DE19846846C2

DE19846846C2 - Nachweis und Bestimmung von Proteinen mittels leicht handhabbarer Wischtests und kolorimetrischer Analyse

Info

Publication number: DE19846846C2
Application number: DE1998146846
Authority: DE
Inventors: Kirsten Simon; Gerd Buenger
Original assignee: Genelab & Co KG GmbH; Vetlabor & Co KG GmbH
Current assignee: Genelab & Co KG GmbH; Vetlabor & Co KG GmbH
Priority date: 1998-10-12
Filing date: 1998-10-12
Publication date: 2001-04-12
Anticipated expiration: 2018-10-13
Also published as: DE19846846A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Verwendung von Pyridyl-Chinolin-Derivaten und eine Anord nung mit einem Teststreifen oder Wischstäbchen und einer Indikatorlösung zur Bestimmung von Verunreinigungen, insbesondere von Proteinen, auf Oberflächen von festen Körpern wie Gegenständen, um eine hinreichende Hygiene zu erreichen und Verschmutzungen vorzubeugen oder Infektionsquellen auf den Oberflächen von Gegenständen zu beseitigen.

Im Lebensmittelbereich werden Lebensmittel auf Gegenständen bearbeitet, wobei bei spielsweise Fleisch im Metzgereibetrieb aufgearbeitet oder die Ausgangsmaterialien zur Her stellung von Teigwaren auf den Oberflächen von Arbeitsplatten im Bäckerwesen bearbeitet werden. Es zeigt sich, daß die Gefahr von Verunreinigungen durch Proteine auf den Oberflä chen besteht, da, wenn infolge von routinehaftem Arbeiten gerade in gewerblichen Betrieben die Reinigung der Oberflächen nicht hinreichend erfolgt, Proteine auf den Arbeitsflächen von Gerätschaften verbleiben und als Ernährungsgrundlage von mitunter krankheitserregenden Mi kroorganismen dienen. Die Verunreinigungen beispielsweise mit Proteinen führen daher zu erhöhter Infektionsgefahr wegen der Ansiedlung von Mikroorganismen, so daß bei hohem Mi kroorganismenbefall die auf diesen Gerätschaften bearbeiteten Lebensmittel mit denselben kontaminiert und deren Verzehr zumindest zu Unwohlsein, Erbrechen oder noch schwerwie genderen Erkrankungen führen kann.

Ebenso besteht diese Infektionsgefahr nicht nur in gewerblichen Betrieben sondern auch in Haushalten, da dem Benutzer in der Regel nicht das Vorhandensein von Proteinen auf Ar beitsflächen in der Küche bewußt ist, geschweige denn diese derart hinreichend beseitigt wer den, daß von diesen Arbeitsflächen keine Infektionsgefahr ausgeht, zumal häufig der Benutzer in Unkenntnis dieser Gefahrenquelle als Erkrankungsursache ist.

Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur quantitativen Proteinbestimmung bekannt. Es wurden eine Reihe verschiedener Techniken entwickelt, die sich jeweils in ihrer Nachweisempfindlichkeit und Störempfindlichkeit unterscheiden. Neben der direkten Absorp tionsmessung von Proteinlösungen wurden meist auch kolorimetrische Tests durchgeführt. Hierbei wird die Verfärbung der zu untersuchenden Proteinlösung nach Zugabe von bestimm ten Farbstoffen mit der Verfärbung von Eichlösungen bekannter Proteinkonzentration vergli chen, wobei meist die genaue Messung der optischen Dichte der Lösungen zugrunde liegt. Bekannte kolorimetrische Methoden sind die nach Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193, 265-275), nach Bradford (Anal. Biochem. 72, 248-254) und nach Smith et al. (Anal. Biochem. 150, 76-85).

Die Proteinbestimmung nach Lowry et al. beruht auf der quantitativen Bestimmung von Kupfer-Proteinkomplexen, die im Verlauf der Biuret-Reaktion entstehen, die mit Hilfe des Fo lin-Ciocalteau-Reagenzes (Phosphomolybdän-Wolframsäure) durchgeführt wird. Die Phos phomolybdän-Wolframsäure ist in dem für die Biuret-Reaktion benötigten alkalischen Medium aber instabil. Daher ist eine genaue zeitliche Einhaltung der Arbeitsschritte für das Zusammen geben von Reagenz und Probe sowie das Durchmischen beider Komponenten für die exakte Testdurchführung unerläßlich. Die Instabilität der Reagenzien schränkt aber den Meßbereich ein und erfordert in vielen Fällen ein Verdünnen und ein erneutes Messen der verdünnten Pro be. Ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, daß zusätzlich zu der durch Biuret bedingten Färbung die Farbentwicklung ebenfalls durch die Reaktion der im Protein vorhandenen Tyrosin- und Tryptophan-Reste mit dem Folin-Ciocalteau-Reagenz verursacht wird, so daß Proteine ohne Tyrosin- oder Tryptophan-Reste bzw. mit vielen Tyrosin- oder Tryptophan- Resten mittels dieser herkömmlichen Methode große Meßungenauigkeiten verursachen. Hier durch zeigen quantitative Meßbestimmungen der Proteine ohne oder mit wenigen Tyrosin- und/oder Tryptophan-Resten einen vermeintlich geringen Proteingehalt, obgleich ein hoher Gehalt vorliegt. Weiterhin ist das Folin-Ciocalteau-Reagenz äußerst giftig und somit für den ungeübten Benutzer in einem z. B. leicht handhabbaren Wischtest nicht verwendbar.

Darüber hinaus erweist sich die Proteinbestimmung nach Lowry et al. für den täglichen routinehaften Bedarf wegen der hohen Giftigkeit als nicht handhabbar, um den in gewerblichen Betrieben, aber auch den in den Haushalten bestehenden Erfordernissen wie Einfachheit und Schnelligkeit Genüge zu tun. Hinzukommend eignet sich die Proteinbestimmung nach Lowry et al. auch nicht in Lebensmittelbetrieben, um Kontakte der zu bearbeitenden Lebensmittel mit der Folin-Ciolteau-Reagenz zu vermeiden. Ebenso ist die Proteinbestimmung nach Lowry et al. lediglich in einem geringen Linearitätsbereich ohne Verlust der Empfindlichkeit für die Protein bestimmung durchführbar. Ebenso können Proteine, welche keine oder wenige Tyrosin- und/oder Tryptophan-Reste aufweisen, nur in unzureichender Weise nachgewiesen werden, die aber gleichfalls eine Gefahrenquelle für die Infektion bilden, weil sie von Mikroorganismen verstoffwechselt werden.

Die Proteinbestimmung nach Bradford beruht auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Blue an Proteine, wobei dieser Farbstoff aber gegenüber verschiedenen Proteinen eine unter schiedliche Bindungsfähigkeit aufweist. Hierdurch kommt es zu großen Schwankungen bei der Meßgenauigkeit. Zusätzlich wird die Bestimmung durch das saure Reaktionsmilieu erschwert, da viele Proteine im sauren Bereich kaum oder gar nicht löslich sind und somit nicht an den Farbstoff gebunden werden können. D. h., daß die Proteinbestimmung nach Bradford nur in stark eingeschränkter Weise benutzt werden kann, um Proteine auf Oberflächen quantitativ festzustellen. Zudem ist zu beachten, daß die Proteinbestimmung nach Bradford wegen der Gefahr von Verätzungen und Gesundheitsgefährdung nicht einsetzbar ist, da das Bradford- Reagenz u. a. Phosporsäure enthält.

