DE19806962A1

DE19806962A1 - Markierung von Nukleinsäuren mit speziellen Probengemischen

Info

Publication number: DE19806962A1
Application number: DE19806962A
Authority: DE
Inventors: Christoph Prof Dr Dr Cremer; Michael Dr Hausmann; Thomas Prof Dr Cremer
Original assignee: Universitaet Heidelberg
Current assignee: Universitaet Heidelberg
Priority date: 1997-02-22
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 1998-10-01
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: DE19806962B4; WO1998037231A2; AU6718498A; WO1998037231A3

Description

Die Erfindung betrifft spezielle DNA-Probengemische für die spezifische Markierung von Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngiger DNA, ein Verfahren zur Markierung von doppelsträngiger DNA mittels in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Einsatz der speziellen DNA-Probengemische sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger spezieller DNA-Probengemische. Dieses Verfahren erlaubt für jede beliebige Spezies die Konstruktion spezifischer DNA-Proben für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung von DNA-Targets mit einem Durchmesser typischerweise kürzer als die minimale Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des verwendeten optischen Systems (z. B. eines Fernfeld-Mikroskops oder eines Slit-Scan Flußfluorometers) ohne thermisch, chemisch oder enzymatisch induzierte Denaturierung der Target-DNA.

Durch den Einsatz von spezifischen DNA-Proben, RNA-Proben oder PNA-Proben, d. h. von Einzelstrangmolekülketten, die entsprechende komplementäre Targetsequenzen im Genom besitzen, ist es möglich, in Zellkernen und auf Chromosomen kleine (Sub)strukturen (= Targets) zu markieren bzw. DNA-Sequenzen auf DNA-Chips (Genchips) zu erkennen. Üblicherweise werden in diese Proben Reportermoleküle eingebunden, die eine hohe Affinität zu entsprechenden Fluorochromkomplexen besitzen. Es können aber auch bestimmte Fluorochromkomplexe direkt in die Marker eingebaut werden, ggf. über einen Linker geeigneter Länge. Im folgenden werden beide erfindungsgemäßen Fluroreszenz-Markierungsverfahren auch als Markierung bezeichnet. Das zur Verfügung stehende Farbspektrum der Fluorochrome reicht über das sichtbare Spektrum bis ins infrarote. Neben dem Emissions-Spektrum kann auch die Lebensdauer der Fluoreszenzemission als Parameter zur Detektion des Markers genutzt werden. Die Eigenschaften Absorptionsspektrum, Emissionsspektrum und Fluoreszenzlebensdauer werden im folgenden als spektrale Signatur bezeichnet. Die erfindungsgemäße Detektion der durch solche Fluoreszenzmarker markierten Target-Regionen erfolgt beispielsweise durch Fernfeld-Mikroskopie (z. B. Epifluoreszenzmikroskopie, konfokale Laser-Scanning Mikroskopie, Wellenfeldmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsmikroskopie, mit oder ohne axialtomographische Ergänzungstechniken). Insbesondere zur Erfassung von 3D-Genom-Mi krostrukturen können höchstauflösende Präzisionsmikroskopietechniken eingesetzt werden.

Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit komplementären fluoreszenzmarkierten Nukleotidsequenzen werden in der Literatur als Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) bezeichnet. Die meisten bei FISH bisher eingesetzten Hybridisierungsprotokolle gehen davon aus, daß als Voraussetzung zu diesem Prozeß nicht nur die Proben-DNA, sondern auch die Target-DNA, die üblicherweise in Duplex Form vorliegt, in eine einzelsträngige Form überführt werden muß (Denaturierung). Diese Denaturierung kann entweder chemisch (z. B. durch Verwendung einer entsprechend hohen Konzentration des Lösungsmittels Formamid oder anderer chaotroper Substanzen), enzymatisch und/oder thermisch (z. B. durch Aufheizen auf Temperaturen über 70°C) erfolgen. Die anschließende Renaturierung führt dann zur Bildung hybrider Doppelstränge aus Proben- und Target-DNA (Standard-FISH).

Diese Betrachtung des Hybridisierungsmechanismus geht davon aus, daß natürliche, in der Target-DNA vorhandene einzelsträngige Abschnitte für die in situ Hybridisierung nicht ausreichend sind. Dies kann für eine Reihe von DNA-Proben als Ganzes zutreffen. So wurde z. B. festgestellt, daß bestimmte DNA-Proben nur dann an chromosomale Targets hybridisieren, wenn eine Denaturierung des Targets und der Probe vorgenommen wurde.

Es ist jedoch bekannt, daß die Bindungsfähigkeit einzelsträngiger DNA-Proben stark von der DNA-Sequenz abhängt. Aufgrund von Untersuchungen an synthetischen Nukleinsäuren konnte festgestellt werden, daß einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen mit doppelsträngigen Duplex-Nukleinsäuresequenzen eine dreisträngige Tripel-Formation bilden können, wobei im Falle von Polypyrimidin- bzw. Polypurinnukleinsäuresequenzen sich die Basen in einer Triplex-Struktur binden können. Auch gewisse gemischte Sequenzen aus Purinbasen oder Pyrimidinbasen sind bei der Tripel-Bildung zulässig.

Ferner ist bekannt, daß einzelsträngige Proben, in denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch eine Polyamidkette (PNA) ersetzt wurde, sich in einer sequenzspezifischen Weise mit doppelsträngiger DNA zu einer neuen dreisträngigen Formation verbinden können (PNA-DNA). Dies wurde jüngst zur Visualisierung bestimmter repetitiver Sequenzen durch FISH experimentell realisiert (PNA-FISH). Wegen der in diesem Falle erfolgten Elimination der elektrostatischen Abstoßungskräfte zwischen der Target-DNA und der Proben-PNA ist dieses Verfahren mit weitgehend beliebigen Basensequenzen sowie sogar in Gegenwart hoher Konzentrationen an Formamid durchführbar; es hat jedoch den Nachteil eines erheblichen Aufwandes bei der Synthese der PNA-Proben.

Auf der Basis nicht-enzymatischer in situ Hybridisierungsverfahren, die zusätzlich auf denaturierende chemische Agenzien verzichten (Fast-FISH), konnte gezeigt werden, daß für bestimmte hochrepetitive DNA-Proben die thermisch denaturierte, einzelsträngige DNA-Probe auch an das nicht denaturierte Target bei Temperaturen unter 40°C bindet; dies kann so interpretiert werden, daß sich im Markierungsbereich dreisträngige Formationen aus einzelsträngiger Proben-DNA und doppelsträngiger Target-DNA bilden. Eine andere Möglichkeit der Ausbildung von Tripelformationen aus Proben- und Target-DNA besteht in der gehäuften Bindung doppelsträngiger Proben-DNA an einzelsträngige Target-DNA in der Nachbarschaft natürlich vorkommender Tripel-Formationen der chromosomalen DNA. Derartige Hybridisierungsbedingungen, insbesondere die spezifische Anlagerung markierter, modifizierter, einzelsträngiger DNA-Sequenzen unter physiologischen Temperatur- und Pufferbedingungen zur Visualisierung der Anlagerungsorte, stellen die Voraussetzung für FISH mit Nukleinsäureproben in vitalen Zellen bzw. von nicht denaturierten DNA-Sequenzen tragenden Mikrotargets dar (Vital-FISH).

