DE19641876A1

DE19641876A1 - Streptavidinmuteine

Info

Publication number: DE19641876A1
Application number: DE19641876A
Authority: DE
Inventors: Arne Skerra; Selma Voss
Original assignee: INST BIOANALYTIK GmbH
Current assignee: Iba 37079 Goettingen De GmbH
Priority date: 1996-10-10
Filing date: 1996-10-10
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2016-10-11
Also published as: DE59713038D1; EP0835934B9; EP0835934A2; EP0835934A3; US6103493A; DE19641876B4; EP0835934B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Streptavidinmuteine, Ver fahren zur Herstellung derartiger Proteine über rekombinante DNA-Technologie, sowie die Verwendung dieser Streptavidinmu teine zur Isolierung, Reinigung bzw. Bestimmung von biologi schen Substanzen, insbesondere von anderen rekombinanten Pro teinen.

Das System Biotin/Streptavidin ist ein heutzutage in der Mole kularbiologie allgemein bekanntes Bindungssystem, dessen Be deutung in den letzten Jahren erheblich zugenommen hat und welches in unterschiedlichen Anwendungsbereichen eingesetzt wird. Dabei macht man sich die spezifische Affinität zwischen Biotin und Streptavidin zunutze, die gleichzeitig mit einer Affinitätskonstante in der Größenordnung von 10¹³ eine der stabilsten bekannten nichtkovalenten Wechselwirkungen ist.

Wichtige herkömmliche Anwendungen bestehen in diversen Abtren nungs- und Nachweisverfahren unter Verwendung meist biotiny lierter Enzyme oder/und Antikörper in unterschiedlichen Varia tionen. Beispiele sind z. B. ELISA, Western Blot etc. Eine Voraussetzung für derartige Verfahren besteht darin, daß das im Verfahren in biotinylierter Form verwendete Reagenz bzw. Enzym zunächst in Reinform erhalten werden kann, um die Bioti nylierung, die in einer chemischen Reaktion erfolgt, durch führen zu können.

Für bestimmte Anwendungen ist jedoch eine Biotinylierung nicht oder zumindest nicht in einfacher Weise möglich, wie bei spielsweise beim Nachweis und bei der Aufreinigung rekombinant hergestellter Proteine, die zuvor noch nicht isoliert wurden. In der Vergangenheit wurde daher nach Wegen gesucht, das Bio tin/Streptavidin-System zu modifizieren, um seinen Anwendungs bereich zu erweitern.

Ein erfolgreicher Ansatz bestand in der Herstellung von Pep tidliganden, die ebenfalls eine spezifische Bindungsaffinität zu Streptavidin aufweisen. Geeignete Peptidliganden und ent sprechende Fusionsproteine sind in DE-OS 42 37 113 offenbart. Der Vorteil dieser Peptidliganden im Vergleich zu Biotin be steht im wesentlichen darin, daß deren kodierende Sequenz auf DNA-Ebene mit dem Gen eines gewünschten Proteins verknüpft und anschließend zusammen mit der des Proteins koexprimiert werden kann, wodurch ein mit dem Peptidliganden markiertes, d. h. an ihn fusioniertes, rekombinantes Protein gebildet wird. Auf grund der geringen Größe der Peptidliganden und der Tatsache, daß sie an den N- oder C-Terminus des gewünschten Proteins angehängt werden können, d. h. also in Bereichen, die für die Struktur und biochemische Funktion eines Proteins häufig keine große Bedeutung haben, ist es im allgemeinen auch nicht not wendig, nach der Isolierung und vor Verwendung des Proteins zu anderen Zwecken den Peptidliganden wieder abzuspalten, so daß auch diesbezüglich eine günstige Verfahrensökonomie gegeben ist. In der Tat ist bisher kein Fall bekannt geworden, bei dem eine Abspaltung erforderlich gewesen wäre. Sollte dennoch die Notwendigkeit der Abspaltung bestehen, kann dies durch Inse rierung einer Proteasespaltstelle zwischen Bindungspeptid und Proteinsequenz bewerkstelligt werden.

Geeignete derartige Peptidliganden sind ausführlich beschrie ben, beispielsweise bei Schmidt und Skerra, Protein Eng. 6 (1993), 109-122 und J. Chromatogr. A 676 (1994), 337-345 sowie bei Schmidt et al., J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766.

Vorteile des Streptavidin-Peptidligand-Systems bestehen darin, daß die Reinigung rekombinanter Proteine überhaupt möglich wird und daß diese Reinigung z. B. durch Affinitätschromatogra phie unter sehr milden Elutionsbedingungen erfolgen kann, da der gebundene Peptidligand als Teil des rekombinanten Proteins kompetitiv von Biotin bzw. dessen Derivaten verdrängt wird. Außerdem gelingt über den Peptidliganden der Nachweis des rekombinanten Proteins beispielsweise durch Western Blot, ELISA oder durch Immunmikroskopie mittels geeigneter Strepta vidinkonjugate.

Ein Nachteil dieses Systems bestand bisher in einer relativ niedrigen Affinität. Für den Komplex zwischen Streptavidin und dem als Strep-tag bezeichneten Peptidliganden (AWRHPQFGG) wurde mittels isothermer Titrationskalorimetrie eine Affini tätskonstante von 2,7 . 10⁴ M^-1 bestimmt. Obwohl es Hinweise gab, daß die Bindung für ein den Peptidliganden enthaltendes Fusionsprotein etwas stärker sein könnte, ist es wün schenswert, über ein System mit prinzipiell verbesserter Affi nität zu verfügen.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand somit darin, das System Streptavidin/Peptidligand hinsichtlich der Bindungsstärke zu optimieren.

Nach anfangs durchgeführten Versuchen, die Sequenz des Peptid liganden weiter zu optimieren, mußte davon ausgegangen werden, daß die Peptidliganden gemäß DE-OS-42 37 113 offensichtlich bereits ein Optimum darstellten und dieser Ansatz somit wenig erfolgversprechend war.

Mit der Verfügbarkeit der Kristallstruktur des Strepta vidin/Peptidligand-Komplexes in hoher Auflösung konnte zwar ein besseres Verständnis der molekularen Wechselwirkungen bzw. der strukturellen Merkmale gewonnen werden (Schmidt et al. 1996), supra), es konnte aus diesen Strukturdaten jedoch keine klare Information erhalten werden ob und in welcher Weise eine Modifizierung der Peptidsequenz oder des Streptavidins in ra tionaler Weise durchgeführt werden kann, um die Affinität zu verbessern und somit die eingangs gestellte Aufgabe zu lösen.