Der in der US-PS 550 00 61 offenbarte Abstrichtupfer umfaßt einen Wattebausch, wel cher zur Aufnahme von Substanzen geeignet ist, und einen hohlförmigen Stab, in welchem sich eine oder mehrere Testflüssigkeiten bzw. deren Vorstufen befinden. Die Testflüssigkeiten sind in aufbrechbaren Behältnissen angeordnet und eignen sich je nach Anwendung und nach Bruch bestimmter Behältnisse zur Reaktion mit den zu bestimmenden Substanzen. Als Testflüssigkei ten können solche zur Biuret-, Ninhydrin-, Lowryschen Reaktion usw. verwendet werden. Die auf dem Abstrichtupfer zu beobachtende Färbung ist aufgrund der Verwendung herkömmlicher Reaktionslösungen gegenüber den auf Arbeitsflächen zu findenden Verbindungen, wie Gluco se, oder reduzierenden Substanzen empfindlich, so dass sich der Abstrichtupfer lediglich zum qualitativen Proteinnachweis eignet.

Auch die in AN 97-021809, betreffend die JPA 902 18 09 A, offenbarte Lehre betrifft den qualitativen Proteinachweis und eignet sich nicht für einen halbquantitativen, geschweige denn quantitativen Proteinachweis, so dass die Prüfling auf Proteinkonzentration auf Arbeits flächen oder dergleichen nicht rasch und routinemäßig häufig durchgeführt werden kann.

Die in US-PS 4 839 295 offenbarte Methode ist auf das Bestimmen einer Proteinkon zentration in einer Flüssigkeit gerichtet, wobei man Cu⁺ infolge der Reaktion von Protein mit einer alkalischen wäßrigen Cu⁺⁺-Lösung herstellt und ein intensiv purpurfarbige Farbkomplex sich einstellt. Das herkömmliche Verfahren weist aber den Nachteil auf, daß die Bestimmung der Färbung der Reaktionslösung bei einem Absorptionsmaximum von 562 nm liegt, welches weit über den in den üblichen Plattenphotometern mit Filtereinsätzen eingesetzten Wellenlän gen angeordnet ist. Ein weiterer Nachteil ist die hohe Inkubationstemperatur von 60°C, die eine Behandlung des Testansatzes im Wasserbad oder im Brutschrank erforderlich macht. Der extrem empfindliche Nachweisbereich von 0,0005 bis 2,0 mg macht in vielen Fällen eine ein- bis mehrmalige Vorverdünnung der zu messenden Proben nötig. Weiterhin ist der herkömmli che Test besonders störanfällig gegenüber anderen reduzierenden Substanzen, so daß dessen Einsatz als Hygiene-Monitoring-Test wesentlich erschwert ist. Hinzukommend ist die Methode nicht zur quantitativen Proteinbestimmung im Hygienewischtest geeignet, da die in Protein- Fett-Gemischen befindlichen Proteine mittels dieser Methode nicht bestimmbar sind, so daß diese Methode in Lebensmittelbereichen, in welchen z. B. fetthaltiges Fleisch verarbeitet wird, nicht einsetzbar ist.

Aufgabe der Erfindung soll es sein, Substanzen bereitzustellen, welche zur qualitativen, halbquantitativen und quantivativen Bestimmung von Proteinen verwendbar sind. Zudem soll eine Anordnung bereitgestellt werden, welche die o. g. Nachteile zum Stand der Technik besei tigt. Darüber hinaus sollen die Anordnung und deren Verwendung leicht handhabbar sein und aufgrund des Erfordernisses weniger Verfahrensschritte eine erhebliche Zeitersparnis erbrin gen, wobei jedoch diese Anordnung auch für den Laien als täglich durchzuführender sogenann ter Handtest sicher durchführbar und in seinem Ergebnis wiederholbar ist. Zudem soll die An ordnung mit einfachen technischen Mittel herstellbar, zumindest die Fertigung derselben kos tengünstig sein. Ebenso soll es erwünscht sein, daß die Anordnung und auch die Verwendung derselben zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Proteinen qualitativ bzw. halb-quantitativ oder quantitativ weniger empfindlich gegenüber den in der Regel auch auf Arbeitsflächen zu findenden störenden Verbindungen wie Glukose oder weiteren reduzierenden Substanzen sind. Zudem soll eine Anordnung bereitgestellt werden, die weniger störanfällig gegenüber Protein- Fett-Gemischen ist, so daß auch Proteine, welche in Protein-Fett-Gemischen auf den Oberflä chen von Arbeitsgegenständen vorhanden sind, nachweisbar und bestimmbar sind.

Die Aufgabe wird gelöst durch die erfindungsgemäße Verwendung gemäß Hauptan spruch und Anordnung gemäß Nebenanspruch. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Aus gestaltungen und Weiterentwicklungen der Erfindung.

Die Erfindung betrifft eine Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen der all gemeinen Formel (I) bis (VIII)

worin R, R¹, R², R^2', R³, R⁴, R^4', R⁵, R⁶, R⁷, R^7', R⁸, R⁹, R^9', R¹⁰ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl,
für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vor zugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl,
für (C₁-C₆)-Alkoxy oder (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl,
für einen Rest der Formel -CH,
für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT,
worin T Wasserstoff Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer, oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T,
worin T die oben angegebene Bedeutung hat,
für einen Rest der Formel -CO₂-Y,
worin Y Halogen ist, oder
für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen,
zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Proteinen in wäßrigen Lösungen, bei denen Cu (II) zu Cu (I) reduziert wird.

Unter Substanz A wird auch im Sinne der Erfindung eine der o. g. Verbindungen der all gemeinen Formel (I) bis (VIII) oder ein Gemisch derselben verstanden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung mit einem Test streifen und einer Indikatorlösung zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Proteinen auf Oberflächen, welcher Teststreifen aus einem Testträger und einem auf dem einen Ende des Testträgers angeordneten saugfähigen und vorzugsweise porösen Formkörper besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Reagenzgefäß befindliche Indikatorlösung 100 Vol.-teile wäßrige Reagenzlösung mit einem mittels NaOH eingestellten pH-Wert von 12, welche 0,4 bis 2,0 Gew.-% einer Substanz A, welche mindestens einen Vertreter der die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII)

worin R, R¹, R², R^2', R³, R⁴, R^4', R⁵, R⁶, R⁷, R^7', R⁸, R⁹, R^9', R¹⁰ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl,
für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vor zugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl,
für (C₁-C₆)-Alkoxy oder (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl,
für einen Rest der Formel -CH,
für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT,
worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T,
worin T die oben angegebene Bedeutung hat,
für einen Rest der Formel -CO₂-Y,
worin Y Halogen ist, oder
für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen, umfassenden Gruppe aufweist,
0,4 bis 1,0 Gew.-% Na₂HPO₄ und
99,2 bis 97,0 Gew.-% aqua bidest enthält, und
1 bis 2 Vol.-teile 4 Gew.-% wäßrige CuSO₄ × 5H₂O-Lösung (Kupfersulfat-Lösung) aufweist, und der Formkörper eine wäßrige Ethanol-Tensid-Lösung enthält.

Als Verbindung für die Substanz A können 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-Derivate der allge meinen Formel (I) verwendet werden,

worin R und R¹ bis R⁹ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasser stoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlen stoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hy droxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Ha logen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A können auch 2-(2-Pyridyl)-5H-(1)-Pyrindin-Derivate der allgemeinen Formel (II)

verwendet werden, worin R, R¹, R², R^2', R³ bis R⁸ gleich oder verschieden und unabhän gig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Car bonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhy dryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Unter Pyrindin-Derivate z. B. der allgemeinen Formel (II) werden auch im Sinne der Er findung solche der Cyclopenta[b]pyrindin-Verbindungen verstanden.

