DE19530107A1 - Verfahren zur gezielten Veränderung von Zell-DNA - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Veränderung von Zell-DNA
sowie ein hierfür verwendbares Mittel.
Seit langem werden Versuche unternommen, Zell-DNA zu verändern. Beispiels
weise werden Viren, insbesondere Retroviren, oder Teile davon als Vektoren
verwendet, Gene in Zell-DNA einzubringen. Sämtlichen Versuchen mangelt es
allerdings daran, daß die Gene nicht gezielt mit hoher Häufigkeit und ohne
Selektion in die Zell-DNA, d. h. an definierte Stellen dieser, eingebracht werden
können. Dies ist aber unerläßlich, wenn einzelne Bereiche einer Zell-DNA genau
verstanden bzw. bei Vorliegen von Defekten therapiert werden sollen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, mit dem Zell-DNA mit hoher Häufigkeit und ohne Selektion
gezielt verändert werden kann.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände der Patentansprüche erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur gezielten
Veränderung von Zell-DNA, das sich dadurch auszeichnet, daß große DNA-
Fragmente in Zellen eingebracht werden und die Zell-DNA durch homologe
Rekombination mit den großen DNA-Fragmenten verändert wird.
Der Ausdruck "Zell-DNA" umfaßt jegliche DNA von Zellen, wie chromosomale
und extrachromosomale DNA.
Der Ausdruck "große DNA-Fragmente" umfaßt DNA-Fragmente jeglicher Art, die
zu Bereichen einer Zell-DNA ausreichend homolog sind, so daß eine homologe
Rekombination zwischen der Zell-DNA und den DNA-Fragmenten erfolgen kann,
und mehrere 100 Kilobasen (kb), vorzugsweise etwa 700 kb oder mehr und
besonders bevorzugt etwa 1000 kb oder mehr aufweisen. Die großen DNA-
Fragmente können im ganzen oder teilweise mit der Zell-DNA homolg rekom
biniert werden.
Vorzugsweise umfassen die DNA-Fragmente regulatorische, kodierende und/oder
nicht-kodierende Sequenzen. Diese Sequenzen können von der DNA eines oder
mehrerer Gewebe bzw. Organismen stammen. Auch können die Sequenzen
künstlicher Art sein, d. h. nicht in der Natur vorliegend. Vorzugsweise kodieren
die Sequenzen für ein oder mehrere Gene bzw. Teile davon. Diese Gene bzw.
ihre Teile können in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen. Letzterer Fall
umfaßt Mutationen, wie Additionen, Inversionen, Deletionen und/oder Sub
stitutionen von ein oder mehreren Basenpaaren.
In bevorzugter Ausführungsform umfassen die DNA-Fragmente Elemente, die zu
ihrer Stabilität und/oder Replikationsfähigkeit beitragen. Solche Elemente sind
insbesondere ein Telomer, ein Zentromer und/oder ein Replikationsursprung.
Diese Elemente können von der DNA eines oder mehrerer Gewebe bzw. Organis
men stammen. Vorzugsweise stammen die Elemente von menschlicher-, Hefe-,
und/oder bakterieller DNA. Besonders bevorzugt stammen die Elemente von YAC
("yeast artificial chromosome")- oder BAC ("bacterium artificial chromosome")-
DNA. DNA-Fragmente mit YAC- oder BAC-DNA sind daher ganz besonders
bevorzugt. Vorstehende DNA-Fragmente sind ebenfalls Gegenstand der vor
liegenden Erfindung.
Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, vorstehende DNA-Fragmente herzustel
len. Dies sind z. B. Verfahren, durch die Zell-DNA isoliert und derart gespalten
werden kann, daß DNA-Fragmente einer Größe von mehreren 100 Kilobasen
(kb), insbesondere von etwa 700 kb oder mehr und ganz besonders von etwa
1000 kb oder mehr, erhalten werden. Desweiteren sind dies z. B. Verfahren,
durch die diese DNA-Fragmente mit Elementen kombiniert werden können, die
zur Stabilität und Replikationsfähigkeit der DNA-Fragmente beitragen. Insbeson
dere kennt der Fachmann Verfahren, diese Elemente von menschlicher-, Hefe-
und/oder bakterieller DNA, besonders von YAC- oder BAC-DNA oder diese DNAs
als solche zu verwenden.
