DE19828726A1 - Bioartifizielles Transplantat und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Bioartifizielles Transplantat und Verfahren zu seiner Herstellung

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bio­ artifiziellen Transplantats unter Verwendung einer zellfrei ge­ machten Bindegewebs-Matrix, die mit autologen Zellen des Trans­ plantat-Empfängers oder mit gentechnisch modifizierten alloge­ nen oder xenogenen Zellen besiedelt wurde. Ferner betrifft die Erfindung ein bioartifizielles empfängerspezifisches Transplan­ tat, das nach dem genannten Verfahren erhältlich ist und aus bereichsweise mit verschieden differenzierten autologen Zellen besiedeltem interstitiellem Bindegewebe besteht.
In der Transplantationstechnik wird heute die Transplantation von Haut, Gefäßen und Organen chirurgisch bereits gut be­ herrscht und ist weit verbreitet. Die Bereitstellung geeigneter Transplantate ist jedoch noch immer schwierig. Die Transplanta­ te kann man nach ihrer Art in drei große Gruppen einteilen.
Zunächst gibt es Transplantate bzw. Implantate aus künstlichen Materialien, wie Kunststoffen, Metallen, Keramik, textilen Ma­ terialien usw. je nach Verwendung und dadurch sich ergebender Belastung.
Die synthetischen Implantate haben heute den Vorteil großer Haltbarkeit und sind besonders im orthopädischen Bereich durch­ gesetzt, da beispielsweise bei künstlichen Gelenken hohe Anfor­ derungen an die Belastbarkeit des Materials gestellt werden. Künstliche Implantate haben jedoch vor allem den Nachteil, daß sie in keinem Falle mitwachsen und auch nicht wirklich einwach­ sen können. Durch letzteres entstehen häufig Probleme am Über­ gang vom künstlichen Implantat zu seiner natürlichen Umgebung.
Als zweites besteht die Möglichkeit, allogenes Material, z. B. Spenderorgane, oder u. U. auch xenogenes Material (tierischen Ursprungs) zu verwenden. Chemisch behandelte Transplantate tie­ rischer Herkunft werden beispielsweise für den Herzklappener­ satz beim Menschen verwendet. Das tierische Material wird dabei i.a. mit Glutaraldehyd behandelt, um die Strukturproteine zu stabilisieren und eine antigene Reaktion zu verhindern. Das mit Glutaraldehyd behandelte Gewebe unterliegt jedoch einer steti­ gen Verhärtung und fortschreitenden Calzifizierung nach der Transplantation. Diese Transplantate müssen daher alle paar Jahre ersetzt werden. Bei der Verwendung allogener Materialien, wie z. B. Spenderorganen ist eine ständige für den Organismus des Empfängers belastende Immunsuppression notwendig. Dennoch kann es zu Abstoßungsreaktionen aufgrund verschiedener Prozesse im Körper kommen.
In manchen Fällen wird schließlich versucht, körpereigenes Ge­ webe für eine Transplantation an anderer Stelle zu verwenden. Diese Methode wird beispielsweise bei Bypass-Operationen ange­ wendet, wobei eine Vene von einer anderen Körperstelle entnom­ men und im Herzbereich eingesetzt wird, um mangelnde Durchblu­ tung dort auszugleichen.
Auch bei Hautverpflanzungen wird häufig eigene, an anderer Stelle entnommene Haut verwendet. Bei der Verpflanzung von Haut besteht das größte Problem darin, daß praktische nichts gewon­ nen wird, wenn die Hautfläche 1 : 1 verpflanzt wird, und daß dem­ zufolge ein kleiner Hautbereich entnommen und anschließend ex­ pandiert werden muß. Diese Dehnung der entnommenen Haut ist je­ doch für die Stabilität und Funktionalität der neu transplan­ tierten Haut schädlich.
Es besteht daher ein großes Bedürfnis für Transplantat- Materialien oder fertig verwendbare Transplantate, die dem na­ türlichen Material soweit nachmodelliert sind, daß sie gut ein­ wachsen, nach Möglichkeit zu keinen Abstoßungsreaktionen ("Host-Versus-Graft-reaction") führen, dadurch lange haltbar sind und vom Wirt wie körpereigenes Material aufgefaßt und im Rahmen des natürlichen Zellaustausches umgebaut werden, so daß möglichst sogar ein Mitwachsen der Transplantate im Körper des Empfängers ermöglicht wird.
Der Erfindung liegt daher die Problemstellung zugrunde, ein solches Transplantat und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.
Zur Lösung dieses Problems ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantats für einen ausgewählten Empfänger vorgesehen, welches die folgenden Schritte umfaßt:
  • a) Bereitstellung eines nativen, eine Collagen-Matrix enthaltenden allogenen oder xenogenen Gewebes bzw. Materials,
  • b) Entfernung weitgehend aller antigen-reaktiver Zellen aus der Collagen-Matrix durch schonende Zellentfernung und an­ schließendes Spülen mit steriler wäßriger Lösung, wodurch eine chemisch nicht modifizierte, praktisch zellfrei ge­ machte, aufgelockerte Collagen-Matrix erhalten wird,
  • c) direkte Weiterverarbeitung des zellfrei gemachten, durch die Behandlung unter b) aufgelockerten Materials durch möglichst vollständige Besiedlung mit den jeweils gewünschten, auto­ logen Zellen des Empfängers oder mit genetisch modifizierten für den Empfänger angepaßten Zellen, wodurch ein unmittelbar einsetzbares Transplantat erhalten wird.
