DE19823679C2 - Verwendung von Crataegus-Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie neoplastischer Erkrankungen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Zubereitungen aus Crataegus zur Herstellung pharmazeuti­ scher Präparate oder Nahrungsergänzungsmittel zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen, wobei die Zubereitungen im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthalten, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung von Crataegus-Pflanzenteilen zur Herstellung von Aufgüssen. Eingeschlossen sind ferner Mittel zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

Trotz der Fortschritte in der modernen Medizin zählen Tumorerkrankungen, d. h. bösartige Neubildungen, noch im­ mer zu den häufigsten Erkrankungen mit meist sehr schlechten Krankheitsverläufen und überwiegend tödlichen Folgen. Unerwünschte Nebenwirkungen engen die Anwendung derzeit zur Verfügung stehender Medikamente in Prophylaxe und Therapie ein. Bisher wurde eine große Anzahl wirksamer Chemotherapeutika (Cytostatika und Cytotoxika), wie z. B. 5-Fluorouracil oder Methotrexat, entwickelt. Der Nachteil der Chemotherapeutika liegt jedoch in den starken Ne­ benwirkungen. Die Nebenwirkungen sind unter anderem darauf zurückzuführen, daß die in der Chemotherapie einge­ setzten Wirkstoffe auch auf "gesunde" Zellen, d. h. normal proliferierende Zellen, cytostatisch und/oder cytotoxisch wir­ ken. Dies führt insbesondere zur Schädigung sich normalerweise häufig teilender Zellen, wie z. B. von Keratinozyten, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen, Stammzellen der Blutbildung (hämatopoetisches System) und Keimzellen mit der Folge unerwünschter Wirkungen, wie z. B. Haarausfall (Alopecia), Schleimhautschädigungen (Mucositits, inte­ stinale Ulcerationen), Unterdrückung der Blutbildung (Myelosuppression mit der Folge von Anämie, Infektionen und Blutungskomplikationen) und Infertilität. Dies begrenzt die Anwendbarkeit heute zur Verfügung stehender Chemothera­ peutika in der Therapie und verbietet ihren Einsatz in der Prophylaxe neoplastischer Erkrankungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Mittel, insbesondere ein pharmazeutisches Präparat oder Nah­ rungsergänzungsmittel, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen zur Verfügung zu stellen, das die ge­ nannten Nebenwirkungen der im Stand der Technik bekannten Chemotherapeutika nicht aufweist. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, das anders als die gegenwärtig verwendeten Chemotherapeutika auf normal proliferierende Zellen keinen oder nur einen geringen cytostatischen oder cytotoxischen Effekt hat.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Herstellung eines Mittels zur Prophylaxe und/oder The­ rapie von Tumorerkrankungen (neoplastischen Erkrankungen) eine Zubereitung aus Crataegus verwendet wird, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthält, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind.

Unter den Zubereitungen, die im wesentlichen Bestandteile enthalten, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind, sind daher solche Zubereitungen zu verstehen, die unter Einsatz von Verfahren erhältlich sind, mit denen polare Inhaltsstoffe von Crataegus gewonnen werden. Dafür in Frage kommende Verfahren zur Herstellung dieser Zubereitungen sind im folgenden beispielhaft angegeben. Unter dem Begriff "polare Lösungsmittel" werden im Rahmen der Erfindung allge­ mein wäßrige und nichtwäßrige Lösungsmittel verstanden, wobei in die letztgenannte Gruppe insbesondere organische Stickstoff- und Sauerstoff-Verbindungen fallen, nicht jedoch Schwefelkohlenstoff, Tetrachlormethan sowie gesättigte Kohlenwasserstoffe.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem Mittel je nach der arzneimittelrechtlichen Spezifikation um pharmazeutische Präparate, Arzneimittel, Heilmittel, Nahrungsergänzungsmittel (food supplements), Zusätze zu Nahrungsergänzungsmitteln oder zu Lebensmitteln, Tees oder dergleichen handeln.

Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, daß Zubereitungen, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthalten, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankun­ gen besonders gut geeignet sind ohne die unerwünschten Nebenwirkungen der nach dem Stand der Technik bekannten Chemotherapeutika aufzuweisen.

Crataegus-Extrakte werden in der Volksmedizin schon seit langem zur Behandlung von Herz- und Kreislauferkran­ kungen eingesetzt und sind in der Zwischenzeit auch von der Wissenschaft als wirksam bei diesen Erkrankungen aner­ kannt worden.

Crataegus ist in den gemäßigten Klimazonen auf der nördlichen und südlichen Erdhalbkugel sowie in den Hochgebir­ gen der Tropen (R. Kaul, "Der Weißdorn: Botanik, Inhaltsstoffe, Qualitätskontrolle, Pharmakologie, Toxikologie und Klinik", 1. Auflage, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart 1998) weltweit verbreitet.

Es handelt sich um die größte Gattung der Maloideae (Pomoideae) einer Unterfamilie der Rosaceae. Die Gattung Cra­ taegus umfaßt ca. 100 bis 200 echte Arten (I. Bauer und U. Hoelscher, "Crataegus" in R. Hänsel, K. Keller, H. Rimpler, G. Schneider (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 4, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin 1992, 1040-1062). In Mitteleuropa werden überwiegend Crataegus laevigata (Synonym: Crataegus oxyacantha) und Crataegus monogyna sowie deren Bastarde angetroffen; dies sind auch die überwiegenden Crataegus Spezies in dem westlichen Mittelmeergebiet und Nordafrika, während im östlichen Mittelmeergebiet und Eurasien bevorzugt Crataegus pentagyna und Crataegus nigra sowie im östlichen Teil Eurasiens neben C. laevigata und C. monogyna auch C. curvise­ pala und C. azarolus wachsen. C. cuneata wird in Japan, China und angrenzenden Regionen arzneilich eingesetzt, wäh­ rend in Nordamerika C. berberifolia, C. aestivalis, C. chrysocarpa, C. crus-galli und C. pruinosa zumindest in der Volks­ medizin ebenfalls bei Herz-/Kreislaufbeschwerden eingenommen werden. Die meist an C. laevigata durchgeführten Un­ tersuchungen über die Inhaltsstoffe haben ergeben, daß alle Pflanzenteile von Crataegus eine Vielzahl von Inhaltsstoffen aus den verschiedensten Stoffgruppen aufweisen (vgl. F. Hoffmann, Pharmaceutica Acta Helvetiae 36 (1961) 30-39; B. Lay, "Zur Chromatographie von Pimpinella major, Panax Ginseng, Crataegus oxyacantha, Tussilago farfara und Mentha piperita", Dissertation 1965, Ludwig-Maximilians-Universität München; N. Nikolov et al., "Recent investigations of crataegus flavonoids" in L. Farkas, M. Gäbor, F. Kállay, H. Wagner (Herausgeber), Elsevier Scientific Publishing Com­ pany, Amsterdam 1982, 325-344; M. Schüssler, "Invitro-Untersuchungen zur Pharmakologie von Flavonoiden aus den offizinellen Crataegus Spezies und ihre analytische Charakterisierung", Dissertation 1995, Philipps-Universität Mar­ burg; R. Kaul, "Der Weißdorn", a. a. O.).