Erfindungsgemäß werden vorstehende DNA-Fragmente in Zellen eingebracht.
Dies können z. B. befruchtete Oozyten oder somatische Zellen, wie Stammzellen,
z. B. hämapoetische Stammzellen, sein. Die Zellen können von Mensch oder Tier,
insbesondere Labortier, wie Maus, Kaninchen, Ratte, und Nutztier, wie Rind,
Schaf, stammen. Das Einbringen der DNA-Fragmente in die Zellen kann durch
übliche Verfahren, wie Mikroinjektion erfolgen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß Zell-DNA
verschiedenster Lebewesen gezielt verändert werden kann. Dies wird durch
homologe Rekombination zwischen der Zell-DNA und großen in die Zellen
eingeführten DNA-Fragmenten erreicht. Die Rekombinationshäufigkeit liegt bei
50% und mehr. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Zell-DNA
in einzelnen Bereichen genau zu untersuchen und deren Funktion aufzuklären.
Insbesondere können einzelne Bereiche, wie Gene oder Teile davon, gezielt
verändert werden. Damit ist es möglich, Gendefekte zu therapieren und neue
Eigenschaften einer Zell-DNA zu verleihen. Die vorliegende Erfindung hat somit
größte Bedeutung für den Bereich der Tierzüchtung und der Medizin, insbesonde
re für die Erkennung und das Verstehen von erblich bedingten Erkrankungen
sowie deren Therapie.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.
Eine YAC-Bibliothek von Maus-DNA (vgl. Larin, Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
88, (1991), 4123) wurde mit einem Tyrosinase-cDNA-Klon, pmcTyr102 (vgl.
Ruppert, S. et al., EMBO J. 7, (1988), 2715) einer Koloniefilter-Hybridisierung
unterzogen. Es wurden Kolonien identifiziert, von denen eine, eine 860 kb große
YAC-DNA aufwies, die ein intaktes Maus-Tyrosinase Gen enthielt. Diese YAC-
DNA wurde zur Mikroinjektion in befruchtete Oozyten einer Albino-Maus (vgl.
Hogan, B. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1986), Cold Spring
Harbor, New York) NMRI/Han verwendet. Hierzu wurde die YAC-DNA in einem
Mikroinjektionspuffer, 100 mM NaCl, 10 mM HCl, pH 7.5, 0,1 mM EDTA, 30 µm
Spermin, 70 µm Spermidin, aufgenommen. Die Konzentration betrug 4 ng YAC-
DNA/µl Mikroinjektionspuffer. YAC-DNA-aufweisende Oozyten (etwa 390)
wurden zur Einpflanzung in 12 pseudoschwangere weibliche Mäuse vorstehen
den Stammes verwendet. Es wurden Mäuse-Nachkommen erhalten, die eine
Pigmentierung des Auges und der Haut aufwiesen.
Zum Nachweis der homologen Rekombination zwischen der Maus-Zell-DNA und
der YAC-DNA wurden eine Fish-Analyse und eine Southern Blot-Analyse durch
geführt.