Die in vivo Fluoreszenz-Markierung entsprechender Loci im Zellkern ist bisher gelungen für: Nukleoli mit Hilfe einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung von RNA-Proben (RNA-FISH); für Zentromerregionen mit einem zentromerspezifischen Protein, das mit Hilfe eines gekoppelten "Green Fluoresceing Protein" (GFP) visualisiert wurde; für gewisse "Homogeneously Staining Regions" (HSR) mit einem Lac Operon-spezifischen GFP-ge koppelten Protein; und für ganze Chromosomenterritorien unter Ausnutzung von Replikationsmechanismen. Nachteil dieser Verfahren ist, daß sie relativ aufwendig sind und damit für Routineanwendungen nicht in Frage kommen.

Wesentlich einfachere und schnellere Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsauresequenzen stellen die verschiedenen Fluoreszenz in situ Hybridisierungsverfahren (FISH) dar. Keines der bekannten FISH Verfahren (Standard-FISH, Fast-FISH, PNA-FISH, RNA-FISH) erlaubte jedoch, mit Hilfe von DNA Proben außerhalb von chromosomalen Subregionen mit hochrepetitiver DNA vital, in vivo bzw. unter physiologischen Bedingungen (Verzicht auf Denaturierung) eine Fluoreszenzmarkierung durchzuführen, und gleichzeitig kleine und kleinste Genomabschnitte spezifisch zu markieren.

Analog ist bisher in der Mikrosensorik kein DNA-in situ Hybridisierungsverfahren bekannt, das auf eine der Targetdenaturierung vergleichbare Prozedur verzichtet.

Die derzeit verfügbaren Techniken zur Visualisierung, insbesondere durch Fluoreszenzmarker (FISH), von Target DNA Sequenzen auf Chromosomen, in Zellkernen und auf DNA-Chips erfordern besonders dann, wenn eine hohe Spezifität (Stringenz) der Markierung gefordert ist, eine umfangreiche Behandlung des Targets. Bei den meisten heute an gewandten FISH-Techniken ist dies insbesondere die Denaturierung und die daraus folgenden notwendigen nachfolgenden präparativen Schritte. So erfordert der Einsatz chaotroper chemischer Agenzien, wie z. B. das üblicherweise in den meisten in situ Hybridisierungsprotokollen verwendete Lösungsmittel Formamid, meist relativ arbeitsaufwendige Waschprozeduren nach erfolgter in situ Hybridisierung, um eine stringente Probenbindung zu gewährleisten. Aber auch eine rein physikalische, d. h. thermische, Denaturierung des Targets, bei der auf derartige extensive Waschprozeduren verzichtet werden kann, erfordert immer noch mehrere Behandlungsschritte des Targets. Die verwendeten Temperaturen führen aufgrund der Denaturierung von chromosomalen Proteinen zu einer Veränderung der Tertiärstruktur des Chromatins und beeinflussen die Konformation der chromosomalen DNA, teilweise in erheblicher Weise. Bei hochempfindlichem Untersuchungsmaterial für die klinische Diagnostik in der Genompathologie und für die Erforschung der dreidimensionalen (3D) Genomstruktur ist jedoch größte Materialschonung erforderlich, um nicht etwa für die Untersuchung relevante 3D-Strukturen zu verändern oder zu zerstören. Insgesamt ist selbst bei Verwendung der mittlerweile kommerziell erhältlichen "Ready to use" Probenkits ein erheblicher Arbeitsaufwand sowie eine, insbesondere in der klinischen Diagnostik, lange Erfahrung mit FISH-Methoden erforderlich, um die korrekte FISH-Markierung von Patientenmaterial zu ermöglichen.

Aus diesen Gründen ist es sowohl für die Grundlagenforschung (= Erforschung nativer 3D-Strukturen des Genoms und ihrer funktionalen Bedeutung, z. B. in der Genompathologie) als auch für die klinische Diagnostik von großer Bedeutung, daß das Targetmaterial möglichst ohne oder mit nur geringer Vorbehandlung markierbar und analysierbar ist. Dies bedeutet, das Target in vivo oder in einem dem in vivo Zustand nahe kommenden (vitalen) Zustand zu halten. Alle bisher bekannten in situ Hybridisierungsverfahren, bei denen von einem vital konservierten Target gesprochen werden kann, erlauben jedoch keine DNA DNA FISH beliebiger spezifischer, kleiner Genomabschnitte, wie z. B. einzelner Gene oder tumorrelevanter Genomloci (genannt seien hier als ein Beispiel die im Zusammenhang mit bestimmten Leukämien relevanten Loci abl-bcr auf den Chromosomen 9 und 22).

Wie in der Mikroskopie ist auch in der Sensorik die online Detektion von spezifischen doppelsträngigen DNA-Sequenzen mit Hilfe von DNA-Proben bisher ohne eine Vorbehandlung, wie z. B. einer Denaturierung, nicht möglich. Der Einsatz entsprechender Chemikalien und/oder die thermische Behandlung können jedoch den Sensor übermäßig belasten und beispielsweise die Empfindlichkeit im Routinebetrieb negativ beeinflussen. Auch bei denjenigen Anwendungen in der Sensorik, wo eine Denaturierung keine negativen Auswirkungen auf Belastbarkeit und Empfindlichkeit hat, ist der mit einer Denaturierung verbundene Aufwand zu berücksichtigen. Gleiches gilt auch für Untersuchungen an FISH-markierten Zellpräparaten, in denen die DNA durch spezielle Verfahren, wie z. B. Halopräparation oder Comet-Assay, frei gelegt wurde.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, spezielle DNA-Probengemische, die geeignet sind zu einer in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen, sowie ein Verfahren zur in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Verwendung der speziellen DNA-Probengemische zur Verfügung zu stellen. Weiterhin besteht die Aufgabe in der Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung von speziellen DNA-Probengemischen für die spezifische in situ Hybridisierung.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Probengemische gemäß Anspruch 1, sowie durch Verfahren gemäß der Ansprüche 3 und 10.

Entsprechende Probengemische kann man dadurch gewinnen, daß man aus der DNA-Se quenz der zu markierenden DNA-Targets mittels Computeranalyse oder experimentell mit Hilfe geeignet hergestellter DNA-Chips Polypurin und/oder Polypyrimidin Subsequenzen bestimmt, die jeweils eine Mindestzahl an Nukleotiden abdecken (Beispiel für das Zellkerngenom: Fig. 1). Von diesen Subsequenzen wird ein DNA-Probengemisch hergestellt, das bevorzugt, d. h. mit hohem Fluoreszenzsignal und/oder mit spektraler Kolokalisation, im Bereich der zu markierenden Target-DNA Region bindet (Fig. 2) unter Bildung von Tripelsträngen. Eingesetzt werden kann dieses Verfahren beispielsweise zur Vital Markierung oder zur in vivo Markierung von Mikrogenomstrukturen in Zellkernen für die Analyse der 3D-Genomorganisation und 3D-Genompathologie mittels multispektraler Präzisionsmikroskopie. Aufgrund dessen, daß auf eine Target-De naturierung sowie auf alle präparativen Sekundärschritte verzichtet werden kann, ist das Verfahren nicht nur für die Grundlagenforschung in Biologie und Medizin, sondern insbesondere auch für vielfältige Aspekte der klinischen Forschung und der Routinediagnostik von Bedeutung. Das Verfahren eignet sich für die Gewinnung spezifischer Oligonukleotide und besitzt über die oben genannten Anwendungsbeispiele hinaus verschiedene weitere Einsatzgebiete, insbesondere im Bereich der Mikrosensorik, um z. B. DNA-Lösungen auf das Vorhandensein bestimmter doppelsträngiger DNA-Sequenzen zu testen (Fig. 3). Weiterhin sind diese DNA -Probengemische beispielsweise anwendbar in der Fluoreszenzmikroskopie, in der Slit-Scan Flußfluorometrie, sowie in der Sensorik einzelner Mikrotargets. Dabei kann auf die übliche Vorbehandlung des Targets, d. h. insbesondere auf eine chemische, enzymatische und/oder thermische Denaturierung, verzichtet werden. Das bedeutet, daß erfindungsgemäß etablierte DNA-Probengemische auch für eine in vivo in situ Hybridisierung geeignet sein können. Insbesondere sollen die erfindungsgemäß etablierten DNA-Probengemische die spezifische Markierung natürlich vorkommender, doppelsträngiger DNA-Targetsequenzen ermöglichen und so auch einzelne kleine Abschnitte des Genoms einer optischen Analyse, z. B. durch hoch- und höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie oder mittels eines DNA-Chips, zugänglich machen.