Crataegus hat eine eindeutige Herz-/und Kreislaufwirkung. Die zahlreichen Untersuchungen sind ausführlich von Ammon et al. zusammengefaßt (H. P. T. Ammon et al., "Crataegus, Toxikologie und Pharmakologie, Teil I: Toxizität", Planta medica 43 (1981) 105-120; H.P.T. Ammon et al., "Crataegus, Toxikologie und Pharmakologie, Teil II: Pharma­ kodynamik", Planta medica 43 (1981) 209-239; H. P. T. Ammon et al., "Crataegus, Toxikologie und Pharmakologie, Teil III: Pharmakodynamik und Pharmakokinetik", Planta medica. 43 (1981) 313-322; die Arbeiten von Ammon et al. dien­ ten auch als Grundlage für die Monographie in Bundesanzeiger Nr. 1 vom 03.01.1984, berichtigt in Bundesanzeiger Nr. 85 vom 05.05.1988 und erneut durch die Monographie im Bundesanzeiger S. 7360 vom 19. Juli 1994 "Crataegi flos (Weißdornblüten), Crataegi folium (Weißdornblätter), Crataegi folium cum flore (Weißdornblätter mit Blüten), Crataegi fructus (Weißdornfrüchte)"). Die Arzneimittelzulassung attestiert Crataegus positiv inotrope, chronotrope, dromotrope und negativ bathmotrope Eigenschaften sowie eine Zunahme der Coronar- und Myokarddurchblutung. Als Indikationen gelten nachlassende Leistungsfähigkeit des Herzens und leichte Formen bradykarder Herzrhythmusstörungen.

In einer Arbeit von Fotsis et al. (Cancer Research 57 (1997) 2916-2921) wurden die antiproliferativen Eigenschaften einzelner Flavonoide, von denen z. B. Luteolin Inhaltsstoff auch von Crataegus ist, untersucht. Es konnte gezeigt wer­ den, daß Luteolin einen inhibierenden Effekt auf die Proliferation menschlicher Neuroblastom- und Brustkarzinomzellen hat. Es wurde aber gleichzeitig festgestellt, daß es, wie auch andere, schon bekannte Chemotherapeutika, auch humane Fibroblasten, Keratinozyten und Endothelzellen, d. h. also physiologischerweise proliferierende Zellen, die natürlicher­ weise im menschlichen und tierischen Organismus vorkommen, in ihrer Proliferation hemmt. Dabei lagen die jeweils zur Inhibierung erforderlichen halbmaximalen Konzentrationen für die Tumorzellen und die physiologischen Zellen im sel­ ben Bereich. Das bedeutet, daß die Verwendung von Flavonoiden als Einzelsubstanzen in wirksamen Konzentrationen dieselben unerwünschten Wirkungen hat, wie sie eingangs für alle bekannten Chemotherapeutika erwähnt wurden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nunmehr überraschenderweise festgestellt, daß Zubereitungen aus Cra­ taegus, die im wesentlichen Bestandteile (d. h. Mischungen von Inhaltsstoffen) aus oberirdischen Crataegus Pflanzentei­ len umfassen, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind, gegenüber Tumorzellen cytostatisch und/oder cytotoxisch wir­ ken, die für die beschriebenen Einzelsubstanzen, d. h. isolierte Flavonoide, beobachtete antiproliferative Wirkung auf sich physiologischerweise teilende Zellen (und die daraus resultierenden unerwünschten Wirkungen, Monographie im Bundesanzeiger S. 7360 vom 19. Juli 1994) nicht aufweisen. Insbesondere führt auch die langfristige, hochdosierte App­ likation von solchen Crataeguszubereitungen nicht zur Schädigung von sich physiologischerweise häufig teilenden Zel­ len, wie insbesondere z. B. Keratinozyten, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen, Stammzellen der Blutbildung (hä­ matopoetisches System) und Keimzellen (I. Bauer und U. Hoelscher, "Crataegus", a. a. O.).

In Arbeiten von Sáenz et al. (Zeitschrift für Naturforschung 52c (1997) 42-44) wurden cytotoxische Effekte von He­ xan-Extrakten aus Crataegus sowie von daraus erhaltenen Triterpen-angereicherten Fraktionen beschrieben. Die cytoto­ xische Wirkung wurde von den Autoren auf Triterpen-Verbindungen zurückgeführt.

Wie im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt werden konnte, weisen die erfindungsgemäß verwendeten Zube­ reitungen aus Crataegus überraschenderweise ein breiteres Wirkungsspektrum als Hexan-Extrakte auf. Während hydro­ phobe Hexan-Extrakte gegenüber einer Vielzahl verschiedener Tumorzellinien keine oder nur geringe cytotoxische Wir­ kung zeigen, weisen die Zubereitungen, die im wesentlichen in polaren Lösungsmitteln lösliche Bestandteile umfassen, gegenüber allen untersuchten Tumorzellinien eine cytostatische und/oder cytotoxische Wirkung auf, wobei die Inhibie­ rung der Zellproliferation bei den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung deutlich ausgeprägter ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kommen zur Herstellung pharmazeutischer Präparate bzw. von Nahrungser­ gänzungsmitteln sämtliche Crataegus-Spezies, insbesondere die oben genannten, in Frage, wobei alle oberirdischen Pflanzenteile, insbesondere Blätter (folii), Blüten (flores), Früchte (fructus) als auch deren Gemische (z. B. folium cum flores), verwendet werden können.

Die Herstellung der Zubereitungen kann nach allen, dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen, die zur Herstellung von Phytopharmaka eingesetzt werden, wie z. B. Auspressen (Preßsaft), Mazeration, Bewegungsmazeration, Schüttel­ mazeration, Digestion, Bewegungsdigestion, (erschöpfende) Perkolation, Soxhlet-Extraktion, Evakolation, Rekolation, Wirbelextraktion, Ultra-Turrax-Extraktion, Ultraschallextraktion, Verfahren mit Vor- und/oder Nachlaufkonzentrierung, Gegenstromverfahren und auch neuere Verfahren, wie z. B. Extraktion mit Flüssigkeiten bzw. überkritischen Flüssigkei­ ten oder Gasen ohne oder mit anschließender Aufreinigung, wie z. B. durch Filtration, Dekantieren, Sedimentieren, Zen­ trifugieren, Adsorbieren, Fällen, Chromatographieren, etc. (vgl. z. B.: J. Ploschke, "Extraktion" in E. Nürnberg, P. Sur­ mann (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 2, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin 1991, 403-411; J. Ziegenmeyer, "Zubereitungen aus Pflanzen und Drogen" in E. Nürnberg, P. Surmann (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 2, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin 1991, 1015-1032; R. Voigt, "Durch Drogenextraktion gewonnene Arzneiformen" in Pharmazeutische Technologie, 8. Auflage, Ullstein Mosby Verlag, Ber­ lin, 1995, 525-552); Monographie "Weißdornfluidextrakt" Deutsches Arzneibuch 10 (DAB 10), 2. Nachtrag von 1993, Amtliche Ausgabe, Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart; Monographie "Crataegi Extractum Siccum Normatum" der Pharmakopoea Helvetica VII). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können diese Herstellungsverfahren sowohl im größeren "technischen" Maßstab, d. h. z. B. durch einen Arzneimittelhersteller, erfolgen als auch im Rahmen von Ein­ zelzubereitungen, z. B. durch den Apotheker. Erfindungsgemäß ist ferner die Zubereitung von Aufgüssen eingeschlos­ sen, wobei die o. g. Crataegus-Pflanzenteile dazu eingesetzt werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Crataegus-Zubereitung ein Extrakt, der durch Extrak­ tion mit Wasser, Alkohol, Essigsäure, Likörwein, einem überkritischen Gas, einer überkritischen Flüssigkeit oder Mi­ schungen davon als Extraktionsmittel erhältlich ist.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Zubereitung ein Preßsaft. Es hat sich gezeigt, daß Preß­ säfte von Crataegus, die im wesentlichen hydrophile Bestandteile enthalten (vgl. I. Bauer und U. Hoelscher, "Crataegus" in R. Hänsel, K. Keller, H. Rimpler, G Schneider (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 4, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin 1992, 1040-1062 und J. Ziegenmeyer, "Zubereitungen aus Pflanzen und Drogen" in E. Nürnberg, P. Surmann (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 2, 5. Auflage, Springer Verlag, Berlin 1991, 1015-1032), ebenfalls besonders geeignet sind. Preßsäfte werden vorzugsweise aus den oberirdi­ schen Pflanzenteilen, bevorzugt den Früchten, hergestellt.