Aus der US-PS 5 336 616 ist bereits ein Verfahren zur Zuberei­ tung eines Gewebes auf Collagen-Basis für die Transplantation bekannt, welches mit Hilfe der Schritte: chemische Vorbehand­ lung und Zellentfernung, Kryobehandlung, Trockenstabilisierung, Trocknung, Rehydrierung und Zellrekonstitution ein bioartifizi­ elles Transplantat mit folgenden Eigenschaften ermöglichen soll: a) es enthält eine extrazelluläre Protein- und Collagen- Matrix, die möglicherweise vom Wirt remodelliert und repariert werden kann, b) es stellt eine intakte Membran-Grundlage für die erfolgreiche Wiederbesiedlung mit lebensfähigen Endothel- oder Epithelzellen dar, c) es ruft primär keine Immunantwort beim Wirt hervor, d) es calzifiziert nicht und e) es kann ein­ fach bei Raumtemperatur gelagert und transportiert werden. Das bekannte Verfahren beruht auf dem Konzept, daß als Transplantat eine möglichst "immun-neutrale" Stützgewebs-Matrix gebildet werden soll, die dann vom Transplantations-Empfänger im Körper umgebaut und remodelliert werden kann. Zur Erleichterung dieses Vorgangs ist auch die Möglichkeit anschließender Besiedlung des nach dem Verfahren hergestellten Transplantates vorgesehen.
Um zu vermeiden, daß die Matrix vom Körper des Transplantat- Empfängers als fremd erkannt wird, ist eine Präparation mit be­ stimmten Schritten vorgesehen. Zunächst wird das entnommene biologische Grundmaterial in eine Stabilisierungslösung einge­ legt, um Strukturschäden zu vermeiden. Diese Stabilisierungslö­ sung kann Antioxidantien, Quellmittel, Antibiotika, Protease- Inhibitoren und auch Relaxantien für glatte Muskulatur enthal­ ten. Dann wird das vorbehandelte Gewebe in eine Azellularisie­ rungslösung eingelegt, die im allgemeinen einen geeigneten Puf­ fer, Salz, ein Antibiotikum, ein oder mehrere Detergentien, ein oder mehrere Protease-Inhibitoren und ein oder mehrere Enzyme enthält. Die so erhaltene azelluläre Matrix könnte nun mit ei­ nem vernetzenden Mittel, wie Glutaraldehyd, fixiert und bis zur Transplantation gelagert werden. Ansonsten wird sie einer übli­ chen Kryobehandlung unterzogen. Im Laufe dieser Kryobehandlung kann das Produkt bereits steril verpackt werden. Das Gewebe wird dann bei niedriger Temperatur unter Vakuumbedingungen ei­ ner möglichst schonenden Gefriertrocknung unterzogen. Diese Ge­ friertrocknung erfolgt offenbar als zusätzliche Maßnahme zur Vermeidung von Rejektionen, da angeblich gefriergetrocknetes Material verglichen mit frischem oder cryokonserviertem Materi­ al weniger Rejektionen verursacht. Das Material soll dann vor­ zugsweise in diesem Zustand gelagert und transportiert werden. Vor einer Transplantation wird das Gewebe rehydriert. Die Rehy­ drierung kann in Salz- oder Ringer-Lösung erfolgen und ggf. Protease-Inhibitor(en) enthalten. Weitere Zusatzstoffe können enthalten sein, z. B. Diphosphonate zur Inhibierung alkaliner Phosphatase und Unterdrückung der Calzifizierung, weiterhin Mittel zur Anregung der Neovaskularisierung und Wirtszellen- Infiltration nach der Transplantation, oder die Rehydrierung kann auch in einem Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd durchge­ führt werden. Als zusätzliche Maßnahme ist schließlich die Be­ siedlung mit immuntoleranten lebensfähigen Zellen in vitro oder in vivo (nach der Transplantation) vorgesehen.
Das zentrale Konzept dieses bekannten Verfahrens besteht darin, eine azelluläre, quasi "neutrale" Matrix zu erhalten, die gut eingebaut wird und keine Rejektionen hervorruft. Die Betonung liegt dabei auf einer "Neutralisierung" der Matrix durch unter Umständen zahlreiche chemische Behandlungsschritte mit Enzymen, Detergentien, Antibiotika, Protease-Inhibitoren usw. Ein wei­ terer Schwerpunkt liegt auf der guten Lager- und Transportfä­ higkeit, die durch die Cryokonservierung und Trocknung erreicht wird, wobei gleichzeitig eine weitere "Neutralisierung" der Ma­ trix stattfinden soll.
Das bekannte Verfahren - und damit auch das danach erhaltene Transplantat - weist jedoch noch gravierende Nachteile auf. So hat es sich gezeigt, daß die polymere Collagenmatrix auch bei schonendem Einfrieren und Trocknen Strukturveränderungen unter Reduzierung der mechanischen Stabilität und Elastizität erlei­ den muß, da in vitro-Versuche zeigen, daß die Zellen bei einer Wiederbesiedlung auf einer vorher getrockneten oder cryobehan­ delten Collagen-Matrix wesentlich schlechter wieder einwachsen.