In einem evolutiven Forschungsansatz wurde nun überraschender weise festgestellt, daß eine Verbesserung der Bindungsaffi nität für das Streptavidin/Peptidligand-System durch Mutation im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 53 von Streptavidin erreicht werden kann.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Poly peptid, ausgewählt aus Muteinen von Streptavidin, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es (a) innerhalb des Bereichs der Aminosäure-Positionen 44 bis 53, bezogen auf die Aminosäu resequenz von Wildtyp-(wt)-Streptavidin (Nomenklatur gemäß Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882), mindestens eine Mutation, insbesondere einen Aminosäureaus tausch enthält und (b) eine höhere Bindungsaffinität für Pep tidliganden, umfassend die Aminosäuresequenz Trp-X-His-Pro- Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeu ten, aufweist als wt-Streptavidin.

Außerhalb des Bereichs der Aminosäurepositionen 44 bis 53 können die Streptavidinmuteine der vorliegenden Erfindung der Aminosäuresequenz von wt-Streptavidin entsprechen. Anderer seits kann die Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Muteine auch außerhalb des Bereichs der Aminosäuren 44 bis 53 Unter schiede zur wt-Streptavidinsequenz aufweisen. Derartige Va rianten der Streptavidinsequenz umfassen natürlich vorkommende sowie künstlich erzeugte Varianten und unter den Abweichungen werden Austausche, Insertionen, Deletionen von Aminosäurere sten sowie N- oder/und C-terminale Additionen verstanden.

Die Angabe "höhere Bindungsaffinität" bezieht sich im Sinne der vorliegenden Anmeldung auf einen Komplex aus einem erfin dungsgemäßen Streptavidinmutein und einem Peptidliganden gemäß DE-OS-42 37 113 und kann durch übliche Verfahren, z. B. ELISA, Fluoreszenztitration oder Titrationskalorimetrie bestimmt werden. Die auf diese Weise bestimmte Bindungsaffinität wird durch Kenngrößen angegeben, wie etwa Affinitäts- und Dissozia tionskonstante oder thermodynamische Parameter. Die Erhöhung der Bindungsaffinität, die mit einem erfindungsgemäß innerhalb des Bereichs der Aminosäurepositionen 44 bis 53 veränderten Streptavidinmutein im Vergleich zum entsprechenden unveränder ten Streptavidin erhalten wird, beträgt im allgemeinen minde stens Faktor 5, bevorzugt mindestens Faktor 10 und stärker bevorzugt mindestens Faktor 20. Bevorzugte erfindungsgemäße Streptavidinmuteine umfassen mindestens eine Mutation im Be reich der Aminosäurepositionen 44 bis 47.

Bevorzugte erfindungsgemäße Streptavidinmuteine sind von Streptavidinvarianten abgeleitet, die am N- oder/und C-Termi nus verkürzt sind. Besonders bevorzugt sind die aus dem Stand der Technik bekannten Minimal-Streptavidine, die sowohl N- als auch C-terminal verkürzt sind. Ein bevorzugtes Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt außerhalb des mutage nisierten Bereichs die Aminosäuresequenz eines Minimal-Strep tavidins, das N-terminal im Bereich der Aminosäurepositionen 10 bis 16 beginnt und C-terminal im Bereich der Aminosäurepo sitionen 133 bis 142 endet. Besonders bevorzugt entspricht das Polypeptid außerhalb des Mutationsbereichs einem Minimal- Streptavidin, das eine Aminosäuresequenz von Position Ala¹³ bis Ser¹³⁹ umfaßt und gegebenenfalls einen N-terminalen Methionin rest aufweist. Die Numerierung von Aminosäurepositionen be zieht sich in dieser Anmeldung durchgehend auf die Numerierung von wt-Streptavidin (Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871-1882).

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Streptavidinmuteine sind dadurch gekennzeichnet, daß an Position 44 Glu durch eine hydrophobe aliphatische Aminosäure, z. B. Val, Ala, Ile oder Leu, ersetzt ist, an Position 45 eine beliebige Aminosäure vorhanden ist, an Position 46 eine hydrophobe aliphatische Aminosäure vorhanden ist oder/und an Position 47 Val durch eine basische Aminosäure, z. B. Arg oder Lys, insbesondere Arg, ersetzt ist. Streptavidinmuteine, bei denen die hydrophobe aliphatische Aminosäure an Position 46 Ala ist, d. h. daß an Position 46 kein Austausch vorliegt, oder/und bei denen die basische Aminosäure an Position 45 Arg ist, haben eine beson ders hohe Affinität für die bei Schmidt et al., Supra, be schriebenen Peptidliganden mit den Sequenzen AWRHPQFGG (Strep- tag) bzw. WSHPQFEK (Strep-tag II).

Spezifische Beispiele für erfindungsgemäße Streptavidinmuteine besitzen im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die Sequenzen Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ oder Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷.

Aus praktischen Erwägungen ist es wünschenswert, über einen weiteren Liganden zu verfügen, der aufgrund einer höheren Bin dungsaffinität oder/und bei Anwesenheit in höheren Konzentra tionen die Bindung der vorstehend definierten Peptidliganden (gemäß DE-OS-42 37 113) zum erfindungsgemäßen Streptavidinmu tein wieder auflösen kann. Auf diese Weise ist es möglich, einen gebundenen Peptidliganden bzw. Proteine, an die ein Peptidligand fusioniert ist, unter sehr milden Elutionsbedin gungen freizusetzen. Unter diesem Aspekt betrifft die vorlie gende Erfindung somit solche erfindungsgemäßen Streptavidinmu teine, deren Bindungsaffinität für Peptidliganden derart ist, daß sie kompetitiv durch andere Streptavidin-Liganden, z. B. Biotin, Iminobiotin, Liponsäure, Desthiobiotin, Diaminobiotin, HABA (Hdroxyazobenzolbenzoesäure) oder/und Dimethyl-HABA, wieder eluiert werden können. Die Verwendung von gefärbten Substanzen wie etwa HABA hat den Vorteil, daß die Elution visuell überprüft werden kann.

