여 부착위치의 오류, 형광염료의 치수 불균일 및 형상의 불균일 문제를 효과적으로 해소할 수 있다. 도 6을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 형광패치(101)는 일반적으로 웰내측바닥면(311)(도 8 또는 도 9 참조)과 직접 접착되어 고상형광염료(123)를 웰내측바닥면(311)에 고정적으로 유지하는 기능을 가진 접착시트(110), 접착시트(110) 위에 형성되는 고상형광염료(123), 고상형광염료(123) 위에 형성되는 실리콘본드층(140) 및 실리콘본드층(140) 위에 형성되는 멤브레인층(150)으로 구성되며, 실리콘본드층(140)은 고상형광염료(123)와 멤브레인층(150)을 상호 접착결합하는 기능을 가지고, 멤브레인층(150)은 빛의 산란 및 반사를 차단하는 기능을 가진다.

이와 같은 구성을 가진 본 발명의 일실시예에 따른 형광패치(101)를 제조하기 위해서는 각각의 구성요소인, 접착시트(110), 액상형광염료(122) 및 고상형광염료(123), 실리콘본드층(140), 멤브레인층(150)을 준비, 제조, 및 가공하는 과정이 필요하다. 따라서, 이하에서는 최종 형광패치(101)를 제조하기까지의 공정을 설명한다. 공정의 각 과정 또는 스텝은 설명하는 순서대로 진행될 수도 있지만 순서가 변경될 수도 있다. 즉, 공정에서의 각 과정 또는 스텝의 순서는 설명의 편의상 나타낸 것이고 엄격한 공정서열을 의미하지 않는다.

형광패치 제조공정

(1) 액상형광염료 생성과정

도 1은 본 발명의 일실시예로서 형광염료를 제조하는 과정을 나타낸 설명도이다. 도 1의 (a) 및 (b)를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따라서 형광염료를 제조하는데 사용되는 시약재료는 6가지(a, b, c, d, e, f)이며 그 용도 및 형광염료 합성과정은 다음과 같다.

(1-1) 형광염료의 제조에 사용되는 시약재료

a: 트리메톡시(메틸)실레인(Trimethoxy(methyl)silane) (MTMS)- (용도:실레인 커플링제)

b: 에탄올(용도: 용매)

c: 물(용도: 가수분해반응을 위해 첨가)

d: HCl 35%(용도: 촉매, 졸-겔반응에서 축합반응을 하기 위한 용도)

e: tris(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린(Rudpp) 루테늄(II) )(Rudpp) (용도: DO(용존산소)를 감응할 수 있는 형광 염료이다). 480 nm의 여기광을 입사시켰을 때 610 nm의 형광을 방출하는 특성을 가진다.

f: 폴리머 B(용도: 폴리에테르 폴리우레탄 계열의 폴리머이며, 용액의 점도를 높여주는 역할을 한다.)

(1-2) 액상형광염료 합성 프로세스

스텝S1 : 마그네틱 스터바(magnetic stirbar)(11)가 들어간 25ml 용기(vial)(10)에 시약재료 a(4.15 g, 30.465mmol), 시약재료 b(2.332 g), 시약재료c(0.72 g)를 열거순으로 넣고, 200 rpm으로 1분간 교반(stirring)한 후 시약재료 d(18 ㎕)를 주입한다(도 1의 (a) 참조).

스텝S2 : 그 후, 다시 적절한 교반기를 사용하여 2 시간 동안 500 rpm으로 교반시켜서 졸-겔 용액(121)을 생성한다(도 1의 (a) 참조).

스텝S3 : 2 시간 후, 위 졸-겔 용액(121) 5g에 시약재료 e(0.04 g), 시약재료 f(3 g)를 넣고 와이즈스터(wise stir)로 혼합한 후, 24시간 동안 500 rpm으로 반응시켜서 결과적으로 액상형광염료(122)를 생성한다(도 1의 (b) 참조).

(2) 접착시트 형성과정

도 2를 참조하여 접착시트(110)의 형성과정을 설명한다.

도 2의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일실시예로서 형광염료가 배치되는 접착시트를 형성하는 과정을 나타낸 설명도로서 (a)는 접착시트의 베이스 필름을 가공하는 과정을 나타낸 평면도이고 (b)는 (a)의 A-A선 단면도이다.

