DE19860549A1 - Scanning-mikroskopisches Verfahren mit hoher axialer Auflösung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Erfassung mindestens einer Entität auf und/oder in einem, bevorzugt auf einem Träger befindlichen, Substrat, wobei mittels einer konfokalen Mikroskopoptik oder einer für die Mehrphotonenanregung ausgelegten Optik, die mindestens eine Strahlungsquelle aufweist, mindestens ein repräsentativer Bereich des Substrates mit einem Meßvolumen gescannt wird unter Erhalt von Meßwerten zur Bestimmung optischer Parameter, wobei die Meßwerte zur Charakterisierung der mindestens einen Entität mittels Signalverarbeitung bearbeitet werden, und wobei die mindestens eine Entität für die Dauer der Aufnahme der Meßwerte ihre Position hinsichtlich des Substrates und/oder des Trägers beibehält. Des weiteren werden Verwendungsmöglichkeiten des Verfahrens sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Erfassung mindestens einer Entität auf einem, bevorzugt auf einem Träger befindli­ chen, Substrat. Ferner werden Anwendungsfelder des erfindungsgemä­ ßen Verfahrens sowie eine Vorrichtung zur Durchführung desselben be­ schrieben.

Es ist bekannt, daß konfokale oder für Mehrphotonenanregung ausge­ legte Anordnungen wegen ihrer hohen axialen Ortsauflösung geeignet sind, um Hintergrundsignale zu reduzieren, welche außerhalb der Foka­ lebene entstehen. Bei der Erfassung insbesondere großflächiger Struktu­ ren ergibt sich somit das Problem, daß im Rahmen des Scanvorgangs darauf geachtet werden muß, daß die Fokalebene sich zu jeder Zeit an einer gewünschten Position innerhalb des zu untersuchenden Objektes befindet. So kann es vorkommen, daß z. B. Unebenheiten eines Proben­ trägers, auf dem das zu untersuchende Objekt angeordnet ist, dazu füh­ ren, daß sich das konfokale Meßvolumen nicht in der gewünschten Ebene im Objekt befindet, sondern womöglich an das Objekt angrenzende Strukturen, wie z. B. Teile des Probenträgers, erfaßt. Dies wirkt sich nachteilig auf die durchzuführende Objekterfassung und -charakterisierung aus.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzu­ stellen, welches eine zuverlässige Erfassung flächiger Strukturen oder dreidimensionaler Strukturen, welche auf einem flächigen Träger ange­ ordnet sind, in einem Mikroskop mit hoher axialer Auflösung, insbesonde­ re einem konfokalen Mikroskop, erlaubt. Ferner soll eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens bereitgestellt werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des An­ spruchs 1 sowie eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 18.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur optischen Erfassung mindestens einer Entität auf und/oder in einem, bevorzugt auf einem Träger befindli­ chen, Substrat bereit, wobei mittels einer konfokalen Mikroskopoptik oder einer für die Mehrphotonenanregung ausgelegten Optik, die mindestens eine Strahlungsquelle aufweist, mindestens ein repräsentativer Bereich des Substrates mit einem Meßvolumen gescannt wird unter Erhalt von Meßwerten zur Bestimmung optischer Parameter, wobei die Meßwerte zur Charakterisierung der mindestens einen Entität mittels Signalverarbeitung bearbeitet werden. Hierbei behält die mindestens eine Entität für die Dau­ er der Aufnahme der Meßwerte ihre Position hinsichtlich des Substrates und/oder des Trägers im wesentlichen bei.

Es ist bevorzugt, daß das Substrat einen Brechungsindex aufweist, der verschieden ist von mindestens einer an das Substrat angrenzenden Komponente. Bei der angrenzenden Komponente kann es sich bei­ spielsweise um einen Träger handeln, auf dem das Substrat angeordnet ist. Das Substrat kann jedoch auch unmittelbar an eine Immersionsflüs­ sigkeit, Luft oder eine das Substrat abdeckende Komponente, wie z. B. ein Deckglas, angrenzen.

Erfindungsgemäß wird nunmehr während des Scanvorganges ein Hilfsfo­ kus erzeugt wird, der zumindest teilweise auf der Grenzfläche zwischen Substrat und angrenzender Komponente oder einer anderen geeigneten Grenzfläche liegt. Die Funktion des Hilfsfokus besteht darin, eine Ab­ standsermittlung zwischen der Grenzfläche und der den Hilfsfokus erzeu­ genden Optik zu ermöglichen. Mittels mindestens eines Detektors, der bevorzugt konfokal angeordnet ist, wird die Intensität des von der Grenz­ fläche rückreflektierten Lichtes erfaßt. Diese weist einen Maximalwert auf, sofern der Hilfsfokus in Richtung der optischen Achse auf der Grenzfläche positioniert ist. Die Intensität des Rückreflexes fällt ab, wenn der Hilfsfokus auf der optischen Achse in Richtung des Substrates bzw. der an das Sub­ strat angrenzenden Komponente bewegt wird.

Um die gewünschte Positionierung des Hilfsfokus, und somit mittelbar auch des Meßvolumens, während des Scanvorganges zu ermöglichen, ist es wünschenswert, festzustellen, ob eine abweichende Positionierung des Hilfsfokus von der Grenzfläche in Richtung des Substrates oder aber in Richtung der an das Substrat angrenzenden Komponente stattgefunden hat. Erfindungsgemäß werden zwei Lösungen vorgeschlagen.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform wird die Position des Hilfsfokus relativ zur Grenzfläche im wesentlichen entlang der optischen Achse variiert und die Intensität des Rückreflexes in Abhängigkeit von der Bewegung registriert (siehe Fig. 1, 2, 3 und 6). Hierbei kann bei­ spielsweise die fokussierende Optik entlang der optischen Achse auf und abbewegt werden. Es ist jedoch auch möglich, das Substrat, welches sich beispielsweise auf einem in z-Richtung unmittelbar oder mittelbar positio­ nierbaren Träger befindet, entsprechend zu bewegen. Es ist ferner mög­ lich, die Divergenz des Strahlenbündels zu variieren, das zur Erzeugung des Hilfsfokus dient. Die Bewegung kann bevorzugt periodisch durchge­ führt werden. Die Amplitude der Bewegung ist bevorzugt so zu wählen, daß eine gleichzeitige Aufnahme von Meßwerten aus dem Meßvolumen nicht gestört wird. In der Regel wird daher die Amplitude der Bewegung der Größenordnung der axialen Ausdehnung des Meßvolumens entspre­ chen.