Ungeachtet dessen ist jedoch, wie vorstehend definiert, die Bindungsaffinität des Streptavidinmuteins für Peptidliganden höher als die des zugrundeliegenden wt-Streptavidins. Die Bindungsaffinität, ausgedrückt als Affinitätskonstante, ist somit bezogen auf den Peptidliganden ABRHPQFGG (im folgenden auch als Strep-tag bezeichnet) größer als 2,7 . 10⁴ M^-1 bzw. bezogen auf WSHPQFEK (im folgenden auch als Strep-tag II be zeichnet) größer als 1,4 . 10⁴ M^-1, d. h. größer als die ver öffentlichten Werte für die Komplexbildung der jeweiligen Peptidliganden mit wt-Streptavidin (innerhalb der Fehlergren zen). Im allgemeinen liegt die Affinitätskonstante für das Strep-tag II mindestens um einen Faktor 10, bevorzugt um einen Faktor 10 bis 200 über den jeweiligen Werten für wt-Streptavi din.

Für bestimmte Nachweisverfahren kann es bevorzugt sein, die Streptavidinmuteine der vorliegenden Erfindung in markierter Form zu verwenden. Demgemäß ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ein erfindungsgemäßes Polypeptid, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zumindest eine Markierung trägt. Geeignete Markierungsgruppen sind dem Fachmann bekannt und umfassen die üblichen Radio-, Fluoreszenz-, Lumineszenz- und Chromophormarkierungen sowie Substanzen bzw. Enzyme, die in einer chemischen oder enzymatischen Reaktion ein bestimmbares Substrat erzeugen. Dabei können alle für wt-Streptavidin be kannten Markierungen auch an die erfindungsgemäßen Streptavi dinmuteine gekoppelt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die eine für das Streptavidin kodierende Sequenz umfaßt. Eine derartige Nukleinsäure ist gegebenenfalls operativ mit einer für ein Signalpeptid kodierenden Sequenz verknüpft und in einer besonderen Ausführungsform ist die für das Signalpeptid kodierende Sequenz die Sequenz für das OmpA- Signalpeptid. Darüberhinaus können jedoch auch, insbesondere in Abhängigkeit des verwendeten Expressionssystems bzw. der Wirtszelle, andere Signalpeptide verwendet werden und sogar bevorzugt sein. Derartige Signalpeptide sind im Stand der Technik in großer Anzahl bekannt und werden hier nicht einge hend erläutert. Bevorzugt ist aber die cytoplasmatische Ex pression, d. h. mit einem Start-Methionin anstelle der Signal sequenz (vgl. Schmidt und Skerra (1994), supra).

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer vorstehend ge nannten Nukleinsäure in operativ funktioneller Umgebung ent hält. Unter einer operativ funktionellen Umgebung werden solche Elemente verstanden, die die Expression, d. h. Trans kription oder/und eine nachfolgende Prozessierung der mRNA ermöglichen, begünstigen, erleichtern oder/und erhöhen. Bei spiele für derartige Elemente sind etwa Promotoren, Enhancer, Transkriptionsinitiationsstellen und -terminationsstellen, Translationsinitiationsstellen, polyA-Stellen etc.

Der Vektor wird in Abhängigkeit vom vorgesehenen Expressions system ausgewählt und hierfür kommen sowohl single copy-Plas mide, multi copy-Plasmide als auch Vehikel, die eine Integra tion der Nukleinsäure in das Wirtsgenom begünstigen, in Be tracht. Geeignete Vektoren sind in großer Anzahl aus dem Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht ausführlich be schrieben. Sie enthalten gegebenenfalls übliche, für Vektoren verwendete Elemente, wie Resistenzen, Selektionsmarker oder/und Elemente, die z. B. eine Amplifizierung der Nuklein säure oder die Induktion der Expression gestatten.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die mit einem derartigen Vektor, welcher als In sert mindestens eine Kopie einer für ein erfindungsgemäßes Streptavidinmutein kodierenden Nukleinsäuresequenz trägt, transformiert oder transfiziert ist. Die Auswahl der Zelle ist nicht sonderlich kritisch und im allgemeinen können beliebige Zellen, die für derartige Zwecke geeignet sind, verwendet werden. Es kommen sowohl prokaryontische als auch eukaryon tische Zellen sowie Hefen in Betracht. Aus praktischen Gründen werden zur Expression eines unglykosilierten Proteins wie im vorliegenden Fall im allgemeinen prokaryontische Zellen bevor zugt und insbesondere E. coli.

Unter einem nochmals anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsge mäßen Streptavidinmuteins, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

(a) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für das Streptavidinmutein kodierende Nukleinsäure umfaßt,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Streptavidinmuteins erfolgt,
(c) Gewinnen des Polypeptids.

Bezüglich des Herstellungsverfahrens ist zu beachten, daß die erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine aufgrund ihrer Bindungs fähigkeit mit dem zelleigenen Biotin eine toxische Wirkung ausüben können. Die Bedingungen beim Kultivieren der Wirts zelle sollten daher so gewählt werden, daß das entstehende Expressionsprodukt entweder mittels einer geeigneten Signalse quenz aus dem Inneren der verwendeten Wirtszelle z. B. in das Periplasma oder das Kulturmedium ausgeschleust wird oder in Form unlöslicher Inclusion bodies (Einschlußkörper) im Inneren der Zelle aggregiert. Im ersteren Fall kann das erfindungs gemäße Streptavidinmutein aus der periplasmatischen Zellfrak tion oder dem Zellüberstand gewonnen werden, während im letz teren Fall Schritt (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Lyse der Wirtszellen, die Gewinnung des Streptavidinmuteins in Form von Inclusion bodies und die Renaturierung des Streptavi dinmuteins umfaßt. Als Wirtszelle ist in diesem Fall E. coli bevorzugt.

Die praktischen Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungs gemäßen Streptavidinmuteine bzw. das System Streptavidinmu tein/Peptidligand entsprechen im wesentlichen denjenigen der herkömmlichen Systeme Streptavidin/Biotin bzw. Streptavidin/ Peptidligand. Vorteile ergeben sich insbesondere in Situatio nen, bei denen eine höhere Bindungsstärke als zwischen nativem Streptavidin und Peptidligand erwünscht ist, bzw. in Situatio nen, bei denen eine Biotinylierung eines interessierenden Substrats nicht möglich oder ungünstiger zu bewerkstelligen ist als die entsprechende Verknüpfung mit einem Peptidligan den.