Werden erfindungsgemäß Preßsäfte verwendet, können sie entweder unmittelbar als pharmazeutisches Präparat oder als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt werden oder mit hierfür geeigneten Flüssigkeiten oder Lösungen, vorzugs­ weise Wasser, wäßrigen Salzlösungen, Ethanol, Sirups oder Weinen (Medizinalweinen) oder Mischungen davon, ver­ dünnt werden. Desweiteren können weitere, dem Fachmann geläufige Zusätze, z. B. aus Gründen der Galenik, zur Kon­ servierung, zur Verbesserung von Geruch, Geschmack und Aussehen, zur Verbesserung der jeweils angestrebten Phar­ makokinetik oder Pharmakodynamik oder aus anderen Gründen hinzugefügt werden. Die Preßsäfte können auch durch dem Fachmann bekannte Verfahren aufkonzentriert werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Extrakten bevorzugt, die mit pola­ ren Extraktionsmitteln erhältlich sind, d. h. mit Extraktionsmitteln, die im wesentlichen polare Inhaltsstoffe von Cratae­ gus in den Extrakt überführen. In diesem Zusammenhang sind wäßrige und/oder alkoholische Extrakte, sowie Extrakte hergestellt mit überkritischen Flüssigkeiten oder Gasen unter Bedingungen, die polare Bestandteile aus den Pflanzentei­ len in den Extrakt überführen, besonders bevorzugt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann jeder Alkohol, der mit Wasser mischbar ist und dessen wäßrige Lösung als Auszugsmittel zur erfindungsgemäß verwendeten Zusammenset­ zung der Extrakte führt, eingesetzt werden. Im Falle alkoholischer Extrakte kommen als Extraktionsmittel insbesondere niedere aliphatische Alkohole mit ein bis zehn, vorzugsweise mit ein bis sechs C-Atomen in Frage, insbesondere Alko­ hole aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol, und/oder Hexanol einschließlich ih­ rer Isomere und Mischungen derselben. Die Fluidextrakte können z. B. mit niederen Alkoholen (bevorzugt C1-C6) mit Wasser, mit wäßrigen alkoholischen Lösungen, mit verdünnter Essigsäure, mit Likörweinen oder mit anderen Auszugs­ mitteln, die polare Bestandteile aus den Pflanzen in den Extrakt überführen aus oberirdischen Pflanzenteilen gewonnen werden oder als Preßsaft bevorzugt aus Früchten erzeugt werden.

Neben Wasser, Alkohol(en) und anderen Auszugsmitteln als solche, die polare Bestandteile aus den Pflanzen in den Extrakt überführen, kann die Extraktion auch mit einer Mischung aus den genannten Auszugsmitteln erfolgen; insbeson­ dere ist als Extraktionsmittel eine Mischung aus Alkohol und Wasser, wobei eine Alkohol/Wasser-Mischung mit einem Anteil von 10 bis 99 Vol.-% Alkohol bevorzugt ist. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Extraktionsmittel eine Alkohol/Wasser-Mischung mit einem Anteil von 15 bis 95 Vol-% Alkohol.

Werden erfindungsgemäß Fluidextrakte verwendet, können sie entweder unmittelbar als pharmazeutisches Präparat oder als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt werden oder mit hierfür geeigneten Flüssigkeiten oder Lösungen, vor­ zugsweise Wasser, wäßrigen Salzlösungen, Ethanol, Sirups oder Weinen (Medizinalweinen) oder Mischungen davon, verdünnt werden. Desweiteren können weitere Zusätze, z. B. aus Gründen der Galenik, zur Konservierung, zur Verbes­ serung von Geruch, Geschmack und Aussehen, zur Verbesserung der angestrebten Pharmakokinetik oder Pharmakody­ namik oder aus anderen Gründen hinzugefügt werden. Die Fluidextrakte können auch nach bekannten Methoden aufkon­ zentriert werden, z. B. zum Extractum spissum.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kommt ferner die Verwendung von Trockenextrakten in Frage, die durch Ent­ fernen (z. B. durch Eindampfen unter vermindertem Druck oder andere dem Fachmann geläufige Verfahren) des Extrak­ tionsmittels (z. B. im Falle von Fluidextrakten) oder des Lösungsmittels (z. B. im Falle von Preßsäften) und anschlie­ ßende Trocknung (wie z. B. durch Lyophilisation, Sprühtrocknung oder andere dem Fachmann geläufige Verfahren) er­ hältlich sind (vgl. J. Ziegenmeyer, "Zubereitungen aus Pflanzen und Drogen", a. a. O., und R. Voigt, "Durch Drogenex­ traktion gewonnene Arzneiformen", a. a. O.). Die Entfernung des Extraktions- oder Lösungsmittels ist insbesondere dann erwünscht, wenn es sich als solches nicht oder nur in sehr eingeschränktem Maße zur Applikation bei Mensch oder Tier eignet. Der Trockenextrakt kann als solcher angewendet werden oder anschließend, soweit es erwünscht ist, wieder in ei­ nem geeigneten Medium, insbesondere in einer physiologisch verträglichen Flüssigkeit aufgelöst, emulgiert, dispergiert oder suspendiert werden, wobei zur Herstellung der Lösung, Emulsion, Dispersion bzw. Suspension Wasser, wäßrige Salzlösungen, Ethanol, Weine (Medizinalweine) sowie andere Lösungsmittel, die besonders die polaren Bestandteile der Extrakte in einen im Hinblick auf die gewählte Galenik und unter dem Gesichtspunkt der Pharmakokinetik geeigneten Zustand überführen oder Mischungen der genannten Flüssigkeiten bevorzugt sind. Bei Aufnahme in Ethanol eignet sich vorzugsweise die Aufnahme der Trockenextrakte in wäßrigem Ethanol einer Konzentration von 15 bis 75 Vol.-%.