Die vom Detektor erfaßte Intensität wird sich jeweils dann erhöhen, wenn der Abstand zwischen reflektierender Grenzfläche und Hilfsfokus sich ver­ ringert. Umgekehrt wird sich die Intensität erniedrigen, wenn durch die Bewegung der genannte Abstand vergrößert wird. Aus der Bewegungs­ richtung, die zu einer Erhöhung bzw. Erniedrigung der detektierten Inten­ sität führt, kann somit ermittelt werden, in welcher Richtung die Position des Hilfsfokus von der Lage der Grenzfläche abweicht.

In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird die Intensität des Rückreflexes mittels mindestens zweier entlang der optischen Achse an­ geordneter Detektoren erfaßt. Dazu wird das von der Grenzfläche reflek­ tierte Licht des Hilfsfokus beispielsweise über teildurchlässige Spiegel auf die Detektoren aufgeteilt. Die Detektoren werden bevorzugt in unter­ schiedlicher Entfernung von der fokussierenden Optik angeordnet, so daß - abhängig von der Lage des Hilfsfokus relativ zur reflektierenden Grenz­ fläche - unterschiedliche Anteile der reflektierten Intensität von den De­ tektoren erfaßt werden. Aus der Verteilung der von den Detektoren er­ faßten Intensitäten kann somit ermittelt werden, in welcher Richtung die Position des Hilfsfokus von der Lage der Grenzfläche abweicht. Dies wird exemplarisch in Fig. 4 dargestellt.

Eine etwaig ermittelte Abweichung des Hilfsfokus von der gewünschten Position läßt sich durch eine entsprechende Nachführung, die ggf. der oben beschriebenen Bewegung überlagert wird, korrigieren. Es ist bevor­ zugt, den Hilfsfokus so nachzuführen, daß dieser sich im wesentlichen auf der Grenzfläche befindet.

Um einen möglichst geringen apparativen Aufwand zu betreiben, ist es wünschenswert, den Hilfsfokus mittels derselben konfokalen Mikroskop­ optik zu erzeugen, die auch zur Erzeugung des Meßvolumens dient. In einer derartigen Ausführung der Erfindung können beispielsweise teil­ durchlässige Spiegel eingesetzt werden, um die Strahlen, die Meßvolu­ men bzw. Hilfsfokus erzeugen, vor dem Objektiv zusammenzuführen, so­ wie die aus dem Meßvolumen bzw. Hilfsfokus detektierte Strahlung wieder zu separieren. Möchte man beispielsweise Meßvolumen und Hilfsfokus zueinander beabstandet im wesentlichen entlang der optischen Achse der konfokalen Mikroskopoptik anordnen, so ist es zweckmäßig, der konfoka­ len Mikroskopoptik auf der der Probe abgewandten Seite geeignete opti­ sche Elemente (z. B. Linsen, konvexe oder konkave Spiegel) mit dem Ziel vorzuschalten, zwei Strahlenbündel unterschiedlicher Divergenz bzw. Konvergenz zu erzeugen, die sodann von der konfokalen Mikroskopoptik zum Meßvolumen einerseits und Hilfsfokus andererseits fokussiert wer­ den. In einer weiteren Ausführungsform sind Meßvolumen und Hilfsfokus deckungsgleich, so daß auf die genannten vorgeschalteten optischen Elemente verzichtet werden kann.

Andererseits kann eine Anordnung gewählt werden, in der Meßvolumen und Hilfsfokus über separate Optiken erzeugt werden. In diesem Fall wer­ den die beiden Optiken vorteilhaft mechanisch so verbunden, daß eine Nachführung des Hilfsfokus eine entsprechende Nachführung des Meß­ volumens bewirkt. Auch in dieser Ausführung können Meßvolumen und Hilfsfokus entweder ganz oder teilweise überlappend, oder aber räumlich getrennt angeordnet sein. Die Positionierung von Hilfsfokus und Meßvo­ lumen zueinander kann in diesem Fall durch die Positionen der beiden genannten Optiken zueinander vorgegeben werden.

Es kann bevorzugt sein, den Anregungsstrahlengang sowohl für das Meßvolumen als auch für den Hilfsfokus mit ein- und derselben Strah­ lungsquelle zu erzeugen, die optional in der Lage ist, Strahlung unter­ schiedlicher Wellenlängen zu emittieren. Andererseits kann es, insbeson­ dere bei räumlicher Trennung von Meßvolumen und Hilfsfokus, bevorzugt sein, zwei getrennte Strahlungsquellen zu verwenden. Bei den Strah­ lungsquellen kann es sich beispielhaft um Laser, lichtemittierende Dioden, Glüh- oder Gasentladungslampen handeln.

In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es besonders vorteilhaft, zur Erzeugung des Meßvolumens und/oder des Hilfsfokus ein Objektiv mit einer hohen numerischen Apertur, bevorzugt größer 0.9, und/oder einem kleinen Arbeitsabstand zu wählen. Die Wahl eines geringen Arbeitsabstandes, insbesondere kleiner/gleich einem Mil­ limeter, wirkt sich besonders günstig bei Fluoreszenzmessungen im Meß­ volumen aus. Im Emissionsstrahlengang auftretende Absorption des Fluo­ reszenzlichtes verringert die Zählrate pro Molekül. Dieser Effekt geht im Gegensatz zu den Erwartungen offenbar linear bzw. stärker als linear in das Signal-Rausch-Verhältnis ein, so daß sich ein geringer Arbeitsab­ stand als vorteilhaft erweist.

Der Scanvorgang kann bevorzugt folgendermaßen ausgeführt werden. Es wird ein konfokales Mikroskop zur optischen Erfassung eines Beobach­ tungsvolumens verwendet mit einer Strahlungsquelle, bevorzugt zur Er­ zeugung von Anregungslicht, einem dichrotischen Spiegel (oder sonstigen Strahlteiler), von dem die auftreffende Strahlung der Strahlungsquelle re­ flektiert wird, einer eine mechanische Apertur aufweisenden Objektivlin­ senanordnung, die die von dem dichroitischen Spiegel reflektierte Strah­ lung empfängt und auf das Beobachtungsvolumen fokussiert, und einer Beobachtungsoptikanordnung, die von dem Beobachtungsvolumen aus­ gehende und durch den dichroitischen Spiegel hindurchtretende Strahlung empfängt. Zwischen dem dichroitischen Spiegel und der Objektivlinsen­ anordnung befindet sich eine Ablenkspiegelanordnung, die einen bevor­ zugt planen objektivseitigen Ablenkspiegel aufweist, der um eine Normal­ punktlage oszillierbar angeordnet ist. Bei Oszillation des objektivseitigen Spiegels kreuzen sich die optischen Achsen des jeweils reflektierten An­ regungslichtes in im wesentlichen einem gemeinsamen Schnittpunkt im Bereich der mechanischen Apertur der Objektivlinsenanordnung. Die Os­ zillationsachse des objektivseitigen Ablenkspiegels ist gleich der Schnittli­ nie der von dem objektivseitigen Ablenkspiegel aufgespannten Ebene mit derjenigen Ebene, die durch den gemeinsamen Schnittpunkt der opti­ schen Achsen der reflektierten Strahlung und senkrecht zur optischen Achse der reflektierten Strahlung bei in seiner Normalpunktlage befindli­ chem objektivseitigen Ablenkspiegel verläuft. Es lassen sich jedoch auch andere, dem Fachmann bekannte Verfahren zur Ablenkung des von der Strahlungsquelle erzeugten Strahles einsetzen. Wahlweise ist es auch möglich, die Position des Substrates oder der verwendeten Mikroskopop­ tik(en) mittelbar oder unmittelbar zu variieren.