Die Vorzüge gegenüber dem herkömmlichen Streptavidin/Biotin- System kommen insbesondere bei der Affinitätschromatographie bzw. in Reinigungs-, Isolierungs- oder Bestimmungsverfahren für rekombinante Proteine zum Tragen. Demnach betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Strepta vidinmuteins in einem Verfahren zur Isolierung, Reinigung oder zum Nachweis eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Ami nosäure darstellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man eine das zu isolierende oder zu reinigende Protein enthaltende Flüssigkeit mit dem gegebenenfalls immobilisierten Streptavi dinmutein unter geeigneten Bedingungen in Kontakt bringt, um eine Bindung der Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu bewirken, den resultierenden Komplex aus der Flüssigkeit ab trennt und das Protein aus dem Komplex freisetzt oder nach weist. Besonders vorteilhaft wird die Peptidsequenz in Form des Strep-tag oder Strep-tag II gewählt. Vorzugsweise ist die Peptidsequenz an den N- oder/und C-Terminus des Proteins fu sioniert. Das Streptavidinmutein kann an eine Festphase gebun den oder mit ihr bindefähig sein.

Ein Vorzug bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Systems Streptavidinmutein/Peptidligand in einem Isolierungs- oder Reinigungsverfahren besteht darin, daß zur Elution des den Peptidliganden tragenden Fusionsproteins sehr milde Bedingun gen verwendet werden können. So kann eine mit dem Streptavi dinmutein gekoppelte Festphase, wie etwa eine Affinitätschro matographiesäule, an welche das Fusionsprotein adsorbiert wurde, mit einer ausreichenden Konzentration eines Liganden, ausgewählt aus Biotin und Derivaten davon, inkubiert werden, um das Fusionsprotein aus dem Komplex freizusetzen. In diesem Zusammenhang hat sich die Verwendung von Desthiobiotin als besonders vorteilhaft herausgestellt.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine in Nachweisverfahren kann im wesentlichen analog zu den entspre chenden Verfahren erfolgen, die für herkömmliches Streptavidin bekannt sind. Eine darüber hinausgehende Anwendungsmöglichkeit ergibt sich bei der qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X- His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man das zu bestim mende Protein mit einem markierten Streptavidinmutein unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung der Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu bewirken, in Kontakt bringt und die Markierung bestimmt. Ein derartiges Bestimmungsverfahren kann beispielsweise qualitativ zum Nachweis von Proteineri in We stern Blots oder quantitativ als ELISA durchgeführt werden. Geeignete Markierungen sind alle bekannten radioaktiven und nichtradioaktiven Markierungsgruppen, z. B. Lumineszenzgruppen, Enzyme, Metalle, Metallkomplexe etc. Das Streptavidin kann direkt z. B. durch kovalente Kopplung markiert sein. Aber auch indirekte Markierungen, z. B. markierte Anti-Streptavidin-Anti körper oder biotinylierte Enzyme usw. können eingesetzt wer den.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Strepatividinmuteine zur Immobilisierung eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X- His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist. Diese Immobilisierung er folgt vorzugsweise an mit Streptavidinmuteinen beschichteten Festphasen wie etwa Mikrotiterplatten, Mikrobeads aus organi schen oder aus paramagnetischen Materialien oder Sensorchips.

Außerdem ist es natürlich auch möglich, die erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine im herkömmlichen Streptavidin/Biotin(deri vat)-System zu verwenden. In anderen Worten bedeutet dies die Verwendung der erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine zur Be stimmung oder Gewinnung von Substanzen, die eine mit Strepta vidin bindefähige Gruppe tragen. Sofern nur ein Teil des wt- Streptavidins durch die erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine ersetzt wird, können dabei über die Ausbildung gemischter Tetramere nochmals besondere Wirkungen erzielt werden.

Gemäß einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch einen Reagenzienkit, der ein erfindungsgemäßes Streptavi dinmutein sowie gegebenenfalls übliche Puffer-, Hilfs- und Zusatzstoffe umfaßt. Ein solcher Reagenzienkit ist insbeson dere zur Verwendung in einem vorstehend beschriebenen Isolie rungs-, Reinigungs- oder Bestimmungsverfahren vorgesehen. Der Kit ist jedoch auch für andere Verfahren geeignet, bei denen das herkömmliche Streptavidin/Biotin-System verwendet wird, z. B. für Nukleinsäurehybridisierungsassays oder Immunoassays. Der Reagenzienkit kann das erfindungsgemäße Streptavidinmutein in festphasengebundener oder/und markierter Form enthalten.

Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die nachste henden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in denen:

Fig. 1 eine Schemazeichnung des Vektors pASK75-SAp dar stellt;

Fig. 2 eine Graphik darstellt, welche die Bindungsaffinität von rekombinantem wt-Streptavidin im Vergleich zu erfindungsgemäßen Streptavidinmuteinen in einem ELISA zeigt;

Fig. 3 die Bindungsaffinität von rekombinantem wt-Strepta vidin im Vergleich zu einem erfindungsgemäßen Strep tavidinmutein in einer Fluoreszenztitration zeigt und

Fig. 4 die Reinigung eines Strep-tag-Fusionsproteins unter Verwendung eines Streptavidinmuteins durch Affini tätschromatographie zeigt.

Fig. 1 zeigt den Expressionsvektor pASK75-SAp, der eine für ein Minimal-Streptavidin (Ala¹³ bis Ser¹³⁹) kodierende Sequenz, eine für das OmpA-Signalpeptid kodierende Sequenz, sowie den Tetracyclin Promotor/Operator (tet^P/O) zur Transkriptionsregula tion enthält.

Weitere gekennzeichnete Regionen des Vektors sind die inter genische Region des filamentösen Phagen f1 (f1-IG), der Repli kationsursprung (ori), das β-Lactamasegen (bla) für die Ampi cillinresistenz, das Tetracyclinrepressorgen (tetR) und der Lipoprotein-Transkriptionsterminator (t_lpp).

Das die kodierenden Sequenzen für Signalpeptid und Minimal- Streptavidin enthaltende hybride Strukturgen beginnt an der Xbal-Stelle und reicht stromabwärts bis zur HindIII-Stelle. Der Übergang zwischen Signalsequenz und Streptavidin erfolgt an der StuI/PvuII-Stelle. Die SacII-Stelle, die zum Inserieren der mutierten Streptavidingensequenzen verwendet wurde, ist ebenfalls angegeben.