Als Verbindung für die Substanz A können auch 2-(2-Pyridyl)-7H-(1)-Pyrindin-Derivate der allgemeinen Formel (III)

verwendet werden, worin R, R¹ bis R⁴, R^4', R⁵ bis R⁸ gleich oder verschieden und unab hängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder ver zweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulf hydryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradketti ges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A kann man auch 2-(2-5H-(1)-Pyrindinyl)-Chinolin- Derivate der allgemeinen Formel (IV) verwenden,

worin R, R¹, R², R^2', R³ bis R¹⁰ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches, vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl, Al koxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Car boxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A kann man auch 2-(2-7H-(1)-Pyrindinyl)-Chinolin- Derivate der allgemeinen Formel (V)

verwenden,
worin R, R¹ bis R⁴, R^4', R⁵ bis R¹⁰ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl, Al koxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Car boxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A können auch Bi-2-5H-(1)-Pyrindin-Derivate der all gemeinen Formel (VI)

verwendet werden, worin R, R¹, R², R^2', R³ bis R⁶, R⁷, R^7', R⁸, R⁹ gleich oder verschie den und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein ge radkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A können auch Bi-2-7H-(1)-Pyrindin-Derivate der all gemeinen Formel (VII)

verwendet werden, worin R, R¹ bis R⁴, R^4', R⁵ bis R⁹, R^9' gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff Halogen oder Hydroxyl, für geradkettiges oder ver zweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulf hydryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradketti ges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest oder Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Als Verbindung für die Substanz A können auch 2-(2-7H-(1)-Pyrindinyl)-5H-(1)- Pyrindin-Derivate der allgemeinen Formel (VIII)

verwendet werden, worin R, R¹, R², R^2', R³ bis R⁸, R⁹ und R^9' gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxy(, für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugsweise mit einer oder meh reren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl, Alkoxy mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, für einen Rest der Formel -CH, für eine Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT, worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradketti ges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist, für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T, worin T die oben angegebene Bedeutung hat, für einen Rest der Formel -CO₂-Y, worin Y Halogen ist, oder für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen.

Vorzugsweise können die oben genannten Verbindungen hydrophile Reste wie -NH₂, -OH, -COOH, -CHO, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T, -SOT, -PO₂T, -PO₃T, oder -PO₄T aufweisen, um die Löslichkeit der Verbindungen in der Reagenzlösung zu erhöhen. Unter Resten mit einen Carbonyl-Gruppe können auch solche mit Aldehyd- oder Keton-Gruppierung verstanden wer den. Unter den Resten kann man auch Gruppen oder Gruppierungen verstehen, z. B. Alkyl- Gruppen, unabhängig davon, ob diese als freies Radikal oder Ion auftreten.

So eignen sich in besonders vorteilhafter Weise die folgenden Verbindungen einzeln oder als Mischung derselben zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Proteinen in wäßrigen Lösungen und für die Verwendung als Substanz A in der Reagenzlösung der erfindungsgemä ßen Anordnung:

Die erfindungsgemäße Anordnung umfaßt einen Teststreifen, der aus einem Testträger und einem vorzugsweise auf dem einen Ende des Testträgers aufgebrachten Formkörper be steht. Der Testträger kann zylindrisch oder stäbchenförmig oder auch streifenförmig ausgebil det sein. Ebenso ist es möglich, daß der Testträger gering elastisch ist, um bei dem Bestreichen der Oberfläche des Gegenstandes oder der Gerätschaft mit dem Formkörper des Testträgers eine wesentliche mechanische Beschädigung des Formkörpers zu vermeiden. Als Testträger können auch beispielsweise quadratische oder rechteckige Plättchen verwendet werden. Eben so sind als Testträger herkömmliche Folienstreifen aus Kunststoffen, wie z. B. Polystyrol, Po lyvinylchlorid, Polyester, Polyamide oder dergleichen, auch solche aus Metallen oder Metallfo lien z. B. Aluminium oder solche aus Glas geeignet.

Der Formkörper des Schichttyps kann ein- oder mehrschichtig ausgebildet sein. Eine doppelseitige, auf den beiden gegenüberliegenden Seiten aufgebrachte Schicht ist gleichfalls möglich. Ebenso kann der Formkörper des Bauschtyps ein bauschförmiger sein, der, vorzugs weise zylindrisch ausgebildet, das eine Ende eines hier stabförmigen Testträgers aufnimmt. Auf einem Ende des Testträgers ist der Formkörper z. B. als eine Schicht angeordnet, welche saugfähig und vorzugsweise porös ist. Der Formkörper hat eine solche Saugfähigkeit aufzu weisen, daß diese die wäßrige Ethanol-Tensid-Lösung und die von den Oberflächen gelösten Verschmutzungen bzw. Proteine aufnehmen kann. Die Schicht ist derart porös, daß die zu überprüfenden Proteine nicht nur vorzugsweise adsorptiv an der Oberfläche der Schicht ge bunden, sondern auch unter Umständen in die vorzugsweise porösen oberflächlichen Bereiche des Formkörpers eindringen und zurückgehalten werden können.

Die Schicht kann beispielsweise eine solche sein, die auf das Ende des Testträgers nicht nur einseitig, wenn der Testträger streifenförmig ausgebildet ist, sondern zweiseitig aufgetra gen ist. Im Falle des Formkörpers des Bauschtyps nimmt der Formkörper - ähnlich eines Wat tebausches - das eine Ende des Testträgers, welcher in dem Fall zylindrisch, hohlzylindrisch oder stäbchenförmig ausgestaltet ist, auf.

Die Schicht kann auch schwamm- oder schaumstoffartig sein, z. B. als offenzelliger Formkörper aus saugfähigen Materialen, vorzugsweise aus offenzelligem Polyurethan-Schaum, Polyester-Schaum, Polyether-Schaum oder Polyesterverbund-Schaum. Ebenso kann die Schicht aus lockeren aus Faserfloren aufgebauten und verdichteten Fasermassen, Vlies oder Gewirke bestehen, wobei die Fasern durch ihre natürliche Haftung zusammengehalten und mit dem Ende des Testträgers gekoppelt sind. So kann der Formkörper des Bauschtyps aus Quarz- oder Mineralfasern bestehen oder aus anderen herkömmlichen Stoffen, die mit den erfindungs gemäßen Verbindungen wie z. B. 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-Derivaten nicht reagieren. Ebenso kann die Schicht als Vlies auf einer Seite des Testträgers oder an seinem einen Ende zwei- oder allseitig aufgebracht sein.

Die Schicht wird mit einer wässrigen Ethanol-Tensid-Lösung getränkt, z. B. in eine sol che eingetaucht. Sie hat üblicherweise einen solchen Aufbau, daß sie zumindest einen hinrei chenden Teil der Ethanol-Tensid-Lösung tropfenfrei enthält.

Tropfenfrei bedeutet im Sinne der Erfindung, daß bei der Entnahme des Formkörpers aus der Ethanol-Tensid-Lösung zumindest ein Teil derselben im Formkörper verbleibt, ohne daß die Ethanol-Tensid-Lösung den Formkörper unter Tropfenbildung verläßt.