접착시트(110)는 앞에서도 설명한 바와 같이, 웰 플레이트(300)의 웰내측바닥면(311)(도 9 및 도 10 참조)에 직접 접착제로서 부착되어 형광패치(101)가 웰내측바닥면(311)에서 유지되도록 하는 기능을 하며, 도 2의 (b)에 나타낸 바와 같이, 접착제층(112)을 사이에 두고 위로는 베이스 필름(111)이 결합되고 아래에는 접착제 보호피막(113)이 결합된다. 접착제 보호피막(113)은 사용시에 제거되고 접착제층(112)이 직접 웰내측바닥면(311)에 결합되며, 베이스 필름(111)은 사용중에도 형광염료와 함께 항상 유지되는 층이다. 접착시트(110)는, 예를 들면, 시중의 3M 접착시트를 사용할 수 있으며, 베이스 필름(111)은, 예를 들면, PET(Polyethylene Terephthalate) 또는 PE(Polyethylene)의 재질로 이루어질 수 있다. 그러나, 형광염료를 적절히 유지할 수 있고, 본 발명에서 적용하고자 하는 배양세포의 대사량 측정에 장애가 되는 재료가 아니라면 특별히 접착시트(110)의 재질에 대해 제한은 없다.

스텝S4 : 이와 같은 접착시트(110)의 베이스 필름(111)의 표면에 도 2의 (a)와 같이, 예를 들면 요철무늬(111a)를 형성하며, 이 요철무늬는 바람직하게는 격자무늬이다. 격자무늬는, 예를 들면, 600_C 사포를 사용하여 가로/세로 2회씩 왕복한다.

베이스 필름(111)의 표면에 요철무늬(111a)(즉, 본 실시예에서는 격자무늬)를 형성하는 이유는 후에 베이스 필름(111) 표면에 액상형광염료(122)(도 3b 참조)를 도포하여 경화시킨 후에 고상형광염료(123)(도 5의 (a) 및 (b) 참조)가 베이스 필름(111)으로부터 분리되는 현상을 방지하기 위함이다. 즉, 고상형광염료(123)와 베이스 필름(111) 간의 부착력을 강화시키기 위해 요철무늬(111a)가 사용된다. 바람직하게는, 사포 가공후 베이스 필름(111)에 남겨진 잔유물, 또는 이물질은, 예를 들면, 스펀지를 이용하여 제거한다.

베이스 필름(111)의 표면에 형성되는 요철무늬(111a)는 격자무늬 대신에 물결무늬, 톱니파무늬, 일정하게 반복되는 도형무늬 등으로 형성할 수도 있고, 무늬형성을 사포가 아니라 금형에 의해 형성할 수도 있다. 즉, 본 발명이 의도하는 기능을 가질 수만 있다면 베이스 필름(111)에 형성되는 요철무늬(111a)의 무늬종류, 무늬제조방법에는 특별히 제한을 두지 않는다.

(3) 형광염료 코팅 과정

도 3 및 도 4를 참조하여 형광염료 코팅 과정을 설명한다.

도 3은 본 발명의 일실시예로서 액상형광염료(122)를 접착시트(110)에 도포하는 과정 중 일부를 나타낸 설명도로서 (a)는 도포용 막대(210)에서 도포 높이 조절을 위한 접착 테이프(212)의 부착을 나타낸 도면이고, (b)는 액상형광염료(122)를 베이스 필름(111)에 부어서 내려놓은 모습을 나타낸 도면이고, 도 4는 본 발명의 일실시예로서 액상형광염료(122)를 접착시트(110)에 고르게 도포한 이후 경화하는 과정을 나타낸 설명도이다.

스텝S5 : 먼저 평탄한 밑받침을 위해, 예를 들면, 유리시트(220)(도 4 참조)를 마련한다. 유리시트(220)는 적어도 접착시트(110) 보다는 치수가 커야 한다.

