DE19901166A1

DE19901166A1 - Verbesserungen beim Transport von Reagentien zu einer Reaktionsstelle

Info

Publication number: DE19901166A1
Application number: DE1999101166
Authority: DE
Inventors: David Charles Mangham; Mark Trehane Drayson
Original assignee: Binding Site Ltd
Current assignee: Binding Site Ltd
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 1999-07-22
Also published as: GB2333358A; GB9800724D0

Description

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren sowie eine Vorrichtung zum Transport von Reagentien, beispielsweise Antikörpern, Nukleinsäuren, Enzymsubstrate oder Färbungsmitteln zu einer Reaktionsstelle, wie einer Gewebeprobe.

Hintergrund

Immunohistochemie stellt eine gebräuchliche Technik zum Nachweis der An- oder Abwesenheit spezifischer Moleküle in einer biologischen Probe sowie deren Verteilung in der Probe (normalerweise eine Gewebeprobe) dar. Immunocytochemie ist ein sehr ähnliches gebräuchliches Gebiet, auf dem mit Zellen gearbeitet wird. Diese Techniken nutzen eine spezifische Bindungsreaktion von Antikörper und Antigen.

Die Erfindung wird am Beispiel der Immunohistochemie beschrieben, sie ist jedoch auch für andere Gebiete von Bedeutung, die später diskutiert werden.

Um einen Antikörper nachzuweisen, der an ein bestimmtes Antigen gebunden ist (d. h. den primären Antikörper/Antigen-Komplex) ist es notwendig, ein Nachweissystem zu verwenden, mit dem es möglich ist, die Anwesenheit und die räumliche Verteilung der Antikörper nachzuweisen. Das Nachweissystem kann ein direktes System sein (bei dem der Antikörper direkt an das Nachweissystem konjugiert ist) oder es kann ein indirektes System verwendet werden, bei dem eine einfach nachzuweisende Verbindung an ein Molekül gekoppelt ist, das direkt oder indirekt an den Antikörper bindet. Ein Beispiel für ein direktes Nachweissystem ist die Markierung eines Antikörpers mit radioaktiven Isotopen. Ein Beispiel für ein indirektes Nachweissystem ist das allgemein gebräuchliche Avidin-Biotin-Komplexierungsverfahren.

Einige Nachweissysteme verwenden Enzyme und erfordern die Zugabe eines Substrats des verwendeten Enzyms, um ein Präzipitat oder ein farbiges Produkt zu erzeugen (oder um etwas zu erzeugen, das anschließend gefärbt werden kann oder um etwas zu erzeugen, das in einem späteren Schritt dazu führt, das sich ein Präzipitat bildet).

Aus den Ergebnissen der Immunochemietests kann die Anwesenheit eines Targetantigens ebenso nachgewiesen werden, wie sein Ort oder seine Verteilung zwischen den Zellen bzw. in den Zellen.

Stand der Technik

Als Beispiel und um die Erfindung in einen Zusammenhang zu stellen, wird im weiteren ein Verfahren zur Anwendung von Reagentien in der Immunohistochemie aus dem Stand der Technik vorgestellt. Dieser bekannte Weg, Antikörper und das Nachweissystem zur Gewebeprobe zu transportieren, besteht in einer Anwendung in flüssiger Phase, bei der eine Antikörperlösung bzw. von Bestandteilen eines Nachweissystems bei einer bestimmten Konzentration mit Hilfe einer Pipette tropfen weise zu einer auf einem Objektträger befestigten Gewebeprobe gegeben werden. Es kann eine dreistufige Anwendung in flüssiger Phase verwendet werden. Bei einem solchen dreistufigen System wird in einem ersten Schritt ein primärer Antikörper zur Gewebeprobe gegeben, die Probe und der Antikörper für 30 Minuten inkubiert und dann gewaschen. In einem zweiten Schritt wird das Nachweissystem erzeugt, wozu mittels einer Pipette ein sekundärer Antikörper, der (zur Signalverstärkung) mit einem Enzym konjugiert ist, zugegeben, die Gewebeprobe und der konjugierte Antikörper für 30 Minuten inkubiert und dann gewaschen. In einem dritten Schritt werden mit der Hand mittels einer Pipette ein oder mehr Reagentien zugegeben, die mit dem Enzym unter Erzeugung eines sichtbaren Ergebnisses reagieren. Die Probe wird anschließend gewaschen (oder inkubiert und gewaschen) und das durch das Enzym durch Reaktion mit dem dritten Reagenz erzeugte unlösliche Präzipitat mit dem Auge oder unter dem Mikroskop detektiert.

Selbstverständlich sind viele andere ähnliche immunohistochemische Verfahren bekannte. Das oben beschriebene dient lediglich als Beispiel.

Die Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, das bekannte Verfahren zum Transport eines Reagenz, wie eines Antikörpers, zu einer Reaktionsstelle zu verbessern. Einige der Ausführungsformen der Erfindung reduzieren die Kosten, die Anforderungen an die Geschicklichkeit sowie an die erforderliche Zeit, wobei gleichzeitig die Genauigkeit der Ergebnisse erhalten bleibt.

Obwohl wir bei den Arbeiten die zur vorliegenden Erfindung führten, ursprünglich vom Gebiet der Immunohistochemie und der Immunocytochemie ausgegangen sind, hat diese auch breitere Anwendungsmöglichkeiten, beispielsweise beim Transport von Nukleinsäuresonden, für Transportsysteme für Enzyme und Transportsysteme für Färbemittel. Auf diesen Gebieten wird die An- oder Abwesenheit eines bestimmten Moleküls untersucht, sowie dessen Verteilung in der Probe. Diese Techniken verwenden ebenfalls Nachweissysteme bzw. Systeme zum Sichtbarmachen.

Nach einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Transport eines Reagenz zu einer biologischen Probe, die auf die An- oder Abwesenheit einer Verbindung zu untersuchen ist, zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Bereitstellen eines Reagenz auf einem Träger; Anordnen des Trägers auf der Probe; Gewährleisten, daß an der Grenzfläche von Träger und Probe Flüssigkeit zur Verfügung steht, wobei die Anordnung so gewählt wird, daß das Reagenz den Träger verläßt und in die Probe wandert, wo es mit der genannten Substanz in Wechselwirkung tritt.

Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit, das Reagenz in flüssiger Phase anzuwenden, was wegen geringer Sorgfalt beim Pipettieren zu Ungenauigkeiten führen kann und geübte Anwender beim Pipettieren und bei der Herstellung der flüssigen Reagentien erfordert. Die erfindungsgemäßen Transportmittel sind einfach auf die Reaktionsstelle anzuwenden.

Das Reagenz kann auf dem Träger in getrockneter oder immobilisierter Form bereitgestellt werden. In getrockneter Form kann das Reagenz wesentlich widerstandsfähiger sein als in wäßriger Form. Beispielsweise müssen in einer Ampulle eingeschlossene gelöste Antikörper bei ungefähr 4°C gelagert werden, und besitzen eine Lagerfähigkeit von Wochen oder Monaten. Getrocknete Antikörper können Temperaturen von bis zu 20°C oder 30°C (oder sogar höher) bestehen und weisen eine deutlich höhere Lagerfähigkeit auf.

Der Träger muß eine Affinität zum zu transportierenden Reagenz aufweisen, vorzugsweise soll er eine hohe Affinität zum von ihm zu transportierenden Reagenz aufweisen. Die Affinität des Trägers zum Reagenz ist geringer als die des Reagenz zu seinem spezifischen Target, jedoch höher als die des Reagenz zu anderen Verbindungen an der Reaktionsstelle.

Der Träger kann porös oder nicht porös sein.

Der Träger kann flexibel gestaltet sein. Dies ermöglicht ihm, sich an eine Gewebeprobe anzuschmiegen, wenn sich zwischen ihnen ein dünner Flüssigkeitsfilm befindet: die Wirkung der Oberflächenspannung kann dazu genutzt werden, einen dünnen Film auf die Gewebeprobe aufzuziehen, wodurch der Abstand zwischen Träger und Probe sinkt. Damit verringert sich die Menge an Antikörpern (oder eines anderen Reagenz) die erforderlich ist, um sicherzustellen, daß an der Probenstelle eine ausreichende Konzentration des Reagenz zur Verfügung steht.