Die Möglichkeit einer Renaturalisierung des Transplantats im Empfängerkörper wird dadurch sehr behindert oder gegebenenfalls zunichte gemacht.
Ferner erscheint der Weg bedenklich, eine freiliegende "neutralisierte" Collagen-Matrix zu schaffen. Die Collagen- Matrix kann zwar in vitro mit zahlreichen Chemikalien behandelt werden, dies läßt sich jedoch im Körper des Empfängers nicht weiterführen. Eine Behandlung mit Glutaraldehyd wird zu den oben bei xenogenen Materialien schon beschriebenen Problemen zunehmender Verhärtung und evtl. doch zu einer Calzifizierung führen. Ferner besteht die Gefahr, daß eine freiliegende Colla­ gen-Matrix letztendlich doch durch endogene Collagenasen ange­ griffen wird, so daß es zu Abstoßungsreaktionen kommen kann. Bei freiliegender, unvollständig oder falsch besiedelter Colla­ gen-Matrix kann es zu vermehrter Granulozyteneinwanderung und zu einer Thrombozyten-Adhäsion und Leukozyten-Einwanderung kom­ men, wodurch schließlich eine Entzündungsreaktion entsteht und das Transplantat strukturell und funktionell verändert wird.
Die Erfindung verfolgt demgegenüber ein neues Konzept. Großer Wert wird auch hier auf die vollständige Azellularisierung, d. h. die vollständige Entfernung antigen-reaktiver Zellen und anderer antigener Gewebekomponenten aus der Zellmatrix gelegt. Die Collagen-Matrix wird dann jedoch nicht in weiteren Behand­ lungsschritten immunologisch "neutralisiert" oder in ihrer Struktur verändert.
Als Ausgangsmaterial dient bei der Erfindung ein allogenes oder xenogenes Material, das die Grundstruktur für das gewünschte Gewebe, Gefäß oder Organ zur Verfügung stellen soll. Im Einzel­ fall könnte hier auch ein autologes Material verwendet werden, das dem späteren Transplantat-Empfänger zuvor entnommen wurde. Erfindungsgemäß soll die Azellularisierung dieses Ausgangsmate­ rials ausschließlich durch schonende Zellentfernung und an­ schließendes, ggf. reichliches Spülen mit steriler wäßriger Lösung erfolgen. Die schonende Zellentfernung kann entweder durch schonende enzymatische Zellverdauung, beispielsweise durch Einlegen des Gewebes bzw. Materials in Trypsin-Lösung, erfolgen oder alternativ mit Hilfe eines chemisch zellablösen­ den Mittels, vorzugsweise mit Hilfe eines ionenspezifischen Komplexbildners.
Im Falle der enzymatischen Zellablösung werden durch das Ver­ dauungsenzym Bindungsstellen in der Verankerung der Zellen mit ihrer Umgebung gelöst. Dies geschieht vorzugsweise durch Einle­ gen des Gewebes bzw. Materials in Trypsin-Lösung. Dieser Tryp­ sin-Lösung kann bei Bedarf EDTA, EGTA, Triton oder TNN zuge­ setzt sein. Durch Einstellung der Zeitdauer, während derer das Enzym auf das Gewebe einwirkt, wird das Maß der Abverdauung ge­ steuert und es wird vermieden, daß ein Angriff auf die Colla­ gen-Matrix selbst erfolgt. Die Trypsinbehandlung bewirkt auch eine gute Auflockerung der zellfrei gemachten Matrix, so daß die Neubesiedlung erleichtert wird.
Alternativ wird ein chemisch zellablösendes Mittel verwendet, das auf beliebige andere chemische Weise die Zellen an ihrer Verankerung zur Collagen-Matrix löst. Vorzugsweise ist vorgese­ hen, daß ein ionenspezifischer Komplexbildner verwendet wird, der den Zellen essentielle Ionen entzieht und so eine Ablösung verursacht. Durch die Komplexierung z. B. von Calziumionen wird die Bindung der Zellen untereinander und die Zell-Matrixbindung über Integrine aufgehoben.
Als ionenspezifischer Komplexbildner kann beispielsweise das calziumspezifische EGTA (Ethylenglykol-bis-(2-aminoethyl­ ethery-tetraessigsäure) eingesetzt werden. EGTA wird vorzugs­ weise kurzzeitig und hochkonzentriert eingesetzt. Auch andere Komplex- bzw. Chelatbildner, wie EDTA (Ethylendiamintetra­ essigsäure), Citrat oder Ethylendiamin oder sonstige chemisch zellabtötende und ablösende Mittel, die die Collagen- Proteinstruktur nicht angreifen, können verwendet werden. So bieten sich weiterhin an: BAPTA/AM (ein zellpermeabler Calzi­ um-Chelator) DMSO, Gadolinium, Desferrioxamin, Desferrithiocin, Hexadentat oder auch Aminocarboxylat.