스텝S6 : 다른 한편으로, 스텝S4에서 마련한 접착시트(110) 보다는 적어도 길이가 크고 바닥이 평탄한 막대(211)를 마련한다. 예를 들면, 베이스 필름(111)의 폭을 20mm, 길이를 100mm로 할 때, 사각형 막대의 길이는 대략 250mm가 바람직하다. 그러나, 그 길이나 폭, 재질, 형상은 코팅을 고르게 도포하는데 유용한 것이라면 특별히 제한을 두지 않는다. 또한, 막대(211) 양쪽에, 예를 들면, 3M의 접착테이프(212)를, 예를 들면, 6회 감아서 도포용 막대(210)를 마련한다. 도포용 막대(210)의 양쪽에 접착테이프(212)를 감는 이유는 형광염료의 도포층 두께를 결정하기 위해서다. 일실시예로서, 접착시트(110) 상의 형광염료의 도포층의 두께는, 예를 들면, 50㎛ ± 10㎛ 범위가 바람직하며, 도포용 막대(210) 양쪽에 감기는 접착테이프(212)는 이러한 형광염료의 도포층을 결정하는 기능을 한다. 접착테이프(212)가 감기는 회수는 특별히 6회에만 한정되는 것은 아니며, 사용하고자 하는 웰 플레이트의 조건이나 배양세포의 특성에 따라서 또한 형광염료의 도포층의 두께에 따라서 증감할 수 있다.

스텝S7 : 접착시트(110)를 요철무늬가 형성된 베이스 필름(111) 면이 위로 향하게 하여 유리시트(220)에 배치하고 위에 액상형광염료(122)를 부어서 내려놓는다(도 3의 (b) 참조).

스텝S8 : 이후, 요철무늬(111a)가 형성된 베이스 필름(111)의 면상에 낙하된 액상형광염료(122)를 접착테이프(212)가 감겨진 도포용 막대(210)를 가지고 일정속도로 끌면서 쓸어내린다. 그러면 감겨진 접착테이프(212)의 두께에 대응하여 베이스 필름(111) 상에 액상형광염료(122)가 목표두께(본 실시예에서는, 예를 들면, 50㎛)에 맞추어 고르게 도포된다(도 4 참조).

스텝S9 : 이와 같이, 액상형광염료(122)가 도포된 베이스 필름(111)은, 예를 들면, 상온에서 24시간 자연 건조한다.

스텝S10 : 이후, 24시간 자연건조된 베이스 필름(111)(즉, 베이스 필름(111) 상의 액상형광염료(122))는 상온 건조 완료후 드라이 오븐을 이용하여 60℃에서 24시간 건조한다.

스텝S11 : 스텝S10의 공정 이후 다시 2시간 이상 상온에 방치한다.

스텝S9 내지 스텝S11의 공정은 액상형광염료(122)가 상온에서 고체 상태로 완벽하게 경화되는데 필요한 조건과 알코올 및 물이 완전 증발되는 과정 또는 조건에 해당된다.

스텝S12 : 건조작업 완료후, 즉 스텝S9 내지 스텝S11 완료후, 코팅의 두께가 목표두께에 해당하는지의 여부를 검수한다. 목표두께에 대해, 예를 들면, ±5% 또는 3% 또는 1%, 0.5%, 0.1% 등으로 오차허용범위를 미리 정해둘 수도 있다. 목표두께가 오차범위를 벗어날 경우, 도포용 막대(210)에서 두께조절용 접착 테이프(212)의 감는 회수를 증감시켜서 위 스텝S1 내지 스텝S12를 반복한다.

일반적으로, 고상형광염료의 두께가 50㎛ 내외의 일정범위일 때, 더욱 정확하게는 50㎛에 근접할 때 형광에 의한 세포대사 감도측정이 가장 적정한 수준인 것으로 확인되고 있으며, 형광염료의 두께가 50㎛ 이하일 때는 감도가 급격히 저하되고, 형광염료의 두께가 50㎛ 이상일 때는 형광패치의 변형이 발생하기 쉽다.

이와 같이, 스텝S5 내지 스텝S12를 통해 접착시트(110) 상에 목표두께를 가지고 경화된 고상형광염료(123)를 형성한다(도 5의 (a)에서 고상형광염료(123) 참조).

(4) 멤브레인층 부착 및 형광염료판재 완성 과정

이하, 도 5를 참조하여 멤브레인층(150) 부착과정을 설명한다.

도 5의 (a)는 본 발명의 일실시예로서 도포된 액상형광염료(122)가 경화된 이후의 고상형광염료(123) 상에 멤브레인층(150)을 배치한 상태를 나타낸 형광염료판재(100)의 평면도이고, 도 5의 (b)는 설명의 편의상 단면방향 길이를 과장하여 나타낸 도 5의 (a)의 A-A선 개략 단면도이다.