Durch die Erforschung der DNA-Sequenz des menschlichen Genoms stehen heute umfangreiche DNA-Sequenzbibliotheken auf entsprechenden Computern zur Verfügung. Da sich solche Bibliotheken auch für andere Spezies im Aufbau befinden, ist eine grundsätzliche Beschränkung auf das Humangenom nicht erforderlich. Dies ist von erheblichem, auch klinischem Interesse, z. B. für die vereinfachte Mikrosensorik von DNA-Sequenzen von Krankheitserregern.

Eigene Untersuchungen haben gezeigt, daß Homo-Purin bzw. Homo-Pyrimidinsequenzen wesentlich häufiger auftreten als bisher angenommen. Dies macht derartige Sequenzen für die Nukleinsäurediagnostik interessant, zumal derartige Sequenzen besonders zur Bildung von Triple Strukturen geeignet sind, das heißt, daß sich entsprechende einzelsträngige Proben-Nukleinsäuren an doppelsträngige Target-Nukleinsäuren sequenzspezifisch anlagern. Allerdings sind einzelne Oligonukleotide mit Längen zwischen 15 und 30 Basenpaaren für die spezifische Markierung von Targetnukleinsäuren wenig geeignet, da sehr ausgeprägte Hintergrundsignale die Detektion erschweren. Erfindungsgemäß werden daher für die in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen Probengemische verwendet, die mindestens zwei Homopurin- und/oder Homopyri din-Oligonukleotide enthalten. Diese Proben-Oligonukleotide sind mit gleichen oder unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern versehen. Das in situ Hybridisierungsverfahren mit diesen Probengemischen wird bevorzugt bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20°C und 37°C, durchgeführt. Um mit zwei oder mehreren Proben-Oligonukleotiden ein einzelnes Signal zu erhalten, dürfen die zu den Proben komplementären Sequenzen der Targetnukleinsäuren bestimmte Abstände nicht überschreiten, die definiert sind durch das Auflösungsvermögen des verwendeten Detektionssystems.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Proben-Oligonukleotide wird beispielsweise in einer DNA-Sequenzbibliothek eine zu markierende, zusammenhängende DNA-Sequenz der Gesamtlänge L ausgewählt. L bedeutet hierbei eine lineare geometrische Länge eines DNA-Fadens der gesamten Basensequenz (1 kbp läßt sich zu ca. L = 350 nm abschätzen). Diese Länge L kann im unbehandelten (ggf. vitalen) Zellkern einer chromosomalen Subregion entsprechen, deren mittlerer Durchmesser d_T kleiner oder gleich der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion (auflösungsäquivalente Größe) des für die anschließende Analyse der Markierungsregion bzw. Zelle verwendeten Optischen Systems ist. DNA-Sequenzen aus DNA-Se quenzbibliotheken enthalten häufiger kleine Sequenzlücken bis zu einer Länge von etwa 1 kbp. Derartige Lücken sind für das erfindungsgemäße Verfahren unschädlich und können außer Betracht bleiben.

Die DNA-Sequenz der Länge L wird nach zusammenhängenden Homopurin und/oder Homopyrimidin Teilsequenzen von N ≧ 15 Nukleotiden abgesucht. Diese Teilsequenzen werden synthetisiert und/oder amplifiziert. Während dieses Prozesses oder danach werden diese Teilsequenzen mit beliebigen Fluoreszenzfarbstoffen geeigneter spektraler Signatur fluorochromiert. Beim gegenwärtigen Stand der Technik sind mindestens 10 Fluorchrome mit verschiedener spektraler Signatur bekannt, die in erfindungsgemäßer Weise an DNA-Sequenzen gekoppelt werden können. Es können alle Teilsequenzen mit gleicher spektraler Signatur oder einzelne oder mehrere Teilsequenzen mit unterschiedlicher spektraler Signatur markiert werden.

Aus allen oder einer geeigneten Teilmenge (z. B. nur repetitive oder nur singuläre) der so vorbereiteten Teilsequenzen der Gesamtmarkierungsregion T der Länge L stellt man ein Gemisch einzelsträngiger DNA-Proben her, wobei alle darin vorkommenden Teilsequenzen in einem definierten Mischungsverhältnis vorliegen können. Die verschiedenen Teilsequenzen des Probengemisches können mit derselben oder mit verschiedenen spektralen Signaturen versehen sein. Anschließend wird das Probengemisch mit dem zu markierenden Zelltarget bzw. der zu analysierenden DNA Sequenz zusammengebracht. Im Falle der in vivo Markierung kann das Probengemisch mittels bekannter Verfahren, z. B. durch Mikroinjektion oder durch membranpermeable Transportverfahren, in die Zellen eingebracht werden. Schließlich läßt man das Probengemisch unter definierten, beispielsweise physiologischen oder nahezu physiologischen Reaktionsbedingungen an die zu markierenden DNA-Targetsequenz längs der Länge L binden (Fig. 1). Da die Länge L oder beliebige zusammenhängende Teile von L, die beispielsweise mit DNA-Teilsequenzen abgedeckt werden, die mit Farbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert sind, in ihrem mittleren Durchmesser d_T im Genom kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der auflösungsäquivalenten Punktbildfunktion des verwendeten optischen Analysesystems, z. B. eines Mikroskops (im Folgenden abgekürzt als FWHM) sind, führt die Markierung mit dem oben beschriebenen Probengemisch zu einer scheinbar optisch zusammenhängenden, "punktförmigen" Markierung (Fig. 2); d. h. alle die von den einzelnen, Fluorochrom-markierten Nukleotidsequenzen derselben spektralen Signatur emittierten Einzelintensitäten addieren sich im Zentrum des Beugungsbildes zu einer Gesamtintensität dieser spektralen Signatur.

Das Mischungsverhältnis der am Markierungsprobengemisch beteiligten Teilsequenzen kann z. B. 1 : 1 betragen; andere Mischungsverhältnisse sind ausdrücklich zugelassen. Ferner können die Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur oder mit Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur markiert sein. Beispielsweise kann die Detektion einer bestimmten Targetsequenz T der Länge L dadurch erfolgen, daß a) alle Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur S₁ markiert werden; oder daß b) ein Teil der Sequenzen mit einer spektralen Signatur S₁ und ein anderer Teil mit einer spektralen Signatur S₂, bzw. weitere Teile mit spektralen Signaturen S_n markiert werden; oder daß c) eine Kombination von a) und b) durchgeführt wird.