Dem Trockenextrakt als solchen oder nach Herstellung einer Lösung, Dispersion, Emulsion bzw. Suspension ange­ wendet, können geeignete Zusätze beigemischt werden, z. B. zur Verdünnung oder aus Gründen der Galenik, zur Kon­ servierung, zur Verbesserung von Geruch, Geschmack und Aussehen, zur Verbesserung der angestrebten Pharmakokine­ tik oder Pharmakodynamik oder aus anderen Gründen.

Erfindungsgemäß können die genannten Zubereitungen entweder einzeln als auch in Form von Mischungen bzw. Kombinationen aus den genannten Zubereitungen, insbesondere aus den genannten Pflanzenteilen, Fluidextrakten, Preß­ säften, Trockenextrakten usw. hergestellt werden. Dabei können z. B. Extrakte, die mit unterschiedlichen Extraktions­ mitteln und/oder aus unterschiedlichen Pflanzenteilen gewonnen wurden miteinander gemischt werden, wie z. B. ein et­ hanolischer Trockenextrakt aus Blättern und Blüten gelöst in einem Preßsaft aus Früchten.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die verwendete Zubereitung ein Extrakt, der dadurch er­ hältlich ist, daß man Pflanzenteile von Crataegus zunächst mit einem lipophilen Lösungsmittel, wie z. B. Hexan, Heptan oder dergleichen, extrahiert und anschließend in einem weiteren Schritt entweder aus den so behandelten Pflanzenteilen einen Preßsaft herstellt oder die so behandelten Pflanzenteile mit einem der oben genannten polaren Auszugsmittel be­ handelt, um im wesentlichen die in diesen Lösungsmitteln löslichen Bestandteile aus den Pflanzen in den Extrakt zu überführen. Mit anderen Worten kann die Zubereitung im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Extrakt sein, der aus Crataegus-Pflanzenteilen erhältlich ist, die vor der Extraktion mit dem polaren Extraktionsmittel zunächst, d. h. in einem vorgeschalteten Schritt, einer Extraktion mit einem lipophilen Extraktionsmittel unterzogen wurden.

Die erfindungsgemäß zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen verwendeten Zubereitungen sind vorzugsweise hinsichtlich ihres Wirkstoffgehalts standardisiert, wobei als sogenannte Leitsubstanzen für das erfindungs­ gemäße Vorhandensein von Bestandteilen, die sich in polaren Lösungsmitteln lösen, Flavonoide dienen, bevorzugt Hy­ perosid nach Deutsches Arzneibuch 10, Grundlfg. 1991 (DAB 10) "Weißdornblätter mit Blüten" oder DAB 10 - 2. Nach­ trag 1993, "Weißdornfluidextrakt" oder Vitexin oder eine Mischung aus Vitexin und Hyperosid nach Note Technique Pro Pharmacopoea (NTPP) 708/709 "Extrait d'Aubepine" (sec) oder Procyanidine als Cyanidinchlorid nach Deutscher Arz­ neimittel Codex 86 (DAC 86), 4. Ergänzung 1992, oder auf Epicatechin nach der Monographie im Bundesanzeiger S. 7360 vom 19. Juli 1994.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthalten die erfindungsgemäß verwendeten Extrakte etwa 0,1 bis 13 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,2 bis 6,5 Gew.-% und besonders bevorzugt etwa 0,24 bis 4,0 Gew.-% Fla­ vonoide und/oder etwa 0,05 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,1 bis 5,0 Gew.-% und besonders bevorzugt etwa 0,2 bis 3,0 Gew.-% Procyanidine.

Die Zubereitungen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Mitteln, insbesondere von pharmazeutischen Zubereitungen und Nahrungsergänzungsmitteln zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkran­ kungen, d. h. von malignen oder semi-malignen neoplastischen Erkrankungen und Präkanzerosen beim Menschen und beim Tier, verwendet.

Insbesondere eignen sich die Zubereitungen zur Prophylaxe und Therapie von Tumorerkrankungen aus der Gruppe der Präkanzerosen, der Karzinome, Sarkome (incl. der Leukämien und Lymphome), Teratome, Blastome und Mischtu­ moren; hier wiederum insbesondere von Colonkarzinomen und Rektumkarzinomen und anderen neoplastischen Erkran­ kungen des Verdauungstraktes inklusive seiner Anhangsorgane (insbesondere von Mundhöhle, Speiseröhre, Magen, Darm, Leber, Gallenblase und des Pankreas), von Nierenkarzinomen und anderen neoplastischen Erkrankungen des Uro­ genitalsystems (hier insbesondere von Ovar, Cervix, Uterus, Blase, Prostata und Hoden), von Osteosarkomen und ande­ ren Sarkomen (insbesondere Fibro-, Leiomyo-, Rhabdomyo- und Liposarkomen und Leukämien und Lymphomen) und anderen neoplastischen Erkrankungen des Stützapparates, von Melanomen und anderen neoplastischen Erkrankungen der Haut, Schleimhäute und ihrer Anhangsorgane, von Glioblastomen und anderen neoplastischen Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems einschließlich seiner Stützgewebe sowie von neoplastischen Erkrankungen des Atmungstraktes (hier insbesondere von Larynx, Pharynx, Bronchien und Alveolarzellen), der Brust (Mamma), Schild­ drüse und Nebenschilddrüse und von Mischtumoren.

Die erfindungsgemäße Verwendung von Zubereitungen, die überwiegend oder im wesentlichen Bestandteile von Cra­ taegus enthalten, die sich in polaren Lösungsmitteln lösen, weisen den Vorteil auf, daß wesentliche unerwünschte Neben­ wirkungen für sie bisher nicht bekannt sind.

Da für solche Crataegus-Extrakte bislang keine gravierenden Nebenwirkungen bekannt sind, ist die Dosierung nicht kritisch, so daß die Extrakte ggf. auch aufkonzentriert werden können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen im allge­ meinen die üblicherweise bei Herz-/Kreislaufkrankheiten verwendete Dosierung der Extrakte gewählt werden, also etwa 0,1 bis 1,8 g Trockenextrakt/Tag oder 0,5 bis 100 g Fluidextrakt/Tag oder etwa 0,1 bis 11 Tee/Tag oder etwa 1,0 bis 100 g Saft/Tag. Eine Erhöhung der Dosierung ist jedoch infolge der guten Verträglichkeit der Crataegus-Zubereitungen, die be­ reits im Rahmen der Behandlung von Herz-/Kreislauferkrankungen nachgewiesen wurde, denkbar.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Tumorerkrankungen, die eine oben genannte Zubereitung umfaßt, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthält, die sich in polaren Lö­ sungsmitteln lösen, wobei die Mittel entweder pharmazeutische Präparate, Nahrungsergänzungsmittel, Zusätze zu Nah­ rungsergänzungsmitteln oder Zusätze zu Lebensmitteln sind. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung können diese Mittel auch in einer Form zur Herstellung von Aufgüssen vorliegen, z. B. als Tees.