Fig. 2 zeigt die verbesserte Affinität der erfindungsgemäßen Streptavidinmuteine für den Peptidliganden Strep-tag II in einem ELISA. Dazu wurden jeweils Reihen einer ELISA-Platte mit äquivalenten Konzentrationen eines rekombinanten wt-Streptavi din (Raute), des Muteins "1" (Kreis) oder "2" (Quadrat) be schichtet oder lediglich mit BSA (Kreuz) abgesättigt. Nach Absättigen und Waschen wurden die Vertiefungen mit einem ge reinigten Fusionsprotein aus bakterieller Alkalischer Phospha tase (PhoA) und Strep-tag II in den aus dem Graph ersichtli chen Konzentrationen inkubiert. Nach Waschen zur Entfernung von ungebundenem Protein wurde die Aktivität des gebundenen PhoA-Strep-tagII-Fusionsproteins in Gegenwart von p-Nitrophe nol gemessen. Die Daten wurden durch nicht-lineare Regression nach der Methode der kleinsten Fehlerquadrate angepaßt. Die folgenden K_d-Werte wurden erhalten: 0,21 µM für Mutein "1"; 0,30 µM für Mutein "2"; 18 µM für rekombinantes wt-Streptavi din.

Fig. 3 ist eine Graphik, welche die Bindungsaffinität von rekombinantem wt-Streptavidin im Vergleich zu erfindungsgemä ßen Streptavidinmuteinen in einer Fluoreszenztitration zeigt.

Eine Lösung des wt-Streptavidins (Raute), des Muteins "1" (Kreis) oder "2" (Quadrat) wurde mit einer Lösung des synthe tisierten Strep-tag II-Peptids, welches N-terminal mit Anthra nilsäure derivatisiert war, titriert und die Fluoreszenz der Tryptophan- und Tyrosinreste dabei gemessen (Anregung bei 280 nm; Emission bei 340 nm). Die experimentellen Bedingungen sind in Beispiel 6 beschrieben. Durch nicht-lineare Regression der Datenpunkte nach der Theorie einfacher Komplexbildung wurde für den Peptidkomplex ein K_D-Wert von 13,0 ± 1,3 µM für wt- Streptavidin ermittelt, während die Mutanten "1" und "2" K_D- Werte von 1,37 ± 0,08 µM bzw. 1,02 ± 0,04 µM zeigten.

Fig. 4 zeigt die Reinigung des Fusionsproteins aus der bakte riellen Alkalischen Phosphatase und Strep-tag II durch Affini tätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten er findungsgemäßen Streptavidinmuteins "1".

Fig. 4 zeigt das Elutionsprofil (anhand der Absorption des Eluats bei 280 nm) bei der affinitätschromatographischen Rei nigung des Fusionsproteins der bakteriellen Alkalischen Phos phatase mit dem Strep-tag II aus dem bakteriellen periplasma tischen Zellextrakt unter Verwendung des immobilisierten Streptavidinmuteins "1". Die experimentellen Bedinungen sind in Beispiel 4 beschrieben. Nach Entfernung der Wirtsproteine durch Waschen mit Chromatographiepuffer wurde nacheinander mit Lösungen von Diaminobiotin (dab), Desthiobiotin (dtb) und Biotin eluiert. In Gegenwart von Destiobiotin wurde das gefun dene Fusionsprotein nahezu quantitativ eluiert. Anschließende Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte eine praktisch vollständige Reinheit des so isolierten Proteins.

Beispiele Allgemeine Methoden

DNA-Manipulationen wurden nach gängigen gentechnischen Metho den durchgeführt (s. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press). Zur Klonierung und Expression wurde im allgemeinen der E. coli K12-Stamm JM83 (Yanisch-Peron et al., (1985), Gene 33, 103-119) verwendet, mit Ausnahme der Expression unter Kontrolle des T7-Promotors, die gemäß Schmidt und Skerra (1994), supra, durchgeführt wurde. Sequenzierungen wurden durch Plasmidse quenzierung nach der üblichen Didesoxytechnik durchgeführt, unter Verwendung des T7-Sequenzierkits von Pharmacia, Freiburg. Die Synthese der Primer bzw. Oligonukleotide er folgte unter Verwendung eines Applied Biosystems DNA-Synthese automaten.

Beispiel 1 Herstellung einer Expressionsbank für Streptavidinmuteine

Zur Konstruktion des Vektors pASK75-SAp, der die für ein Mini mal-Streptavidin kodierende Gensequenz, fusioniert an die kodierende Sequenz des OmpA-Signalpeptids, trägt (vgl. Fig. 1), wurde die für Minimal-Streptavidin kodierende Sequenz aus dem Expressionsvektor pSA1 (Schmidt und Skerra, (1994), supra) unter Verwendung der Primer

und Taq-DNA-Polymerase durch PCR amplifiziert, das Reaktions produkt über Gelelektrophorese gereinigt, mit PvuII und HindIII geschnitten und in das mit StuI und HindIII geschnit tene Vektorfragment von pASK75 ligiert. Die vollständige Nu kleotidsequenz von pASK75 ist in DE-A-44 17 598.1 angegeben. Der dadurch erzeugte Vektor pASK75-SAp umfaßt eine DNA-Se quenz, die für das OmpA-Signalpeptid, fusioniert an Minimal- Streptavidin, beginnend mit Ala¹³ kodiert.

Eine Plasmidbank mit DNA-Sequenzen, die für im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 (bezogen auf wt-Streptavidin) mutagenisierte Streptavidinderivate kodieren, wurde herge stellt durch PCR-Amplifizierung von pASK75-SAp unter Verwen dung der folgenden Primer:

Auf diese Weise wurden DNA-Sequenzen erzeugt, die an jeder der vier Positionen 44 bis 47 32-fach degenerierte Codons für jeweils alle 20 Aminosäuren bzw. ein Stopcodon enthielten. Zusätzlich wurde an der Stelle im Bereich der Codons für die Aminosäuren 41/42 eine KpnI-Restriktionsstelle erzeugt. Die resultierenden PCR-Produkte wurden durch Gelelektrophorese ge reinigt, mit SacII und HindIII gespalten und in das entspre chend gespaltene Vektorfragment von pASK75-SAp ligiert.

Mit dem Vektorgemisch wurden E.coli JM83-Zellen unter Verwen dung des Calciumchloridverfahrens (Sambrook et al., 1989) transformiert.