Die vorgenannten Mittel können einzeln oder in Mischungen ein­ gesetzt werden, sie können durch andere Zusätze ergänzt werden, wie z. B. durch Tenside, die die Ablösung der Zellen erleichtern können (z. B. TRITON®). Vorzugsweise ist das chemisch zellablö­ sende Mittel frei von Enzymen, die bei längerer Einwirkung Col­ lagen angreifen könnten, wie z. B. Trypsin. Durch die genannten Mittel werden die Zellen gleichzeitig abgetötet und abgelöst. Das Ablösen kann durch intensives Spülen oder eine entsprechen­ de, die Zellen mechanisch abscherende Behandlung unterstützt werden.
Ein Vorteil der chemisch-mechanischen Behandlung liegt darin, daß der Behandlungsschritt, in dem die Collagen-Matrix zellfrei gemacht wird, nur deutlich weniger Zeit in Anspruch zu nehmen braucht als bei einer Behandlung mit Trypsin. Hierdurch sinkt erstens die Gefahr, daß die Collagen-Matrix selbst angegriffen wird, und zweitens bleibt die Tertiärstruktur besser erhalten, wenn das Substrat nicht zu lange in Lösung gequollen wird. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß durch den Einsatz "harter Chemikalien" Probleme durch u. U. kontaminierte Enzyme tieri­ schen Ursprungs vermieden werden können. Ein weiterer Vorteil liegt schließlich darin, daß die Basalmembran intakt bleibt. Die Basalmembran stellt das direkte und gewebespezifische Adhä­ sionssubstrat für die Endothelzellen dar. Der Glycosilierungs­ grad der Matrixproteine beeinflußt auch die Zellimigration und somit ein späteres Einwandern von Zellen. Die natürliche Form des Collagengerüstes in ihrer dreidimensionalen Verbindung mit anderen Matrixkomponenten und Integrinen kann daher durch die Erfindung erhalten werden.
Auf die beschriebene Weise wird eine aufgelockerte, jedoch in ihrer Sekundär- und Tertiärstruktur dem nativen polymerisierten Collagen noch weitgehend entsprechende Collagenstruktur erhal­ ten, die für das Einwachsen neuer Zellen, nämlich autologer Zellen des Empfängers oder, falls dies im Einzelfall möglich ist, anderer immuntoleranter Zellen bestens vorbereitet ist.
Die zellfrei gemachte, aufgelockerte Matrix wird daher allen­ falls kurz zwischengelagert oder sterilisiert (beispielsweise radioaktiv mit UV oder Protonen bestrahlt, oder mit Ethylenoxid begast), jedoch nicht chemisch weiterbehandelt, sondern prinzi­ piell sofort, möglichst vollständig mit den jeweils gewünsch­ ten, i.a. mit für den Empfänger autologen Zellen in vitro be­ siedelt. Diese Besiedlung kann in einem normalen Kulturmedium erfolgen, dem ein Antibiotikum zugesetzt sein kann. Im Falle der besonders schonenden und schnell verlaufenden Zellablösung durch Komplexbildner kann ggf. Eine zusätzliche chemische oder Kryo-Behandlung erfolgen, wenn dies aus besonderen Gründen not­ wendig erscheint.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß eine spätere Abstoßungsreaktion erfolgreich bereits dadurch vermieden werden kann, daß eine vollständige, im Einzelfall auch mehrschichtige Besiedlung der weitestgehend azellularisierten Matrix mit im­ muntoleranten Zellen, d. h. im allgemeinen mit autologen Zellen des Empfängers, vorgenommen wird. Statt autologer Zellen können auch Zellen anderen Ursprungs verwendet werden, die genetisch so verändert wurden, daß sie für den Transplantat-Empfänger "verträglich" sind, d. h., vom Körper nicht mehr als "fremd" er­ kannt werden. Auf diese Weise wird dem Empfänger ein Transplan­ tat zur Verfügung gestellt, das an allen zugänglichen Stellen mit autologen Zellen bedeckt ist und daher vom Körper des Emp­ fängers nicht als fremd erkannt werden wird. Dieses Transplan­ tat wird im Körper den üblichen Umbildungsmechanismen unterwor­ fen werden, so daß es auf natürliche Weise remodelliert, erneu­ ert und unter Zelldifferenzierung weiter angepaßt wird. Das Transplantat ist daher bestens vorbereitet, besonders gut ein­ zuwachsen, umgebaut zu werden und ggf. sogar mitzuwachsen. Durch die azellularisierte Matrix kann eine Vielzahl von Trans­ plantatformen vorgegeben werden. Diese können je nach Anwen­ dungszweck mit verschiedenen autologen Zellen besiedelt werden, und zwar ggf. auch bereichsweise mit unterschiedlichen autolo­ gen Zellen.