Der Träger kann eine Membran oder ein Film sein. Er kann ein Streifen aus einem Material sein. Wahlweise kann er eine bestimmte Dicke aufweisen und kann ein Schwamm sein.

Der Träger ist bevorzugt ein künstlich hergestelltes Material sein, das auf Cellulose basieren kann, wie Nitrocellulose, Celluloseacetat oder eine andere behandelte Form (z. B. Papier), oder Nylon. Der Träger ist bevorzugt hydrophil.

Das Reagenz wird bevorzugt auf der Oberfläche des Trägers bereitgestellt.

Die Affinität von Nitrocellulose und Nylon zu Proteinen ist bekannt und sie werden bei vielen Anwendungen zum Sammeln von Proteinen eingesetzt (beispielsweise um Proteine herauszufiltrieren). Es ist ein fachliches Dogma, daß Nitrocellulose (und Nylon) Proteine bindet und sie nie mehr freigibt. Hier werden diese Materialien benutzt, um Proteine bereitzustellen, womit in genauem Gegensatz zu diesem Dogma (das nicht die ganze Wahrheit darstellt) gehandelt wird. Es wurde gefunden, daß Nitrocellulose dazu verwendet werden kann, um Reagentien in kontrollierter Weise zu transportieren.

Das Verfahren kann die Bereitstellung eines Reagenz umfassen, das an den Träger bindet und sicherstellt, daß der Träger nicht zu viele freie Bindungsstellen aufweist, an die ungebundenes Reagenz binden kann, so daß Reagenz, das vom Träger abdissoziiert, dazu neigt, an die Substanz in der Probe zu binden und nicht wieder an den Träger.

Bevorzugt ist der Träger (z. B. eine Membran) mit dem Reagenz imprägniert oder es ist an diesen gebunden und der Träger wird dem Anwender mit bereits aufgetragenen vorbereiteten aktiven Chemikalien zur Verfügung gestellt.

Es können verschiedene Reagentien, die auf verschiedenen Trägern aufgetragen sind, zur Verfügung gestellt werden, die jeweils auf die jeweilige Probe angewandt werden. Wahlweise oder zusätzlich können mehr als ein aktives Reagenz auf einem einzelnen Träger zur Verfügung stehen.

Wird mehr als ein Reagenz auf dem Träger bereitgestellt, können diese miteinander an der Probe reagieren und einen Komplex oder eine andere nützliche Verbindung an der Probe ausbilden, oder sie können spezifisch für unterschiedliche Targetmoleküle sein. Sofern sie für verschiedene Targetmoleküle spezifisch sind, können die Reagentien unterschiedliche Nachweissysteme bzw. Systeme zum Sichtbarmachen aufweisen und können (oder können nicht) die Anwendung verschiedener weiterer Substanzen erfordern, um ihre Anwesenheit und ihren Ort sichtbar zu machen.

Der Träger kann zusätzlich zum Reagenz, das spezifisch für das gesuchte Molekül ist, ein Konservierungsmittel enthalten. Der Träger kann wahlweise oder zusätzlich ein verstärkendes Mittel aufweisen, das die Wirkung des Reagenz verstärkt. Beispielsweise kann der Träger eine hohe Affinität zum Reagenz aufweisen, und kann (zusätzlich zum Reagenz) eine Blockersubstanz aufweisen, die viele Bindungsstellen auf dem Träger blockiert und es einem dissoziierten Reagenzmolekül erschwert, sich wieder an den verwendeten Träger zu binden.

Der Träger (z. B. eine Membran) kann dem Anwender in gebrauchsfertigem Zustand (d. h. naß) oder in einem potentiell gebrauchsfertigem Zustand (d. h. getrocknet) zur Verfügung gestellt werden, bzw. kann er in diesen Zuständen gelagert werden.

Das Verfahren umfaßt vorzugsweise die Anwendung des Trägers auf eine Reaktionsstelle, wo die für das Reagenz und das Targetmolekül spezifische Reaktion stattfindet. Die Reaktionsstelle ist gewöhnlich ein Gewebeschnitt oder ein zytologisches Präparat, das auf einem Objektträger befestigt ist.

Vor, nach oder während des Schritts der Anwendung des Trägers (z. B. einer Membran) kann der Träger durch ein Verfahren verändert werden, z. B. ein erneutes Anfeuchten.

Die in getrockneter Form vorliegenden Transportmittel können durch Zugabe eines Tropfens einer Lösung zur Reaktionsstelle vor der Anwendung der Transportmittel wieder befeuchtet werden. Wahlweise kann die Reaktionsstelle bereits feucht sein (z. B. wenn dies eine Gewebeprobe ist), weshalb keine zusätzliche Zugabe von Wasser erforderlich ist. Unter gewissen Umständen kann die Flüssigkeit auch direkt auf das Transportmittel gegeben werden.

Vorzugsweise ist die Lösung Wasser, eine wäßrige Lösung, eine Pufferlösung oder eine Lösung in einem organischen Lösungsmittel.

Das Transportmittel wird auf die Reaktionsstelle bevorzugt in der Weise angewendet, daß diese vollständig oder zum größten Teil bedeckt ist und mit ihm in Kontakt steht.

Nach dem Aufbringen des Trägers auf die Probe umfaßt das Verfahren vorzugsweise eine Inkubationszeit, in der das Reagenz (oder eine andere nützliche Verbindung) aus dem Träger auf die Reaktionsstelle (z. B. einem Gewebeschnitt) freigesetzt wird.

Das Verfahren kann weiter (oder kann nicht) die Anwendung eines oder mehrerer anderer Träger (z. B. Membranen) umfassen, die unterschiedliche Reagentien tragen (z. B. Proteine, oder Enzymsubstrate) um entweder das Reagenz, das zur Reaktionsstelle transportiert wurde, oder bereits vorhandene Substrate an der Reaktionsstelle (z. B. einer Gewebeprobe) nachzuweisen. Der Zweck dieser anschließenden Anwendung eines weiteren Trägers (oder weiterer Träger) besteht darin, die Targetmoleküle sichtbar zu machen (obwohl diese auch mit einem geeigneten einzelnen Träger sichtbar gemacht werden können), indem ein Nachweissystem oder dessen einzelne Komponenten zu den Targetmolekülen transportiert werden.

Eine Komponente des Nachweissystems kann ein Reagenz sein, das aufgegeben wird, um ein spezifisches Molekül bzw. eine spezifische Substanz nachzuweisen und kann einen Antikörper (d. h. Immunohistochemie oder Immunocytochemie) sein, eine Nukleinsäuresonde (in-situ Hybridisierung), ein Substrat für ein Enzym (Enzym-Histochemie) oder ein Färbemittel.

Ein weiterer Bestandteil des Transportsystems kann ein Mittel zum Sichtbarmachen der An- oder Abwesenheit des oben genannten Nachweisreagenzes sein. Derartige Techniken zum Sichtbarmachen umfassen die Verwendung von Enzymen (z. B. Peroxidase, oder alkalische Phosphatase), Fluoreszenzmitteln (z. B. FITC); Partikelmaterial (z. B. Gold), oder radioaktiv markierten Verbindungen.

Wird ein Verfahren zum Sichtbarmachen mit Enzymen verwendet, muß ein Substrat für dieses Enzym aufgegeben werden (und dies kann auf einer Membran in ähnlicher Weise, wie bei den vorher beschriebenen anderen Reagentien angewendet werden).

Es können eine oder mehrere der Komponenten des Nachweissystems mit dem erfindungsgemäßen Träger bereitgestellt werden.

Nach einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der An- oder Abwesenheit einer Substanz an einer Reaktionsstelle (wie einer Gewebeprobe) zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte.
Bereitstellen eines ersten Reagenz auf einem ersten Transportmittel;
Anwendung der Transportmittel auf die Reaktionsstelle;
Sicherstellen, daß das Reagenz an der Reaktionsstelle hydratisiert ist;
Entfernen des ersten Transportmittels;
Bereitstellen zumindest einer Komponente eines Nachweissystems, das dazu ausgelegt ist, die An- oder Abwesenheit des ersten Reagenz anzuzeigen, auf einem zweiten Transportmittel;
Anwenden eines zweiten Transportmittels auf die Reaktionsstelle;
Sicherstellen der Freigabe der Komponenten des Nachweissystems aus einem zweiten Transportmittel;
und Ermöglichen der Komponente des Nachweissystems abzureagieren, um ein nachweisbares Signal zu erzeugen.