Beispiel 2 Identifizierung von Streptavidinmuteinen mit erhöhter Bin dungsaffinität für Peptidliganden

Zur Identifizierung von Streptavidinmuteinen mit erhöhter Bindungsaffinität für Peptidliganden wurde ein Fusionsprotein aus der Alkalischen Phosphatase von E.coli (PhoA) und dem Strep-tagII-Peptid (WSHPQFEK) hergestellt, welches an ihren C- Terminus angehängt wurde. Hierzu wurde das vollständige phoA- Gen einschließlich der eigenen Signalsequenz und Translations initiationsregion aus chromosomaler E.coli K12 W3110-DNA (Bachmann, Bacteriol. Rev. 36 (1972), 525-557) unter Verwen dung der Phosphorthioat-Primer

und Pfu-DNA-Polymerase gemäß einer von Skerra (Nucleic Acids Res. 20 (1992), 3551 bis 3554) publizierten Methode durch PCR amplifiziert. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde gereinigt und mit dem Restriktionsenzym XbaI geschnitten. Dieses DNA-Fragment wurde dann in mehreren Schritten unter Austausch der Region zwischen XbaI und Eco47III in das Plasmid pASK75-strepII (konstruiert aus pASK75 durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung des Oligodeoxynukleotids 5'-CAC AGG TCA AGC TTA TTA TTT TTC GAA CTG CGG GTG AGA CCA AGC GCT GCC TGC) inseriert, wobei das Expressionsplasmid pASK75-PhoA strep II erhalten wurde.

Die Proteinproduktion erfolgte in 2 l LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin, wobei die Genexpression bei A₅₅₀ = 0,5 durch Zugabe von 0,2 µg/ml Anhydrotetracyclin induziert wurde. Die Induk tion erfolgte über Nacht bei einer Temperatur von 37°C. Das PhoA/Strep-tag II Fusionsenzym wurde dann aus der periplasma tischen Zellfraktion durch Streptavidin-Affinitätschromatogra phie unter Verwendung von Diaminobiotin als Elutionsmittel gemäß der Prozedur von Schmidt und Skerra (1994), supra, ge reinigt. Aufgrund des Vorhandenseins von Zn(II)- und Mg(II)- Ionen im aktiven Zentrum des Enzyms enthielt der Chromato graphiepuffer kein EDTA.

Die in Beispiel 1 erhaltene Plasmidbank wurde auf einer hydro philen GVWP-Membran (Millipore, Eschborn) ausplattiert, die auf eine Agarplatte mit LB-Medium enthaltend 100 µg/ml Ampi cillin gelegt worden war. Die Membran wurde bei 37°C für 7 bis 8 Stunden inkubiert, bis Kolonien sichtbar wurden.

Dann wurde eine zweite Membran vorbereitet, eine Immobilon P- Membran (Millipore, Eschborn), die mit Anti-Streptavidin- Immunglobulin (Sigma, Deisenhofen) in einer Konzentration von 720 µg/ml in PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl) ca. sechs Stunden beschichtet und danach in 3% w/v Rinderserumal bumin (BSA), 0,5% v/v Tween in PBS ca. 2 Stunden blockiert wurde.

Diese zweite Membran wurde auf eine M9-Minimalagarplatte, die 100 µg/ml Ampicillin und 0,2 µg/ml Anhydrotetracyclin ent hielt, gelegt. Anschließend wurde die GVWP-Membran mit den Kolonien auf der Oberseite auf die zweite Membran gelegt und die relativen Positionen der beiden Membranen markiert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die obere Mem bran mit den Kolonien abgenommen und auf einer frischen LB- Ampicillin-Agarplatte bei 4°C gelagert. Die zweite Membran wurde ebenfalls von der Agarplatte abgenommen und dreimal eine Minute unter Schütteln in PBS/Tween (0,1% v/v Tween in PBS) gewaschen. Danach wurde die Membran mit 10 ml frischer PBS/Tween-Lösung, enthaltend das gereinigte PhoA/Strep-tagII-Fu sionsprotein (ca. 1-2 µg/ml), versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde jeweils zweimal in PBS/Tween und PBS-Puffer nachgewaschen. Die Signalentwicklung erfolgte während 1 bis 2 Stunden in Gegenwart von 10 ml AP- Puffer (100 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) unter Zugabe von 30 µl Brom-Chlor-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml in Dimethylformamid) und 5 µl Nitroblau-Tetrazolium (NBT) (75 mg/ml in 70% v/v Dimethylformamid). Den dabei entstandenen Farbpunkten wurden entsprechende Kolonien auf der ersten Mem bran zugeordnet. Nach Isolierung und Kultivierung dieser Klone wurden zwei Streptavidinmuteine "1" und "2" identifiziert. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen in der mutagenisierten Region für wt-Streptavidin und für die Muteine waren wie folgt:

Beispiel 3 Herstellung der Streptavidinmuteine im präparativen Maßstab

Zur Herstellung der Streptavidinmuteine im präparativen Maß stab wurde das bekannte Expressionssystem für rekombinantes Minimal-Streptavidin (Schmidt und Skerra (1994), supra) ver wendet. Dazu wurde aus dem Vektor pSA1, der die kodierende Region von wt-Streptavidin trägt und den T7-Promotor enthält, der Großteil der kodierenden Region unter Verwendung der sin gulären SacII- und HindIII-Restriktionsstellen entfernt und durch die entsprechenden Bereiche aus den mutierten pASK75- SAp-Plasmiden setzt. wt-Streptavidin und die Streptavidinmu teine wurden danach in Form cytoplasmatischer Einschlußkörper exprimiert, solubilisiert, renaturiert und durch fraktionierte Ammoniumsulfatpräzipitation gereinigt, wie bei Schmidt und Skerra (1994), supra beschrieben. Die Reinheit der Proteine wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung des diskontinuierlichen Puffersystems von Fling und Gregerson (Anal. Biochem. 155 (1986), 83-88) überprüft. Die Charakterisierung der gereinig ten, gegen Wasser dialysierten Proteine durch Elektrospray- Ionisations-Massenspektrometrie ergab Massen von 13334 für das rekombinante wt-Streptavidin (theoretisch 13331,5), 13371 für Mutein "1" (theoretisch 13372,6) und 13344 für Mutein "2" (theoretisch 13342,5).