In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, daß in die Ma­ trix Wachstumsfaktoren mit eingebracht werden. Hierbei kann es sich vorzugsweise um für die jeweiligen Zellen spezifische Fak­ toren, wie HGF, VEGF, FGF, ECGF oder PDGF handeln. Ebenso kön­ nen auch Matrixfaktoren wie z. B. Fibronektin oder chemotakti­ sche Faktoren eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Wachstumsfakto­ ren bei der Zellbesiedlung eingebracht, indem genetisch modifi­ zierte Zellen verwendet werden, die mit Genen für geeignete Wachstumsfaktoren transformiert wurden, so daß eine wenigstens transiente Expression an Wachstumsfaktor(en) im Zeitraum nach der Transplantation erfolgt. Die temporäre Expression von Wachstumsfaktor(en) kann helfen, die Akzeptanz für das Trans­ plantat zu erhöhen, indem Kapillarisationsprozesse verstärkt oder ausgelöst werden. Für die Transformation bzw. Transfektion der Zellen ist eine geeignete Methode auszuwählen. Es kann sich dabei um die Elektroporation, liposomalen Gentransfer, rezep­ torvermittelte Endozytose, Proteincoating oder sonst ein geeig­ netes der bekannten und in der Literatur hinlänglich beschrie­ benen Verfahren handeln.
Alternativ kann der Wachstumsfaktor auch direkt in die extra­ zelluläre Matrix eingebracht werden. Dies könnte beispielsweise in mikroinkapsulierter Form oder durch geeignete Beschichtung geschehen. Hierdurch sollte der Wachstumsfaktor kurzfristig oder über einen bestimmten Zeitraum ab Implantation retardiert in dem Transplantat feigesetzt werden, so daß zeitweise eine örtlich hohe Konzentration an Wachstumsfaktor erzeugt wird, von der eine Signalwirkung für die Auslösung von Kapillarisations­ prozessen ausgeht.
Das nach dem Verfahren erhaltene Transplantat ist unmittelbar einsetzbar. Lagerung und Transport sollte höchst schonend unter sterilen und nicht dehydrierenden Bedingungen erfolgen. Eine gesonderte De- und Rehydrierung oder sonstige strukturverän­ dernde Maßnahmen empfehlen sich an dem fertigen Transplantat nicht.
Insbesondere bei pareanchymatösen Organen ist die Steuerung, welche Zellen wo aufwachsen sollen, besonders wichtig, damit das Gewebe nicht als fremd erkannt wird. Bei röhrenförmigen Ge­ fäßen und Herzklappen-Transplantaten werden zweckmäßigerweise außen autologe (Myo-)Fibroblasten und innen Endothelzellen ver­ wendet. Die Fibroblasten wachsen mehrschichtig auf und sichern auf diese Weise eine äußerlich intakte Besiedlung mit autologen Zellen, wodurch die Infiltration mit Granulationsgewebe ver- oder zumindest stark gehindert wird. Das Aufbringen der Zellen auf die Außenseite röhrenförmiger Gefäße kann z. B. mit Hilfe viskoser Flüssigkeiten erfolgen. Die Zellen halten sich dadurch besser auf der äußeren Oberfläche, so daß das Einwachsen er­ leichtert wird. Es kann eine viskose oder sogar gelierfähige Lösung Verwendung finden, die z. B. Collagen, Plasma oder Fibri­ nogen enthalten kann.
Die Erfindung umfaßt dementsprechend insbesondere auch bioarti­ fizielle empfängerspezifische Transplantate, welche aus be­ reichsweise mit verschieden differenzierten autologen Zellen besiedeltem interstitiellem Bindegewebe bestehen. Anstelle von autologen Zellen, die vorher vom Transplantat-Empfänger gewon­ nen wurden, können auch quasi-autologe Zellen anderen Ursprungs eingesetzt werden, die gentechnisch im Hinblick auf den Empfän­ ger verändert wurden. Die Collagen-Matrix des interstitiellen Bindegewebes soll nach Möglichkeit nirgends mehr freiliegen.
Handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Transplantat um ein Haut-Transplantat, ist es vorzugsweise außen (auf der körperab­ gewandten Seite) mit Keratinozyten und innen (körperseitig) mit Zellen mesodermalen Ursprungs besiedelt. Auch hierbei sind die Oberflächen jeweils vollständig besiedelt, so daß dort überwie­ gend keine Collagen-Matrix freiliegt, die auf die Dauer verhär­ ten oder vom Körper als fremd erkannt und deshalb bekämpft wer­ den könnte.
Neben Hauttransplantaten können auch bioartifizielle Herzklap­ pen, Aorten, sonstige Gefäße, Sehnen, Cornea, Knorpel, Knochen, Larynx, Herz, Trachea, Nerven, Miniskus, Diskus intervertebra­ lis oder z. B. Ureteren, Urethra und Blase erhalten werden. Letztere können zur Defektdeckung bei Patienten nach Operatio­ nen oder bei angeborenen Mißbildungen (z. B. Hypospadie) verwen­ det werden.
Das polymerisierte, praktisch im nativen Zustand belassene Col­ lagen der Transplantat-Matrix ist von einer dem natürlichen Zu­ stand weitgehend entsprechenden hohen mechanischen Stabilität und Elastizität. Dies ermöglicht, daß das bioartifizielle Transplantat lange, möglicherweise dauerhaft, ohne erneuten operativen Ersatz im Körper des Empfängers verbleiben kann. Darüberhinaus beeinflußt dieses Collagen die Zelldifferenzie­ rung beim körpereigenen Umbau positiv. Das transplantierte ar­ tifizielle Organ wird leichter durch "inneren Umbau" körperei­ gen gemacht, d. h. daß die autologen Zellen die xenogene Matrix innerhalb des Organismus resorbieren und durch neue autologe Matrix ersetzen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen beschrie­ ben, die Isolationsprotokolle für die die Isolation autologer Zellen und Beispiele für die Durchführung des Verfahrens umfas­ sen.