Das erste Signal und/oder das Nachweissystem stehen bevorzugt in getrockneter Form zur Verfügung.

Vorzugsweise ist die Substanz (z. B. ein Protein), deren Anwesenheit nachgewiesen werden soll, ein Antigen.

Das erste Reagenz ist bevorzugt ein primärer Antikörper, der spezifisch für das Antigen ist, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll. Der primäre Antikörper wird bevorzugt aus einer Bibliothek von Antikörpern ausgewählt, die für verschiedene Antigene spezifisch sind, jedoch einer gemeinsamen Quelle entstammen und die daher einen gemeinsamen Strukturabschnitt aufweisen. Vorzugsweise ist die Quelle ein Säugetier, wie ein Schaf.

Das Nachweissystem umfaßt bevorzugt eine Kombination von zwei Komponenten auf getrennten Transportmitteln. Die erste Komponente des Nachweissystems kann ein sekundärer Antikörper-Enzym-Komplex sein (oder andere Mittel für einen Nachweis oder zur Verstärkung). Der sekundäre Antikörper-Enzym-Komplex ist bevorzugt für den gemeinsamen Strukturabschnitt der Bibliothek primärer Antikörper spezifisch. Das Enzym dient dazu, das Nachweissignal zu verstärken.

Wird ein enzymatisches Nachweissystem verwendet, kann die zweite Komponente des Nachweissystems ein Substrat sein, auf das das Enzym zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals (z. B. ein Präzipitat) einwirkt. Natürlich kann auch ein nicht-enzymatisches Nachweissystem verwendet werden, wobei in diesem Fall kein Substrat erforderlich ist.

Die Verwendung einer Bibliothek primärer Antikörper, wobei diese einer gemeinsamen Quelle entstammen und damit einen gemeinsamen Abschnitt aufweisen, jedoch jeweils spezifisch für ein anderes Antigen sind, zusammen mit einer zweiten Komponente, ist vorteilhaft (jedoch nicht essentiell). Obwohl die Erstellung der Bibliothek primärer Antikörper billig ist, können sich viele Antikörpervarianten in der Bibliothek befinden und damit wäre die Konjugation einer jeden mit einer zweiten Komponente eines Nachweissystems (z. B. einem Enzym, um einen Komplex aus Antikörper und Enzym zu erhalten) und damit die Zusammenführung des Reagenz mit der ersten Komponente des Nachweissystems kosten- und zeitaufwendig. Bindet wegen des der gesamten Bibliothek gemeinsamen Abschnittes der sekundäre Antikörper jedoch an alle primären Antikörper der Bibliothek, muß nur der sekundäre Antikörper mit dem Nachweissystem konjugiert werden, wobei dieses Konjugat dann für alle primären Antikörper der Bibliothek verwendet werden kann, wodurch sich die Kosten reduzieren.

Als vereinfachtes Modell des bei einer Ausführungsform der Erfindung verwendeten Prinzips, kann von einem (unwahrscheinlichen) Zustand ausgegangen werden, bei dem das Transportmittel zu 100% beladen ist. Der Antikörper auf dem Transportmittel, der vom Transportmittel abdissoziiert, hat nur die Wahl zwischen zwei Bindungszuständen; er kann sich wieder an das Transportmittel an seine vorige Position binden oder er kann sich zu einem Antigen bewegen, das an der Reaktionsstelle angeboten wird. Es wird daher ein Wettbewerb in der Affinität erzeugt. Ist der Antikörper für ein an der Reaktionsstelle vorhandenes Antigen spezifisch, bindet sich der Antikörper an diese, da die Affinität zum Antigen größer ist, als die zum Transportmittel. Ist der Antikörper für das Antigen an der Reaktionsstelle unspezifisch, ist die Affinität zum Transportmittel größer und der Antikörper verbleibt deshalb auf dem Transportmittel.

Natürlich wird in der Praxis keine 100%-ige Beladung des Transportmittels erreicht, da dies zu teuer ist, jedoch kann eine ähnliche Wirkung dadurch erreicht werden, daß viel potentielle Bindungsstellen auf dem Träger blockiert werden.

Reduktion des Hintergrundsignals

Nach einem anderen Aspekt der hier offenbarten Erfindung wird ein dreistufiger Wettbewerb in der Affinität erzeugt, welcher zu einer Reduktion des Hintergrundsignals führt, das durch die schwache Bindung des Reagenz (z. B. einem Antikörper) an Moleküle verursacht wird, die an der Reaktionsstelle vorhanden sind, zu denen es jedoch nicht spezifisch ist. Bei dem vorliegenden Verfahren ist die Affinität zum spezifischen Antigen höher als die zum Transportmittel, jedoch ist die Affinität zum Transportmittel höher als die zu anderen Molekülen bzw. Antigenen, zu denen das Reagenz (z. B. ein Antikörper) nicht spezifisch ist. In einem vereinfachten Modell bindet das Reagenz daher an Moleküle, für das es spezifisch ist, oder es verbleibt auf dem Transportmittel. Natürlich hängen die Affinitätsreaktionen bzw. Affinitätskonstanten von der Statistik oder der Wahrscheinlichkeit ab: das System ist dynamisch im Hinblick auf das Reagenz (z. B. einen Antikörper) durch dessen fortwährende Bindung und Ablösung, wobei für dieses jedoch eine größere Tendenz dahin besteht, zum spezifischen Protein, das nachgewiesen wird, gebunden zu bleiben. Die geringste Tendenz besteht dahin, an ein unspezifisches Protein der Gewebeprobe zu binden oder bei diesem zu verbleiben und eine mittlere Tendenz besteht dahin, sich an das Transportmittel zu binden.

Natürlich trifft dasselbe zu, wenn das Reagenz nicht ein Antikörper ist: Nukleinsäuresonden, Enzymsubstrate und Färbemittel können alle einen dreifachen Wettbewerb ausbilden, wobei dies zur Reduktion des Hintergrundsignals verwendet werden kann.

Ein weiterer Vorteil des vorgeschlagenen Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik besteht darin, daß die Konzentration an eingesetzten Antikörpern wegen des Wettbewerbs in der Affinität weniger wichtig ist. Bei den Verfahren nach dem Stand der Technik werden die in der Immunohistochemie verwendeten Lösungen des Antikörpers genau titriert, um der Probe, der Vorrichtung und den Versuchsbedingungen zu entsprechen. Dies selbst ist zeitaufwendig und erfordert erhebliche Fertigkeiten. Beim erfindungsgemäßen Verfahren steht auf dem Transportmittel bevorzugt mehr Reagenz (z. B. Antikörper) zur Verfügung, als Targetsubstanz (z. B. ein Antigen) an der Reaktionsstelle, wobei die exakte Konzentration jedoch keine so große Rolle spielt wie bei den Verfahren aus dem Stand der Technik.

Die Wirkung, die damit erzeugt wird, daß das Transportmittel präsent ist, während das Reagenz (z. B. ein Antikörper) abdissoziiert, besteht darin, daß eine alternative Bindungsstelle zur Bindung an ein in der Probe vorhandenes unspezifisches Protein besteht, so daß im Hintergrund weniger Bindungen auftreten, wodurch der Kontrast zwischen Präzipitat, das durch ein spezifisches Protein erzeugt wird, und Präzipitat aus dem Hintergrund größer wird, wodurch das Resultat des Tests besser sichtbar wird.

Weniger Abfallreagenz

Weiter führten die Verfahren aus dem Stand der Technik durch die Anwendung in flüssiger Phase zu großen Mengen an Abfall. Wird ein Tropfen einer Lösung des Antikörpers auf die Gewebeprobe gegeben, so tritt nur das Reagenz (z. B. ein Antikörper), das unmittelbar benachbart zur Probe ist, mit dieser in Kontakt und reagiert ab, das verbleibende Reagenz im Tropfen ist Abfall und könnte genauso gut nicht vorhanden sein. Das erfindungsgemäße Transportmittel ist vorzugsweise dünn und flexibel, weshalb der größte Teil des im Transportmittel enthaltenden Reagenz (z. B. ein Antikörper) mit der Probe in Kontakt tritt und nutzbringend mit jeglichem vorhandenen Antigen reagieren kann.