Aufgrund der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigten cytostatischen und cytotoxischen Effekte eröffnen diese Zubereitungen eine neue therapeutische Anwendung. Mit der erfindungsgemäßen Verwendung der Zubereitungen ist man somit in der Lage, die bisher noch nicht endgültig befriedigenden Therapiemaßnahmen gegen (semi-)maligne neoplastische Erkrankungen zu ergänzen oder zu ersetzen. Insbesondere aufgrund ihrer außerordentlich guten Verträg­ lichkeit ist die Verwendung der oben genannten Crataegus-Extrakte und -Preßsäfte nicht nur in der Therapie, sondern auch in der primären (also schon vor dem Auftreten einer Erkrankung) und sekundären (also zur Verhinderung eines Re­ zidivs oder eines Zweittumors nach Therapie) Prophylaxe dieser Erkrankungen möglich.

Es eignen sich die Zubereitungen aus Crataegus aufgrund ihrer cytostatischen und/oder cytotoxischen Wirkung auf (semi-)maligne neoplastische Zellen/Tumore von Mensch und Tier zur Anwendung bei der Primär- und Sekundär-Pro­ phylaxe sowie der Therapie (adjuvantiv, palliativ oder u. U. auch alleinstehend als wesentliche Wirksubstanz (semi-)ma­ ligner neoplastischer Erkrankungen bei Mensch und Tier, wobei die Zubereitungen auch in Kombination mit anderen Phytopharmaka oder in Kombination mit chemisch definierten Substanzen, d. h. z. B. mit bekannten Chemotherapeutika (Cytostatica und/oder Cytotoxica oder auch anderen Pharmaka) oder Nahrungsergänzungsstoffen oder mit Lebensmit­ teln möglich sind.

Die erfindungsgemäßen Mittel können für die äußerliche oder innerliche Anwendung formuliert sein. Bei der äußerli­ chen Anwendung können sie zur Applikation direkt auf den Tumor, transdermal oder okkular genutzt werden. Die inner­ liche Anwendung kann enteral oder parenteral erfolgen. Erfolgt sie parenteral kann sie insbesondere durch Inhalation, durch Infusion, durch subkutane oder intramuskuläre oder intravenöse Injektion, intravaginal, intrauterin, rectal, intrau­ rethral oder intravesikal sowie durch direkte Injektion in den Tumor, das betroffene Gewebe oder Organ erfolgen. Die er­ findungsgemäß verwendeten Crataegus-Zubereitungen werden der jeweils gewählten Applikationsform entsprechend formuliert. Als Arzneiformen kommen daher z. B. Inhalationslösungen, Aerosole, Stäube, Nebel, Instanttees, Teeaufbe­ reitungen, Aufgüsse, Abkochungen oder Mazerate sowie Schäume, Mixturen, Schüttelmixturen, Pulver, Puder, Tablet­ ten, Dragees, Granulate, Kapseln (auch Mantel-, Mehrschichttabletten oder Mischgranulate), Augenarzneien, Schleim­ hautadhäsiva, Pflaster, Säfte, Tinkturen, Weine, Lotionen, Lösungen, Essenzen, Suspensionen, Emulsionen, Pasten, Sal­ ben, Cremes, Gele, spezielle Verbandauflagen, Adhäsionsverbände, Suppositorien (Zäpfchen), Arzneistäbchen, Pellets oder implantierbare Arzneiformen (wie Pumpenfüllungen) usw. in Betracht. Insbesondere kommen auch besondere ga­ lenische Zubereitungen wie Liposomen oder überzogene Tabletten, Mikroemulsionen und Nanopartikel in Frage, ein­ schließlich galenischer Zubereitungen, die eine besonders schnelle oder verzögerte Freisetzung (Depotformen) sowie Kombinationen davon umfassen (R. Voigt, "Pharmazeutische Technologie", 8. Auflage, Ullstein Mosby Verlag, Berlin 1995; T. Wimmer et al. "Arzneiformen" in E. Nürnberg, P. Surmann (Herausgeber), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 2, 5; Auflage, Springer Verlag, Berlin 1991, 622-1047).

Ferner kommt im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Crataegus-Pflanzenteilen, z. B. in Form von Tee, zur Herstellung von Aufgüssen in Betracht.

Die Zubereitungen, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthalten, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung entweder als pharmazeutisches Präparat (d. h. als Arzneimittel) oder als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben.

Mit den nachfolgend beschriebenen Beispielen wurden die Wirkungen verschiedener Extrakte aus Pflanzen der Spe­ zies Crataegus auf das Wachstumsverhalten und das Überleben von Tumorzellen untersucht.

Beispiele Material und Methoden Crataegus-Zubereitungen

Im Rahmen der vorliegenden Beispiele wurden als Crataegus-Zubereitungen unter Verwendung der Blätter (folii), Blüten (flores) und/oder Früchten (fructus) Extrakte und Preßsäfte hergestellt. Folgende Crataegus-Arten wurden bei­ spielhaft eingesetzt:
Folia cum flore Crataegi nach DAB 10, Grundlfg. 1991 "Weißdornblätter mit Blüten": Crataegus monogyna, Crataegus laevigata (Synonym: oxyacantha) sowie Crataegus nigra, Crataegus pentagyna und Crataegus azarolus; Fructus Crataegi nach DAC 86, 4. Ergänzung 1992 "Weißdornbeeren": Crataegus monogyna, Crataegus laevigata (Synonym: oxyacantha) oder deren Mischungen, mit fremden Bestandteilen höchstens 2% insbesondere Früchte anderer Crataegus-Arten (Cra­ taegus nigra, Crataegus pentagyna und Crataegus azarolus).

Die Extraktionsverfahren variierten von Mazeration über Digestion, (erschöpfende) Perkolation bis hin zur Soxhlet- Extraktion. Die jeweilige Konzentration der Auszugsmittel und die einzelnen ausgezogenen Pflanzen(-teile) sind in der Tabelle 3 aufgeführt.

Die Herstellung der Preßsäfte erfolgte nach dem Fachmann bekannten Vorschriften (J. Ziegenmeyer, "Zubereitungen auf Pflanzen und Drogen", a. a. O. und R. Voigt, "Pharmazeutische Technologie", a. a. O.).

Die Herstellung der Extrakte erfolgte unter Verwendung der folgenden Extraktionsmittel:
Wasser,
wäßriges Ethanol: 45%ig, 50%ig, 60%ig, 70%ig
wäßriges Methanol: 70%ig
Hexan (als Vergleich).

Teeaufgüsse wurden hergestellt durch Übergießen von jeweils 2 g fein geschnittener Pflanzendroge mit 150 ml ko­ chendem Trinkwasser. Nach Inkubation über 15 Minuten wurde durch einen Teefilter gesiebt. Das Produkt wurde unter Anlage von Vakuum bei 50°C eingedampft, und die erhaltene Trockensubstanz wurde in Wasser gelöst.

Der in Wasser gelöste, mit Wasser als Auszugsmittel hergestellte Extrakt von Crataegus folium cum flore (d. h. Extrakt hergestellt aus Blättern und Blüten von Crataegus nach DAB 10 "Weißdornblätter mit Blüten") wurde in einem weiteren Experiment zusätzlich mit reinem Hexan ausgeschüttelt, um alle lipophilen Bestandteile, die in Hexan löslich sind, zu entfernen. Das Ausschütteln erfolgte nach folgendem Schema: einmal mit dem selben Volumen und anschließend zwei­ mal mit dem neunfachen Volumen Hexan, so daß sich eine Reduktion der in Hexan und Wasser gleichsam löslichen Sub­ stanzen in der wäßrigen Phase auf 1/200 ergab. Lipophilere Substanzen, die sich besser in Hexan als in Wasser lösen, ver­ blieben in einer weit niedrigeren Restkonzentration als 1/200 in der wäßrigen Phase.