스텝S13 : "(3)형광염료 코팅과정"을 종료한 후, 즉, 접착시트(110) 상에 고상형광염료(123)가 형성된 이후, 고상형광염료(123) 상에 접착제로서 기능하는 실리콘본드층(140)을 도포하고 멤브레인층(150)을 고상형광염료(123)에 부착한다.

바람직하게는, 실리콘본드층(140)의 도포 두께는, 예를 들면, 20㎛ 이하내에서 고르게 도포한다. 실리콘본드층(140)을 20㎛ 이상으로 할 경우는 형광패치(101)가 변형될 수도 있으며, 특히, 실리콘본드층(140)을 통해 고상형광염료(123)에 부착된 멤브레인층(150)의 이탈, 분리 가능성이 있음을 발견하였다. 그러나, 형광패치(101)의 전체 두께 및 치수(넓이)에 따라서 실리콘본드층(140)의 두께를 변경할 수도 있다.

실리콘본드층(140)을 위해 사용되는 실리콘은 일반적으로 시판되는 것으로서, 본 발명에 따른 형광패치를 제조하는데 방해가 되지 않으면, 특히 멤브레인층을 고상형광염료(123)에 부착할 때, 형광패치의 기능을 수행할 수 있는 정도라면 특별히 제한이 없다.

실리콘본드층(140)을 통해 고상형광염료(123)에 부착되는 멤브레인층(150)은, 예를 들면, 폴리카보네이트 + 티타늄(Ti)의 재질로 이루어질 수 있으며, 멤브레인층(150)으로서의 기능(빛의 산란 및 반사차단)을 적절히 수행할 수 있으면, 그 재질에 특별히 제한을 두는 것은 아니다.

스텝S14 : 멤브레인층(150)을 고상형광염료(123)에 부착한 이후 실리콘본드층(140)과 함께 상온에서 24시간 정도 건조시키는 것이 바람직하다. 이와 같이 실리콘본드층(140)을 멤브레인층(150)과 함께 상온에서 24시간 정도 건조시키는 이유는, 실리콘을 완전히 경화시킬 수 있는 정도의 시간이 24시간이고, 또한 실리콘이 경화되지 않으면 그 실리콘 독성으로 인해 배양세포가 웰 플레이트(300) 내에서 사멸될 수 있기 때문에, 그 배양세포의 사멸을 방지하는데도 필요하다.

이상과 같이, 스텝S13 및 스텝S14를 통해, 접착시트(110), 고상형광염료(123), 실리콘본드층(140) 및 멤브레인층(150)으로 이루어지는 형광염료판재(100)를 형성할 수 있다. 도 5의 (b)는 형광염료판재(100)의 일예를 나타내고 있다. 형광염료판재(100)의 형상은 직사각형이지만, 처음부터 접착시트(110)를 원형등으로 하여 최종 형광염료판재(100)의 모양을 다양하게 형성할 수도 있다.

(5) 형광패치 형성 과정

이하, 도 6 및 도 7을 참조하여 본 발명의 일실시예에 따른 형광패치(101) 형성과정을 설명한다.

도 6의 (a)는 본 발명의 일실시예로서 펀치될 부분을 나타낸 형광염료판재(100)의 평면도이고, 도 6의 (b)는 펀치될 부분을 대응시켜 비교하기 위해 나타낸 개략 단면도이고, 도 7의 (a)는 형광염료판재(100)를 펀칭가공하기 위한 펀치장치(400)에서 상부다이(410)와 하부다이(420)가 결합된 상태를 나타낸 사시도이고, 도 7의 (b)는 상부다이(410)가 분리되고 하부다이(420)에 형광염료판재(100)가 배치된 상태를 나타낸 사시도이다.