Beispiel 4 Affinitätschromatographie

Die in Beispiel 3 hergestellten Streptavidinmuteine sowie wt- Streptavidin wurden mit einer Beladung von 5 mg Protein pro ml gequollenem Gel an NHS-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Freiburg) gekoppelt (Schmidt & Skerra, 1994, Supra). Nach Blockierung der restlichen aktiven Gruppen mit 100 mM Tris/HCl, pH 8,0 über Nacht wurden 2 ml des Gels in eine Säule mit einem Durchmesser von 7 mm eingebracht. Um das Verhalten der auf diese Weise immobilisierten Streptavidinmuteine bei der Affinitätsreinigung von Strep-tag oder Strep-tag II-tragenden Fusionsproteinen zu untersuchen, wurde der rekombinante Prote aseinhibitor Cystatin (Schmidt & Skerra 1994, supra), der entweder mit dem Strep-tag oder dem Strep-tag II fusioniert war, sowie das vorstehend erwähnte PhoA/Strep tag-II Fusions protein verwendet. Die Fusionsproteine wurden in einem Expres sionsystem durch Sekretion in den periplasmatischen Raum pro duziert und die periplasmatische Zellfraktion wurde wie in Schmidt & Skerra (1994), supra beschrieben, präpariert.

Die Chromatographie erfolgte in Gegenwart von 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, enthaltend 1 mM EDTA (außer bei PhoA) unter Verwendung einer Flußrate von ca. 20 ml/h und Messung der Eluatabsorption bei 280 nm. Nach Auftragen einer Probe von 10 ml, entsprechend der periplasmatischen Zellfraktion von 1 l E.coli Kulturmediu m, wurde die Säule gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm die Basislinie erreicht hatte. Danach wurde gebundenes Protein schrittweise eluiert, durch Auftragen von jeweils 10 ml Diami nobiotin, Desthiobiotin und Biotin (alle von Sigma, Deisenho fen) in einer Konzentration von 2,5 mM in Chromatographiepuf fer und in der angegebenen Reihenfolge.

Es zeigte sich, daß im Gegensatz zu wt-Streptavidin die Anwen dung von Diaminobiotin bei den Streptavidinmuteinen nicht zu einer Elution führte. Bei Verwendung des mit höherer Affinität an Streptavidin bindenden Biotinderivats Desthiobition wurde auch bei den Muteinen eine Elution in einem scharfen Maximum erreicht. Diese war quantitativ, da bei der nachfolgenden Elu tion mit Biotin keine wesentliche Menge an Fusionsprotein im Eluat nachgewiesen werden konnte (vgl. Fig. 4).

Beispiel 5 ELISA

Zur Bestimmung der Bindungsaffinität der Streptavidinmuteine für den Peptidliganden Strep-tagII wurde ein ELISA durchge führt.

Die Vertiefungen einer 96-Loch Mikrotiterplatte (Becton Dik kinson and Co., Oxnard, CA) wurden mit 100 µl einer Lösung von rekombinantem wt-Streptavidin bzw. der Muteine "1" oder "2" in einer Konzentration von jeweils 100 µg/ml in 50 mM NaHCO₃, pH 9,6 über Nacht beschichtet. Die Vertiefungen wurden danach 2,5 h mit 3% w/v BSA, 0,5% v/v Tween in PBS blockiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS/Tween wurden 50 µl des gleichen Puffers zu jeder Vertiefung gegeben. In die erste Vertiefung in jeder Reihe wurden 20 µl einer Lösung aus 20 µl von 4,85 µM gereinigtem und dialysiertem PhoA/Strep tag II Fusionsprotein plus 30 µl PBS/Tween gegeben und gemischt. Für die weiteren Vertiefungen einer Reihe wurde eine Verdünnungsserie erstellt, indem 50 µl (von insgesamt 100 µl) aus der ersten Vertiefung herauspipettiert und mit dem Inhalt (50 µl) der nächsten Ver tiefung in derselben Reihe vermischt wurden usw. Auf diese Weise wurden Konzentrationen des Fusionsproteins zwischen 970 nM in der ersten Vertiefung jeder Reihe und 0,19 nM in der zehnten Vertiefung erhalten.

Nach einstündiger Inkubation wurden die Lösungen entfernt und die Vertiefungen jeweils zweimal mit PBS/Tween und mit PBS gewaschen. Danach wurden 100 µl einer Lösung aus 0,5 mg/ml p- Nitrophenylphosphat in 1 mM ZnSO₄, 5 mM MgCl₂, 1 mM Tris/HCl, pH 8,0 in jede Vertiefung pipettiert. Die Aktivität des gebun denen Fusionsproteins wurde unter Verwendung eines SpektraMAX 250 Photometers (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) als Absorp tionsänderung bei 410 nm pro Zeit gemessen.

Die Auswertung der Daten erfolgte unter der Annahme eines einfachen Bindungsgleichgewichts zwischen Streptavidin (Mu tein), Monomeren (P) und PhoA/Strep-tag II Fusionsprotein (L), wodurch die Dissoziationskonstante zu K_D = [P] [L]/[P.L] gegeben ist. Unter der Bedingung, daß [P]_TOT = [P] + [P.L] und daß [L] sehr viel größer als [P.L] ist, so daß [L]_TOT ungefähr gleich [L] ist, gilt für die Menge des gebundenen Fusionsproteins [P.L] = [L]_TOT [P]_TOT/(K_D + [L]_TOT). Die graphische Auswertung der erhaltenen Versuchsergebnisse ist in Fig. 2 gezeigt.

Aus den Bindungskurven ist ersichtlich, daß die zwei Strepta vidinmuteine eine sehr ähnliche Affinität für das Strep-tag II Fusionsprotein aufweisen, die um mehr als eine Größenordnung über der Affinität von wt-Streptavidin liegt.

Beispiel 6 Fluoreszenztitration

Zur Bestimmung der Dissoziationskonstante des 1 : 1-Komplexes aus den Streptavidinmuteinen (als Monomer betrachtet) und dem Peptidliganden wurde eine Fluoreszenztitration mit dem peptid chemisch synthetisierten Strep-tag II durchgeführt.

Das Peptid mit der Sequenz Abz-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu- Lys-COOH (Abz steht für o-Aminobenzoesäure, d. h. Anthranilsäu re) wurde an der festen Phase schrittweise aus Fmoc-geschützt en Aminosäuren nach dem Fachmann bekannten Methoden in der Reihenfolge vom C-Terminus zum N-Terminus synthetisiert, wobei Abz als Boc-geschütztes Derivat im letzten Schitt gekoppelt wurde. Das Peptid wurde anschließend vom Träger abgespalten und von den Schutzgruppen befreit. Nach Reinigung durch HPLC wurde die Molmasse mittels Felddesorptions-Massenspektrometrie bestätigt.