In einer Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung enthält die Ethanol-Tensid- Lösung 20 bis 70 Vol.-teile EtOH, 0,2 bis 3,0 Vol.-teile Tenside des nichtionischen Typs und 27,0 bis 79,8 Vol.-teile aqua bidest. In einer besonderen Ausgestaltung enthält diese 40 bis 60 Vol.-teile EtOH, 0,8 bis 2,0 Vol.-teile Tenside und 38 bis 59,2 Vol.-teile aqua bidest. Zudem zeigt sich von besonderem Vorteil, wenn 60 Vol.-teile EtOH, 1,0 Vol.-teil Tenside und 39 Vol.-teile aqua bidest verwendet werden.

Besonders eignen sich als Tenside solche, die nichtionische sind, wie Polyoxyethylen- Derivate der Sorbitanester. Gleichfalls können verwendet werden Polyethoxysorbitanlaurat, -palmitat, -stearat, -tristearat, -oleat, -trioleat. Ebenso können solche des hydrophilen und hy drophoben Typs verwendet werden, um ein hinreichendes Ablösen der Proteine von den Ar beitsflächen der Gerätschaften zu erleichtern. Ebenso ermöglicht die Ethanol-Tensid-Lösung nicht nur das Ablösen der Proteine von den Arbeitsflächen und deren Aufnahme zumindest im oberflächlichen Bereich des Formkörpers, sondern auch deren Ausspülung aus dem Formkör per bei Eintauchen desselben in die wässrige Reagenzlösung. Besonders eignen sich die Tensi de wie Polyethoxysorbitanoleat (Tween 80) für das Lösen und das Emulgieren der Fette, so daß die Proteine aus den Protein-Fett-Gemischen, wie sie bei der Verarbeitung von fetthalti gem Fleisch aufzutreten vermögen, herausgelöst und mittels der Indikatorlösung der erfin dungsgemäßen Anordnung nachgewiesen und bestimmt werden können.

Vorzugsweise wird die Schicht mit dem Testträger auf der Oberfläche des Gegenstandes, beispielsweise eines Arbeitsbrettes, mit einer Oberfläche des stein-, metall-, glas-, kunststoff- oder holzartigen Typs bestrichen. Unter Bestreichen ist im Sinne der Erfindung auch zu verste hen, daß der Formkörper im innigen Kontakt mit der Oberfläche auf der Oberfläche bewegt wird, so daß bei Beaufschlagung des Teststreifens mit einer hinreichenden Druckkraft die Pro teine von der Oberfläche abgelöst und deren adsorptive Bindung auf und/oder in dem Form körper, unterstützt von der Ethanol-Tensid-Lösung, ermöglicht wird. Auch können Proteine in tiefere Bereiche des Formkörpers gelangen, wobei deren Ausspülung durch die Ethanol- Tensid-Lösung bei Eintauchen des Formkörpers in die Indikator-Lösung erleichtert wird.

Die Indikator-Lösung wird aus einer wäßrigen Reagenz-Lösung und einer Kupfersulfat- Lösung hergestellt. Vorzugsweise enthält die Reagenzlösung ein oder mehrere 2-(2-Pyridyl)- Chinolin-Derivate, 2-(2-Pyridyl)-5H-(1)-Pyrindin-Derivate, 2-(2-Pyridyl)-7H-(1)-Pyrindin- Derivate, 2-(2-5H-(1)-Pyrindinyl)-Chinolin-Derivate, 2-(2-7H-(1)-Pyrindinyl)-Chinolin- Derivate, Bi-2-5H-(1)-Pyrindin-Derivate, Bi-2-7H-(1)-Pyrindin-Derivate und 2-(2-7H-(1)- Pyrindinyl)-5H-(1)-Pyrindin-Derivate, welche vorzugsweise als Substituenten eine oder mehre re hydrophile Gruppen oder Reste aufweisen. Ganz vorteilhaft sind mehrere 2-(2-Pyridyl)- Chinolin-Derivate mit einer Carboxyl-Gruppe in 4-Position des Chinolinrestes.

Unter einem festen Körper wird im Sinne der Erfindung ein jeglicher Gegenstand, wie Arbeitsgerätschaft, z. B. Schneid- oder Hackbrett, oder dergleichen, welcher für die Aufarbei tung von z. B. Lebensmitteln oder von deren Ausgangsmaterialien verwendet wird, verstanden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Anordnung enthält die Rea genzlösung 0,6 Gew.-% einer oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII), 0,6 Gew.-% Na₂HPO₄ und 98,8 Gew.-% aqua bidest. Nach Mischen der Reagenzlö sung wird die Reagenz-Lösung auf einen pH-Wert von 12 mittels 1 N NaOH eingestellt. An schließend wird die Reagenz-Lösung gefiltert, vorzugsweise mittels Mikrofilter mit einer Po rengröße von 0,045 mm, um nicht gelöste Bestandteile aus der Reagenzlösung zu beseitigen. Anschließend wird eine Kupfersulfat-Lösung mit 1-2 Vol.-Teilen auf 100 Vol-Teile wässrige Reagenzlösung hinzugegeben. Die Kupfersulfat-Lösung besteht aus 4 Gew.-% wäßriger Cu SO₄ × 5H₂O-Lösung (= Kupfersulfat-Lösung).

Nach der Vermischung der wässrigen Reagenz-Lösung und der Kupfersulfat-Lösung wird ggf. die Indikator-Lösung gleichfalls gefiltert und bei Raumtemperatur gehalten. Beson ders eignen sich für die erfindungsgemäße Anordnung die 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-Derivate der allgemeinen Formel (I), welche in 4-Position einen Carboxyl-Rest haben.

Der Formkörper des Testträgers, welcher die von der Oberfläche aufgenommenen Pro teine enthält, wird in die Indikator-Lösung, welche sich vorzugsweise in einem Teströhrchen beispielsweise aus Polystyrol befindet, eingetaucht und verbleibt ca. 5 bis 40 Minuten lang z. B. bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Hierbei wird in der Regel zumindest die Fläche des Form körpers, welche in Kontakt mit der bestrichenen Oberfläche des Gegenstands war, vollständig eingetaucht und ggf. hin- und herbewegt.

Dinatriumhydrogen-Phosphat dient als Puffersubstanz. Es zeigt sich, daß bei der erfin dungsgemäßen Anordnung K-Na-Tartrat, welches Cu²⁺-Ionen komplexiert und diese Ionen in Lösung hält, in dieser Ausgestaltung nicht erforderlich ist. Vorzugsweise weisen die zu ver wendenden Ausgangsmaterialien zur Herstellung der Indikator-Lösung p. A. Qualität auf Vor zugsweise wird aqua bidest oder aqua dest eingesetzt.

Nach 15-minütigem Verbleiben des Formkörpers in der Indikator-Lösung zeigt sich kein Farbumschlag - die Indikator-Lösung bleibt grün, wenn kein Protein anwesend ist -, ein grauer Farbumschlag für wenige Proteine, ein hell brombeerfarbener Farbumschlag für mittlere Pro teinmengen oder ein dunkel brombeerfarbener Farbumschlag der Indikator-Lösung für sehr große Proteinmengen. Bei Vorhandensein von Proteinen werden Cu²⁺-Ionen durch Proteine in dem alkalischen Milieu der Indikator-Lösung zu Cu¹⁺-Ionen reduziert und bilden mit Ver bindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) einen Komplex.