먼저, 도 7을 참조하면, 펀치장치(400)는 펀칭철부(411)를 가진 상부다이(410)와 펀칭요부(421)를 가진 하부다이(420)를 포함하며, 상부다이(410)가 하부다이(420)를 향해 하강하면 펀칭철부(411)의 각 볼록부분과 펀칭요부(421)의 각 오목부분은 일치하게 되며, 이에 따라서 하부다이(420)에 형광염료판재(100)를 펀칭요부(421) 부분에 맞추어 배치하면 펀칭요부(421)의 크기에 맞추어 형광패치(101)가 형성된다. 일실시예로서, 도 7에 따르면, 펀칭요부(421)의 오목부분 및 이에 대응하는 펀칭철부(411)의 볼록부분은 각각 7개로 이루어져 있고, 형광패치(101)가, 예를 들면, 직경 6mm의 크기로 제조되도록 형성되어 있다. 그러나, 웰 플레이트(300)의 규모, 센서부의 배치에 따라서 형광패치(101)의 직경을 변경할 수 있고, 이에 따라서 또한 펀칭요부(421)의 오목부분 및 펀칭철부(411)의 볼록부분 역시 개수 및 치수가 증감될 수 있음은 자명하다. 바람직하게는 형광패치(101)의 직경은 6mm ± 0.6mm 범위이다. 또한, 펀칭장치(400)는 본 발명에 따라서 의도하는 목표 형광패치(101)가 제조될 수 있으면, 그 모양이나 구성에 있어 특별히 제한은 없으며, 도 7의 펀치장치(400)는 구성 가능한 일실시예를 예시한 것뿐이다.

스텝S15 : 도 7의 펀치장치(400)에 의해 형광염료판재(100)를 펀칭가공한다.

도 6을 참조하면, 펀치가공이 이루어질 경우, 도 6 및 도 7의 실시예에 따르면 한 개의 형광염료판재(100) 마다 7개의 형광패치(101)가 산출된다. 도 6의 (a)는 펀치가공으로 인하여 형광염료판재(100)에 펀치공간(160)이 형성되어 있으며, 펀치공간(160)에 대응하여 형광염료판재 펀치존(100a)에 해당하는 부분이 형광패치(101)로서 형성된다. 도 6의 (b)에서 높이방향과 가로방향(직경방향)의 축적비율은 실제생산물과는 외관상 일치하지 있으며, 이는 단지 설명의 편의상 높이방향의 치수를 과장하여 표시한 것이고, 실질적으로 형성되는 형광패치(101)는 도 6의 (b) 우측 하단에 표현되어 있는 바와 같이 납작하고 높이는 1mm 이내, 바람직하게는 0.5mm 이내, 더욱 바람직하게는 0.25mm이고, 가장 일반적인 범위는 0.2mm 이상 1mm이하이가 된다. 또한, 도 6 및 도 7의 실시예에 따라서 결과적으로 형성되는 형광패치(101)는 접착시트(110), 고상형광염료(123), 실리콘본드층(140) 및 멤브레인층(150)을 포함하지만, 다른 본 발명의 일실시예로서, 접착시트(110)와 고상형광염료(123) 만으로도 형광패치(101)를 구성할 수도 있다. 이 경우, 그 원재료가 되는 형광염료판재(100)는 앞에서 설명한 "(1) 액상형광염료 생성과정", "(2) 접착시트(110) 형성과정", "(3) 형광염료 코팅 과정"만 수행하고, "(4) 멤브레인층 부착 및 형광염료판재 완성 과정"은 수행하지 않고 바로 형광염료판재(100)를 완성하고, 펀치가공을 통해 형광패치(101)를 제조할 수도 있다.

스텝S16 : 제조된 형광패치(101)는 일반적으로 빛의 노출에 의한 변질을 방지하기 위해 어두운 곳에 보관하며, 바람직하게는 알루미늄 포일에 포장하여 어두운 곳에 보관한다.

적용예

다음에, 도 8 및 도 9를 참조하여 본 발명의 적용예에 대하여 설명한다.

도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 형광패치(101)가 적용될 수 있는 웰 플레이트(300)의 일예를 나타낸 사시도이고, 도 9는 본 발명의 일실시예에 따라서 형광패치(101)를 적용한 일예를 나타낸 설명도이다.

먼저, 도 8을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 형광패치(101)가 적용되는 세포배양용 웰 플레이트(300)는 웰(310)이 6×4 = 24로 배열되어 있다. 각 웰(310)의 웰내측바닥면(311)은 pH 센서(321) 및 DO 센서(331), 그리고 LED(322, 332)로부터의 빛이 적어도 투과될 수 있도록 투명하게 구성된다. 도 8의 웰 플레이트(300)는 본 발명의 형광패치(101)가 적용되는 일예이며, 본 발명의 형광패치(101)가 부착되어 세포대사량을 측정할 수 있으면 여러 가지 다양한 형태의 웰 플레이트가 본 발명에 적용될 수 있는 것은 당연한 것이다.