Als optische Parameter können beispielsweise Streulichtintensitäten, Fluoreszenzintensitäten bei mindestens einer Wellenlänge, Fluoreszen­ zintensitäten in Abhängigkeit von der Polarisation, Fluoreszenzlebens­ dauern und/oder molekulare Helligkeiten bestimmt werden. Es kann hier­ bei bevorzugt sein, molekulare Helligkeiten gemäß des in der Internatio­ nalen Offenlegungsschrift WO 98/16814 beschriebenen Verfahrens zu bestimmen. Es wird dort beschrieben, daß Intensitätsfluktuationen emit­ tierter Strahlung von in einem Meßvolumen befindlichen Partikeln mittels eines Detektors beobachtet werden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: wiederholte Messung der Anzahl von Photonen pro Zeit­ intervall definierter Länge; Bestimmung einer Funktion, wie beispielsweise einer Verteilungsfunktion, der Anzahl von Photonen pro Zeitintervall; und sodann Bestimmung einer Funktion, wie auch hier beispielsweise einer Verteilungsfunktion, der spezifischen partikulären Helligkeiten auf Basis der Funktion der Anzahl der Photonen pro Zeitintervall. Es werden weiter­ hin Hinweise gegeben, wie die Funktion der Anzahl von Photonen prozes­ siert werden kann oder wie beispielsweise instrumentelle Parameter an­ gemessen berücksichtigt werden können. Physikalische Eigenschaften von Partikeln, insbesondere partikuläre Helligkeiten, können aber auch wie in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP 98/06165 dargelegt ermittelt werden. Das dort beschriebene Verfahren umfaßt die folgenden Schritte: wiederholte Messung der Dauer von Zeitabschnitten zwischen detektierten Photonen; Bestimmung einer Funktion, z. B. einer Vertei­ lungsfunktion, der Dauer der genannten Zeitabschnitte; und sodann Be­ stimmung einer Funktion spezifischer physikalischer Eigenschaften der zu untersuchenden Partikel auf Basis der genannten Funktion der Dauer von Zeitabschnitten. Es wird insbesondere ein Fittingprozeß bezüglich experi­ mentell bestimmter und theoretischer Funktion der Dauer der Zeitintervalle vorgeschlagen, wobei hinsichtlich der theoretischen Funktion Parameter einer räumlichen Helligkeitsfunktion, welche für das instrumentelle Setup charakteristisch ist, berücksichtigt werden. Es wird vorgeschlagen, bei­ spielsweise Fluoreszenzpolarisation, wellenlängenabhängige Fluoreszen­ zintensitäten, Fluoreszenzlebensdauern, Energietransfer, etc. zu untersu­ chen. In einer weiteren Ausführungsform kann es vorteilhaft sein, mehrere optische Parameter zu ermitteln, um somit eine verbesserte Charakterisie­ rung der Entität zu erzielen. Dies kann insbesondere mittels des in der Internationalen Patentanmeldung PCT/EP 98/03505 beschriebenen Ver­ fahrens erfolgen. Es wird hier folgendes Verfahren vorgeschlagen: Be­ stimmung von Intensitätsfluktuationen emittierter Strahlung von in einem Meßvolumen befindlichen Partikeln mittels mindestens eines Detektors; Bestimmung intermediärer statistischer Daten beinhaltend eine minde­ stens zweidimensionale "gemeinschaftliche" statistische Funktion auf Ba­ sis der genannten Intensitätsfluktuationen; Bestimmung von Informationen auf Basis der intermediären statischen Daten. Im letzten Schritt kann z. B. das gemeinschaftliche Auftreten von zwei Eigenschaften an einem Parti­ kel untersucht werden. Auf den Offenbarungsgehalt der genannten Pa­ tentanmeldungen, insbesondere im Hinblick auf die zu untersuchenden physikalischen Eigenschaften der zu untersuchenden Partikel sowie die Bestimmung der intermediären statistischen Daten, wird hiermit ausdrück­ lich Bezug genommen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich beispielsweise zur Bestim­ mung optischer Parameter von Entitäten wie Molekülen, Molekülkomple­ xen, Polymeren, vesikulären Strukturen, Zellen, Bakterien und Viren. Die­ se können z. B. auf mineralischen oder organischen Substraten angeord­ net sein. Hierbei kann es sich insbesondere um polymere Gele, polymere Partikel, vesikuläre Strukturen, Zellen, Bakterien und Viren handeln.

In einer weiteren Ausführungsform werden a-priori-Informationen über die Verteilung und/oder Struktur der Entitäten und/oder der Substrate in der Signalverarbeitung genutzt. So können beispielsweise als Substrat Bakte­ rien oder polymere Kugeln (sog. Beads) eingesetzt werden, auf deren Oberfläche oder in derem Inneren jeweils bevorzugt gleichartige Entitäten angeordnet sind. Um mit Methoden der Signalverarbeitung, insbesondere der Bildverarbeitung, Meßwerte als zusammengehörig erkennen zu kön­ nen, ist es oftmals hilfreich, a-priori-Informationen über die zu untersu­ chenden Substrate, wie beispielsweise deren Gestalt, räumliche Ausdeh­ nung, Anordnung etc., in der Signalverarbeitung zu berücksichtigen. So kann es ferner vorteilhaft sein, über die zu als gleichartig erkannten Enti­ täten gehörigen Meßwerte jeweils Mittelwerte zu bilden oder diese ander­ weitig statistisch auszuwerten, um die Charakterisierung der Entitäten si­ gnifikanter zu gestalten. Als Methoden der Signalverarbeitung können an sich in der Literatur bekannte Verfahren zur Objekterkennung eingesetzt werden, wie z. B. Hough-Transformation, Template Matching und korrela­ tive Verfahren. Derartige Verfahren sind in der Literatur beschrieben (sie­ he z. B. E. R. Davies, Machine Vision: Theory, Algorithms, Practicalities; Academic Press, London - San Diego, 2 nd edition, 1997).