Weitere Eigenschaften der Erfindung

Das primäre Reagenz (z. B. ein Antikörper) und ein sekundäres Reagenz aus einem indirekten System zum Sichtbarmachen (z. B. ein Antikörper-Enzym- Komplex) können auf demselben Transportmittel zur Verfügung gestellt werden. Die gemeinsame Lagerung dieser Substanzen ist in der flüssigen Phase nicht möglich, da die beiden Substanzen innerhalb von Stunden beginnen, miteinander zu reagieren und zu komplexieren. Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann jedoch das Transportmittel getrocknet werden, ehe die Substanzen miteinander reagieren und es tritt keine weitere Reaktion ein, ehe sie nicht zum Gebrauch erneut befeuchtet werden.

Das erfindungsgemäße Transportmittel kann für längere Zeit gelagert werden, als die flüssigen Gegenstücke, da die vorgetrockneten Reagentien nicht so schnell verderben.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Mittel zum Transport von Reagentien (z. B. eine Membran) an eine Reaktionsstelle zur Verfügung gestellt, das einen Träger umfaßt, der das verwendete Reagenz an der Reaktionsstelle freisetzt.

Das Transportmittel ist bevorzugt eine hydrophile Membran. Die Membran ist bevorzugt aus Nitrocellulose, Celluloseacetat, Nylon oder Vergleichbarem. Das Transportmittel kann auch ein anderes geeignetes Material sein, wie ein Stoff, Papier oder eine Schwamm. Vorzugsweise ist das Transportmittel flexibel, um einen innigen Kontakt mit der Reaktionsstelle zu ermöglichen und um einen dünnen Film zwischen dem Transportmittel und der Reaktionsstelle zu erzeugen, wodurch die räumliche Trennung minimiert wird und die erforderliche Menge an Reagenz (z. B. ein Antikörper) ökonomisch sparsam eingesetzt wird. Die Reaktionsstelle ist bevorzugt ein histologisches oder cytologisches Präparat, wie eine Gewebeprobe oder ein Aspirat. Die Reagentien können Antikörper, Antikörperkomplexe, Nukleinsäuren, Enzymsubstrate, Färbemittel oder andere Reagentien sein, die an die Reaktionsstelle transportiert werden sollen.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zum Transport eines Reagenz zu einer Reaktionsstelle zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines körperlichen Trägers, wie einer Membran oder Vergleichbarem, und Auftragen einer Lösung des Reagenz auf den Träger.

Bevorzugt umfaßt das Verfahren das Trocknen des Trägers. Der Träger kann vollständig getrocknet werden oder teilweise. Der Träger kann mit dem Reagenz getränkt werden. Das Verfahren kann umfassen, daß mehr als ein Reagenz in den Träger eingebracht wird. Das Verfahren kann umfassen, daß eine Blockersubstanz in den Träger eingebracht wird, so daß es dem Reagenz erschwert wird, wieder an den Träger zu binden, nachdem es bei der Anwendung abdissoziiert ist. Der Träger ist bis zum Gebrauch bevorzugt in Folie versiegelt.

Nach einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der zumindest einen erfindungsgemäßen Träger umfaßt, der ein Reagenz enthält, das in oder nicht in vorgetrockneter Form vorliegen kann.

Der Kit kann eine Gebrauchsanleitung umfassen. Der Kit kann einen Träger (oder Transportmittel) umfassen, der ein primäres Reagenz (z. B. Antikörper) in vorgetrockneter Form enthält. Der Kit kann mehrere Träger umfassen, wobei jeder ein anderes primäres Reagenz enthält. Die primären Reagentien sind bevorzugt aus einer Bibliothek von Reagentien ausgewählt, die eine gemeinsame Quelle und Basissequenz aufweisen. Der Kit kann einen oder mehrere Träger umfassen, die Komponenten eines erfindungsgemäßen Nachweissystems umfassen.

Das Nachweissystem kann ein sekundäres Reagenz umfassen (z. B. einen Antikörper-Enzym-Komplex). Das sekundäre Reagenz bindet bevorzugt an die gemeinsame Basissequenz der Reagentienbibliothek.

Der Kit kann ein oder mehrere Träger umfassen, die primäre Antikörper (oder andere Reagentien) in vorgetrockneter Form umfassen und ein oder mehr Transportmittel, die Komponenten des Nachweissystems in vorgetrockneter Form umfassen. Die primären Antikörper (oder andere Reagentien) können für jeden Träger unterschiedlich sein. Der Kit kann ein oder mehrere Träger umfassen, die beide Reagentien umfassen, d. h. ein primäres Reagenz (primäre Antikörper) und ein sekundäres Reagenz (z. B. ein Antikörper-Enzym- Komplex), das den Nachweis des primären Reagenz ermöglicht. Der Kit kann ein Peroxid umfassen (oder ein anderes für die enzymatische Reaktion erforderliches Reagenz), das in trockener Form vorliegen kann. Die Träger können in Foliensäcken zur Verfügung stehen, die Foliensäcke können mit ihrem Inhalt beschriftet sein.

Es kann ein Träger, mit mehr als einem aktiven Reagenz (z. B. Antikörper, die für unterschiedliche Antigene spezifisch sind) zur Verfügung gestellt. Falls dies der Fall ist, ist vorzugsweise das erste Reagenz (z. B. ein Antikörper) mit einem Tier einer ersten Spezies erzeugt worden (z. B. Schaf), und das zweite Reagenz (z. B. ein Antikörper) mit einem Tier einer anderen Spezies (z. B. Kaninchen) erzeugt worden sein. Dies ermöglicht es, gleichzeitig zwei verschiedene Nachweissysteme zu verwenden, die sich gegenseitig nicht beeinflussen (z. B. ist das Nachweissystem 1 spezifisch für Material aus der Spezies 1 und das Nachweissystem 2 spezifisch für Material aus der Spezies 2).

Auf demselben Träger können auch dritte und weitere Reagentien, möglicherweise von einer dritten und andersartigen Spezies zur Verfügung gestellt sein. Wahlweise kann der Kit auch unterschiedliche Träger umfassen, auf denen sich Reagentien von unterschiedlichen Spezies befinden, so daß einfacherweise verschiedene Systeme zum Sichtbarmachen zur Verfügung stehen. Es kann auch ein Träger zur Verfügung gestellt sein, der Substanzen aufweist, die in mehr als einem System zum Sichtbarmachen involviert sind. Ein Kit kann einen Träger aufweisen, auf dem sich mehrere Nachweissysteme befinden, die jeweils komplementär und spezifisch zu einem jeweiligen Reagenz sind.

Eine andere Weise, mit der die Erfindung betrachtet werden kann, ist die als diagnostischer Test. Obwohl diagnostische Tests, die auf den menschlichen Körper angewendet werden, in einigen Ländern nicht patentierbar sind, sind diagnostische Tests, die in-vitro und nicht am menschlichen Körper durchgeführt werden, praktisch überall patentierbar.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir einen in-vitro diagnostischen Test zur Verfügung, umfassend die Entnahme einer biologischen Probe von einem Subjekt (z. B. ein Mensch, eine Pflanze, ein Tier oder Mikroorganismen);
Bereitstellen eines Trägers, der ein Reagenz (z. B. einen Antikörper) trägt, das spezifisch für eine Substanz ist, nach der mit dem Test gesucht wird;
Zusammenbringen des Trägers mit der Probe in einen engen Kontakt, wobei sichergestellt wird, daß sich zwischen diesen eine Flüssigkeit befindet, wodurch eine Migration des Reagenz vom Träger zur Probe ermöglicht wird;
Untersuchung der Probe, um die Anwesenheit des Reagenz nachzuweisen.

Bevorzugt umfaßt das Verfahren einen Warteschritt für die Gleichgewichtseinstellung bei der Ausbildung des Affinitätswettbewerbs oder der Reaktionskinetik zwischen Träger und Substanz um die Bindung des Reagenz (oder zumindest bis dies beginnt, so daß das Reagenz an die Substanz bindet bzw. mit der Substanz reagiert).

Der diagnostische Test wird nahezu immer den Schluß von den Ergebnissen der Untersuchung einer Probe auf die Anwesenheit einer Substanz bzw. auf die Auswirkung deren Anwesenheit auf die Wahrscheinlichkeit umfassen, daß im Subjekt eine Krankheit, eine Störung oder ein abnormaler oder veränderter Zustand vorliegt (und gewöhnlich eine bestimmte Krankheit, eine Störung oder etwas anderes).