Die Fluoreszenztitration wurde in einer 1.1 cm²-Quarzküvette, welche bei 25°C thermostatisiert war, mit einem LS50-Fluores zenzspektrophotometer der Firma Perkin Elmer (Langen) durch geführt. Die Wellenlängen für Anregungen bzw. Emission betru gen 280 nm sowie 340 nm, bei einer jeweiligen Schlitzbreite von 5 nm. 2 ml der Lösung von wt-Streptavidin bzw. der Muteine "1" und "2", welche wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und gegen 1 mM EDTA, 100 mM Tris/HCl pH 8,0 dialysiert worden waren, wurden mit einer Konzentration von 1 µM (absorptions photometrisch bestimmt für das jeweilige Monomer unter Ver wendung eines Extinktionskoeffizienten von ε₂₈₀ = 40455 M^-1 cm^-1) in der Küvette vorgelegt. Dann wurden Volumina von 1 µl oder 4 µl einer 0,5 mM Lösung des Peptids in dem gleichen Puffer wiederholt zupipettiert (insgesamt 40 µl) und nach Mischen mit einem Rührfisch die Fluoreszenzintensität abgelesen. Die Aus wertung der Daten erfolgte wie bei Fig. 3 beschrieben.

Claims

1. Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen von Streptavidin, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) innerhalb des Bereichs der Aminosäurepositio nen 44 bis 53, bezogen auf die Aminosäuresequenz von Wildtyp-Streptavidin, mindestens eine Mutation enthält und (b) eine höhere Bindungsaffinität für Peptidliganden, umfassend die Aminosäuresequenz Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y- Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeu ten, aufweist als wt-Streptavidin.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Mutein eines Minimal-Streptavidins ist, das N- terminal im Bereich der Aminosäuren 10 bis 16 von Wild typ-Streptavidin beginnt und C-terminal im Bereich der Aminosäuren 133-142 von Wildtyp-Streptavidin endet.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Mutation im Bereich der Aminosäure positionen 44 bis 47 vorliegt.

4. Polypeptid nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 44 Glu durch eine hydrophobe aliphatische Aminosäure ersetzt ist, an Position 45 eine beliebige Aminosäure vorhanden ist, an Position 46 eine hydrophobe aliphatische Aminosäure vorhanden ist oder/und an Posi tion 47 Val durch eine basische Aminosäure ersetzt ist.

5. Polypeptid nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 46 Ala vorhanden ist.

6. Polypeptid nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß an Position 47 Arg vorhanden ist.

7. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die Sequenz Val⁴⁴-Thr⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ vorliegt.

8. Polypeptid nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Bereich der Aminosäurepositionen 44 bis 47 die Sequenz Ile⁴⁴-Gly⁴⁵-Ala⁴⁶-Arg⁴⁷ vorliegt.

9. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsaffinität für den Peptidliganden derart ist, daß eine kompetitive Elution durch Streptavidin- Liganden, ausgewählt aus Biotin, Iminobiotin, Liponsäure, Desthiobiotin, Diaminobiotin, HABA oder/und Dimethyl- HABA erfolgen kann.

10. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Affinitätskonstante des Komplexes aus Polypeptid und Peptidligand, bezogen auf AWRHPQFGG < 2,7 . 10^-4 M^-1, und bezogen auf WSHPQFEK < 1,4 . 10⁴ M^-1 ist.

11. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Markierungsgruppe trägt.

12. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für das Streptavidinmutein nach einem der Ansprüche 1 bis 10 kodierende Sequenz umfaßt.

13. Vektor, umfassend mindestens eine Kopie einer Nuklein säure nach Anspruch 12 in operativ funktioneller Umge bung.

14. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach Anspruch 13 transformiert oder transfiziert ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Streptavidinmuteins nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(a) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für das Streptavidinmutein ko dierende Nukleinsäure umfaßt,
(b) Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, bei denen eine Expression des Streptavidinmuteins er folgt,
(c) Gewinnen des Polypeptids.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei Schritt (c) Lyse der Wirtszellen, Gewinnung des Streptavidinmuteins in Form von Inclusion bodies und Renaturierung des Streptavidinmuteins umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Expression in Schritt (b) die Expression eines Signalpeptid-tragenden Streptavidins und dessen Sekretion in das Periplasma der Wirtszelle oder das Kulturmedium umfaßt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Wirtszelle E. coli ist.

19. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An sprüche 1 bis 11 in einem Verfahren zur Isolierung, Rei nigung oder Bestimmung eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z entwe der beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man eine das zu isolierende, zu reinigende oder zu bestimmende Protein enthaltende Flüs sigkeit mit dem Streptavidinmutein unter geeigneten Be dingungen, um eine Bindung der Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu bewirken, in Kontakt bringt, den resultierenden Komplex aus der Flüssigkeit abtrennt und das Protein gegebenenfalls aus dem Komplex freisetzt oder bestimmt.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Streptavidinmutein an eine Festphase gebunden oder mit ihr bindefähig ist.

21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Freisetzen des Fusionsproteins aus dem Kom plex den Komplex mit einer ausreichenden Menge eines Liganden für das Streptavidinmutein ausgewählt aus Biotin und Derivaten davon inkubiert.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Biotinderivat Desthiobiotin ist.

23. Verwendung eines markierten Streptavidinmuteins nach Anspruch 11 in einem Verfahren zur Bestimmung eines Pro teins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His- Pro-Gln-Phe-Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure dar stellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, wobei man eine das zu bestimmende Protein mit dem markierten Streptavidinmu tein unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung der Peptidsequenz an das Streptavidinmutein zu bewirken, in Kontakt bringt, und die Markierung bestimmt.

24. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An sprüche 1 bis 11 zur Immobilisierung eines Proteins, das mit einer Peptidsequenz der Formel Trp-X-His-Pro-Gln-Phe- Y-Z, wobei X eine beliebige Aminosäure darstellt und Y und Z entweder beide Gly oder Y Glu und Z Arg oder Lys bedeuten, fusioniert ist, an einer Festphase.

25. Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptidsequenz ausgewählt wird aus AWRHPQFGG oder WSHPQFEK.

26. Verwendung eines Streptavidinmuteins nach einem der An sprüche 1 bis 11 zur Bestimmung oder Gewinnung von Sub stanzen, die eine mit Streptavidin bindefähige Gruppe tragen.

27. Reagenzienkit zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 26, umfassend ein Streptavidinmutein nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie gegebenenfalls übliche Puffer-, Hilfs- und Zusatzstoffe.