Oftmals ist es wünschenswert, durch bestimmte optische Parameter aus­ gezeichnete Entitäten und/oder Substrate von den übrigen Entitäten und/oder Substraten zu separieren, um sie einer weiteren Analyse und/oder Bearbeitung zu unterziehen. Diese Separation kann beispiels­ weise mittels eines geeigneten Manipulators, wie z. B. einer Pipette, eines mechanischen Greifers etc. geschehen. Besonders geeignete Verfahren sind beispielhaft in der Internationalen Offenlegungsschrift WO 95/35492 beschrieben, auf deren Offenbarungsgehalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. So wird dort beispielsweise die Entnahme bzw. Separa­ tion durch elektrische Spannungs- oder Feldimpulse, durch Druckdiffe­ renzpulse oder auch durch Lichtdruckpulse beschrieben. Es kann auch ein bevorzugt piezogesteuertes Pump- bzw. Dispensiersystem verwendet werden. Im allgemeinen ist es hilfreich, während des Scanvorgangs die ermittelten Meßwerte in Abhängigkeit der Position des Meßvolumens zu erfassen, um somit den Separationsvorgang zu automatisieren.

Das Verfahren läßt sich insbesondere in der Wirkstoffsuche, kombinatori­ schen Chemie, funktionalen Genomanalyse, evolutiven Biotechnologie, Diagnostik oder Proteom-Analyse einsetzen.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden beispielsweise polymere Beadstrukturen als Substrate eingesetzt, die jeweils mit einer Vielzahl gleichartiger Entitäten besetzt sind oder die sol­ che enthalten. Diese Entitäten können beispielsweise aus einem Prozeß der kombinatorischen Chemie entstanden sein, wobei in der Regel die eigentliche Struktur der Entität nicht bekannt ist. Die Entitäten können vor­ zugsweise detektierbare Marker, wie z. B. Fluoreszenzfarbstoffe, aufwei­ sen. Diese Variante birgt den Vorteil, daß die nachfolgend zuzusetzenden Reaktionspartner nicht zwangsläufig detektierbare Marker aufweisen müssen. Die Substrate befinden sich vorzugsweise auf einem Träger, z. B. Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl von Ausnehmungen oder einer folien­ artigen Struktur. Es werden nunmehr Reaktionspartner zugesetzt, deren Wechselwirkungen mit den Entitäten untersucht werden soll. Diese Reak­ tionspartner können in einer Ausgestaltung ebenfalls detektierbare Marker aufweisen. Das Substrat wird sodann abgescannt mit beispielsweise dem Ziel, potentielle Binder der Reaktionspartner unter den Entitäten zu finden und/oder eine chemische Reaktion auszulösen. Die Bindung zwischen Reaktionspartner und Entität kann mit den oben näher beschriebenen op­ tischen Parametern charakterisiert werden. Mit gewünschten Eigenschaf­ ten ausgestattete Komplexe zwischen Reaktionspartner und Entität kön­ nen von den übrigen Entitäten bzw. Substraten separiert werden, um sie einer weiteren Analyse und/oder Behandlung zu unterziehen. Das be­ schriebene Verfahren wird vorzugsweise in der Wirkstoffsuche angewen­ det.

In einer weiteren Variante ist zwischen dem Substrat und den einen de­ tektierbaren Marker aufweisenden Entitäten eine spaltbare Linkerstruktur angeordnet. So können z. B. in einem Prozeß der chemischen Synthese auf Substraten, wie polymeren Beads, spaltbare Linkerstrukturen ange­ ordnet sein, die mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt werden, an denen sodann die zu untersuchenden Entitäten bevorzugt in einem kombinatori­ schen Verfahren synthetisiert werden. Diese Variante birgt den Vorteil, daß nach Selektion von Beads, welche mit gewünschten Eigenschaften ausgestattete Komplexe zwischen Reaktionspartner und Entität tragen, eine Abspaltung der farbstoffmarkierten Entität erfolgen kann und diese sodann in einem sogenannten löslichen Assay näher analysiert werden kann. Auch diese Variante eignet sich besonders in der Wirkstoffsuche.

In einer weiteren Ausgestaltung werden Substrate mit Entitäten bekannter Struktur verwendet, wobei alle Substrate die gleichen Entitäten aufweisen. Bevorzugt werden auch hier die Substrate auf die Ausnehmungen von Mikro- oder Nanotiterplatten verteilt. Sodann wird in jede der Ausnehmun­ gen eine Lösung von Reaktionspartnern, von denen bekannt ist, daß sie mit den Entitäten wechselwirken, zugesetzt. Zudem werden die Ausneh­ mungen mit Lösungen unterschiedlicher potentieller Wirkstoffe versetzt, um festzustellen, ob diese geeignet sind, die Wechselwirkung zwischen Entität und Reaktionspartner zu beeinflussen.

Die in den vorstehenden Absätzen näher beschriebenen Ausgestaltungen können auch mit biologischen Substraten, wie z. B. Viren, Phagen, Bakte­ rien, Pilze oder eukaryotischen Zellen, ausgeführt werden. So können z. B. natürlich vorkommende oder geklonte Entitäten bevorzugt an Oberflächen der genannten biologischen Substrate untersucht werden mit dem Vorteil, daß hier eine Kopplung zwischen dem als wünschenswert identifizierten Phänotyp mit seinem zugehörigen Genotyp vorliegt. Eine derartige Vor­ gehensweise ist unter den einschlägigen Begriffen des Phage-Displays oder zellulären Displays bekannt.

In einer weiteren Applikation kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in zellulären Reporterassays hilfreich sein. Die Genauigkeit des Scanver­ fahrens erlaubt die Beobachtung der Aufnahme und/oder intrazellulären Translokation von Substanzen mit einer überraschend hohen Ortsauflö­ sung sowie Quantifizierungsgenauigkeit.

In vorteilhafter Weise ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren auch die Untersuchung von Signaltransduktionswegen. Es zeichnet sich insbe­ sondere auch dadurch aus, daß mit Primärzellen gearbeitet werden kann und somit auf eine Überexprimierung der zu untersuchenden Entitäten, wie z. B. Rezeptoren, verzichtet werden kann.

Das Verfahren kann zudem im sog. differentiellen Display angewendet werden, in dem beispielsweise Zeilen erkrankter Personen mit denen ge­ sunder Personen verglichen werden. Weitere Vergleichsmöglichkeiten beinhalten: behandelte/unbehandelte Zellen, Wildtyp/Mutante, etc. Weitere Applikationen betreffen die Untersuchung molekularer Interaktio­ nen, wie z. B. Protein-Protein-Wechselwirkungen und Protein-Nuklein­ säure-Wechselwirkungen. Insbesondere können auch Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder Peptiden unbekannter Natur bzw. Funktion mit Liganden potentieller physiologischer Signifikanz, deren Struktur jedoch oftmals noch nicht aufgeklärt ist, untersucht werden. Hierbei wird vor­ zugsweise mindestens ein Partner mit einer partikulären Struktur che­ misch oder adsorptiv verkoppelt sein.