Bereits durch das Auftreten der grau bzw. brombeerfarbigen Färbung der Indikator- Lösung zeigt sich in qualitativer Weise das Vorhandensein von Proteinen auf der Arbeitsfläche bzw. Oberfläche von Gerätschaften. Hierdurch wird auch bei laienhafter Benutzung der erfin dungsgemäßen Anordnung dem Benutzer die Verunreinigungen der Arbeitsfläche mit Protei nen offensichtlich und deutlich vor Augen geführt. Zudem zeichnen sich durch die einfache Handhabung der erfindungsgemäßen Anordnung als sogenannter Schnell-Wisch-Test die Hy gienischen Mängel der Arbeitsfläche deutlich ab. Ebenso erweist es sich von Vorteil, daß die erfindungsgemäße Anordnung und Verwendung gegenüber der herkömmlichen Proteinbe stimmung nach Lowry et al. eine sehr einfache Durchführung der Überprüfung der Proteinbe stimmung ermöglicht, da die Proteinbestimmung nach Lowry et al. zumindest eine zweistufige, getrennte und zeitabhängige Zuführung der Reagenzien erforderlich machen würde. Hinzutre tend zeichnet sich die erfindungsgemäße Anordnung durch unwesentliche Giftigkeit und das Fehlen von ätzenden Substanzen im Vergleich zu den Methoden nach Lowry et al. und nach Bradford aus.

Ebenso zeichnet sich der brombeerfarbene Komplex bei der Verwendung der erfindungs gemäßen Anordnung durch seine hohe Stabilität aus und hinzutretend durch seinen sehr großen Linearitätsbereich, so daß auch der Laie beispielsweise bei grauer Färbung auf eine geringe Proteinkonzentration und bei dunkel brombeerfarbener Färbung der Indikatorlösung auf einen sehr hohen Proteingehalt schließen kann. Hinzukommend ist der große Linearitätsbereich von Vorteil, welcher größer ist als der nach Lowry et al. Im Gegensatz zu der Methode von Lowry et al. werden auch Proteine unabhängig von ihrem Tyrosin- und Tryptophan-Gehalt und im Gegensatz zu der Methode nach Bradford unabhängig von proteinabhängigen Schwankungen der Farbstoffbindungsfähigkeit nachgewiesen.

Das bedeutet, daß Proteine weder zu hoch wie bei Lowry et al. noch zu hoch oder zu niedrig wie bei Bradford bestimmt werden und somit fälschlicherweise keine saubere oder zu stark mit Proteinen verschmutzte Oberfläche angezeigt wird.

Ebenso finden sich nur geringe Schwankungen der Färbung der Indikator-Lösung durch Proteine unterschiedlicher Primärstruktur wie BSA oder Ovalbumin. Ganz besonders ist der Umstand zu betonen, daß sowohl durch das basische Milieu der Indikator-Lösung als auch durch das Vorhandensein von Tensiden in der Ethanol-Tensid-Lösung eine Fällung der Protei ne bei deren Überführen aus oder von dem Formkörper in die Indikator-Lösung im wesentli chen nicht eintritt, sondern deren Löslichkeit und Gleichverteilung in der Indikator-Lösung ermöglicht wird. Ebenso erreicht man durch die erfindungsgemäße Anordnung eine im wesent lichen quantitative Überführung der Proteine von den mit dem Formkörper bestrichenen Berei chen der Oberfläche der Arbeitsflächen, so daß sich die erfindungsgemäße Anordnung nicht nur als qualitativer Nachweis, sondern auch zur halb-quantitativen oder quantitativen Bestim mung eignet.

Unter halbquantitativ wird im Sinne der Erfindung verstanden, daß bei der raschen Ana lytik eine mengenabhängige Farbreaktion, beispielsweise bei keiner, geringer, mittlerer und stärker Proteinansammlung, auf der Oberfläche der Gegenstände festgestellt werden kann.

Unter Nachweis wird im Sinne der Erfindung die qualitative Proteinfeststellung, also die Ab- oder Anwesenheit von Protein - unabhängig von dessen Konzentration und Menge - ver standen.

Hinzukommend bezieht sich die Erfindung auf eine Verwendung einer Schablone mit mindestens einem Durchbruch zur halb-quantitativen oder quantitativen Bestimmung von Pro teinen mittels der erfindungsgemäßen Anordnung. Der Durchbruch kann eine rechteckige wie quadratische, kreisrunde oder streifenförmige Ausstanzung sein. Die Fläche des Durchbruchs stimmt mit dem Flächeninhalt der zu überprüfenden Oberfläche des Gegenstandes überein und eine mit der Ethanol-Tensid-Lösung getränkte adsorptionsfähige Schicht eines Testträgers wird in dem Durchbruch entlang desselben auf der zu überprüfenden Oberfläche eines Gegen standes ein- bis mehrmalig bewegt, wobei vorzugsweise der Formkörper anschließend in eine Indikatorlösung, vorzugsweise 5 bis 40 Minuten lang bei Raumtemperatur, eingetaucht wird, welche 100 Vol.-teile wäßrige Reagenzlösung mit einem mittels NaOH eingestellten pH-Wert von 12, welche 0,4 bis 2,0 Gew.-% eine oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) oder Mischungen derselben, 0,4 bis 1,0 Gew.-% Na₂HPO₄ und 99,2 bis 97,0 Gew.-% aqua bidest enthält, und 1 bis 2 Vol.-teile 4 Gew.-% wäßrige CuSO₄ × 5H₂O-Lösung (Kupfersulfat-Lösung) aufweist, und anschließend durch einen Farbvergleich mittels eines Farbprüfblattes oder photometrisch in einem Wellenlängenbereich von 490 nm bis 520 nm eine Quantifizierung der Proteinmenge durchgeführt wird, z. B. in Mikrotiterbehälterplatten.

Die rechteckige Ausstanzung ermöglicht das Bestreichen der Oberfläche des Gegenstan des mit dem Formkörper, quasi quantitativ diskret. Hierbei wird der Formkörper in der Aus stanzung im innigen Kontakt mit der zu überprüfenden Oberfläche, vorzugsweise mehrmals kräftig, in eine Richtung bewegt bzw. gerieben.

Um eine hinreichende quantitative Bestimmung von Proteinen mittels der Schablone zu ermöglichen, kann die Breite der Ausstanzung - lichte Breite auch genannt - der Breite des bei spielsweise als Schicht ausgebildeten Formkörpers entsprechen. Ebenso kann die lichte Breite dem Außendurchmesser des Formkörpers des bauschartigen Typs entsprechen. Unter lichte Breite wird der Abstand der beiden gegenüberliegenden Längsseiten, die länger sind als die gegenüberliegend angeordneten Querseiten, verstanden. Durch die Ausstanzung des rechtecki gen Typs wird eine definierte zu prüfende Fläche vorgegeben, von welcher im wesentlichen quantitativ die Proteine aufgenommen werden können.

Die Innenfläche der Ausstanzung der Schablone, welche von den Längsseiten und den Querseiten begrenzt wird, entspricht dem Flächeninhalt der zu überprüfenden Fläche des Ge genstandes. Durch die Benutzung der Schablone wird eine halbquantitative, aber auch quanti tative Bestimmung von Proteinen eines bestimmten oder diskreten Flächeninhaltes ermöglicht. Die auch für den Laien erkennbare Unterscheidung in schwache, mittlere und starke Färbung der Indikator-Lösung zeigt diesem in deutlicher Weise an, daß ein bestimmter Flächeninhalt der zu überprüfenden Oberfläche mit einer schwachen, mittleren oder starken Verunreinigung mit Proteinen einhergeht, und auch in entsprechendem Umfang die Gefahr von mikrobieller Besiedelung bestehen kann. Zudem hilft das Farbprüfblatt, welches 4 Farbflächen mit grüner, grauer, hell brombeerfarbener und dunkel brombeerfarbener Farbe aufweist, durch Farbver gleich die gefärbte Indikator-Lösung den entsprechenden Proteinmengen zuzuordnen, um eine zumindest halb-quantitative Proteinbestimmung zu ermöglichen.