Als Endkonzentration des gesamten Extraktes wurden 200 µg/ml angestrebt. Die Crataegus-Extrakte, die auf Fla­ vonoide (Hyperosid nach DAB 10, Grundlfg. 1991 "Weißdornblätter mit Blüten" oder DAB 10, 2. Nachtrag 1993 "Weiß­ dornfluidextrakt" oder Vitexin oder eine Mischung aus Vitexin und Hyperosid nach NTPP 708/709 "Extrait d'Aubepine" (sec)) oder Procyanidine (Cyanidinchlorid nach DAC 86, 4. Ergänzung 1992) als Leitsubstanz standardisiert waren, wur­ den so gelöst, daß die Konzentration der Leitsubstanz in dem Endansatz konstant war. Im Fall von Flavonoiden waren dies 4,4 µm/ml, bei Procyanidinen 2,6 µm/ml. Bei einem Abweichen der Leitsubstanzkonzentration im Trockenextrakt von 2,2% Flavonoiden bzw. 1,3% Procyanidinen wurde entsprechend mehr oder weniger Extrakt eingesetzt, die End­ konzentration der Leitsubstanz blieb konstant. Alle Lösungen wurden unmittelbar vor dem Verdünnen in Zellkulturme­ dium und Zugabe zur Zellkultur durch 0,2 µm Spritzenfilter sterilfiltriert.

Die Extrakte (Trockenextrakte, wenn nicht anders erwähnt) wurden mit verschiedenen, in Tabelle 1 angegebenen Ver­ fahren gewonnen:

Tabelle 1

Zum Vergleich wurde Crataegus entsprechend der Vorschrift von M. T. Sáenz et al. (a. a. O.) mit Hexan als Auszugs­ mittel extrahiert. Der Extrakt wurde unter Vakuum bei 50°C eingedampft und anschließend in 8%iger Tween® 80 Lösung (Polyoxyethylensorbitanmonooleat) gelöst.

Die Standardisierung der Trockenextrakte auf die jeweils in der Tabelle 3 genannten Leitsubstanzen erfolgte durch Mi­ schen von Trockenextrakten mit unterschiedlichem Gehalt an der jeweiligen Leitsubstanz oder durch Zugabe von Hilfs­ stoffen wie SiO₂, Maltodextrin, Glucosesirup, und/oder Maisstärke. Diese Substanzen hatten in den eingesetzten Kon­ zentrationen keinen Einfluß auf das Wachstum der untersuchten Zellen oder die Meßergebnisse.

Zellinien

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden als Beispiele fünf menschliche Tumorzellinien (vier Karzinomzellrei­ hen, eine Sarkomzellinie) und eine tierische Karzinomzellinie (vgl. Tab. 2) untersucht. Alle Zellinien wurden in perma­ nenter Zellkultur in Zellkulturflaschen mit 75 cm² Bodenfläche gehalten. Sie wurden einmal wöchentlich passagiert und erhielten zweimal wöchentlich Mediumwechsel. Zu Versuchsbeginn (Tag 0) wurden die Zellen in Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (96 wells plates) mit der in Tabelle 2 angegebenen Dichte in jeweils 100 µl Medium pro well (= 0,32 cm²) ausgesät. An den Tagen 1 und 4 erhielten alle Zellen Mediumwechsel und nach dem Mediumwechsel am Tag 4 begann unmittelbar die Inkubation mit den Wirksubstanzen (Crataegus-Zubereitungen, Gentiana, Superoxid-Dismutase, 5-Fluorouracil und Methotrexat; s. u.) bzw. den Lösungsmitteln als Kontrollen. Die Messung der Effekte der Wirksub­ stanzen erfolgte am Tag 7 (also nach 72stündiger Inkubation) mit zwei unterschiedlichen Methoden, dem sogenannten MTT-Assay bzw. dem SRB-Assay (siehe Tab. 2).

Tabelle 2

Legende zu Tab. 2

EMEM: Minimum Essential Medium, DMEM: Dulbecco's modified Eagle Medium, McCoy's 5a: Zellkulturmedium;
FCS: Fetales Kälberserum, NEAA: nicht essentielle Aminosäuren, Napyr: Natriumpyruvat; allen Medien waren 36 U/ml Penicillin und 36 µm/ml Streptomycin zugesetzt; MTT: colorimetrischer Assay zur Zellenzymaktivitätsbestimmung (s. u.), SRB: Suforhodamine B - Assay zur Zellproteingehaltbestimmung (s. u.).
MTT-Assay: Der MTT-Assay (T. Mossman, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63) basiert auf der Messung der meta­ bolischen Aktivität lebender Zellen. Den Zellen wird die Substanz 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli­ umbromid (MTT) angeboten, die sie intrazellular zu dem wasserunlöslichen Farbstoff Formazan reduzieren. Diese Re­ duktion findet nur in metabolisch aktiven Zellen statt, so daß dieser Assay ausschließlich lebende Zellen detektiert. Zum Meßzeitpunkt wird zu den Zellen in 100 µl Medium je 100 µl MTT-Lösung (4 mg/ml PBS, phoshate buffered saline) ge­ geben. Anschließend findet bei 37°C eine zweistündige Inkubation statt. Danach wird das Medium abgesaugt, so daß die am Zellboden haftenden, gefärbten, lebenden Zellen zurückbleiben. Diese und der Farbstoff werden mit 100 µl DMSO (Dimethylsulfoxid) innerhalb von 5 Minuten unter kräftigem Schütteln gelöst. Anschließend wird die Extinktion bei 570 nm photometrisch bestimmt. Ihre Linearität im hier benutzten Bereich, wie auch ihre Korrelation zur Anzahl der le­ benden Zellen (unter dem Mikroskop ausgezählt) wurde in Vorversuchen nachgewiesen. Die jeweiligen photometrischen Kontrollen erhielten anstelle der MTT-enthaltenen Lösung die selbe Menge PBS ohne MTT. Zur Auswertung wurde ΔE bestimmt durch Subtraktion der Extinktion in den Kontrollen mit PBS von den Meßwerten mit MTT.
SRB-Assay: Der SRB-Assay (P. Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst. 82 (1990) 1107-1112) beruht auf einer Bindung des Farbstoffes Sulforhodamin B (SRB) an basische Proteine. Das Prinzip sieht vor, mit Hilfe von Trichloressigsäure die am Kulturgefäßboden haftenden Tumorzellen zu fixieren und im Anschluß daran ihr Protein zu färben. Diese Färbung wird dann ebenfalls photometrisch bestimmt. Nichtlebende Zellen zeichnen sich dadurch aus, daß sie sich zunächst vom Zell­ kulturboden lösen und sich dann in dem Kulturmedium auflösen. So mißt diese Methode ebenfalls nur die lebenden Zel­ len in einer Zellkultur. Die in 100 µl Medium wachsenden Zellen werden zunächst durch die Überschichtung mit 25 µl 50%iger, 4°C kalter Trichloressigsäure fixiert. Nach einstündiger Inkubation bei 4°C werden alle nicht-fixierten Bestand­ teile entfernt und die zurückgebliebenen fünfmal mit Wasser gespült. Nach Lufttrocknung erfolgt die Zugabe von 200 µl 0,4%iger Sulforhodamin B-Lösung in 1%iger Essigsäure, bzw. in den photometrischen Kontrollen nur die Zugabe der Essigsäure.