Es kann auch bevorzugt sein, das erfindungsgemäße Verfahren im Rah­ men der Gelelektrophorese einzusetzen. In Kombination mit einem Sepa­ rations- bzw. Isolierungsvorgang können bestimmte Entitäten auf dem als Substrat dienenden Gel direkt einer weiteren Analyse oder auch Verviel­ fältigung (PCR, etc.) zugeführt werden.

Das Verfahren kann auch eingesetzt werden, um selten vorkommende Zelltypen zu detektieren und bevorzugt zu isolieren, wie dies z. B. in der Pränataldiagnostik, in der Onkologie oder allgemein der Pathologie der Fall ist.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsge­ mäßen Verfahrens dargestellt.

Fig. 1 beschreibt schematisch eine konfokale Mikroskopanordnung mit einer Strahlungsquelle und zwei Detektoren, von denen einer Signale aus dem Hilfsfokus und der andere Signale aus dem Meßvolumen detektiert.

Fig. 2 zeigt schematisch eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung einer konfokalen Mikroskopanordnung, in der Meßvolumen und Hilfsfokus entlang der optischen Achse getrennt voneinander angeordnet sind. Die Anordnung weist eine zusätzliche Strahlungsquelle zur Erzeugung des Hilfsfokus auf.

Fig. 3 zeigt eine Variante, in der getrennte Optiken zur Erzeugung von Hilfsfokus und Meßvolumen eingesetzt werden. Es wird exemplarisch ge­ zeigt, daß Hilfsfokus und Meßvolumen sowohl in axialer wie auch lateraler Richtung getrennt voneinander angeordnet sein können.

Fig. 4 beschreibt eine weitere erfindungsgemäße Ausführung, in der Hilfsfokus und Meßvolumen wiederum durch dieselbe Optik erzeugt wer­ den. In dieser Variante werden zwei Detektoren für das aus dem Hilfsfo­ kus reflektierte Licht eingesetzt, die entlang der optischen Achse zueinan­ der versetzt sind, um die Richtung von Abweichungen der Position des Hilfsfokus zu erkennen.

Fig. 5 beschreibt eine Ausführungsform, wobei als Grenzfläche der Übergang eines Substrates zur angrenzenden Luftschicht dient.

Fig. 6 zeigt eine Ausgestaltung mit einem faseroptischen Koppler.

Fig. 7a und b zeigen das Ergebnis des in Ausführungsbeispiel 2 darge­ stellten Experimentes.

In Fig. 1 ist zunächst eine konfokale Anordnung dargestellt: Die Strah­ lung aus einer Strahlungsquelle 10 wird durch eine Optik 33 kollimiert und durch ein Objektiv 32 auf das zu untersuchende Substrat 60 fokussiert. In der beispielhaft dargestellten Anordnung liegt das Meßvolumen 70 auf der Grenzfläche 62 zwischen Substrat 60 und Träger 61. Aus dem Meßvolu­ men 70 austretende Streu- oder Fluoreszenzstrahlung wird wiederum durch das Objektiv 32 gebündelt und über den Strahlteiler 40, der z. B. als teildurchlässiger oder wellenlängenabhängiger Spiegel ausgeführt sein kann, ganz oder teilweise reflektiert. Die reflektierte Strahlung wird durch eine Optik 30 auf eine Blende 50 fokussiert, die zum Meßvolumen 70 konfokal angeordnet ist. Die durch die Blende hindurchtretende Strahlung fällt auf den Detektor 20, der zur Aufnahme des Meßsignals dient. Es kann auch auf die Blende 50 verzichtet werden, insbesondere bei Ver­ wendung der Mehrphotonenanregung.

Der Hilfsfokus 71, der zur Vermessung der Lage der Grenzfläche 62 dient, ist im dargestellten Fall identisch mit dem Meßvolumen 70. Über einen weiteren Strahlteiler 41, eine Optik 31 und eine ebenfalls konfokal ange­ ordnete Blende 51 wird ein Teil der an der Grenzfläche 62 reflektierten Strahlung auf den Detektor 21 gelenkt. Dieser Detektor dient somit zur Aufnahme der aus dem Hilfsfokus 71 reflektierten Strahlung. Es sei an­ gemerkt, daß jedoch auch auf die Blende 51 verzichtet werden kann. Es ist jedoch vorteilhaft, auch für den Strahlengang zum Detektor 21 eine konfokal angeordnete Blende vorzusehen, da diese die Empfindlichkeit der Bestimmung der Lage der Grenzfläche erhöht. In der in der vorliegen­ den Figur dargestellten Ausführungsform wird beispielsweise die fokussie­ rende Optik 32 entlang der optischen Achse auf- und abbewegt werden, um somit die aktuelle Position des Hilfsfokus 71 relativ zur Grenzfläche 62 bestimmen und ggf. nachregeln zu können.

Fig. 2 zeigt eine Variante der konfokalen Anordnung, in der Meßvolumen 70 und Hilfsfokus 71 entlang der optischen Achse getrennt voneinander angeordnet sind. Die in Fig. 1 gezeigte, konventionelle konfokale Strah­ lungs- und Detektionseinheit aus Strahlungsquelle 10, Detektor 20 und den zugehörigen optischen Elementen ist hier der Übersicht halber nicht mehr dargestellt. Zusätzlich zu den in Fig. 1 gezeigten Elementen wird hier eine separate Strahlungsquelle 11 zur Erzeugung des Hilfsfokus 71 verwendet. Durch die Optik 31 wird das vom Strahlteiler 42 reflektierte Licht dieser Strahlungsquelle im gezeigten Beispiel zu einem konvergen­ ten Strahlenbündel kollimiert, so daß der vom Objektiv 32 erzeugte Hilfsfokus 71 in einem geringeren Abstand vom Objektiv 32 liegt als das Meßvolumen 70, das durch Fokussierung eines parallelen Strahlenbün­ dels durch das Objektiv 32 entsteht. Der Hilfsfokus 71 ist wiederum auf der Grenzfläche 62 zwischen Substrat 60 und Träger 61 angeordnet; die an der Grenzfläche 62 reflektierte Strahlung wird über das Objektiv 32 und die Optik 31 auf die konfokal angeordnete Blende 51 fokussiert und vom Detektor 21 erfaßt. Durch geeignete Wahl der Kollimationsoptik 31 kann in dieser Ausführung der Hilfsfokus 71 in einer wählbaren Distanz vom Meß­ volumen 70 angeordnet werden. Es ist bevorzugt, den Hilfsfokus 71 auf der Grenzfläche 62 zu positionieren und das Meßvolumen 70 in einem gewünschten Abstand vom Hilfsfokus 71 innerhalb des Substrates 60 zu erzeugen. In einer weiteren Ausführungsform wird der Hilfsfokus 71 aus einem vor dem Objektiv 32 divergenten Strahlenbündel erzeugt, so daß der Hilfsfokus 71 in einer größeren Entfernung vom Objektiv 32 als das Meßvolumen 70 angeordnet ist. Auch hier kann wiederum auf die Blende 51 verzichtet werden. Der in Fig. 1 beschriebene Suchmechanismus kann auch hier vorteilhafterweise angewendet werden.