Beispiele Herstellung eines bioartifiziellen Transplantats (allgemein) Gewebevorbereitung (Zellentfernung) mit Trypsin
Das Gewebe wird nach der Entnahme in eine bevorzugt 0,05%ige Trypsinlösung gelegt und dort je nach Wandstärke des Materials z. B. 24, 48, 72 oder 96 Stunden belassen. Alternativ kann statt der Zeit die Konzentration der Trypsin-Lösung variiert werden. Das Gewebe soll vollständig mit Trypsinlösung bedeckt sein. Die Flüssigkeit wird vorzugsweise ständig durch Rühren in Bewegung gehalten. Die Temperatur sollte zwischen 25 und 37°C liegen.
Insbesondere bei sehr festem Gewebe kann zur Unterstützung der Zellablösung zusätzlich eine Veränderung des pH-Wertes oder ei­ ne schonende Ultraschall-Behandlung vorgenommen werden.
Gewebevorbereitung (Zellentfernung) mit Komplex- bzw. Chelat­ bildner
Typischerweise erfolgt die Behandlung des Gewebes durch Immer­ sion in einer 1% EDTA isotonischen Kochsalzlösung bei 4°C für ca. 3 Stunden. Die Behandlungsdauer ist von der Konzentration des Komplexbildners abhängig. Bedarfsweise kann auch hier eine Unterstützung der Ablösung, beispielsweise durch Ultraschall, erfolgen.
Nach Abschluß der enzymatischen oder komplexierenden Ablösung von Zellen und antigenen Gewebeteilchen wird das Gewebe gespült d. h. mehrfach in Spüllösung eingelegt oder längere Zeit unter Durchfluß von Spüllösung gereinigt. Zum Spülen kann sterile wäßrige Lösung wie z. B. NaCl-Lösung, PBS oder andere verwendet werden. Das Spülen kann mehrere Tage dauern und führt zusätz­ lich zu einer Entfernung vormals nicht abgeschwemmter Zellkör­ per.
Wenn die Behandlung mit Komplexbildner bei 4°C vorgenommen wur­ de, kann auch das Spülen vorteilhaft bei dieser Temperatur er­ folgen. Dabei sollte wenigstens ca. 2 Stunden gespült werden.
Falls erforderlich, wird das Gewebe nun in isotonischer Lösung bei Kühlung auf etwa 4°C unter Zusatz von Antibiotika bis zur weiteren Besiedlung steril gelagert.
An dieser Stelle ist eine radioaktive Bestrahlung, beispiels­ weise eine y-Sterilisierung, eine Begasung mit Ethylenoxid, ei­ ne UV- oder Protonenbestrahlung möglich.
Bei der Isolation der für die Besiedlung zu verwendenden Zellen (z. B. Endothelien glatte Muskelzellen, Fibroblasten) können konventionelle Isolationsprotokolle verwendet werden.
Die Besiedlung erfolgt bei 37°C unter Sterilbedingungen in ei­ nem Medium, dem ggf. Wachstumsfaktor (ECGF) zugesetzt sein kann. Für eine vollständige Besiedlung ist es vorteilhaft, daß Kulturmedium ständig zu bewegen und das bewegte Material häufig mit Sauerstoff in Kontakt zu bringen.
Die Besiedlung mit verschiedenartigen Zellen bzw. Zellpopula­ tionen kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Ein Vorteil der Erfindung ist, daß die Zellen eine extrazellu­ läre Matrix in einer weitestgehend der natürlichen Zusammenset­ zung entsprechenden Form und 3-D-Geometrie vorfinden. Das heißt, daß unter Vermeidung strukturschädlicher Prozesse, wie z. B. Dehydrierung und Rehydrierung, eine dem physiologischen Zustand nahekommende extrazelluläre Matrix für die Zellbesied­ lung verwendet werden kann. Diese Matrix kann zeitlich gestaf­ felt besiedelt werden.
Sofern es sich um Haut handelt, kann das Gewebe zwischenzeit­ lich auf einem Träger fixiert oder in einem Rahmen eingespannt werden, wonach dann nur die eine Seite mit Zellen bespült wird. Dieses Verfahren kann für die Ober- und Unterseite angewendet werden.
Auch andere Materialien können durch geeignetes Einspannen und/oder Abdichten bestimmter Bereiche gezielt besiedelt wer­ den. Beispielsweise kann von oben mit Keratinozyten und von un­ ten mit Bindegewebszellen und ggf. Zellen von Hautanhangsgebil­ den besiedelt werden. Alternativ können von oben zeitlich vor der Besiedlung mit Keratinozyten Zellen von Hautanhangsgebilden aufgegeben werden.
Röhrenförmige Transplantate können z. B. zunächst innen im Durchfluß besiedelt werden, dann abgebunden oder eingespannt und außen besiedelt werden.