In Fall a) erfolgt die Diskriminierung der Bundungsstelle an die Targetsequenz von nicht spezifisch gebundenen Teilsequenzen durch die erhöhte Intensität des Fluoreszenzsignals: Da laut Voraussetzung der Durchmesser d₁ der Targetregion kleiner ist als die FWHM, addieren sich die Intensitätsbeiträge der Fluoreszenzemissionen der spezifisch gebundenen Teilsequenzen, während die nicht spezifisch gebundenen Teilsequenzen einer zufälligen räumlichen Verteilung im Objekt unterliegen, deren mittlerer Abstand bei geeigneten Bedingungen größer ist als die FWHM. Als Konsequenz ist die Intensität dieser vereinzelten Fluoreszenzsignale ("Hintergrund") erheblich geringer. Sind beispielsweise 10 Teilsequenzen spezifisch an das Target gebunden und die übrigen Teilsequenzen im Präparat zufällig verteilt, dann kann der Ort des Targets aufgrund seines ca. 10mal so großen Fluoreszenzsignals identifiziert werden.

In Fall b) erfolgt die Identifizierung der spezifischen Bindungsstelle an das Target T aufgrund der Kolokalisation von Fluoreszenzsignalen unterschiedlicher spektraler Signatur. Beispielsweise enthalte das Target lediglich 3 Bindungsstellen für Teilsequenzen t₁, t₂, t₃, die jeweils mit den spektralen Signaturen S₁, S₂ und S₃ markiert wurden. In diesem Falle wird sich die Intensität der einzelnen von t₁, t₂ und t₃ detektierten Fluoreszenzsignale am Ort des Targets nicht von der Intensität der "Hintergrundssignale" nichtgebundener Probenmoleküle unterscheiden. Der Ort des Targets ist jedoch bestimmt durch das gleichzeitige Auftreten von Fluoreszenzsignalen mit den spektralen Signaturen S₁, S₂ und S₃ an dem Targetort nach Korrektur der ggf. auftretenden chromatischen Verschiebungen ( "spektrale Kolokalisation").

Fall e) ist eine Kombination der beiden Verfahrensbeispiele a) und b): Die Detektion des Ortes von T aufgrund erhöhten Fluoreszenzsignals von Fluorochromen einer bestimmten spektralen Signatur und aufgrund von spektraler Kolokalisation von zwei oder mehr spektralen Signaturen ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In diesem Falle wird die Sicherheit der eindeutigen Detektion des gewünschten Targetortes besonders groß. Eine derartige erhöhte Sicherheit der Zuordnung kann beispielsweise bei der Detektion von tumorrelevanten Targetsequenzen in der klinischen Pathologie von großer Bedeutung sein.

Zwei verschiedene Targetsequenzen T₁, T₂ mit den jeweiligen Längen L₁, L₂ können beispielsweise wie folgt unterschieden werden:

a) Die für das Target T₁ spezifischen DNA-Probensequenzen werden alle mit derselben spektralen Signatur S₁ markiert; die für das Target T₂ spezifischen Probensequenzen werden alle mit einer spektralen Signatur S₂ markiert. Der Ort von T₁ wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals der spektralen Signatur S₁ detektiert; der Ort von T₂ wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals der spektralen Signatur S₂ detektiert.
b) Die für das Target T₁ spezifischen DNA-Probensequenzen werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen S₁, S₂, S₃ markiert; die für das Target T₂ spezifischen DNA-Pro bensequenzen werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen S₄, S₅, S₆ markiert. Der Ort von T₁ wird in diesem Falle durch die spektrale Kolokalisation von S₁, S₂, S₃ detektiert; der Ort von T₂ wird durch die spektrale Kolokalisation von S₄, S₅, S₆ detektiert.

Erfindungsgemäß ist auch eine geeignete Kombination der Verfahren a) und b), wobei auch die Anzahl und Kombination der spektralen Signaturen geeignet variiert werden kann. Ebenso ist eine Erweiterung auf mehr als 2 Targets mit Hilfe einer entsprechenden Erweiterung der Anzahl der spektralen Signaturen erfindungsgemäß.

Ist der Abstand der Schweipunkte der Targets T₁, T₂, T₃ . . . voneinander kleiner als die FWHM, so können die Targets auch in diesem Falle mit Hilfe einer spezifischen spektralen Signaturkombination unabhängig von der Gegenwart der anderen Targets detektiert werden. Beispielsweise wird T₁ durch spektrale Kolokalisation von S₁, S₂, S₃; T₂ durch spektrale Kolokalisation von S₄, S₅, S₆; T₃ durch spektrale Kolokalisation von S₇, S₈, S₉ usw. detektiert (s. o.). Im Falle der höchstauflösenden Präzisionsmikroskopie, bei der es auch möglich ist, Distanzen unterhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des verwendeten optischen Systems zu imessen, kann es, abhängig vom jeweils verwendeten Fluorochrom und seiner Inkorporationshäufigkeit in die jeweiligen Teilsequenzen, notwendig sein, auch andere Mischungsverhältnisse als 1 : 1 einzusetzen.

Ist der Abstand der Schwerpunkte der Targets T₁, T₂, T₃ . . . voneinander jeweils größer als die FWHM, so können zusätzliche Kombinationen verwendet werden. Beispielsweise kann in diesem Falle Target T₁ durch die Kombination S₁, S₂, S₃; Target T₂ durch die Kombination S₁, S₃, S₄; Target T₃ durch S₁, S₃, S₅; Target T₄ durch S₁, S₃, S₆; Target T₅ durch S₂, S₃, S₄, usw. charakterisiert werden.

Lösung mit experimentell ermittelten Oligonukleotidsequenzen

Für das vorliegende in vivo-FISH bzw. vital-FISH Verfahren von DNA-enthaltenden Targets mit einem Durchmesser kleiner als die Halbwertsbreite der Punktbildfunktion des zur Detektion verwendeten optischen Systems ist die Bestimmung von geeigneten Oligonukleotidsequenzen erforderlich, aus denen geeignete Mischungen von DNA-Proben hergestellt werden können. Eine oben beschriebene Möglichkeit besteht in der Auswahl passender Oligonukleotidsequenzen aus Sequenzdatenbanken der zu analysierenden Targetregionen.

Zusätzlich oder an Stelle dieser Lösung kann das folgende Verfahren herangezogen werden. Die Zahl theoretisch möglicher Oligonukleotide mit einer bestimmten Länge, die mit der Target-DNA Tripel-Strukturen bilden können, ist begrenzt. Bei einer Länge von 15 bp beispielsweise gibt es 2¹⁵ Möglichkeiten; bei einer Länge von 20 bp beispielsweise gibt es 2²⁰ Möglichkeiten für eine Oligonukleotidsequenz, die nur aus Purinen bzw. nur aus Pyrimidinen besteht; insgesamt ergibt dies also rund 32 000 bzw. 1 Million Möglichkeiten. Diese 15mers bzw. 20mers können nach bekannten Verfahren (z. B. Gene Chip Probe Array der Firma Affymetrix) auf einem DNA-Chip synthetisiert werden. Beim gegenwärtigen Stand der Technik wurden bereits mehrere hunderttausend Sequenzen auf einem Chip untergebracht. Geht man entsprechend dem genannten Beispiel von einem feature Durchmesser von 1 µm × 1 µm aus, so kann bei einem Abstand der einzelnen features von ebenfalls 1 µm die Gesamtmenge von einer Million features auf einem Gen-Chip Areal von wenigen Quadratmillimetern untergebracht werden. Für die Realisierung der hier beschriebenen Erfindung mit Hilfe von 15mer Homopurin bzw. Homopyrimidinsequenzen ist bereits der erreichte Stand ausreichend. Jeder Platz auf dem Chip ("feature") wird mit einer großen Zahl identischer Oligonukleotide einer bestimmten Sequenz, entweder nur aus Purinbasen (Homopurinsequenz), oder nur aus Pyrimidinbasen (Homopyrimidinsequenz) besetzt. Beispielsweise kann ein Chip mit 32 000 bzw. 1 Million verschiedener features so gestaltet werden, daß er alle in der Natur natürlicherweise vorkommenden DNA-15mers bzw. DNA-20mers enthält, die durch Verbindung mit doppelsträngigen DNA-Sequenzen Tripelstrukturen bilden können. Hybridisiert man anschließend gesamtgenomische DNA einer Spezies bzw. Teilfraktionen dieser DNA, z. B. die DNA eines individuellen Chromosoms, eines individuellen Chromosomenarms, einer Chromosomenbande oder eines Gens auf diesen DNA-Chip, dann ist es möglich, alle Abschnitte mit einer Länge von (z. B.) 15 oder von 20 Basenpaaren in diesen genomischen DNA Proben zu identifizieren, die tripelhelikale Strukturen bilden können. Diese Hybridisierung kann sowohl unter denaturierenden Bedingungen als auch nicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden.