Ebenso kann eine quantitative Erfassung der Verunreinigungen der diskreten Oberfläche des Gegenstandes durch photometrische Bestimmung bei einem Wellenlängenbereich von 490 bis 520 nm und darüber hinaus mittels Vergleich mit entsprechenden Protein-Eich-Lösungen erfolgen. Hierbei zeichnet sich die erfindungsgemäße Anordnung durch den großen Lineari tätsbereich aus, der sowohl geringe als auch hohe Proteinkonzentrationen pro Flächeninhalt deutlich anzeigt.

Unter kolorimetrischer Bestimmung wird im Sinne der Erfindung auch die Bestimmung der Proteinkonzentration durch Farbvergleich mit einer Standard-Lösung derselben Substanz verstanden. In der Regel erfolgt die kolorimetrische Bestimmung des Farbumschlages oder der Färbung der Indikator-Lösung durch Messen der Extinktion.

Gerade die erfindungsgemäße Anordnung ermöglicht im Vergleich zu dem in der US-PS 4 839 295 offenbarten Verfahren eine vereinfachte Durchführung der Inkubation bei Raum temperatur oder auch bei 37°C. Diese macht sowohl die einfache Durchführung von Hand testen als quasi Wischhygienetest als auch die Testdurchführung in Standard-Laborautomaten ohne technische Änderungen, um eine Vielzahl an Oberflächen zu prüfen, wie sie gerade in gewerblichen Betrieben z. B. im Lebensmittelbereich oder in der Lebensmittelherstellung von Back-, Teigwaren oder Fleischprodukten zwingend erforderlich ist, möglich. Ebenso zeichnet sich die erfindungsgemäße Anordnung aus durch die Möglichkeit der Bestimmung bei einem Wellenlängenbereich von 490 bis 520 nm, vorzugsweise bei einer Wellenlänge von 492 nm, welche eine Standard-Wellenlänge in allen herkömmlichen Plattenphotometern ist. Dies wird ermöglicht durch das breite Absorptionsmaximum bei einem Optimum von 508 nm.

Ebenso ermöglicht die erfindungsgemäße Anordnung aufgrund der gelungenen Mi schungsverhältnisse und der erfindungsgemäßen Zusammensetzung der Indikatorlösung und der Ethanol-Tensid-Lösung einen solchen Empfindlichkeitsbereich, daß die in vielen Fällen notwendigen ein- oder mehrmaligen Vorverdünnungen von Probenmaterialien entfallen kön nen, so daß eine Einmalbestimmung eine hinreichende Sicherheit über das Vorhandensein bzw. den Mangel an Proteinen angibt. Ebenso zeichnet sich die erfindungsgemäße Anordnung durch eine geringere Störanfälligkeit gegenüber reduzierenden Substanzen wie beispielsweise Gluko se und Detergentien in Reinigungsmitteln aus. Daher eignen sich die erfindungsgemäßen Ver bindungen der allgemeinen Formel (I) bis (VIII) wegen des Empfindlichkeitsbereichs auch für den Einsatz in Hygiene-Monitoring-Verfahren als optimal einsetzbare Substanzen.

Hinzukommend zeichnet sich die erfindungsgemäße Anordnung durch den geringeren Verbrauch an Reagenz-Lösung aus, so daß auch eine kostengünstige Herstellung der erfin dungsgemäßen Anordnung als rascher und leicht handhabbarer Wischtest auch für den unge übten Laien für den täglichen Bedarf ermöglicht wird. Zudem führt die Verwendung nur gerin ger Materialien zu der erwünschten Kostensenkung bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Anordnung wegen der lediglichen Verwendung von einem mit einem Formkörper versehenen Testträger, Teströhrchen, Indikator-Lösung sowie Ethanol-Tensid-Lösung und der geringen Konzentrationen der Substanzen A sowie der weiteren Verbindungen und Flüssigkeiten in hin reichender Weise.

Ebenso erweist sich die Anordnung mit ihrer bestimmten Indikator-Lösung gegenüber der Verwendung von Reinigungs- und Desinfektionsmitteln von Vorteil, da diese die Redukti on zu Cu⁺-Ionen nur unwesentlich beeinflussen. Sonach eignet sich die erfindungsgemäße An ordnung hinzukommend zur Überprüfung von bereits gereinigten Arbeitsflächen, um eine Nachkontrolle ebenfalls zu ermöglichen.

Die Tenside in den herkömmlichen Reinigungsmitteln, welche zur Reinigung der Ober flächen der Gegenstände verwendet werden, stören den Nachweis und die Bestimmung der Proteine mit Hilfe der erfindungsgemäßen Anordnung nicht.

Die Indikator-Lösung, welche 0,4 bis 2,0 Gew.-% einer oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII), 0,4 bis 1,0 Gew.-% Na₂HPO₄ und 99,2 bis 97,0 Gew.-% aqua bidest, vorzugsweise 0,6 Gew.-% einer oder mehrerer Verbindung der allgemeinen For meln (I) bis (VIII), 0,6 Gew.-% Na₂HPO₄ und 98,8 Gew.-% aqua bidest, enthält, eignet sich auch zur quantitativen Proteinbestimmung beispielsweise in Mikrotiterbehälterplatten.

Ausführungsbeispiele (a) Gewinnung von 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-4-Carbonsäure

Das wasserlösliche Natriumsalz der 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-4-Carbonsäure kann mit Hilfe der Pfitzinger-Reaktion aus Isatin und 2-Acetylpyridin hergestellt werden. Mit der Me thode von Lesene und Henze (J. Amer. Chem. Soc. 64, 1897-1900) wird das Kaliumsalz der 2- (2-Pyridyl)-Chinolin-4-Carbonsäure hergestellt, aus dem durch Ansäuern die freie Säure gefällt wird. Diese wird mit Natriumhydroxid wieder in Lösung gebracht. Das durch Eindampfen un ter reduziertem Druck bei 40°C erhaltene Natriumsalz wird mindestens 2 × aus Wasser (80-90°C) und dann mindestens 1 × aus Ethanol (Siedehitze) umkristallisiert. Das im Anschluß an die mindestens 2 tägige Trocknung bei Raumtemperatur im Exsikkator erhaltene wasser- und lösungsmittelfreie Salz der 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-4-Carbonsäure ist ein amorphes cremefar benes Pulver mit einem Schmelzpunkt von ca. 302°C.

b) Synthesemöglichkeiten für die Substanzklassen gemäß der Strukturformeln (I) bis (VIII)

Es gibt prinzipiell die Möglichkeit der Synthese der Grundgerüste der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) auf einem einheitlichen Weg. Grundlage ist in allen Fällen die Pfitzinger Reaktion (W. Pfitzinger, J. Prakt. Chem. (2) 33, 100 (1886); 38, 582 (1888)). Sie beschreibt ursprünglich die Synthese von Chinolin-4-Carbonsäuren aus Isatin mit a-Methylen- Carbonyl Komponenten. Die Durchführung der Reaktion entspricht der Methode nach Lesene und Henze (J. Amer. Chem. Soc. 64, 1897-1900).

Je nach Wahl der Edukte - Isatin kann ebenfalls ersetzt werden - erhält man die 4- Carbonsäuren unterschiedlicher Ringsysteme. Die Substanzgerüste der Verbindungen der all gemeinen Formeln (I) bis (VIII) können mit Hilfe der unten beschriebenen Edukte hergestellt werden. Durch Decarboxylierung ist es möglich, die 4-Carbonsäuren jeweils in die Grundgerü ste der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) zu überführen.