Bei der Herstellung eines bioartifiziellen Gefäßes ist es bei­ spielsweise möglich, von außen Myofibroblasten und innerhalb des Lumens humane Endothelien aufzugeben. Ziel ist es, das Ein­ wachsen der Zellen in die Wand des Gefäßes und eine Differen­ zierung der Zellen am Migrationsziel innerhalb der 3D- Mikroumgebung der extrazellulären Matrix zu erreichen. Diese Einwanderung der Zellen in die Matrix stellt ein wesentliches Merkmal und gleichzeitig einen bedeutenden Vorteil der Erfin­ dung dar.
Die Gefäßbesiedlung von außen kann auch zunächst mit glatten Muskelzellen und danach mit (Myo-)Fibroblasten erfolgen.
Alternativ können innen, in das Lumen, zunächst Myofibroblasten gegeben werden und danach - zeitlich so versetzt, daß sich eine konfluente Myofibroblasten-Zellschicht gebildet hat - ebenfalls in das Lumen Endothelien (in Kulturmedium suspendiert).
Die Gewinnung der Endothelien und glatten Muskelzellen wird entsprechend dem Stand der Technik durchgeführt.
GEWEBEGEWINNUNG
Vena saphena-Stücke des peripheren Beins von Patienten von ca. 1 cm Länge werden in heparinisiertes Vollblut gegeben und auf diese Weise in das Labor transportiert. Dort erfolgt die Isola­ tion der Endothelien und Myofibroblasten für die weitere Expan­ sion in vitro.
ISOLATION UND KULTUR VON ENDOTHELIEN, GLATTEN MUSKELZELLEN UND FIBROBLASTEN 1. Materialien
  • - HBSS (Clintec, Salvia, Homburg)
  • - PBS, darin CA2+ und Mg2+ (Sigma)
  • - Collagenase A (Boehringer Mannheim)
  • - M-199 mit L-Glutamin (Sigma), darin 10% (20%) FBS (Sigma)
  • - gepooltes Humanserum
  • - 100 µ/ml Penicillin (Sigma), 100 µg/ml Streptomycin (Sigma)
  • - 5000 µ/ml Heparin (Heparin Novo, Nordisk, Mainz, frei von Konservierungsstoffen)
  • - 6-well Kulturplatten (Greiner, Frickenhausen, Deutschland)
  • - Fibronectin Beschichtung
2. Endothelzellen 2.1. Beispiel für eine Zellgewinnung
Die Zellgewinnung erfolgt durch Füllen des Segments mit PBS, darin Ca2+ und Mg2+ (Sigma) und 0,2% Collagenase A (Boehringer, Mannheim) (alternativ HBSS oder M-199 mit 0,2% Collagenase A), 30 min Inkubieren in HBSS (5% CO2/95% Luft/37°C), evtl. Verlän­ gerung der Inkubationszeit auf 1h, Fushen mit 50 ml M-199 mit L-Glutamin (Sigma), darin 20% FBS (Sigma) (alternativ: Auf­ schneiden des Gefäßes und Abschaben der Zellen in einer mit Me­ dium gefüllten Petrischale), Auffangen der Zellen und Zentrifu­ gieren (10 min bei 300 xg), Resuspendieren in 5 ml M-199, darin 20% FKS, 10 µ/ml Penicillin (Sigma), 100 µg/ml Strepromycin (Sigma), 50 µg/ml EGF (endothilial growth factor) (Boehringer, Mannheim), 5000 µ/ml Heparin und Kultivieren auf mit 1%iger Ge­ latine vorbeschichteten 6-well Kulturplatten. Alternativ kann anstelle von Humanserum auch FBS oder NCS verwendet werden.
2.2 Kultur von Endothelzellen
Die Kultur kann erfolgen durch: Inkubation bei 5% CO2, 95% Luft bei 37°C unter Mediumwechsel alle 3 Tage. Nach Erreichen der Konfluenz wird zur Ablösung der Zellen eine Lösung mit 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA (Sigma) in PBS ohne Ca2+ und Mg2+ ver­ wendet (Inkubation 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur). Alter­ nativ kann eine mechanische Trennung durch "Abschaben" erfol­ gen. Anschließend wird M-199, darin 20% FBS (zur Trypsininakti­ vierung) gewaschen. Es wird 10 min bei 300 × g zentrifugiert und anschließend resuspendiert. Schließlich wird in 75cm2- Kulturflaschen subkultiviert (1. Passage, 2. Passage in 175cm2- Flaschen über ca. 2 Wochen). Diese Zellen werden zur Aussaat auf das Transplantat verwendet.
3. Myofibroblasten 3.1. Gewinnung von SMC ("smooth muscle cells" = glatte Muskel­ zellen) und FB (fibroblasts, Fibroblasten)
Die Gewinnung erfolgt in folgenden Schritten:
  • - mechanische Abtrennung der Adventitia (FB) vom deendothelia­ lisierten Gefäß
  • - Zerkleinerung in 1mm-Stücke
  • - die Stücke werden mit wenig Medium in eine Kulturflasche ge­ geben
  • - nach 2-3 Tagen kleben die Gewebeteile auf dem Flaschenboden
  • - die Kulturflaschen werden täglich für 8 h senkrecht gestellt.