Dieser Ansatz erlaubt es, die für die Bildung von Tripel-Strukturen (und damit die in vivo bzw. vital Markierung chromosomaler DNA-Targets) benötigten Oligonukleotide als Pool für die optische Detektion eines ausgewählten genomischen Abschnittes bereitzustellen. Durch vergleichende Hybridisierung von DNA-Chips der beschriebenen Konfiguration mit genomischen DNA Fraktionen, die die DNA des interessierenden Abschnitts repräsentieren, und von DNA Fraktionen, die die übrige genomische DNA repräsentieren, kann festgestellt werden, welche der beispielsweise 20mers mit Tripel-bildenden Eigenschaften ausschließlich in einem interessierenden genomischen DNA Abschnitt (z. B. einem bestimmten Chromosom, Chromosomenabschnitt, oder einem bestimmten Gen) vorkommen.

Anschließend erfolgt die weitere Synthese bzw. Amplifikation der interessierenden DNA Sequenzen wie oben beschrieben. Ebenso wie die aus den Computerdaten ermittelten Sequenzen sind die hier per Chip gefundenen Sequenzen für die in vivo oder vital Markierung geeignet und beispielsweise in der Präzisionsmikroskopie einsetzbar.

Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht in der systematischen Konstruktion von DNA-Probengemischen, die eine oder mehrere gegebene Markierungsregionen im Genom abdecken. Ein besonderer Vorzug dieser Verfahrensweise besteht darin, daß, sofern keine geeigneten Computer-DNA-Sequenzbibliotheken vorliegen, die interessierenden Oligo nukleotide mit Tripel-bildenden Eigenschaften mit einem Chip der oben beschriebenen Art in genomischer DNA jeder beliebigen Spezies identifiziert werden können, ohne daß DNA Sequenzinformation bereits vorliegen muß. Dies ist insbesondere von Interesse für die rasche Identifizierung relevanter Oligonukleotidsequenzen mit Tripel-bildenden Eigenschaften in noch nicht sequenzierten Genonien, wie z. B. der meisten Erreger von Infektionskrankheiten.

Der mittlere Durchmesser d_T der Markierungsregion ist voraussetzungsgemäß geringer als die FWHM. Dies bedeutet, daß die Fluoreszenzsignale der einzelnen, kurzen dreisträngigen Markierungsorte und der einzelsträngigen Abschnitte in der nächsten Umgebung (Abstand der einzelsträngigen Abschnitte ≦ 100 Basenpaare von dem nächstgelegenen Basentripel einer Dreifachstrangkonfiguration) in der Target-Region sich konstruktiv überlagern und/oder für eine spektrale Kolokalisation herangezogen werden können; so kann eine wesentliche Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses bzw. der Target-Identifikation erreicht werden, die eine Fluoreszenzdetektion so markierter Targets unter in vivo, physiologischen oder nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht. Eine automatische Computeranalyse vorhandener DNA-Sequenzbibliotheken bzw. der erfindungsgemäße Einsatz eines DNA-Chips zur Oligonukleotid-Gewinnung ermöglicht die Suche nach generalisierten Homopurin- oder Homopyrimidinsequenzen mit 15 oder mehr Nukleotiden aus einer spezifischen längeren DNA-Sequenz. Diese natürlichen, für die Ausbildung von Tripelformationen geeigneten Teilsequenzen können bei der natürlichen Chromatinfaltung, wie sie im Zellkern vorliegt, eine Gesamtsequenz mit einem Targetdurchmesser d_T ≦ FWHM so mit einem Fluorochrom einer bestimmten spektralen Signatur abdecken, daß es möglich ist, diese in einem Bildsegment ("Bildpunkt") so stark zu akkumulieren, daß der Ort des Targets von eventueller Hintergrundsfluoreszenz diskriminierbar wird. Diese Hintergrundfluoreszenz kann dadurch z. B. entstehen, daß einzelne Teilsequenzen aus dem gesamten Gemisch aller Teilsequenzen auch unspezifisch binden. Bei Verwendung geeigneter Fluorochrome und Bildaufnahme- und -verarbeitungstechniken läßt sich mit einem erfindungsgemäß konstruierten Probengemisch das spezifische Markierungssignal im Vergleich zu dem unspezifischem Hintergrundsignal so entscheidend verbessern, daß eine eindeutige Identifizierung einer gesuchten chromosomalen DNA Region oder DNA Sequenz möglich wird.

Erfindungsgemaße DNA Probengemische enthalten in wäßriger Lösung mindestens zwei markierte Oligonukleotide, von denen jedes entweder eine Homopurin- oder Homopyrimidinsequenz aufweist. Vorzugsweise enthält die wäßrige Lösung zusätzlich Salze wie Natrium und/oder Magnesiumchlorid in Konzentrationen zwischen 0,1 und 100 mM. Weiterhin kann die wäßrige Lösung Puffersubstanzen, bevorzugt Phosphatpuffer enthalten.

Da die erfindungsgemäßen Probengemische durch Synthese und/oder Amplifikation gewonnen werden können, läßt sich somit ein Markierungskit herstellen, der es ermöglicht, ohne umfangreichere Targetbehandlung, d. h. insbesondere ohne chemische, enzymatische und/oder thermische Targetdenaturierung, eine spezifische FISH durchzuführen. Dies vereinfacht in der klinischen Diagnostik den Umgang mit Patientenmaterial als Target ganz erheblich. Insbesondere brauchen physiologisch relevante Bedingungen, wie sie bei der Gewinnung des Patientenmaterials im allgemeinen vorliegen, nicht mehr geändert werden. Dies ist ein entscheidender Vorteil auch in Anbetracht einer schonenden Behandlung des zu analysierenden Zellmaterials, um relevante Strukturinformationen zu konservieren.

Zur Durchführung des Hybridisierungsverfahrens mit den erfindungsgemäßen Probengemischen wird zu fixiertem oder unfixiertem Untersuchungsmaterial, z. B. menschliche Zellen oder Chromosomenpräparationen, bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, bevorzugt zwischen 20°C und 37°C, erfindungsgemäßes Probengemisch zugegeben. Vorzugsweise wird das Probengemisch unmittelbar vor der ISH erhitzt auf eine Temperatur zwischen 85°C und 95°C und anschließend auf die Hybridisierungstemperatur abgekühlt. Enthält das Untersuchungsmaterial DNA-Se quenzen, die komplementär zu Oligonukleotid-Sequenzen des Probengemisches sind, so hybridisieren die Oligonukleotide des Probengemisches mit den komplementären doppelsträngigen DNA-Sequenzen des Untersuchungsmaterials, wobei Triplex-Stränge gebildet werden. Nach einer Inkubationszeit zwischen 1 Minute und 1 Stunde, bevorzugt zwischen 2 und 10 Minuten, kann einmal oder zweimal gewaschen werden. Anschließend erfolgt die Detektion mittels gängiger Techniken, beispielsweise digitaler Fluoreszenzmikroskopie.