Fig. 3 stellt eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung dar, in der ein separates Objektiv 34 zur Erzeugung des Hilfsfokus 71 eingesetzt wird. Das Meßvolumen 70 wird wiederum über das Objektiv 32 erzeugt und abgebildet; die dem Objektiv 32 nachgeordneten Komponenten der kon­ ventionellen konfokalen Anordnung sind wiederum nicht dargestellt. Zur Erzeugung des Hilfsfokus 71 wird eine separate Strahlungsquelle 11 ver­ wendet, deren Strahlung über eine Optik 35 kollimiert und durch das Ob­ jektiv 34 auf die Grenzfläche 62 zwischen Substrat 60 und Träger 61 fo­ kussiert wird. Aus dem Hilfsfokus 71 reflektierte Strahlung wird wiederum durch das Objektiv 34 gebündelt und über den Strahlteiler 42 ganz oder teilweise reflektiert. Die reflektierte Strahlung wird durch eine Optik 31 auf eine zum Hilfsfokus 71 konfokale Blende 51 fokussiert; die durch die Blende 51 hindurchtretende Strahlung fällt auf den Detektor 21. In der beispielhaft dargestellten Anordnung sind Hilfsfokus 71 und Meßvolumen 70 sowohl in axialer wie auch lateraler Richtung getrennt voneinander an­ geordnet. Auch hier kann wiederum auf die Blende 51 verzichtet werden. Der in Fig. 1 beschriebene Suchmechanismus kann auch hier vorteil­ hafterweise angewendet werden.

Fig. 4 zeigt eine Variante der in Fig. 1 dargestellten Ausführung der Erfindung, in der zwei Detektoren 21, 22 für das aus dem Hilfsfokus 71 reflektierte Licht eingesetzt werden. Entsprechende Anordnungen von zwei oder mehr Detektoren können auch in den Ausführungen gemäß Fig. 2 oder 3 verwendet werden. Die konventionelle Anordnung zur Be­ strahlung und Beobachtung des Meßvolumens 70 ist wiederum nicht dar­ gestellt. Meßvolumen 70 und Hilfsfokus 71 sind in der beispielhaft ge­ zeigten Anordnung deckungsgleich; die das Meßvolumen 70 erzeugende Strahlungsquelle dient gleichzeitig zur Erzeugung des Hilfsfokus 71.

Der Hilfsfokus 71 liegt wiederum auf der Grenzfläche 62 zwischen Sub­ strat 60 und Träger 61. Die an der Grenzfläche 62 reflektierte Strahlung wird durch das Objektiv 32 und den Strahlteiler 41 ganz oder teilweise in Richtung der Detektoren 21, 22 gelenkt. Die Strahlung wird mittels eines weiteren Strahlteilers 43 auf die Detektoren 21, 22 aufgeteilt. Beiden De­ tektoren sind fokussierende Optiken 31, 33 sowie Blenden 51, 52 vorge­ ordnet. Die Blenden 51 und 52 sind dabei vor bzw. hinter der jeweiligen konfokalen Position angeordnet, wenn der Hilfsfokus 71 auf der Grenzflä­ che 62 liegt. Verändert sich nunmehr die relative Lage von Hilfsfokus 71 und Grenzfläche 62 zueinander, so werden die Detektoren 21, 22 eine veränderte Intensitätsverteilung des Rückreflexes erfassen. Abhängig von der Richtung der Lageänderung des Hilfsfokus 71, der in Richtung des Substrates 60 oder des Trägers 61 verschoben sein kann, wird entweder auf dem Detektor 21 oder dem Detektor 22 eine erhöhte bzw. erniedrigte Intensität der aus dem Hilfsfokus 71 stammenden Strahlung auftreffen. Dementsprechend kann auf die in den Fig. 1 bis 3 beschriebene Suchbewegung verzichtet werden.

Fig. 5 zeigt eine weitere Variante der in Fig. 1 dargestellten Ausführung der Erfindung. Die konventionelle Anordnung zur Bestrahlung und Beob­ achtung des Meßvolumens 70 ist wiederum nicht dargestellt. Meßvolumen 70 und Hilfsfokus 71 sind in der beispielhaft gezeigten Anordnung dec­ kungsgleich; die das Meßvolumen 70 erzeugende Strahlungsquelle dient gleichzeitig zur Erzeugung des Hilfsfokus 71. Als Grenzfläche 62 dient nunmehr der Übergang zwischen Substrat 60 und angrenzender Luft 63. Es wird eine winkelabhängige Reflexion, insbesondere Totalreflexion, an der Grenzfläche 62 mittels eines ortsauflösenden Detektors 21 detektiert. Abhängig von der Lage des Hilfsfokus 71 relativ zur Grenzfläche 62 än­ dert sich die räumliche Verteilung der aus dem Hilfsfokus 71 zurückge­ streuten Strahlung auf dem Detektor 21, der beispielsweise als CCD- Kamera ausgebildet sein kann.

Fig. 6 zeigt eine weitere Ausgestaltung des optischen Aufbaus zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Anlehnung an Fig. 2. Die konventionelle Anordnung zur Bestrahlung und Beobachtung des Meßvolumens 70 ist wiederum nicht dargestellt. Als Strahlungsquelle 11 zur Erzeugung des Hilfsfokus 71 wird bevorzugt ein Halbleiterlaser einge­ setzt, dessen Ausgangsstrahlung in eine optische Faser 81 eingekoppelt wird. Der faseroptische Koppler 42 entspricht dem "klassischen" Strahl­ teiler in Fig. 2. Die Strahlung aus dem Hilfsfokus 71 wird in dieser Aus­ führung in den Kern einer optischen Faser 80 eingekoppelt, der die in Fig. 2 dargestellte Lochblende 51 in ihrer Funktion ersetzt. Nach Passieren des faseroptischen Kopplers 42 wird die Strahlung mittels optischer Faser 82 auf einen Detektor 21 geleitet.