도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 형광패치(101)를 사용할 경우에는 형광패치(101)의 최하층에 위치하는 접착제 보호피막(113)(도 6 하단부분 참조)을 제거하고 접착제층(112)이 웰내측바닥면(311)의 센서대응영역(312, 313)에 마주하도록 접착시킨다. 각각의 센서대응영역(312, 313)은 pH 센서부(320) 또는 DO 센서부(330)가 웰내측바닥면(311)과 마주할 때 pH 센서부(320)와 DO 센서부(330)가 웰내측바닥면에서 차지하는 면적 중 적어도 90% 이상(또는 pH 센서부(320)와 DO 센서부(330)를 모두 커버할 수 있는 영역)에 해당하는 영역으로서, 형광패치(101)의 면적과 크기가 같다.

도 9의 실시예의 경우, 도 8의 웰 플레이트(300)에 적용한다는 것을 전제로, 각각의 센서대응영역(312, 313)은 형광패치(101)와 같은 면적, 즉, 직경 6mm로 형성하고 있어 pH 센서부(320)와 DO 센서부(330)를 웰내측바닥면(311) 상에서 모두 커버할 수 있다. 이와 같이 형광패치(101)의 형광염료가 pH 센서부(320)와 DO 센서부(330)를 모두 커버할 때, pH 센서부(320)의 pH 센서(321) 및 LED(322)와, 그리고 DO 센서부(330)의 DO 센서(331) 및 LED(332)와 상호간 대사량측정에 유효한 광량의 빛을 주고받을 수 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 형광패치(101)를 사용할 경우, 정확한 센서대응영역(312, 313)에 형광염료를 배치할 수 있을 뿐만 아니라, 형광염료의 크기 및 두께도 일정하게 유지할 수 있어, 웰 플레이트(300)의 모든 웰(310) 내에서 형광염료의 배치위치, 모양, 크기를 균일하게 할 수 있으므로, 이와 같은 동일한 형광염료 세팅조건에 기반하여 세포대사량 측정값을 신뢰성 있게 획득할 수 있다.

그 밖에도 본 발명은 형광염료의 배치의 신속성, 편리성, 형광염료의 이탈 또는 떨어짐 억제 또는 방지기능의 효과도 함께 제공한다.

이상과 같이 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 즉, 형광패치를 형성하기 위한 여러 공정은 모두 자동화 장치를 통해 이루어질 수도 있으며, 형광패치를 부착한 웰 플레이트가 제공될 수도 있다. 또한, 형광패치의 모양은 원형을 일실시예로서 나타내었지만, 직삭형, 정사각형, 띠모양, 삼각형 등 부착용도에 따라서 다양하게 형성할 수 있다. 그 밖에도, 본 발명의 일실시예로서 형광패치가 적용되는 센서부도 LED와 포토다이오드 조합으로 한 광센서에 그 적용하는 예를 설명하였지만, 본 발명이 의도하는 형광패치의 사용목적을 달성할 수 있는 것이라면, 어떠한 광센서에도 적용할 수 있다.

그 밖에도 본 발명의 형광패치가 적용되는 일예로서 6 × 4 웰 플레이트를 제시하고 있지만, 다른 형태의 모든 세포배양용 웰 플레이트에도 본 발명이 적용될 수 있음은 당연한 것이다.

따라서, 본 발명의 요지 및 다음의 특허청구범위를 일탈하지 않고도 당분야의 통상의 기술자에 의해 여러 가지 변경 및 변형이 가능하며, 이러한 변경 또는 변형도 모두 본 발명에 속하는 것임은 자명하다.