Für die allgemeine und klinische Genomforschung bzw. Genompathologie eröffnen solche erfindungsgemäß hergestellten Probengemische den Vorteil einer spezifischen in vivo Markierung von Genomstrukturen im Zellkern für eine multispektrale Analyse der Genomorganisation und ihrer funktionalen Bedeutung.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Vorteil besteht auch bei beliebig fixiertem Unter suchungsmaterial darin, daß der Denaturierungsschritt entfällt. Das DNA-Probengemisch kann mit derselben Einfachheit gehandhabt werden wie z. B. etablierte DNA-Färbungen der klinischen Cytogenetik: Das Probengemisch wird auf das Präparat gegeben; nach geeigneter Einwirkungszeit z. B. bei Zimmertemperatur und einem evtl. erfolgenden kurzen Waschschritt, ebenfalls bei Zimmertemperatur, kann die Fluoreszenzmikroskopische Auswertung beginnen.

Ein weiterer Vorteil gegenüber bekannten FISH-Verfahren bei Raumtemperatur besteht auch bei beliebig fixiertem zellulärem Untersuchungsmaterial darin, daß das Probengemisch keine toxisch wirkenden chaotropen chemischen Agenzien enthält. Hier können z. B. die bei längerem Umgang mit chaotropen Substanzen möglichen Allergiereaktionen eliminiert werden.

Ebenso können in der Sensorik entsprechende DNA-Chips konstruiert werden, die DNA-Se quenzen bei Anlagerung an gegebene Proben erkennen, ohne daß der Chip oder das Untersuchungsmaterial zusätzlich eine chemische und/oder thermische Behandlung benötigen. Ferner können die Anforderungen an das zur Detektion verwendete optische System erheblich reduziert werden. Zum Beispiel ist es möglich, Mikroskopoptiken von geringerer numerischer Apertur (d. h. geringerer FWHM) einzusetzen, wenn die Dimensionen des Chips entsprechend angepaßt werden (Fig. 3). Da heute zur optischen Analyse von DNA-Chips sehr komplexe Systeme, z. B. konfokale Laserscanning-Mi kroskope, eingesetzt werden, kann hierdurch das Verfahren wesentlich ökonomischer gestaltet werden.

Die Fig. 1-3 erläutern die Erfindung näher. Es zeigen:

Fig. 1 Identifizierung von DNA-Abschnitten 3 bis 8 innerhalb des chromosomalen DNA-Targets T mit einer Basenabfolge (Pu. . .Pu)_N oder (Py. . .Py)_N, N ≧ N₀; N₀ ≧ 15 1: Zu markierendes chromosomales DNA-Target T; 2: Zellkern; d_T: Durchmesser des Targets.

Fig. 2a Amplifikation der identifizierten (Pu. . .Pu)/(Py. . .Py) Sequenzen an das Target T: Markierung mit geeigneten Fluorochromen (Label F)

Fig. 2b: Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung mit einem Gemisch aus t₁. . .t_M oder einigen von diesen Sequenzen.

Fig. 3 DNA-Chip geeigneter Dimension mit 2ⁿ features 1.1, 1.2, . . ., 1.n, 2.1, 2.2, . . ., n.n. Jedes feature hat vom Detektionssystem abhängige Dimensionen und Abstände zu den Nachbarfeatures. 1: Abstand zwischen den features < 2 Halbwertsbreiten, 2: feature, d_T: Durchmesser des Targets.

Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung anhand ihres Einsatzes in der Präzisionsmikroskopie für die Genomforschung, wobei der Einsatz der erfindungsgemäß hergestellten Probengemische an Hand der Erforschung der Pathologie der dreidimensionalen Genomstruktur erläutert wird. Wichtig dabei ist die Erforschung der Veränderung nativer Mikrostrukturen des Genoms im Zellkern, die mit pathologischen Veränderungen von Zellen korreliert oder kausal dafür verantwortlich sind. Von Probengemischen, die geeignet sind, um derartige fundamentale Fragen der modernen Humangenetik und Zellular-Pathologie zu beantworten, ist zu erwarten, daß sie auch geeignet sein können, als Marker hinsichtlich der klinischen Diagnostik auf derartige Genomveränderungen zu dienen.

Das menschliche Genom ist im Zellkern nicht zufällig verteilt; zahlreiche Forschungsergebnisse weisen darauf hin, daß es abhängig von Zelltyp und -status, einer dreidimensionalen Kompartmentalisierung unterworfen ist, die funktionelle Bedeutung hat. Voraussetzung für die Entschlüsselung der geordneten dreidimensionalen Genomstruktur sind spezifische DNA-Markierungsverfahren, die die jeweils vorliegende native Chromatinstruktur im Zellkern nicht verändern und ggf. sich auch dazu eignen, dynamische Vorgänge in vivo sichtbar zu machen. Dazu werden gegenwärtig hochsensitive Mikroskopieverfahren entwickelt, die quantitative Distanz-Analysen von markierten kurzen DNA-Sequenzen, Proteinen etc. im intakten Zellkern bis hinunter zu wenigen zehn Nanometern erlauben. Für einen hochsensitiven Nachweis werden neuartige Fluoreszenz-Farbstoffkomplexe eingesetzt, die dank einer hohen Fluoreszenz-Quan tenausbeute und einem hohen Signal/Rausch-Verhältnisses bereits den Nachweis einzelner oder weniger, mit DNA-Sequenzen koppelbarer Moleküle erlauben. Solche Techniken ermöglichen es im Prinzip erstmals, die "Hyperfeinstruktur" des menschlichen Genoms zu untersuchen sowie pathologisch relevante Veränderungen der 3D-Genomorganisation zu erforschen.

Eine erhebliche Einschränkung der hier möglichen Forschung stellen hierbei noch die derzeit vorhandenen DNA Proben dar, die für eine spezifische in situ Hybridisierung unphysiologische, häufig komplexe Markierungsprozeduren erfordern. Dadurch kann nicht mehr gewährleistet werden, daß die nativen Targetstrukturen auch nach Anwendung der Hybridisierungsprotokolle noch so erhalten sind, daß sie den Vitalzustand in einer für die Kenntnis der Funktion relevanten Weise widerspiegeln.

Probengemische, wie sie erfindungsgemäß konstruiert und produziert werden können, ermöglichen eine FISH unter nichtdenaturierenden, physiologischen Bedingungen und können darüberhinaus sogar in lebende Zellen injiziert oder andersweitig eingebracht werden. Da anschließend infolge von Diffusionsvorgängen eine natürliche Anlagerung, d. h. ohne weitere äußere Einwirkung, an die zu markierende Targetsequenz im Genom stattfinden kann, kann somit die oben genannte, wesentliche Lücke in einer zukünftigen Hochpräzisionsgenomforschung geschlossen werden.

Als konkretes Ausführungsbeispiel soll im Folgenden die Gewinnung eines Probengemisches für zwei ausgewählte Targetregionen auf dem menschlichen X-Chromosom und ihre Detektion skizziert werden.

Die konkrete Aufgabe dieses Beispieles bestand zunächst darin, erfindungsgemäße Probengemische für den Locus HSU66082_1 in Xq27.3-q28 (= Locus 1) des menschlichen Genoms, sowie für den Locus HUMPFLNG6PD-1 (= Locus 2) auf demselben Chromosom des menschlichen Genoms zu konstruieren.