Reaktionswege

1. (I):
Isatin + 2-Acetylpyridin < 2-(2-Pyridyl)-Chinolin-4-Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-Pyridyl)-Chinolin
2. (II):
1H-Pyrrol-2,3-dion + 2-Acetyl-5H-(1)-Pyrindin < 2-(2-(5H-(1)-Pyrindinyl))-Pyridin-4- Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-(5H-(1)-Pyrindinyl))-Pyridin
3. (III):
1H-Pyrrol-2,3-dion + 2-Acetyl-7H-(1)-Pyrindin < 2-(2-(7H-(1)-Pyrindinyl))-Pyridin-4- Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-(7H-(1)-Pyrindinyl))-Pyridin
4. (IV):
Isatin + 2-Acetyl-5H-(1)-Pyrindin < 2-(2-(5H-(1)-Pyridinyl))-Chinolin-4-Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-(5H-(1)-Pyrindinyl))-Chinolin
5. (V):
Isatin + 2-Acetyl-7H-(1)-Pyrindin < 2-(2-(7H-(1)-Pyrindinyl))-Chinolin-4-Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-(7H-(1)-Pyrindinyl))-Chinolin
6. (VI):
1,4-Dihydro-cyclopenta[b]pyrrol-2,3-dion + 3-Hydroxy-2-Butanon < Bi-(2-(5H-(1)- Pyrindin- 4-Carbonsäure)) < Decarboxylierung < Bi-(2-(5H-(1)-Pyrindin)
7. (VII):
1,6-Dihydro-cyclopenta[b]pyrrol-2,3-dion + 3-Hydroxy-2-Butanon < Bi-(2(7H-(1)- Pyrindin- 4-Carbonsäure)) < Decarboxylierung < Bi-(2-(7H-(1)-Pyrindin)
8. (VIII):
1,6-Dihydro-cyclopenta[b]pyrrol-2,3-dion + 2-Acetyl-5H-(1)-Pyrindin < 2-(2-(5H-(1)- Pyrindinyl))-7H-(1)-Pyrindin-4-Carbonsäure < Decarboxylierung < 2-(2-(7H-(1)- Pyrindinyl))-5H-(1)-Pyrindin

(c) Anwendungsbeispiele

Die Proteinbestimmung mit Hilfe einer oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) und der entsprechend angesetzen Indikator-Lösung, welche einen oder mehrere Vertreter der die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) umfassenden Gruppe enthält, kann für verschiedene Anwendungen wie beispielsweise als Hygiene- Monitoring-Test oder Plattentest zur quantitativen Proteinbestimmung im Laborbereich zum Einsatz kommen. Voraussetzung für die verschiedenen Einsatzmöglichkeiten ist die Herstel lung einer Reagenz-Lösung mit einer oder mehreren o. g. Verbindungen der allgemeinen For meln (I) bis (VIII).

(d) Herstellung der Reagenz-Lösung

Unter Verwendung einer oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) wird eine wässrige Reagenz-Lösung hergestellt, die 0,6 Gew.-% 2-(2-Pyridyl)-Chinolin- 4-Carbonsäure aus a) sowie 0,6 Gew.-% Dinatriumhydrogenphosphat enthält. Der pH-Wert wird mit 1 N NaOH auf 12,0 eingestellt. Die eingesetzten anorganischen Salze sind von Rea genzienqualität. Das Wasser ist frei von Ionen. Dinatriumhydrogenphosphat dient als Puffer substanz. K-Na-Tartrat, welches Cu²⁺-Ionen komplexiert und diese Ionen in Lösung hält, ist in diesem Fall nicht nötig. Um nicht gelöste Bestandteile zu beseitigen, wird die Reagenz- Lösung durch einen Mikrofilter (Porengröße 0,045 mm) gefiltert. Zur Herstellung der Indika torlösung werden 100 Vol.-teile Reagenzlösung mit 1 oder 2 Vol.-teile der 4 Gew.-% wäßrige CuSO₄ × 5H₂O-Lösung (Kupfersulfat-Lösung) gemischt. Diese Kupfer-Sulfat-Lösung wird mit ionenfreiem Wasser hergestellt und w. o. beschrieben filtriert.

(e) Wischtest

Der Formkörper wird mit einer wäßrige Ethanol-Tensid-Lösung mit 0,030 ml getränkt, die 60 Vol.-teile EtOH, 1,0 Vol.-teile Tween 80 und 39 Vol.-teile aqua bidest enthält. Man bestreicht die Oberfläche einer Arbeitsfläche, hier: die Arbeitsfläche einer Arbeitsplatte eines Metzgers, tropfenfrei mit dem als Wattebausch aus Kunststoffgarnen ausgebildeten Formkör per, welcher das eine Ende des Testträgers umschließt. Der Formkörper wird dann in die Indi kator-Lösung eingetaucht und für eine Zeitdauer von 15 Minuten bei RT in der Indikator- Lösung gehalten. Während der Inkubation des Formkörpers in der Indikator-Lösung werden die Proteine, welche adsorptiv an der Oberfläche des Formkörpers gebunden oder evtl. teilwei se in denselben eingedrungen sind, abgelöst und führen zu der Reduktion von Cu²⁺ in dem alkalischen Milieu der Indikator-Lösung zu Cu⁺, welches mit den Verbindungen der allgemei nen Formeln (I) bis (VIII) einen farbigen Komplex bildet.

Es zeigt hinzutretend, daß auch längerem Stehenlassen der Indikatorlösung, z. B. länger als 60 min, die Färbung der Indikatorlösung im Gegensatz zu der Methode nach Smith et al., bei welcher eine Farbveränderung auftritt, annähernd konstant bleibt.

Ein Farbprüfblatt weist vier unterschiedliche gefärbte Flächen, nämlich eine grüne, graue, hell brombeerfarbene und dunkel brombeerfarbene, auf, die für Fehlen von Proteinen, schwa chen Proteingehalt, mittleren Proteingehalt und für starken Proteingehalt stehen, entsprechend für eine fehlende Verunreinigung, beziehungsweise für eine schwache bis starke Verunreini gung mit Proteinen. Anhand des Farbprüfblattes kann im Vergleich mit der gefärbten Indika tor-Lösung qualitativ und auch halbquantitativ festgestellt werden, in welchem Ausmaß eine Proteinverunreinigung vorliegt.

In einem anderen Ausführungsbeispiel wird eine Schablone verwendet, die eine quadrati sche Ausstanzung von 10 cm² Fläche aufweist. Die auf einer Seite des Testträgers an seinem einen Ende aufgetragene Schicht als Formkörper wird zuvor mit der Ethanol-Tensid-Lösung getränkt. Anschließend wird tropfenfrei die Schicht in der Ausstanzung mehrmalig unter leichtem Anpressdruck auf der Oberfläche der Arbeitsplatte hin- und herbewegt. Durch den leichten Anpressdruck werden die auf der Arbeitsfläche befindliche Proteine adsorptiv an die Schicht bzw. an der Oberfläche der Schicht gebunden. Die Schicht wird in die Indikator- Lösung eingetaucht und gleichfalls 15 Minuten lang in der Indikator-Lösung (siehe oben) bei RT gehalten.

Aufgrund des eintretenden Farbumschlages kann die Bestimmung der Proteine nicht nur halbquantitativ aufgrund des Vergleichs von Färbung der Indikator-Lösung mit dem Farbprüf blatt ermöglicht werden, sondern auch durch Verwendung von Photometern eine vollquantita tive Analytik erzielt werden.