Bedenkt man den Affinitätswettbewerb zwischen dem Träger und der Gewebeprobe um die Antikörper führt dies zu einer weiteren Eigenschaft der Erfindung, der Verbesserung des Kontrastes zwischen dem spezifischen Signal, nachdem zum Nachweis der Substanz gesucht wird, und dem Hintergrundsignal.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für einen diagnostischen Test zur Verbesserung des Kontrastes zwischen einem Signal, das die An- oder Abwesenheit einer interessierenden Substanz anzeigt, und dem Hintergrundsignal, das nicht die An- oder Abwesenheit einer interessierenden Substanz anzeigt, wobei das Verfahren umfaßt Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe, welche die Substanz und andere Substanzen aufweist; Bereitstellen eines Reagenz, das spezifisch mit der Substanz reagiert oder an diese bindet, das jedoch auch zu einem geringeren Grad mit der anderen Substanz reagiert oder an diese bindet; Bereitstellen eines Wettbewerbsmittels, das zu einem geringeren Grad als die Substanz mit dem Reagenz reagiert oder an dieses bindet, jedoch zu einem höheren Grad als zumindest ein deutlicher Anteil der anderen Substanzen; wobei die Anordnung so gewählt wird, daß das Wettbewerbsmittel Reagenz, das über diejenige Menge überschießt, das mit der Substanz reagiert bzw. an diese bindet aufnimmt, so daß der Kontrast zwischen dem Ergebnis der Anwendung des Reagenz auf die Substanz und auf die anderen Substanzen deutlich größer ist, als wenn keine Wettbewerbsmittel zur Verfügung stehen.

Vorzugsweise wird das Wettbewerbsmittel entfernt und die Probe gewaschen, ehe in einem weiteren Schritt ein nachweisbares Signal des Produktes aus Substanz und Reagenz erhalten wird. Das Wettbewerbsmittel kann das Mittel sein, mit dem das Reagenz zur Probe transportiert wird.

Es gibt eine weitere technische Wirkung, die einen anderen Weg öffnet, die Erfindung zu betrachten. Die Wirkung, daß sich wegen des Wettbewerbs zwischen der nachzuweisenden Substanz und dem Wettbewerbsmittel (z. B. dem Träger für das Reagenz) ein Gleichgewicht einstellt, bewirkt, daß die Antikörperkonzentration, die von der Probe gesehen wird, weniger schwankt, wenn sich die Konzentration des Reagenz auf dem Träger ändert, als dies bei einer entsprechenden Konzentrationsänderung einer Lösung der Fall ist, die auf die Probe pipettiert wird, wobei keine Wettbewerbsmittel vorhanden sind. Es besteht daher weniger Anlaß, sich darüber Sorgen zu machen, ob die Konzentration an angewandtem Reagenz genau richtig ist.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir ein Verfahren zur Verfügung, mit dem die Notwendigkeit einer genauen Kontrolle der Konzentration des Reagenz, das auf eine Testprobe, die in einem histologischen oder zytologischen Test angewendet wird, verringert wird, umfassend die Bereitstellung einer zu untersuchenden Probe, die eine Substanz aufweist oder aufweisen kann, die nachgewiesen werden soll; Anwenden eines Reagenz, das mit der Substanz reagiert oder an diese bindet, auf die Probe; Sicherstellen, daß ein Wettbewerbsmittel gegenwärtig ist, wobei das Wettbewerbsmittel mit der Substanz im Wettbewerb um die Reaktion bzw. die Bindung an das Reagenz im Wettbewerb steht, wobei das Wettbewerbsmittel eine Reaktionskonstante bzw. -affinität zum Reagenz aufweist, die deutlich ist, jedoch niedriger als die der Substanz.

Dies kann daher in der Wirkung als eine Art Puffersystem gesehen werden, jedoch auf einem ungewöhnlichen und neuen Feld.

Im folgenden werden unter Bezug auf eine Zeichnung bestimmte Ausführungsformen der Erfindung näher beschrieben, wobei diese die Erfindung jedoch in keiner Weise beschränken sollen. Dabei zeigt

Fig. 1 die Anwendung des Reagenz auf eine Reaktionsstelle bei

a) Anwendung nach dem Stand der Technik in flüssiger Phase und
b) Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2a-c schematisch ein Beispiel aus dem Stand der Technik, z. B. eine zweistufige Anwendung von Reagentien in flüssiger Phase in der Immunohistochemie, die allgemein als indirektes Peroxidaseverfahren bekannt ist.

Fig. 1 zeigt die Verringerung der Abfallmenge an Antikörpern, die durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Verfahren einer Anwendung in flüssiger Phase nach dem Stand der Technik erreicht wird.

In Fig. 1a ist das Reagenz, in diesem Fall eine Antikörperlösung 1, in Form eines Tropfens 3 aus einer Pipette 4 auf eine Gewebeprobe 2 gegeben worden, die auf einem Objektträger 12 befestigt ist. Die Gewebeprobe trägt Antigene 5 auf ihrer Oberfläche und es ist deutlich erkennbar, daß nur die Antikörper 1 in dem Bereich des Tropfens 3, der in Kontakt mit der Gewebeprobe 2 steht, an das Antigen 5 binden, während die verbleibenden Antikörper im Tropfen 3, die nicht abreagiert haben, weggewaschen werden.

In Fig. 1b, in der gleiche Ziffern gleiche Teile angeben, ist das Reagenz 1 durch den erfindungsgemäßen Träger (oder die Transportmittel) 6 auf die auf einem Objektträger 12 befestigte Gewebeprobe 2, die ein Antigen 5 aufweist, transportiert worden. Der Träger 6 ist ein aus einer flexiblen Membran geformter Streifen, beispielsweise aus Nitrocellulose oder Nylon, durch den, wenn er von Hand oder mit Hilfe einer Pinzette auf die Gewebeprobe 2 gelegt wird, wobei ein Tropfen Flüssigkeit dazwischen ist, die Mehrheit der Antikörper 1 in Kontakt mit dem Antigen 5 gelangen und nur sehr wenige, die nicht abreagiert haben, weggewaschen werden.

Die Verwendung des Streifens 6 beseitigt die Notwendigkeit, eine Lösung des Antikörpers auf die Probe 2 zu pipettieren. Um den Kontakt zwischen dem Streifen 6 und der Probe 2 zu verbessern, wird vor der Auflage des Streifens 6 ein Tropfen einer wäßrigen Lösung auf die Gewebeprobe 2 gegeben, es sei denn, diese ist bereits feucht (siehe Fig. 1b).

Der Streifen 6 kann einfach und schnell angewandt werden und dies kann auch von weniger trainierten Personen ausgeführt werden, da der Streifen 6 auf Vorrat hergestellt und gelagert werden kann, bis er für eine Anwendung gebraucht wird.

Die Fig. 2a-c zeigen die Technik einer Anwendung in der Immunohistochemie in flüssiger Phase nach dem bisherigen Stand der Technik. Fig. 2a zeigt den ersten Schritt der Technik, bei der der primäre Antikörper an die auf einem Objektträger 12 befestigte Gewebeprobe 2 bindet. Der primäre Antikörper 1 ist zum Antigen 5 auf der Gewebeprobe 2 spezifisch und bindet an diese. Der Antikörper 1 bindet sich jedoch auch schwach an Antigene auf der Probe (nicht gezeigt), für die er nicht spezifisch ist und verursacht somit ein gewisses Hintergrundrauschen in den Ergebnissen. Nachdem der Antikörper 1 auf die Probe 2 aufgebracht wurde, muß eine Inkubation in der Größenordnung von etwa einer Stunde bei geeigneter Temperatur erfolgen, ehe die Probe zur Entfernung von nicht abreagiertem Antikörper 1 gewaschen wird.

Der zweite Schritt dieser Technik, der in Fig. 2b gezeigt ist, besteht in der Anwendung eines sekundären Antikörpers 7, der zu einem Enzym 8, z. B. Peroxidase konjugiert ist. Diese Konjugat 10 bindet an den primären Antikörper 1 und ermöglicht so, das Targetantigen sichtbar zu machen. Der Grad, mit dem das Antigen sichtbar gemacht wird, hängt von der Menge an spezifisch gebundenem Enzym ab, die über oder unter der Menge an unspezifisch gebundenem Enzym liegt. Wiederum muß das Konjugat für ungefähr eine Stunde bei geeigneter Temperatur inkubiert werden, ehe zur Entfernung von ungebundenem Konjugat gewaschen wird.