Nach 30minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Farbstofflösung ausgegossen und die Kultur viermal mit 1%iger Essigsäure gespült. Nach Entfernung der Spüllösung und Trocknung wird der an den basischen Proteinen haf­ tende Farbstoff in 100 µl 10 mM TrisBase (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) innerhalb von 5 Minuten gelöst. Die Ex­ tinktion wurde bei 570 nm bzw., wenn die OD (optische Dichte) außerhalb des linearen Bereichs lag, bei 492 nm (bei CMT-93 Zellen) gemessen. Zur Auswertung wurde ΔE bestimmt durch Subtraktion der Extinktion in den Kontrollen mit Essigsäure von den Meßwerten mit SRB.

Ergebnisse

Die in der Tabelle 3 dargestellten Daten sind Mittelwerte aus drei einzelnen Messungen. ΔE gemessen unter der Wir­ kung der verschiedenen Prüfsubstanzen wurde zusätzlich in Prozent von ΔE der jeweiligen Lösungsmittelkontrolle dar­ gestellt. Die Kontrollzellen, die keine Prüfsubstanzen (Crataegus-Zubereitungen) sondern nur Medium oder Lösungs­ mittel erhielten, erreichten zum Meßzeitpunkt (Tag 7) 100% ihrer Dichte (Anzahl) per definitionem. Zum Zeitpunkt der Prüfsubstanzzugabe (Tag 4) hatten die Zellen bereits ca. 50% der Dichte und damit auch 50% der zu messenden ΔE schon erreicht. Das heißt, daß eine Wachstumshemmung durch die Prüfsubstanz, die zu einem ΔE Meßwert von 50% des Kontrollmeßwertes führt, bedeutet, daß eine 100%ige Wachstumshemmung (Cytostase) erreicht wurde und die Zellzahl somit ab dem Zeitpunkt der Prüfsubstanzzugabe nicht weiter zugenommen hat. Ein Meßwert von 75% bedeutet dement­ sprechend eine ca. 50%ige Hemmung des Wachstums während der Inkubation mit der Prüfsubstanz. Meßwerte, die unter 50% ΔE der Kontrolle liegen, zeigen, daß nicht nur eine vollständige Cytostase (Wachstumshemmung) stattgefunden hat, sondern darüber hinaus die Zelldichte absolut gegenüber der Zelldichte bei Zugabe der Prüfsubstanz abgenommen hat, die Prüfsubstanz also hier neben der vollständigen Cytostase auch einen Zelluntergang (cytotoxischen Effekt) aus­ gelöst hat.

Soweit nicht anders erwähnt, handelt es sich bei allen in Tabelle 3 aufgeführten Extrakten um Trockenextrakte, die in dem jeweils angegebenen Lösungsmittel gelöst wurden. Die angegebenen Lösungsmittel-Endkonzentration (Endkonz.) lagen im Versuchsansatz, also im Zellmedium vor. Die Ergebnisse aller Kontrollbedingungen sind am Ende der Tabelle 3 dargestellt.

Wäßriger Trockenextrakt aus Crataegus-Blättern und -Blüten zeigte eine deutliche cytostatische/cytotoxische Wir­ kung an SKMEL-2 und U373MG Zellen. Diese Wirkung war weitestgehend unabhängig davon, worin der Trockenex­ trakt gelöst wurde (Wasser, DMSO, 1,2-Propandiol oder Ethanol). Die Lösungsmittel selbst hatten keinen wesentlichen Eigeneffekt auf das Zellwachstum.

Crataegus-Extrakt, der mit 45%igem wäßrigen Ethanol hergestellt worden war, zeigte ebenfalls cytostatische/cytoto­ xische Wirkung auf SKMEL-2 und U373MG Zellen sowie besonders auf die zusätzlich untersuchten HT-29 und Caki-1 Zellen und auf CMT-93 Zellen. Zusätzlich wurde auch eine Hemmung des Wachstums der Osteosarkomzellen SAOS-2 erzielt. Mit 70%igem wäßrigen Ethanol gewonnener Crataegus-Extrakt, der nach Entfernen des Auszugsmittels in DMSO gelöst wurde, zeigte mit Ausnahme der geringeren Wirkung auf die Osteosarkomzellen ein identisches Wir­ kungsprofil, wie der Extrakt, der mit 45%igem Ethanol als Auszugsmittel zubereitet wurde. Auch hier hatte das Lösungs­ mittel (DMSO oder 1,2-Propandiol) keinen Einfluß auf die Wirkung des Extrakts.

Crataegus-Extrakt, der mit 70%igem Methanol als Auszugsmittel hergestellt und auf 2% Vitexin standardisiert wor­ den war, zeigte ebenfalls cytostatische/cytotoxische Aktivität an Caki-1, CMT-93, SKMEL-2 und U373MG Zellen. Da­ mit war das Wirkungsprofil demjenigen des ethanolischen Extrakts sehr ähnlich. Methanolischer Extrakt, standardisiert auf 1,41% Hyperosid, zeigte ein ähnliches Wirkungsprofil. Er hemmte zusätzlich das Wachstum von HT-29 Zellen, nicht aber das von U373MG Zellen.

Bei Teeaufguß handelt es sich um einen weiteren der möglichen Herstellungswege eines wäßrigen Extraktes. Interes­ santerweise waren die Ergebnisse hinsichtlich des Wirkungsprofils von Teeaufguß und wäßrigem Extrakt gleich.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden neben den Crataegus-Zubereitungen, die im wesentlichen Bestand­ teile von Crataegus enthalten, die sich in polaren Lösungsmitteln lösen, auch mit Hexan als Extraktionsmittel gewonnene Zubereitungen aus Crataegus, die im wesentlichen Triterpenverbindungen enthalten (M. T. Sáenz et al., a. a. O.), zum Ver­ gleich untersucht.

Hexanextrakt aus Crataegus löste sich in 8%igem Tween® 80, und im Versuchsansatz konnte die Endkonzentration von 0,32% Tween® 80 erreicht werden. Diese war also mehr als Faktor 2 niedriger als von den Autoren beschrieben (M. T. Sáenz et al., a. a. O.). Dennoch führte diese Lösungsmittelkonzentration zu einer massiven Schädigung der Zellen, mit einem Absterben auf 5 bis 22% der Kontrollzellzahl (Ausnahme: CMT-93 Zellen). Es ist somit davon auszugehen, daß auch die restlichen Zellen durch das Lösungsmittel stark vorgeschädigt wurden.