10: 용기 11: 마그네틱 스터바
90: 액상형광염료 제공툴 91: 액적형광염료
92: (종래)형광염료 100: 형광염료판재
100a: 형광염료판재 펀치존 101: 형광패치
110: 접착시트 111: 베이스 필름
111a: 요철무늬 112: 접착제층
113: 접착제 보호피막 121 졸-겔 용액
122: 액상형광염료 123: 고상형광염료
140: 실리콘본드층` 150: 멤브레인층
160: 펀치공간 210: 도포용 막대
211: 막대 212: 접착테이프
220: 유리시트 300: 웰 플레이트
310: 웰 311: 웰내측바닥면
312: (pH)센서대응영역 313: (DO)센서대응영역
320: pH 센서부 321: pH 센서
322: LED 330: DO 센서부
331: DO 센서 332: LED
350: 회로기판 400: 펀치장치
410: 상부다이 411: 펀칭철부
420: 하부다이 421: 펀칭요부

Claims

복수의 웰을 포함하는 웰 플레이트 내에서 배양되는 세포의 대사량 측정용 DO(용존산소) 센서부 및 pH 센서부와 빛을 주고받을 수 있으며, 웰 플레이트의 각각의 웰내에서 배양되는 세포에서 세포대사의 결과로 산출되는 용존산소 및 수소 중 적어도 하나에 감응할 수 있고, 상기 감응의 결과로 발생하는 빛을 세포대사량 정보로서 상기 DO 센서부 및 pH 센서부 중 적어도 하나에 제공할 수 있는 고상형광염료를 생성하기 위한 전처리 단계로서 액상형광염료를 합성하는 액상형광염료 합성 단계와;
상기 웰 플레이트의 웰의 웰내측바닥면에 직접 접촉하여 부착되는 접착면을 가진 접착제층과, 상기 접착면과는 반대되는 면에 결합된 베이스 필름을 포함하는 접착시트를 마련하는 단계와;
상기 베이스 필름 상에 상기 액상형광염료를 일정두께로 도포하는 액상형광염료 도포단계와;
도포된 상기 액상형광염료를 일정기간 경화하여 고상형광염료를 형성하는 액상형광염료 경화단계와;
상기 경화단계로 액상형광염료가 고상형광염료로 형성되면, 상기 베이스 필름과 고상형광염료를 적어도 포함하는 형광염료판재를 형성하는 단계와;
상기 형광염료판재를 펀칭하여 일정크기 및 일정 모양으로 형성하는 형광패치 형성단계를;
구비하며,
상기 접착시트를 마련하는 단계에서, 상기 베이스 필름 상에 일정모양의 요철을 형성하는 단계를 더 포함하고,
상기 일정모양의 요철은 격자무늬 요철 또는 물결무늬 요철이고,
상기 액상형광염료 도포단계에서는 양쪽에 접착테이프로 도포두께의 높이를 조절한 도포용 막대를 이용하여 베이스 필름 상에 일정한 두께로 상기 액상형광염료를 도포하는 것을 특징으로 하는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 액상형광염료 경화단계에서 경화시간은 상온에서 24시간 자연건조, 건조용 오븐 내에서 60℃에서 24시간 건조 및 다시 상온에서 2시간 방치를 포함하고,
상기 액상형광염료 경화단계 이후, 경화된 고상형광염료 상에 빛산란 및 반사를 방지하는 멤브레인층을 형성하는 멤브레인층 형성단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 멤브레인층 형성단계에서, 상기 고상형광염료 상에 실리콘본드를 도포한 후 상기 멤브레인을 상기 고상형광염료에 부착하여 멤브레인층을 형성하는 것을 특징으로 하는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법.
제1항에 있어서,
액상형광염료 합성 단계이후 24시간 방치단계를 더 포함하고,
상기 형광패치의 일정크기는 DO 센서부 또는 pH 센서부와 마주하는 웰의 웰내측바닥면의 센서대응영역의 크기이거나 적어도 센서대응영역의 면적보다 90% 이상 크며, 상기 일정모양은 원형이고,
상기 액상형광염료 도포단계에서 도포되는 액상형광염료의 일정두께는 50㎛±10㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 형광염료판재를 펀칭하여 일정크기 및 일정 모양으로 형성하는 형광패치 형성단계 이후, 형성된 형광패치를 일정 용기에 담아서 어두운 곳에 보관하는 단계를 더 포함하고,
상기 형광패치의 일정크기는 직경 6mm ±0.6mm 범위이고 두께는 0.2mm 이상 1mm 이하 범위이며,
상기 일정 용기는 알루미늄 호일로 이루어진 용기인 것을 특징으로 하는 웰 플레이트용 형광패치 제조방법.
제1항 내지 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 웰 플레이트용 형광패치.
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