Der letzte, in Fig. 2c gezeigte Schritt ist die Zugabe eines Peroxids, z. B. Wasserstoffperoxid, und Diaminobenzidintetrachlorid (DAB). Das Peroxid reagiert mit dem Enzym 8 des Konjugats 10 aus sekundärem Antikörper und Enzym, wodurch freie Sauerstoffradikale gebildet werden, die mit dem DAB reagieren und ein braunes Präzipitat ergeben, das mit dem Auge oder unter dem Mikroskop sichtbar wird.

Die Reagentien werden alle in flüssiger Phase zugegeben, wie dies bei Fig. 1a erläutert wurde. Der ganze Ablauf, in dem alle drei Schritte ausgeführt werden, kann mehrere Stunden umfassen, insbesondere wenn eine Titration der Antikörperlösungen erforderlich ist, um die richtigen Konzentrationen einzustellen.

Wahlweise können einige oder alle der Reagentien durch die Träger transportiert werden, wie dies in der Erfindung beschrieben wurde, vergleichbar mit dem, was in Fig. 3 gezeigt wird.

Der erfindungsgemaße Träger wird hergestellt, indem 4 cm² große Streifen aus Nitrocellulose zugeschnitten und 15 Minuten mit einer Lösung des erforderlichen Reagenz bei Raumtemperatur getränkt werden. Der Streifen kann, falls gewünscht, anschließend für einen späteren Gebrauch getrocknet werden. Beispielsweise kann der Träger mit einer Lösung eines primären Antikörpers, eines Komplexes aus sekundärem Antikörper und Enzym oder einer Lösung von Diaminobenzol getränkt werden, je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck.

Bei einer Modifikation bezugnehmend auf die Fig. 1 und 2 werden der primäre Antikörper 1 und das sekundäre Konjugat 10 unter Verwendung eines einzelnen Streifens 6 aufgebracht. Der primäre Antikörper 1 und das Konjugat 10 werden wie oben beschrieben auf einen einzelnen Streifen 6 geladen und der Streifen wird getrocknet, nachdem eine begrenzte Komplexbildung eingetreten ist. Der Streifen kann dann für längere Zeit gelagert werden, ohne daß die Reagentien weiter einen Komplex bilden, da sie auf dem Streifen immobilisiert sind.

Eine gleichzeitige Bereitstellung dieser beiden Reagentien auf demselben Streifen verringert die Anzahl der erforderlichen Inkubations- und Waschschritte.

Fig. 3 zeigt einen Kit 19, der eine Anzahl von in Foliensäcken 20 enthaltenen Streifen 18 umfaßt, wobei auf den Aufklebern 21 deren Inhalt angegeben ist. Die Streifen enthalten bei diesem Beispiel primäre Antikörper, Konjugate aus sekundärem Antikörper und Enzym, DAB oder sowohl primäre Antikörper als auch Konjugate aus sekundärem Antikörper und Enzym auf einem einzelnen Streifen. Der Kit enthält außerdem eine Ampulle 22 mit einer Lösung von 0,1%-Wasserstoffperoxid in TBS sowie eine Pipette 23. Weiter enthält der Kit eine Gebrauchsanleitung 24.

Herstellung eines Kits mit Trägern, die mit Reagentien beladen sind Beispiel 1 Herstellung eines Trägers für Antikörper (bzw. eines Transportmittels)

Ein Stück Nitrocellulose (oder Celluloseacetat, Nylon oder Vergleichbares) wird in Stücke mit einer Größe von 4 cm² geschnitten (die Größe kann mit der Anwendung variieren und kann beispielsweise im Bereich von 1 bis 8 cm² liegen) was das Transportmittel oder den Träger ergibt.

Die Stücke aus Nitrocellulose werden in einer Lösung des Antikörpers, die mit 1-5% BSA verdünnt wurde, gewaschen. Der Grad der Verdünnung des Antikörpers kann mit der Anwendung variieren. Die Nitrocellulosestücke werden für 15 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Lösung des Antikörpers getränkt.

Die imprägnierten bzw. getränkten Stücke aus Nitrocellulose werden für 15 Minuten mit einem Lüfter in einem Inkubator bei 45°C getrocknet. Die getrocknete Antikörper enthaltenden Träger werden zur Lagerung bis zur Anwendung in Folie versiegelt.

Beispiel 2 Herstellung eines Trägers für Diaminobenzol (DAB)

Ein Stück Nitrocellulose wird auf eine Größe von 4 cm² zugeschnitten (die Größe kann mit der Anwendung variieren und kann beispielsweise im Bereich von 1 bis 8 cm² liegen) was den Träger ergibt.

Die Stücke aus Nitrocellulose werden bei Raumtemperatur für 15 Minuten mit einer Lösung von DAB getränkt.

Die getränkten Nitrocellulosestücke werden anschließend getrocknet.

Die die DAB-Lösung in vorgetrockneter Form enthaltenden Träger werden zur Lagerung bis zum Gebrauch in Folie versiegelt.

Beispiel 3 Allgemeines Verfahren für die Immunohistochemie unter Verwendung der Träger aus den Beispielen 1 und 2 zum Transport der Reagentien zur Reaktionsstelle

Schnitte einer zu untersuchenden Gewebeprobe werden auf einem Objektträger aus Glas befestigt und über Nacht bei 60°C in einem Inkubator gehalten.

Die Schnitte werden dann entfettet und erneut befeuchtet.

Es kann ein Citratpuffer mit pH 6 (oder ein ähnlicher Puffer) zur Probe gegeben und für mehrere Minuten (z. B. in einem Autoklaven) erhitzt werden, um die Antigene aus der Probe zu holen.

Die Probe wird für 10 Minuten in einer Lösung von 1% Wasserstoffperoxid in Methanol gewaschen, um die endogene Peroxidaseaktivität zu zerstören. Die Probe wird dann mit einer gepufferten wäßrigen Lösung gewaschen.

Ein Träger (oder ein Transportmittel) der einen primären Antikörper enthält, der spezifisch für ein Antigen ist, dessen Anwesenheit bestimmt werden soll, wird für eine Stunde auf eine Probe angewandt. Nach der Entfernung des Trägers wird die Probe mit einer gepufferten wäßrigen Lösung gewaschen, um alle Antikörper, die nicht abreagiert haben, zu entfernen.

Auf die Probe wird für eine Stunde ein Träger angewendet, der ein Konjugat aus sekundärem Antikörper und Enzym enthält, während der sekundäre Antikörper an den primären Antikörper binden kann. Nach der Entfernung des Trägers wird die Probe mit einer gepufferten wäßrigen Lösung gewaschen, um jegliches Konjugat, das nicht abreagiert hat, zu entfernen.

Es wird eine Lösung von 0,1% Wasserstoffperoxid in einer gepufferten waßrigen Lösung zur Probe gegeben und anschließend für 10 Minuten ein Träger, der DAB enthält angewandt. Wahlweise kann das Wasserstoffperoxid und das DAB auch auf einem Träger kombiniert werden.

Der Träger wird entfernt und die Probe gegengefärbt, dehydratisiert und ein Deckglas aufgebracht, ehe das Ergebnis analysiert wird.

Die oben beschriebenen spezifischen Beispiele betreffen alle die Immunohistochemie, es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Vorteile der Erfindung nicht auf das oben genannte Gebiet beschränkt sind.

Wie Eingangs erläutert, kann das auf dem Träger bzw. Streifen zur Verfügung stehende Reagenz eine Nukleinsäuresonde sein (z. B. können imprägnierte Träger bzw. Streifen zum Nachweis viraler DNA in menschlichem Gewebe verwendet werden, wobei die Streifen spezifisch entworfene Nukleinsäuresonden für die in-situ Hybridisierung enthalten). Die Nukleinsäuresonden sind gewöhnlich mit einem System zum Nachweis bzw. zum Sichtbarmachen verbunden, wie einem radioaktiv markierten Abschnitt (der dazu verwendet werden kann, Material zu präzipitieren).

Ein Beispiel aus einem anderen Gebiet ist die Enzymhistochemie, bei der ein interessierendes Enzym bereits in einer Gewebeprobe vorliegt und zum Nachweis ihrer Anwesenheit und ihrer Verteilung bzw. Lokalisation ein geeignetes Enzymsubstrat mit Hilfe eines Trägers angewendet werden kann.