Das Wirkungsspektrum des rein lipophilen Hexan-Extraktes unterschied sich eindeutig von denen der erfindungsge­ mäß verwendeten polaren Extrakte aus Crataegus. Der Hexan-Extrakt hatte nahezu keine Wirkung auf Caki-1, HT-29 und SKMEL-2 Zellen, während die erfindungsgemäß eingesetzten Crataegus-Zubereitungen im Gegensatz dazu auf diese cytostatisch/cytotoxisch wirkten, auf die beiden letztgenannten Zellen sogar besonders stark. Das pharmazeutische Profil der Zubereitungen, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthalten, die in polaren Lösungsmitteln lös­ lich sind, unterscheidet sich somit deutlich von demjenigen der lipophilen, aus Crataegus gewonnenen Triterpenverbin­ dungen.

Zur Kontrolle dieser Ergebnisse wurde ein weiterer Vergleichsversuch durchgeführt. Dabei wurde wäßriger Trocken­ extrakt in Wasser gelöst und anschließend mit reinem Hexan ausgeschüttelt. Auf diese Weise wurden Substanzen, die in Wasser ebenso gut löslich sind wie in Hexan, auf 1/200 ihrer ursprünglichen Konzentration in der wäßrigen Phase redu­ ziert. Die Konzentrationen lipophilerer Substanzen, d. h. von Stoffen, die sich in Hexan besser lösen als in Wasser, wur­ den durch das zusätzliche Ausschütteln gegen Hexan jedoch noch erheblich weiter reduziert (s. o.).

Interessanterweise zeigte der wäßrige Extrakt auch nach dem Ausschütteln mit Hexan dasselbe Wirkungsprofil wie vorher, einschließlich der Hemmung der SKMEL-2 und U373MG Zellen. Der Effekt an SKMEL-2 Zellen wurde dabei nur minimal reduziert. Hinsichtlich der U373MG Zellen wurde die Wirkung des wäßrigen Extraktes überhaupt nicht re­ duziert.

In weiteren Vergleichsversuchen wurden Gentian-Extrakt (Gentiana lutea radix, extrahiert mit 100 g/l Wasser bei 100°C über 2 Stunden; vgl. JP-A 4-5237) und Superoxid-Dismutase aus Rindererythrozyten (JP-A 4-5237) eingesetzt, die keine cytostatischen oder cytotoxischen Effekte auf die untersuchten Zellreihen aufwiesen.

Untersucht wurden ferner Extrakte und Preßsaft aus Crataegus-Früchten (Crataegus fructus), wobei die Extrakte mit 50%igem bzw. 60%igem Ethanol oder 70%igem Methanol als Auszugsmittel hergestellt worden waren. Das Wirkungs­ profil der Trockenextrakte, die durch Extraktion mit 60%igem Ethanol oder 70% Methanol hergestellt worden waren, mit Hemmung des Wachstums der SKMEL-2 und U373MG Zellen, war vergleichbar. Der zusätzlich untersuchte Preßsaft zeigte ebenso wie auch der untersuchte ethanolische Fluidextrakt eine wachstumshemmende Wirkung auf HT-29, Caki-1 und SAOS-2 Zellen.

Als Positivkontrollen wurden ferner chemisch definierte Cytostatika untersucht. Es wurde pro Zellreihe jeweils ein Cytostatikum, daß für die jeweilige Diagnose als effektiv in der klinischen Pharmakologie beschrieben wird, eingesetzt. An vier der sechs untersuchten Zellreihen zeigten die Cytostatika eine hemmende Wirkung. Die malignen Melanom- und Glioblastomzellen wiesen gegenüber Methotrexat in der eingesetzten Konzentration hingegen Resistenz auf.

Die vorliegenden Beispiele belegen somit die Eignung der Zubereitungen, die im wesentlichen Inhaltsstoffe von Cra­ taegus enthalten, die sich in polaren Lösungsmitteln lösen, zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäß verwendeten Crataegus-Zubereitungen ein breites Wirkungsspektrum auf un­ terschiedliche Tumorzelltypen und eine mit üblichen Cytostatica/Cytotoxica vergleichbare oder sogar bessere Wirkung, wobei die Crataegus-Zubereitungen keine Nebenwirkungen aufweisen.

Claims (21)

1. Verwendung einer Zubereitung aus Crataegus zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung im wesentlichen Be­ standteile von Crataegus enthält, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung aus Blättern, Blüten und/oder Früchten von Crataegus hergestellt ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung durch Mazeration, Dige­ stion, Perkolation oder andere Extraktion erhältlich ist.

4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung ein Preßsaft ist.

5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Preßsaft aus Crataegus-Früchten hergestellt ist.

6. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung ein Extrakt ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Extrakt erhältlich ist durch Extraktion mit Was­ ser, Alkohol, Essigsäure, Likörwein, einem überkritischen Gas, einer überkritischen Flüssigkeit oder Mischungen davon als Extraktionsmittel.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel ein Alkohol aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Pentanol, und Hexanol einschließlich Isomeren und Mischun­ gen derselben ist.

9. Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Extraktionsmittel eine Alkohol/Wasser- Mischung mit einem Anteil von 10 bis 99 Vol.-% Alkohol, vorzugsweise mit einem Anteil von 15 bis 95 Vol.-% Al­ kohol ist.

10. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitungen aus Crataegus- Pflanzenteilen erhältlich ist, die vor der Herstellung der Zubereitung einer Extraktion mit einem lipophilen Extrak­ tionsmittel unterzogen werden.

11. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung ein Trockenextrakt ist, der durch Entfernen des Extraktionsmittels oder Lösungsmittels und anschließende Trocknung erhältlich ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Trockenextrakt wieder in einer Flüssigkeit aufgelöst, emulgiert, dispergiert oder suspendiert ist.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit aus der Gruppe bestehend aus Wasser, wäßrigen Salzlösungen, Ethanol, Sirups, Weinen oder Mischungen davon ausgewählt ist.

14. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung etwa 0,1 bis 13 Gew.-% Flavonoide, vorzugsweise etwa 0,2 bis 6,5 Gew.-% Flavonoide, besonders bevorzugt etwa 0,24 bis 4,0 Gew.-% Flavonoide, und/oder etwa 0,05 bis 10 Gew.-% Procyanidine, vorzugsweise etwa 0,1 bis 5,0 Gew.-% Procyanidine, besonders bevorzugt etwa 0,2 bis 3,0 Gew.-% Procyanidine, enthält.

15. Verwendung nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorerkrankungen maligne oder semimaligne neoplastische Erkrankungen sind.

16. Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Tumorerkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine in den Ansprüchen 1 bis 14 genannte Zubereitung umfaßt, die im wesentlichen Bestandteile von Crataegus enthält, die in polaren Lösungsmitteln löslich sind.

17. Mittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein pharmazeutisches Präparat ist.

18. Mittel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Nahrungsergänzungsmittel ist.

19. Verwendung von Pflanzenteilen von Crataegus zur Herstellung eines Aufgusses zur Prophylaxe und/oder Be­ handlung von Tumorerkrankungen.

20. Verwendung einer in den Ansprüchen 1 bis 14 genannten Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen.

21. Verwendung eines Aufgusses aus Pflanzenteilen von Crataegus zur Prophylaxe und/oder Therapie von Tumor­ erkrankungen.