3.2 Kultivierung von SMC und FB
Die Kultivierung erfolgt mit einer Zelldichte von 10000 Zel­ len/cm2 bei 37°C, 95% Luft und 5% CO2 bei einem Mediumwechsel alle 2 bis 3 Tage bis zur weitgehenden Konfluenz; dann Typsi­ nierung und Passagierung.
Zu den Figuren:
Fig. 1 Aorta des Schweins nach Behandlung (Versuch entspre­ chend Schritten a) und b) des erfindungsgemäßen Verfahrens). Die Matrix ist aufgelockert und frei von Zellen. Die Zellent­ fernung erfolgte hier mit Trypsin.
Fig. 2 Rasterelektronische Aufnahme der Oberfläche einer mit Trypsin entsprechend der Erfindung azellularisierten Oberfläche einer Aortenwand. Die Matrixfibrillen sind dargestellt.
Fig. 3 Aorta des Schweins nach Besiedlung mit Endothelien, die einen Monolayer an der oberflächlichen Lumenseite bilden.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplan­ tats für einen ausgewählten Empfänger, welches die folgenden Schritte umfaßt:
  • a) Bereitstellung eines nativen, eine Collagen-Matrix enthal­ tenden allogenen oder xenogenen Gewebes bzw. Materials,
  • b) Entfernung weitgehend aller antigen-reaktiver Zellen aus der Collagen-Matrix durch schonende Zellentfernung und an­ schließendes Spülen mit steriler wäßriger Lösung,
  • c) direkte Weiterverarbeitung des zellfrei gemachten, durch die Behandlung unter b) aufgelockerten Materials durch mög­ lichst vollständige Besiedlung mit den jeweils gewünschten autologen Zellen des Empfängers oder mit genetisch modifi­ zierten für den Empfänger angepaßten Zellen, wodurch ein unmittelbar einsatzbereites Transplantat erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die schonende Zellentfernung durch eine enzymatische Zellverdauung geschieht, vorzugsweise durch Einlegen des Gewebes bzw. Materi­ als in Trypsin-Lösung.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die schonende Zellentfernung mit Hilfe eines chemisch zellablösen­ den Mittels erfolgt, vorzugsweise mit Hilfe eines ionenspezifi­ schen Komplexbildners, wie EDTA oder EGTA.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Material zwischen Schritt a) und b) und/oder zwischen Schritt b) und c) in isotonischer Lösung bei Kühlung auf vorzugsweise 4°C und unter Zusatz von Antibiotika steril zwischengelagert und/oder gegebenenfalls schonend sterilisiert wird, vorzugsweise durch Begasen oder Bestrahlen, z. B. mit γ- Strahlen, UV oder Protonen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Besiedlung des Materials örtlich mit ver­ schiedenen differenzierten autologen Zellen erfolgt, beispiels­ weise bei röhrenförmigen Gefäßen außen mit (Myo-) Fibroblasten und innen mit Endothelzellen.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufbringen der Zellen auf die Außenseite röhrenförmiger Gefäße mit Hilfe viskoser Flüssigkeiten erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß in die Matrix zusätzlich wenigstens ein Wachs­ tumsfaktor, Matrixfaktor oder chemotaktischer Faktor einge­ bracht wird - vorzugsweise mit Hilfe der Zellen bei der Besied­ lung, oder vor der Besiedlung durch Einbringen des Wachstums­ faktors in einer geeigneten Form in die extrazelluläre Matrix, oder nach der Besiedlung durch Einbringen des Wachstumsfaktors in die besiedelte Matrix.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß für die Besiedlung genetisch modifizierte Zellen verwendet werden, die mit Wachstumsfaktor(en) codierenden Genen transformiert bzw. transfiziert sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das erhaltene Transplantat für Lagerung und Transport steril unter nicht dehydrierenden Bedingungen gela­ gert wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das collagenhaltige allogene oder xenogene Gewebe bzw. Material Herzklappen, Haut, Gefäße, Aorten, Sehnen, Cor­ nea, Knorpel, Knochen, Trachea, Nerven, Miniskus, Diskus inter­ vertebralis, Ureteren, Urethra und Blase umfaßt.
11. Bioartifizielles empfängerspezifisches Transplantat, wel­ ches aus bereichsweise mit verschieden differenzierten autolo­ gen oder gentechnisch veränderten quasi-autologen Zellen besie­ deltem interstitiellem Bindegewebe besteht, insbesondere er­ hältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Transplantat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein parenchymatöses Organ handelt.
13. Transplantat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine bioartifizielle Herzklappe handelt, welche au­ ßen mehrschichtig mit (Myo-)Fibroblasten und innen mit En­ dothelzellen besiedelt ist, wobei die Oberflächen jeweils voll­ ständig besiedelt sind, so daß dort weitgehend keine Collagen- Matrix freiliegt.
14. Transplantat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Hauttransplantat handelt, welches außen (auf der körperabgewandten Seite) mit Keratinozyten und innen (körperseitig) mit Zellen mesodermalen Ursprungs besiedelt ist, wobei die Oberflächen jeweils vollständig besiedelt sind, so daß dort überwiegend keine Collagen-Matrix freiliegt.
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