Das auf dem Träger zur Verfügung gestellte Reagenz kann ein vorgefertigter Komplex sein. Wird das Reagenz getrocknet, wird der Komplex eingefroren und komplexiert nicht weiter. Es ist daher möglich, Träger mit vorgefertigten Komplexen zu lagern. Es ist nicht einfach, Komplexe in flüssiger Form zu lagern, da sie weiter Komplexe ausbilden und präzipitieren.

Obwohl die Existenz vorgetrockneter Träger nicht essentiell für die Erfindung in ihrem weitesten Umfang ist, stellt dies doch einen erheblichen Vorteil dar: Antikörper oder andere Reagentien können in getrockneter Form trocken in fester Form gelagert werden, und eine Lagerung bei der korrekten Temperatur ist nicht so wesentlich; eine Packung trockener Streifen wiegt wegen der Flüssigkeit wesentlich weniger als eine Packung feuchter Streifen (dies ist wesentlich beim weltweiten Versand der Kits); schließlich ist die Haltbarkeit der Streifen länger, wenn sie trocken sind.

Das erfindungsgemäße Transportsystem weist die folgenden Vorteile auf:
erhöhte Stabilität
reduzierte Hintergrundfärbung
gesteigerte Reproduzierbarkeit
sicherer Gebrauch auch durch weniger qualifizierte Kräfte
einfache Anwendung
Komplexbildner können zur Lagerung stabilisiert werden.

Typische Materialien, die auf Streifen zur Verfügung stehen können (wobei dies keine erschöpfende Aufzählung darstellt) sind: Antikörper, konjugierte Antikörper (z. B. konjugiert mit Biotin, Avidin, Enzymen, FITC, Gold, radioaktiv markierte Verbindungen), Lectine, Enzyme (zur Gewebevorbehandlung), Substrate für endogene Enzyme (Histochemie, z. B. alkalische Phosphatase beim Osteosarkom), allgemeine Farben und Färbungsmittel.

Auf einem weiteren Gebiet, bei dem vorbereitete beladene Streifen zum Einsatz gelangen können, ist bei der Bereitstellung von Substanzen, die erforderlich für die Vorbereitung von histologischen oder zytologischen Proben für weitere Schritte sind. Beispielsweise um Enzyme (z. B. Trypsin) für die enzymatische Behandlung einer Probe bereitzustellen, ehe anschließend Tests durchgeführt werden (d. h. Immunochemie).

Claims

1. Verfahren zum Transport eines Reagenz zu einer biologischen Probe, die auf die An- oder Abwesenheit einer Substanz getestet werden soll, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
Bereitstellen des Reagenz auf einem Träger;
Aufbringen des Trägers auf die Probe;
Sicherstellen, daß an der Grenzfläche zwischen Träger und Probe Flüssigkeit vorhanden ist;
wobei die Anordnung so gewählt wird, daß das Reagenz den Träger verläßt und zur Probe wandert, wo sie mit der Substanz wechselwirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reagenz auf dem Träger in getrockneter oder immobilisierter Form vorliegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Träger eine Affinität zum Reagenz aufweist, daß er transportiert.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger eine hohe Affinität zum Reagenz aufweist, das er transportiert.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Affinität des Trägers zum Reagenz geringer ist, als die des Reagenz zu seiner spezifischen Targetsubstanz, jedoch höher als die des Reagenz zu den anderen Komponenten in der Probe.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger flexibel ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger eine Membran, ein Film oder ein Streifen aus einem Material ist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, wobei der Träger eine wesentliche Dicke aufweist und ein Schwamm ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Material ein industriell hergestelltes Material ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Material Cellulose als Basis hat.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Material Nitrocellulose, Celluloseacetat oder Nylon ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger hydrophil ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagenz auf der Oberfläche des Trägers zur Verfügung gestellt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es weiter umfaßt, daß ein Reagenz verwendet wird, das an den Träger bindet und sicherstellt, daß nicht zu viele freie Bindungsstellen auf dem Träger zur Verfügung stehen, an die sich ein abdissoziiertes Reagenz binden kann (so daß ein Reagenz, das vom Träger abdissoziiert ist eher eine Bindung an die Substanz in der Probe ausbildet als sich erneut an den Träger zu binden).

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagenz als Imprägnierung des Trägers oder an diesen gebunden vorliegt.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei verschiedene Reagentien auf verschiedenen Trägern zur Verfügung gestellt werden, wobei jeder auf die interessierende Substanz angewendet wird.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei weiter mehr als ein Reagenz auf einem einzelnen Träger zur Verfügung gestellt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei vor, während oder nach der Anwendung des Trägers auf die Probe das Reagenz erneut befeuchtet wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei eine Inkubationszeit vorgesehen ist, in der der Träger für eine Zeitdauer in Kontakt mit der Probe steht, so daß das Reagenz vom Träger freigesetzt wird und auf die Probe übergeht.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahren weiter umfaßt, daß ein oder mehrere Träger mit unterschiedlichen Reagentien auf die Probe angewendet werden, um entweder das Reagenz nachzuweisen, das auf die Probe transportiert wurde oder bereits vorher in der Probe vorhandene Substrate.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei eine erste Komponente eines Nachweissystems ein Reagenz ist, das zur Identifikation eines bestimmten Moleküls oder einer bestimmen Substanz auf die Probe transportiert wurde.

22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei die erste Komponente einen Antikörper, eine Nukleinsäure, ein Enzymsubstrat oder ein Färbungsmittel umfaßt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20-22, wobei eine zweite Komponente des Transportsystems ein Mittel zum Sichtbarmachen der An- bzw. Abwesenheit des Nachweisreagenzes ist.

24. Verfahren zum Transport eines Reagenz zu einer biologischen Probe, wie sie im wesentlichen unter Bezugnahme auf die Abbildungen in der Beschreibung und in den Abbildungen beschrieben ist.

25. Verfahren zum Nachweis der An- oder Abwesenheit einer Substanz an einer Reaktionsstelle (wie einer Gewebeprobe) umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines ersten Reagenz auf einem ersten Träger;
Anwenden des ersten Trägers auf die Reaktionsstelle;
Sicherstellen, das das Reagenz an der Reaktionsstelle befeuchtet ist;
Entfernen des ersten Trägers von der Reaktionsstelle:
Bereitstellung zumindest einer Komponente eines Detektionssystems, das dafür ausgebildet ist, die An- oder Abwesenheit des ersten Reagenz nachzuweisen, auf einem zweiten Träger;
Anwenden des zweiten Trägers auf die Reaktionsstelle;
Sicherstellen, daß die Komponente des zweiten Nachweissystems vom zweiten Träger freigesetzt wird; und
Erzeugen eines nachweisbaren Signals, indem die Komponente des Nachweissystems mit der Substanz abreagieren kann bzw. nicht abreagiert.

26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei das erste Reagenz und/oder die Komponenten des Nachweissystems in trockener Form zur Verfügung gestellt werden.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei die nachzuweisende Substanz ein Antigen ist.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das erste Reagenz ein primärer Antikörper ist, der spezifisch für das Antigen ist, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der primäre Antikörper aus einer Bibliothek von Antikörpern ausgewählt wird, die für verschiedene Antigene spezifisch sind, jedoch auf eine gemeinsame Quelle zurückgehen und damit einen gemeinsamen Strukturabschnitt aufweisen.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Quelle ein Säugetier ist.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 30, wobei das Nachweissystem eine Kombination von zwei Komponenten auf getrennten Transportmitteln umfaßt.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die erste Komponente des Nachweissystems ein Komplex aus einem sekundären Antikörper und einem Enzym ist.

33. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die erste Komponente des Nachweissystems auf demselben Träger zur Verfügung gestellt wird, wie das erste Reagenz.

34. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Komplex aus zweitem Antikörper und Enzym spezifisch für den gemeinsamen Abschnitt der Bibliothek primärer Antikörper ist.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei die zweite Komponente des Nachweissystems ein Substrat ist, das zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals mit dem Enzym reagiert.

36. Verfahren zum Nachweis der An- oder Abwesenheit einer Substanz in einer Probe, wie sie hier im wesentlichen beschrieben ist.

37. Transportmittel zum Transport eines Reagenz an eine Reaktionsstelle, umfassend einen Träger, der ein Reagenz trägt, das bei der Anwendung freigesetzt wird, wenn der Träger mit einer Reaktionsstelle verbunden wird.