Fig. 7a zeigt Theophyllin-Beads, die mit den in Ausführungsbeispiel 2 genannten Antikörpern versetzt wurden. Die hohe Auflösung zeigt, daß die lokal erhöhte Konzentration fluoreszenter Antikörper am Bead sich deutlich vom Hintergrundsignal der in Lösung befindlichen fluoreszenten Antikörper unterscheidet. Fig. 7b zeigt die Negativkontrolle ohne Zusatz des ersten Antikörpers, so daß der zweite fluoreszenzmarkierte Antikörper sich nicht an das Bead anlagert und im Bild die charakteristische Ring­ struktur erzeugt.

Nachfolgend wird in Ausführungsbeispiel 1 eine spezifische Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie in Ausführungsbeispiel 2 eine konkrete biologische Anwendung detailliert dargestellt.

Ausführungsbeispiel 1

Das vorliegende Ausführungsbeispiel entspricht im wesentlichen dem in Fig. 6 dargestellten Aufbau. Als Strahlungsquelle zur Erzeugung des Hilfsfokus 71 wird ein Halbleiterlaser 11 mit einer Leistung von 3 mW und einer Wellenlänge von 780 nm eingesetzt. Die Ausgangsstrahlung des Lasers 11 wird über eine Monomode-Glasfaser 81 zu einem faseropti­ schen Y-Koppler 42 geführt. Eine weitere Monomode-Glasfaser 80 am Ausgang des Kopplers 42 dient sowohl zur Zuführung der Strahlung für den Hilfsfokus 71, als auch zur konfokalen Detektion des an der Grenzflä­ che 62 reflektierten Lichtes.

Zur Kollimierung der zugeführten bzw. detektierten Strahlung dient ein Achromat 31 mit einer Brennweite von 40 mm. Durch Änderung des Ab­ standes zwischen dem freien Ende der Faser 80 und dem Achromaten 31 kann die Konvergenz des zum Objektiv 32 geführten Strahlenbündels, und damit die Lage des Hilfsfokus 71 relativ zum Meßvolumen 70, variiert werden. In der hier beschriebenen Ausführung ist durch eine Verschie­ bung des Achromaten 31 über insgesamt 5 mm die Distanz zwischen Meßvolumen 70 und Hilfsfokus 71 zwischen 0 µm und 100 µm einstellbar. Das hier eingesetzte Objektiv 32 ist ein Standard-Mikroskopobjektiv mit 40-facher Vergrößerung und einer Numerischen Apertur von 1,2. Es ist auf einem piezoelektrischen Translator montiert, der eine Verschiebung des Objektivs entlang der optischen Achse über eine Strecke von 100 µm ermöglicht. Die Grenzfrequenz für diese Bewegung liegt, bedingt durch die Antriebskraft des Translators sowie die Masse des eingesetzten Ob­ jektivs, bei etwa 400 Hz.

Als Grenzfläche 62 wird in dieser beispielhaften Ausführung der Übergang von einem gläsernen Träger 61 (Brechungsindex n₁ ≈ l.52) zum Substrat 60, das in diesem Fall aus einer wäßrigen Suspension von polymeren Ku­ geln (Brechungsindex n₂ ≈ 1.33) besteht, verwendet. Die von der Grenz­ fläche 62 reflektierte Strahlung wird über das Objektiv 32 und den Achro­ maten 31 wiederum auf die Faser 80 gelenkt, deren optischer Kern die Funktion der in Fig. 1 bis 4 dargestellten Lochblende 51 übernimmt, also eine konfokale Detektion gewährleistet. Über den Koppler 42 gelangen 50% der Strahlungsleistung auf den Detektor 21, der als Silizium- Photodiode mit nachgeschaltetem Transimpedanzverstärker (Verstärkung 10⁸ V/A) ausgeführt ist.

Das Ausgangssignal des Detektors 21 wird über einen 14-Bit Analog- Digital-Wandler einem digitalen Signalprozessor (DSP) zugeführt. Dieser DSP steuert über einen 14-Bit Digital-Analog-Wandler und einen nachge­ schalteten Hochspannungsverstärker auch den piezoelektrischen Trans­ iator des Objektivs 32. Zur Steuerung der Nachführung wird das Objektiv mit einer typischen Frequenz von 200 Hz und einer Amplitude von 0,5 µm sinusförmig auf- und abbewegt. Über eine zu dieser Suchbewegung syn­ chrone Demodulation der vom Detektor 21 aufgenommenen Intensität bestimmt der DSP die Richtung einer eventuellen Abweichung zwischen der Position der Grenzfläche 62 und der (über die sinusförmige Bewegung zeitlich gemittelten) Position des Hilfsfokus 71. Eine ggf. festgestellte Ab­ weichung wird durch eine der Sinusbewegung überlagerte Nachführung des Objektivs 32 ausgeglichen.

Ausführungsbeispiel 2

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel werden als Substrat sog. Tenta- Gel^TM - Beads des Typs S PHB-Gly (RAPP Polymere) eingesetzt. Diese sind konjugiert mit Theophyllinmolekülen (Aldrich) als Entitäten. Die Bela­ dung der Beads beträgt 9%. 5 mg der Beads werden in 444 µl PBS-Pufter suspendiert. Als Probenträger werden Lab-Tek Chambered Coverglasses, #1 Borosilicat, steril, 8-weil (Nung Nalge International, Lot.Nr. 148116- 0605) verwendet. Als erster Antikörper wird ein polyklonaler Kaninchen Anti-Theopyllin-Antikörper (Europa Research, Lot.Nr. 80 17 15) verwen­ det. Als zweiter Antikörper dient ein fluoreszenzmarkierter (TRITC, Tetra­ methylrhodamin-5-(und 6)-isothiocyanat) Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (DAKO, Lot.Nr. 077(101)). Der Assaypuffer, nachfolgend TNT genannt, setzt sich wie folgt zusammen: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.01% Tween-20.

Der Assay wird wie folgt durchgeführt: 8 µl Beadsuspension werden mit 100 µl einer 1 : 2000 Verdünnung des ersten Antikörpers versetzt und für 30 min. bei Raumtemperatur geschüttelt. Es folgt ein zweimaliger Wasch­ schritt mit INT-Puffer (0.01% Tween-20). 100 µl einer Verdünnung 1 : 5000 des zweiten Antikörpers werden zugesetzt und für eine Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Sodann werden 200 µl TNT-Puffer zuge­ setzt.

Zur Erzeugung des Anregungsstrahlenganges hinsichtlich des Meßvolu­ mens 70 wird ein HeNe-Laser mit einer Emissionswellenlänge von 543 nm eingesetzt. Als für das Fluoreszenzspektrum von TRITC geeigneter Bandpaßfilter wird detektionsseitig ein Bandpaß mit einer mittleren Durchlaß-Wellenlänge von 580 nm und einer Halbwertsbreite von 30 nm eingesetzt.