Zudem wird durch die Verwendung der Schablone mit Ausstanzungen die Bestimmung der Proteinmenge pro Oberflächeneinheit der Arbeitsplatte ermöglicht, so daß auch bei Be rücksichtigung der gesamten Oberfläche eine im wesentlichen genaue Angabe der Proteine auf der gesamten Oberfläche errechnet werden kann. Der Meßbereich des Wischtestes liegt zwi schen 0 bis 0,5 mg Protein.

(f) Plattentest

Bei der Verwendung der Reagenzlösung zur Messung von Proteinmengen im Plattentest werden 0,225 ml der Reagenzlösung mit 0,025 ml flüssiger Probe zusammen in die Mikrotiter behälter einer Mikrotiterbehälterplatte überführt. Der Proteingehalt dieser Probe kann zwi schen 0 bis 0,25 mg Protein betragen. Die Inkubation der Mikrotiterbehälter kann bei Raum temperatur oder bei 37°C erfolgen. Die photometrische Adsorptionsmessung erfolgt nach mindestens 30 Minuten vorzugsweise bei einem Extinktionswert von 508 nm. Ebenso ist eine Bestimmung der Extinktion bei 492 nm möglich. 492 nm ist der Absorptionsmeßbereich für viele immunologische Testverfahren (z. B. ELISA), in deren Verlauf die chromogene Substanz OPD (ortho-Phenylendiamin) mittels des Enzyms Peroxidase umgesetzt wird. Eine Kalibrati onskurve für das betreffende Protein kann aus Protein-Standardeichlösungen hergestellt wer den, die zwischen 0 bis 0,25 mg Protein pro 0,025 ml enthalten. Die Proteinmenge in der Probe kann durch den Vergleich der gemessenen Absorption der Probe mit den Absorptionen der Standard-Lösungen aus der Kalibrationskurve wie üblich bestimmt werden.

Claims

1. Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII)
worin R, R¹, R², R^2', R³, R⁴, R^4', R⁵, R⁶, R⁷, R^7', R⁸, R⁹, R^9', R¹⁰ gleich oder verschieden und unabhängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl,
für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vor zugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substi tuiert ist,
für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl,
für (C₁-C₆)-Alkoxy oder (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl,
für einen Rest der Formel -CH,
für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT,
worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Car boxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T,
worin T die oben angegebene Bedeutung hat,
für einen Rest der Formel -CO₂-Y,
worin Y Halogen ist, oder
für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen,
zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Proteinen in wäßrigen Lösungen, bei denen Cu (II) zu Cu (I) reduziert wird.

2. Anordnung mit einem Teststreifen und einer Indikatorlösung zum Nachweis und/oder zur Bestimmung von Proteinen auf Oberflächen, welcher Teststreifen aus einem Testträger und einem auf dem einen Ende des Testträgers angeordneten saugfähigen und porösen Formkörper besteht, dadurch gekennzeichnet, daß die in einem Reagenzgefäß befindliche Indikatorlösung
100 Vol.-teile wäßrige Reagenzlösung mit einem mittels NaOH eingestellten pH-Wert von 12, welche
0,4 bis 2,0 Gew.-% einer Substanz A, welche mindestens einen Vertreter der die Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII)
worin
R, R¹, R², R^2', R³, R⁴, R^4', R⁵, R⁶, R⁷, R^7', R⁸, R⁹, R^9', R¹⁰ gleich oder verschieden und unab hängig voneinander für Wasserstoff, Halogen oder Hydroxyl,
für geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, welches vorzugswei se mit einer oder mehreren Carbonyl-, Carboxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für Nitro, Cyano, Amino, Sulfhydryl, Phenyl, Benzyl,
für (C₁-C₆)-Alkoxy oder (C₁-C₆)-Alkoxycarbonyl,
für einen Rest der Formel -CH,
für einen Rest der Formel -CHO, -COOH, -SO₂T, -SO₃T, -SO₄T oder -SOT,
worin T Wasserstoff, Halogen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen ist, welches vorzugsweise mit einer oder mehreren Carbonyl-, Car boxyl- oder Hydroxyl-Gruppen substituiert ist,
für einen Rest der Formel -PO₂T, -PO₃T oder -PO₄T,
worin T die oben angegebene Bedeutung hat,
für einen Rest der Formel -CO₂-Y,
worin Y Halogen ist, oder
für einen Mono- oder Disaccharid-Rest stehen, umfassenden Gruppe aufweist,
0,4 bis 1,0 Gew.-% Na₂HPO₄ und
99,2 bis 97,0 Gew.-% aqua bidest enthält, und
1 bis 2 Vol.-teile 4 Gew.-% wäßrige CuSO₄ × 5H₂O-Lösung (Kupfersulfat-Lösung) aufweist,
und der Formkörper eine wäßrige Ethanol-Tensid-Lösung enthält.

3. Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper aus einem Ma terial des Adsorptions-Typs hergestellt ist.

4. Anordnung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzlösung 0,6 Gew.-% Substanz A, 0,6 Gew.-% Na₂HPO₄ und 98,8 Gew.-% aqua bidest enthält.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Ethanol-Tensid-Lösung
20 bis 70 Vol.-teile EtOH,
0,2 bis 3,0 Vol.-teile Tenside des nichtionischen Typs und
27 bis 79,8 Vol.-teile aqua bidest enthält.

6. Anordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Ethanol-Tensid-Lösung 60,0 Vol.-teile EtOH, 1,0 Vol.-teil Tenside des nichtionischen Typs und 39,0 Vol.-teile aqua bidest enthält.

7. Verwendung der Anordnung nach einem der Ansprüche 2 bis 6 zum Nachweis oder zur Be stimmung von Proteinen auf Oberflächen von festen Körpern, dadurch gekennzeichnet, daß

a) man einen Teststreifen mit einem auf seinem einen Ende seines Testträgers angeordneten saugfähigen und porösen Formkörper des Adsorptions-Typs in der wäßrigen Ethanol- Tensid-Lösung tränkt,
b) nach Abtropfen der Ethanol-Tensid Lösung die zu überprüfende Oberfläche mit dem Formkörper des Testträgers bestreicht,
c) anschließend den Teststreifen mit seinem Formkörper in die wäßrige Indikatorlösung ein taucht und
d) man die Indikatorlösung kolorimetrisch zur quantitativen Proteinbestimmung bestimmt oder
e) die Indikatorlösung mit einem Farbprüfblatt, welche Farbflächen unterschiedlicher Färbung aufweist, zum qualitativen Proteinnachweis oder zur halbquantitativen Proteinbestimmung vergleicht.

8. Verwendung der Anordnung Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man im Schritt d) die Indikatorlösung bei einer Wellenlänge von 490 bis 520 nm bestimmt.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Testträger ein strei fenförmiger verwendet wird, welcher auf einer ersten Seite mit dem Material beschichtet ist.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß vor dem Schritt b) eine Schablone mit mindestens einer Ausstanzung auf die zu überprüfende Ober fläche aufgelegt wird und im Schritt b) der mit Ethanol-Tensid-Lösung getränkte Form körper in der Ausstanzung mehrmals auf der Oberfläche des festen Körpers unter leichtem Andruck zwecks quantitativer Überführung der Proteine pro Oberflächeneinheit bewegt wird.

11. Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) nach Anspruch 1 zur photometrischen Messung von Proteinmengen in einem Plat tentest mittels Mikrotiterbehälterplatten.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass zu 100 Vol.-teilen Reagenzlösung mit einer oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (VIII) 1 oder 2 Vol.-teile der 4 Gew.-% wäßrigen CuSO₄ × 5H₂O-Lösung (Kupfersulfat- Lösung) gemischt werden.