1) Ermittlung der Oligonukleotidsequenzen

a) Es werden die aus Datenbanken bekannten DNA-Sequenzdatenfiles von Locus 1 und Locus 2 auf das Vorhandensein von Homopurin- bzw. Homopyrimidinsequenzen der Oligonukleotidlänge 15 geprüft, wobei offensichtlich repetitive Sequenzen (z. B. aaaaaaaa . . . oder tttttt . . .) hier nicht berücksichtigt werden.
Gefunden wurden für Locus 1 die 15mers:
Für Locus 2 die 15mers:
b) Die DNA-Sequenzen aus Locus 1 bzw. Locus 2 werden aus bestehenden Genbanken, z. B. des Deutschen Humangenomprojektes, erhalten, amplifiziert, mit Fluorochromen markiert, in Oligonukleotide einer Mindestgröße von 15 Basenpaare gespalten, und anschließend auf erfindungsgemäßen DNA-Chips in stringenter Weise hybridisiert. Diese DNA-Chips enthalten in spezifischer Reihenfolge alle Kombinationen komplementärer Purin 15mers bzw. Pyrimidin 15mers oder eine hier relevante Teilmenge davon (z. B. nur die für das menschliche X-Chromosom spezifischen Purin/Pyrimidin 15mers). Nach der Hybridisierung der DNA-Proben aus Locus 1 werden Fluoreszenzsignale bei den Positionen (1 (Reihe), 167 (Spalte)); (2, 34); (67, 98); (73, 28); (95, 3) usw. gefunden; nach der Hybridisierung der DNA-Proben aus Locus 2 werden Fluoreszenzsignale bei den Positionen (1, 23); (2, 46): (66, 81); (95, 3) usw. beobachtet. Aufgrund der bekannten Zuordnung von Sequenzposition und Oligonukleotidsequenz ergeben sich die aus der DNA-Sequenzbank bekannten, oben genannten Sequenzen.
Sequenzpositionen, die sowohl in Locus 1 als auch in Locus 2 vorkommen (hier (95, 3)) werden für die Herstellung der Probengemische eliminiert. Gegebenenfalls werden Vergleichshybridisierungen mit der verbleibenden genomischen DNA durchgeführt, d. h. genomischer DNA ohne die DNA-Sequenzen von Locus 1 und Locus 2; statt der verbleibenden genomischen DNA können ggf. auch geeignete Teilfraktionen verwandt werden. Alle Sequenzpositionen, die außer an Locus 1 bzw. Locus 2 noch im Genom (ggf. in einer Teilfraktion des Genoms) vorkommen, werden bei der Etablierung der Probengemische nicht berücksichtigt.

2) Etablierung der Probengemische

Die in 1) gefundenen Oligonukleotidsequenzen für Locus 1 und Locus 2 werden nach bekannten Verfahren synthetisiert und beispielsweise mit endständigen Fluorochromen verbunden. Z.B. werden die für Locus 1 spezifischen Oligonukleotidsequenzen mit Fluorochromen einer spektralen Signatur S₁ am 5'-Ende der Sequenz markiert, während die für Locus 2 spezifischen Oligonukleotidsequenzen am 5'-Ende der Sequenz mit Fluorochromen einer spektralen Signatur S₂ markiert werden. Eine Signalverstärkung kann durch zusätzliche Markierung des 3'-Endes mit entsprechend gleichen Fluorochromen erzielt werden.

3) Prüfung der Spezifität durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung

Eine experimentelle Überprüfung der Spezifität kann z. B. durch Hybridisierung unter geeigneten Puffer-, Temperatur-, und Waschbedingungen an präparierte Metaphase chromosomen erfolgen. Beispielsweise wird bei Vorliegen eines erfindungsgemäßen Probengemisches von Locus 1 ein FISH-Signal nur in der Region Xq27.3-q.28 beobachtet.

4) Fluoreszenzhybridisierung an dreidimensional konservierten Zellkernen

Zur möglichst schonenden Hybridisierung (Vital-FISH) werden die zu untersuchenden Zellkerne, ggf. nach Fixierung, einer in situ Hybridisierung unter nicht-denaturierenden Bedingungen unterzogen: Das Hybridisierungsgemisch enthält lediglich die in 2) etablierten Probengemische in einem physiologischen Puffer, wobei die Behandlungstemperatur zu keinem Zeitpunkt über 40°C erhöht wird. Zur Beseitigung von nichtgebundenen Probensequenzen wird ein Waschschritt mit physiologischem Puffer bei Temperaturen nicht über 40°C durchgeführt.

5) Fluoreszenzhybridisierung an kernhaltige Zellen in vivo

Die in 2) etablierten Probengemische werden in Interphasezellen mikroinjiziert. Alternativ können auch Verfahren der Elektroporation oder der vesikelvermittelten Inkorporation verwandt werden. Anstelle von Waschschritten kann bei der In Vivo-FISH eine Verminderung der Hintergrundssignale durch Diffusion und zelluläre Eliminationsprozesse erreicht werden.

6) Optischer Nachweis der Bindungsorte

Als Beispiel für den Nachweis der Bindungsorte seien Verfahren der höchstauflösenden digitalen Fluoreszenzmikroskopie genannt. In dem genannten Anwendungsbeispiel werden von 10 spezifischen Teilsequenzen für Locus 1 und 10 spezifischen Teilsequenzen für Locus 2 ausgegangen. Je nach Fluorochromierungsgrad sind dann an den Bindungsorten von Locus 1 bzw. Locus 2 ca. 10-1000 Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen S₁ bzw. S₂ zu detektieren.

Targets mit ca. 1000 Fluorochrommolekülen insgesamt können noch mit den Verfahren der konventionellen digitalen Epifluoreszenzmikroskopie (z. B. Verwendung einer hoch empfindlichen, gekühlten CCD-Kamera) oder mit Hilfe etablierter Methoden der konfokalen (1 Photonen) Mikroskopie spezifisch detektiert werden. Da sich die Intensitätssignale an einem Bindungsort mit einem Durchimesser kleiner/gleich der FWHM überlagern, kann der Ort des Targets von nicht gebundenen, zufällig verteilten Probensequenzen mit ausreichendem Signal zu Rausch-Verhältnis (SNR) von unspezifischen Bindungsorten diskriminiert werden.

Sind jedoch beispielsweise nur 10 Fluorochrommoleküle am Targetort zu detektieren, so sind andere mikroskopische Nachweisverfahren indiziert. Beim gegenwärtigen Stand der Technik können hier z. B. zeitaufgelöste mikroskopische Fluoreszenzverfahren oder konfokale 2-Photonen-Mikroskopie oder eine Kombination dieser Methoden verwendet werden. Mit derartigen Techniken ist es heute bereits möglich, einzelne bis wenige, zur DNA-Probenmarkierung geeignete Fluorochrommoleküle nachzuweisen.

Um eine bessere Unterscheidung des Targetortes von zufällig verteilten fluorochromierten Oligonukleotidsequenzen zu ermöglichen, kann hier die Methode der spektralen Kolokalisation (s. o.) angewandt werden. Beispielsweise wird der Ort von Locus 1 in situ durch die kolokalisierte Detektion weniger Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen S₁, S₂, S₃ angezeigt, während der Ort von Locus 2 durch die kolokalisierte Detektion weniger Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen S₄, S₅, S₆ angegeben wird.