Das Ergebnis des Ausführungsbeispieles 2 ist in den Fig. 7a und b dargestellt. Die aufgenommenen Meßwerte werden zunächst einem Bild­ verarbeitungsschritt unterzogen, der dazu dient, die einzelnen Beads zu identifizieren und zu lokalisieren. In der hier beschriebenen Ausführung wird hierzu die Hough-Transformation verwendet. Im Anschluß werden zu jedem identifizierten Bead diejenigen Meßwerte ermittelt, die Punkte auf der Beadoberfläche kennzeichnen. Hierzu ist es vorteilhaft, a-priori- Informationen einzusetzen, wie etwa in diesem Fall die Erwartung, daß die optischen Schnitte durch die Beadoberfläche annähernd kreisförmige Strukturen ergeben. Im vorliegenden Fall werden, jeweils entlang radial vom Zentrum der identifizierten Beads ausgehender Suchbahnen, die Meßwerte maximaler Intensität ermittelt. Alternativ können in diesem Schritt aus der Literatur bekannte Verfahren wie Kantenverstärkung und/oder Schwellwertanalyse verwendet werden.

Claims (21)

1. Verfahren zur optischen Erfassung mindestens einer Entität auf und/oder in einem, bevorzugt auf einem Träger (61) befindlichen, Substrat (60), wobei mittels einer konfokalen Mikroskopoptik oder einer für die Mehrphotonenanregung ausgefegten Optik, die mindestens eine Strah­ lungsquelle (10) aufweist, mindestens ein repräsentativer Bereich des Substrates (60) mit einem Meßvolumen (70) gescannt wird unter Erhalt von Meßwerten zur Bestimmung optischer Parameter, wobei die Meß­ werte zur Charakterisierung der mindestens einen Entität mittels Signal­ verarbeitung bearbeitet werden, und wobei die mindestens eine Entität für die Dauer der Aufnahme der Meßwerte ihre Position hinsichtlich des Sub­ strates (60) und/oder des Trägers (61) beibehält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat (60) einen Bre­ chungsindex aufweist, der verschieden ist von mindestens einer an das Substrat (60) angrenzenden Komponente, und wobei während des Scan­ vorganges ein Hilfsfokus (71) erzeugt wird, der zumindest teilweise auf der Grenzfläche (62) zwischen Substrat (60) und angrenzender Kompo­ nente oder einer sonstigen geeigneten Grenzfläche liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die angrenzende Komponente ein Träger (61), Luft (63) oder eine Immersionsflüssigkeit ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Hilfsfokus (71) mittels derselben konfokalen Mikroskopoptik erzeugt wird, die auch zur Erzeugung des Meßvolumens (70) dient.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Meßvolumen (70) und Hilfsfokus (71) im wesentlichen entlang der optischen Achse der konfokalen Mikroskopoptik angeordnet sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Meßvolumen (70) und Hilfsfokus (71) einander ganz oder teilweise überlappen.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Meßvolumen (70) und Hilfsfokus (71) von zwei unterschiedlichen Strahlungsquellen oder von einer Strahlungsquelle (11) erzeugt werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein Rückreflex aus dem Hilfsfokus (71) von mindestens einem Detektor (21) erfaßt wird und zur Messung und/oder Nachführung des Abstandes zwischen der Grenz­ fläche (62) und der den Hilfsfokus erzeugenden Optik (32) genutzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Rückreflexe aus dem Hilfsfokus (71) winkelabhängig von einem ortsauflösenden Detektor (21), insbesondere einer CCD-Kamera, erfaßt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Position des Hilfsfokus (71) relativ zur Grenzfläche (62) im wesentlichen entlang der optischen Achse bevorzugt periodisch variiert wird und die Intensität des Rückreflexes in Abhängigkeit von der Bewegung registriert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Intensität des Rückreflexes mittels mindestens zweier entlang der optischen Achse an­ geordneter Detektoren (21, 22) erfaßt wird, und der Abstand der Grenzflä­ che (62) von der den Hilfsfokus (71) erzeugenden Optik (32) aus der Verteilung der von den Detektoren (21, 22) erfaßten Intensitäten bestimmt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei als optische Pa­ rameter die Streulichtintensität und/oder die Streulichtintensität in Abhän­ gigkeit von der Polarisation und/oder die Fluoreszenzintensität bei minde­ stens einer Wellenlänge und/oder die Fluoreszenzintensität in Abhängig­ keit von der Polarisation und/oder die Fluoreszenzlebensdauer und/oder molekulare Helligkeiten und/oder Raman-Streuung und/oder Lumineszenz aufgenommen werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei a-priori- Informationen über die Verteilung und/oder Struktur der Entitäten und/oder der Substrate (60) in der Signalverarbeitung genutzt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei mineralische oder organische Substrate (60), insbesondere polymere Gele, polymere Partikel, vesikuläre Strukturen, Zellen, Bakterien und Viren eingesetzt werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei als Entitäten Moleküle, Molekülkomplexe, Polymere, polymere Partikel, vesikuläre Strukturen, Zellen, Bakterien und Viren eingesetzt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei anhand der op­ tischen Parameter ausgewählte Entitäten und/oder Substrate (60) wäh­ rend oder im Anschluß an den Scanvorgang von den übrigen Entitäten und/oder Substraten (60) getrennt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Anwendung in der Wirkstoffsuche, der funktionalen Analyse kombinatorisch-chemischer oder kombinatorisch-biologischer Syntheseprodukte, der funktionalen Geno­ manalyse, der evolutiven Biotechnologie, der Diagnostik, der Proteom- Analyse oder der Materialuntersuchung.

18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 mit

• - mindestens einer konfokalen Mikroskopoptik oder einer für die Mehr­ photonenanregung ausgelegten Optik, die mindestens eine Strah­ lungsquelle (10) sowie mindestens einen Detektor (20) zur Aufnahme von Meßwerten aus einem Meßvolumen (70) aufweist,
• - mindestens einer weiteren, bevorzugt konfokalen, Mikroskopoptik, die mindestens eine Strahlungsquelle (11) sowie mindestens einen De­ tektor (21) zur Aufnahme von Meßwerten aus einem Hilfsfokus (71) aufweist,
• - mindestens einer Einrichtung zur Positionierung von Meßvolumen (70) und Hilfsfokus (71) relativ zu einem Substrat (60).

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlungsquellen (10) und (11) identisch sind.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 und/oder 19, dadurch ge­ kennzeichnet, daß zur Erzeugung von Meßvolumen (70) und Hilfsfokus (71) dieselbe Mikroskopoptik verwendet wird.

21. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20 in der Wirkstoffsuche, der funktionalen Analyse kombinatorisch-chemischer oder kombinatorisch-biologischer Syntheseprodukte, der funktionalen Ge­ nomanalyse, der evolutiven Biotechnologie, der Diagnostik, der Proteom- Analyse oder der Materialuntersuchung.