38. Mittel nach Anspruch 37, wobei der Träger eine hydrophile Membran ist.

39. Mittel nach Anspruch 38, wobei die Membran aus Nitrocellulose, Celluloseacetat, Nylon, oder vergleichbarem ist.

40. Mittel nach Anspruch 37, wobei der Träger Stoffe Papier oder ein Schwamm ist.

41. Mittel nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei der Träger flexibel ist.

42. Mittel nach einem der Ansprüche 37 bis 41, wobei die Reaktionsstelle ein histologisches oder zytologisches Präparat ist.

43. Mittel nach einem der Ansprüche 37 bis 42, wobei die Reagentien Antikörper, Antikörperkomplexe, Nukleinsäuren, Enzymsubstrate, Färbemittel, oder andere Reagentien sind, die zur Reaktionsstelle transportiert werden sollen.

44. Mittel zum Transport eines Reagenz auf eine Probe, wie es hier im wesentlichen beschrieben ist.

45. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zum Transport eines Reagenz zu einer Reaktionsstelle, umfassend die Schritte:
Bereitstellen eines körperlichen Trägers, und
Anwenden einer Lösung des Reagenz auf den Träger.

46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei es ein völliges oder teilweises Trocknen des Trägers umfaßt.

47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, wobei der Träger mit Reagenz getränkt wird.

48. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, wobei weiter mehr als ein Reagenz auf dem Träger aufgebracht wird.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, wobei weiter eine Blockersubstanz auf dem Träger aufgebracht wird, so das es für das Reagenz schwierig ist, sich wieder an den Träger zu binden, nachdem es bei der Anwendung abdissoziiert ist.

50. Verfahren zur Herstellung eines Mittels zum Transport von Reagentien auf eine Probe, wie sie hier im wesentlichen beschrieben ist.

51. Kit, umfassend zumindest einen Träger nach Anspruch 37, welcher ein Reagenz enthält, das in vorgetrockneter Form oder nicht in vorgetrockneter Form vorliegen kann.

52. Kit nach Anspruch 51, umfassend zumindest einen Träger, der ein Reagenz in vorgetrockneter Form enthält.

53. Kit nach Anspruch 51 oder Anspruch 52, umfassend mehrere Träger, die jeweils verschiedene Reagentien enthalten.

54. Kit nach einem der Ansprüche 51 bis 53, wobei die Reagentien aus einer Bibliothek von Reagentien ausgewählt werden, die eine gemeinsame Quelle und Basissequenz aufweisen.

55. Kit nach einem der Ansprüche 51 bis 54, wobei dieser weiter ein oder mehrere Träger umfaßt, die Komponenten eines Nachweissystems enthalten.

56. Kit nach Anspruch 55, wobei das Nachweissystem ein sekundäres Reagenz aufweist.

57. Kit nach Anspruch 56, wobei das sekundäre Reagenz an die gemeinsame Basensequenz der Reagentienbibliothek bindet.

58. Kit nach einem der Ansprüche 56 oder 57, wobei dieser ein oder mehrere Träger umfaßt, die die sowohl das primäre als auch das sekundäre Reagenz enthalten.

59. Kit nach einem der Ansprüche 56 bis 58, wobei dieser ein Substrat umfaßt, das für eine enzymatische Reaktion benötigt wird.

60. Kit nach einem der Ansprüche 51 bis 59, wobei dieser einen Träger umfaßt, der mehr als ein Reagenz enthält.

61. Kit nach einem der Ansprüche 51 bis 60, wobei dieser weiter einen Träger umfaßt, der eine Vielzahl von Nachweissystemen trägt, die komplementär zu und spezifisch für ein bestimmtes Reagenz sind.

62. Kit, wie er hier unter Bezug auf die Abbildungen sowie in diesen im wesentlichen beschrieben ist.

63. Diagnostischer in vitro Test, umfassend:
Entnahme einer biologischen Probe aus einem Subjekt;
Bereitstellen eines Trägers, der ein Reagenz trägt, das spezifisch für eine Substanz ist, nach der mit dem Test gesucht wird;
Zusammenführen von Träger und Probe in eine enge Nachbarschaft, wobei sichergestellt ist, daß sich eine flüssige Phase zwischen diesen befindet, die eine Wanderung des Reagenz vom Träger auf die Probe ermöglicht;
Prüfen der Probe, um die Anwesenheit der Substanz festzustellen.

64. Test nach Anspruch 63, wobei das Subjekt ein Mensch, eine Pflanze, ein Tier oder ein Mikroorganismus ist.

65. Test nach Anspruch 63 oder 64, wobei dieser einen Schritt einschließt, in dem die Einstellung eines Gleichgewichts eines Affinitätswettbewerbs oder einer Reaktionskinetik zwischen Träger und Substanz, nach der mit dem Test gesucht wird, abgewartet wird.

66. Test nach einem der Ansprüche 63 bis 65, wobei aus den Ergebnissen der Untersuchung der Probe auf die Anwesenheit, oder die Auswirkung der Anwesenheit einer Substanz auf die Wahrscheinlichkeit geschlossen wird, daß eine Krankheit, eine Störung oder ein anormaler oder veränderter Zustand im Subjekt vorliegt.

67. Diagnostischer in vitro Test, wie er hier im wesentlichen beschrieben ist.

68. Verfahren zur Verstärkung des Kontrastes bei einem diagnostischen Test zwischen einem Signal, das die An- oder Abwesenheit einer interessierenden Substanz anzeigt und dem Hintergrundsignal, das nicht die An- oder Abwesenheit einer interessierenden Substanz anzeigt, wobei das Verfahren umfaßt:
Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe, die die Substanz und andere Substanzen enthält;
Bereitstellen eines Reagenz, das mit der Substanz spezifisch reagiert oder an diese spezifisch bindet, jedoch auch in einem geringeren Ausmaß mit den anderen Substanzen reagiert oder an diese bindet;
Bereitstellen eines Wettbewerbsmittels, das in geringerem Maß als die Substanz mit dem Reagenz reagiert oder an diese bindet, jedoch in einem größeren Maß als zumindest ein wesentlicher Anteil der anderen Substanzen;
wobei die Anordnung so gewählt ist, das das Wettbewerbsmittel Reagenz, das über die Menge, die mit der Substanz reagiert bzw. an diese bindet, überschießt bindet, so daß der Kontrast zwischen dem Ergebnis, das bei der Anwendung des Reagenz auf die Substanz und die weiteren Substanzen erhalten wird, deutlich größer ist als er wäre, wenn kein Wettbewerbsmittel bereitgestellt ist.

69. Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Wettbewerbsmittel entfernt wird und die Probe gewaschen wird, bevor in einem weiteren Schritt das nachweisbare Signal des Produkts aus Substanz und Reagenz ausgelesen wird.

70. Verfahren nach Anspruch 68 oder Anspruch 69, wobei das Wettbewerbsmittel der Träger zum Transport des Reagenz zur Probe ist.

71. Verfahren zur Steigerung des Kontrastes bei einem diagnostischen Test zwischen dem Signal, das für die An- oder Abwesenheit einer interessierenden Substanz kennzeichnend ist, und dem Hintergrundsignal, wie es hier im wesentlichen beschrieben ist.

72. Verfahren zur Verringerung der Notwendigkeit einer genauen Kontrolle der Konzentration eines Reagenz, das auf eine Probe angewendet wird, die in einem histologischen oder zytologischen Test getestet wird, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:
Bereitstellen einer zu testenden Probe, die eine Substanz enthalten kann, deren Anwesenheit mit dem Test überprüft werden soll;
Anwenden eines Reagenz auf die probe, wobei das Reagenz mit der Probe reagieren oder an diese binden kann; und
Sicherstellen, daß ein Wettbewerbsmittel vorhanden ist, wobei das Wettbewerbsmittel mit der Substanz um die Reaktion mit bzw. die Bindung an das Reagenz konkurriert und das Wettbewerbsmittel eine Reaktionskonstante bzw. Affinität zu dem Reagenz aufweist, die deutlich ist, jedoch geringer als die der Substanz.

73. Verfahren zur Verringerung der Notwendigkeit, die Konzentration des Reagenz, das auf eine zu testende Probe angewandt wird, anfänglich zu überprüfen, wie sie hier im wesentlichen beschrieben ist.