Einsatz als Verfahren in der Chip-Sensorik

Für die erfindungsgemäße Anwendung des Verfahrens in der Sensorik von DNA-Chips besteht eine Ausführungsform darin, daß auf dem Chip alle oder ein Teil der Tripel-Strang bildenden Oligonukleotidsequenzen eines zu analysierenden Genoms, Chromosoms, Chromosomenabschnittes, Gens, oder Genabschnittes aufgebracht werden, in der Weise, daß jedes feature einzelsträngige Oligonukleotide einer bestimmten Sequenz enthält. Unter feature wird hier ein einzelnes Feld auf einem Chip verstanden, auf das Oligonukleotide gleicher Sequenz und Länge aufgebracht werden. Der Durchmesser der features ist erfindungsgemäß kleiner/gleich der FWHM. Der Abstand zwischen den features kann jedoch größer als diese Halbwertsbreite gewählt werden. Bei einer erfindungsgemaßen Sensorik Applikation wird die zu analysierende (Target)DNA nach Zerlegung in Fragmente geeigneter Länge (z. B. einige hundert Basenpaare) fluoreszenzmarkiert und kann in nicht denaturiertem (meist doppelstrangigen) Zustand in einer Lösung nach bekannten Verfahren unter nicht denaturierenden Bedingungen an den DNA-Chip hybridisiert werden. Nach einem Waschschritt wird nur an denjenigen feature-Orten eine Fluoreszenzintensität bestimmter Größe detektiert, bei denen doppelsträngige Target-DNA und einzelsträngige feature-DNA eine Tripel-Struktur gebildet haben.

Als ein konkretes Anwendungsbeispiel sei ein DNA-Chip genannt, der spezifisch ist für den Nachweis der oben genannten Locus 1 und Locus 2 auf dem menschlichen X-Chromosom:

a) Zunächst werden nach den o.a. Verfahren die einzelnen, für Locus 1 bzw. Locus 2 spezifischen Oligonukleotidsequenzen getrennt voneinander synthetisiert/amplifiziert. Eine Fluorochromierung kann hier unterbleiben. Anschließend werden die Oligonukleotid sequenzen in einer geeigneten Menge jeweils einzeln an bestimmten Stellen eines DNA-Chips niedergelegt. Ggf. können in einem Kontrollbereich des DNA-Chips noch weitere Sequenzen niedergelegt werden, um z. B. eine Prüfung der Hybridisierungseffizienz zu gestatten.
b) Die zu untersuchende DNA, z. B. genomische Patienten-DNA, wird nach Fluoreszenzmarkierung an den DNA-Chip hybridisiert. Die Positionsverteilung der Fluoreszenzsignale nach Detektion mit einem optischen System, dessen Halbwertsbreite FWHM kleiner/gleich dem Durchmesser der verwendeten DNA-features ist, gibt die gewünschte Information über die Existenz der betreffenden Homopurin/Homopyrimidin-Se quenzen in der Patienten-DNA. Diese Information kann z. B. als Marker für andere, benachbarte Sequenzen verwendet werden.
c) In einem modifizierten Verfahren M1 werden die Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-Chip mit einem Fluorochrom A markiert, die Proben-DNA mit einem Fluorochrom B, dergestalt daß bei Bindung von Proben-DNA-Sequenzen an Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-Chip bei geeigneter Anregung ein Energietransfer stattfindet, der zum optischen Nachweis des Bindungsortes verwandt werden kann.
d) In einem modifizierten Verfahren M2 werden die Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA Chip mit einem Fluorochrom markiert, dergestalt daß bei Bindung einer Sequenz aus der zu untersuchenden DNA eine Verminderung (Quenching) oder eine Erhöhung (Enhancement) des Fluoreszenzsignals eintrifft. Der Vorteil eines derartigen Verfahrens ist, daß die zu untersuchende DNA nicht fluoreszenzmarkiert werden muß.

Claims

1. DNA-Probengemische für die spezifische Markierung von Target-Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen DNA-Bereichen, enthaltend mindestens zwei Oligonukleotide, von denen jedes entweder nur aus Purinnukleotiden oder nur aus Pyrimidinnukleotiden besteht und die jeweils mit mindestens einem Marker versehen sind.

2. DNA-Probengemische nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Oligonukleotid aus 15 bis 30 Nukleotiden besteht.

3. Verfahren zur Markierung von Target-Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen DNA-Bereichen, mittels markierter DNA-Probengemische, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probengemische unter nicht denaturierenden Bedingungen mit den Target-Nukleinsäuren zum Zwecke der in situ Hybridisierung zusammengebracht werden und anschließend die Markierung mittels Standardverfähren detektiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probengemische mittels eines Fluoreszenzmarkers markiert sind.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Pro bengemische vor der in situ Hybridisierung auf eine Temperatur zwischen 85°C und 95°C erhitzt und anschließend auf Hybridisierungstemperatur abgekühlt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in situ Hybridisierung bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, bevorzugt zwischen 20°C und 37°C stattfindet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Pro bengemische für eine in vivo Markierung der Target-DNA durch Mikroinjektion oder andere, membranpermeable Transportverfahren und -stoffe in die Zelle eingebracht und einer natürlichen Anlagerungsreaktion überlassen werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probengemische neben den markierten Oligonukleotiden in einer physiologischen Pufferlösung keine weiteren chemischen Agenzien oder Nukleinsäuregemische enthalten.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-Oli gonukleotide als Mikrotargets auf Chips aufgebracht sind und als Rezeptoren in der Sensorik dienen, wobei der Durchmesser der features kleiner oder gleich der auflösungsrelevanten Halbwertsbreite der Punktbildfunktion des zur Analyse verwendeten optischen Systems ist.

10. Verfahren zur Herstellung von DNA-Probengemischen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in DNA-Sequenzbibliotheken die spezifisch zu markierende, zusammenhängende DNA-Sequenz des genomischen Targets der linearen Länge L festgelegt wird, wobei die Länge L oder vollständig zusammenhängende Teilbereiche der Länge L so gewählt werden, daß der Durchmesser d_T der entsprechenden, gefalteten Chromosomenregion kleiner oder gleich der minimalen Halbwertsbreite des Hauptmaximums der auflösungsbestimmenden Punktbildfunktion des für die Analyse verwendeten optischen Systems ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Sequenz der Länge L alle Homopurin- und/oder Homopyrimidinsequenzen einer definierten Länge bestimmt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Chip features eingerichtet werden, die alle potentiell möglichen Oligonukleotidsequenzen aus Homopurin- und/oder Homopyrimidinsequenzen einer gegebenen Zahl größer oder gleich 15 Nukleotide von einer zu markierenden, zusammenhängenden DNA-Sequenz des Genoms der linearen Länge L enthält, wobei die Länge L oder vollständig zusammen hängende Teilbereich der Länge L so gewählt werden, daß der Durchmesser der entsprechenden, gefalteten Chromosomenregion kleiner oder gleich der minimalen Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des für die Analyse verwendeten optischen Systems ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß durch in situ Hybridisierung der fragmentierten DNA eines zu markierenden Genoms, Chromosoms oder Chromosomenabschnittes mit den Nukleotidsequenzen auf dem Chip die in dieser DNA vorkommenden Teilsequenzen aus Homopurin und/oder Homopyrimidinsequenzen einer gegebenen Zahl größer oder gleich 15 Nukleotide gewonnen werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die so bestimmten Teilsequenzen oder ein Teil davon synthetisiert und/oder amplifiziert werden.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen Teilsequenzen mit je einem oder mehreren Fluorochromen gleicher oder verschiedener spektraler Signatur markiert und anschließend alle oder ein für L repräsentativer Teil in einem definierten Mischungsverhältnis gemischt werden.