- (a) Bei der Fish-Analyse wurde die Milz vorstehender Mäuse-Nachkommen isoliert und zerkleinert in eine 10 ml Spritze eingebracht. Dann wurde durch zwei Schichten Flor filtriert. Die Zellen wurden zentrifugiert und in RPMI 1640-Medium resuspendiert, das 20% fötales Kälberserum, 1% Penicillin/Streptomycin und 2% Gluthamin enthielt. Für die Stimulierung der Zellen durch Mitogene wurden 6 µg/ml Concavalin A und 1 50 µg/ml β-Mercaptoethanol zugegeben. Die mitotische Arretierung, die hypoto nische Behandlung, die Methanol/Essigsäure-Fixierung und das Ausbreiten von Chromosomen und Kern wurden in üblicher Weise durchgeführt. Geeignete DNA-Proben, z. B. Fragmente des Tyrosinase-Gens, wurden durch Nick-Translation unter Verwendung von Biotin oder Dioxygenin modifizierten Nukleotiden markiert. Die in-situ-Hybridisierung, der Proben nachweis und die mikroskopische Analyse wurden in üblicher Weise durchgeführt. Die hybridisierten Proben wurden durch FITC und Rhodamin oder Cy3, gekoppelt an Avidin bzw. Anti-Dioxygeninantikörpern, nach gewiesen. Chromosomen wurden durch DAPI gekennzeichnet. Die Bestim mung der chromosomalen Lokalisation der Proben wurde an einem Epi fluoreszenzmikroskop zweifach durchgeführt. Zum einen wurde eine konventionelle Mikrophotographie unter Verwendung von "multiple band pass"-Extitations- und Emissions-Filtern durchgeführt, welche die simulta ne Sichtbarmachung von FITC, Rhodamin (oder Cy3) und DAPI erlauben. Zum anderen wurde eine digitale Bildanalyse durchgeführt, wo digitale Bilder für jedes Fluorochrom unter Verwendung einer CCD-Kamara erhal ten werden, und die Bilder wurden nach sorgfältigem Anordnen über lagert.
- (b) Bei der Southern Blot-Analyse wurde aus dem Schwanz vorstehender Mäuse-Nachkommen, Zell-DNA isoliert und mit HindIII gespalten. Diese DNA wurde einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und mit markierten HindIII-Fragmenten des bekannten Plasmids Y-RC16 hybri disiert.
Aus beiden Nachweisverfahren geht hervor, daß die YAC-DNA durch homologe
Rekombination in das endogene Tyrosinase-Gen der Maus-Zell-DNA aufgenom
men wurde, wobei die Rekombinationshäufigkeit bei 50% lag.
Claims (13)
1. Verfahren zur gezielten Veränderung von Zell-DNA, dadurch gekennzeich
net, daß große DNA-Fragmente in Zellen eingebracht werden und die Zell-
DNA durch homologe Rekombination mit den großen DNA-Fragmenten
verändert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die großen
DNA-Fragmente etwa 700 kb oder mehr aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die großen
DNA-Fragmente etwa 1000 kb oder mehr aufweisen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß
die großen DNA-Fragmente regulatorische, kodierende und/oder nicht
kodierende Sequenzen umfassen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenzen
für ein oder mehrere Gene bzw. Teile davon kodieren.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß
die großen DNA-Fragmente Elemente umfassen, die zu ihrer Stabilität
und/oder Replikationsfähigkeit beitragen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente
ein Telomer, ein Zentromer und/oder einen Replikationsursprung umfas
sen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Elemente
YAC- oder BAC-DNA sind oder von diesen stammen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß
die Zellen von Mensch oder Tier stammen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein
Labortier oder ein Nutztier ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen befruchtete Eizellen oder somatische Zellen sind.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, dadurch gekennzeichnet,
daß das Einbringen der großen DNA-Fragmente in die Zellen durch Mi
kroinjektion erfolgt.
13. DNA-Fragmente zur Durchführung des Verfahrens nach einem der An
sprüche 1-12, wie sie in einem der Ansprüche 2-8 definiert sind.
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ID=7769608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1995130107 Ceased DE19530107A1 (de) | 1995-08-16 | 1995-08-16 | Verfahren zur gezielten Veränderung von Zell-DNA |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19530107A1 (de) |
| WO (1) | WO1997007227A2 (de) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG174053A1 (en) | 2006-09-01 | 2011-09-29 | Therapeutic Human Polyclonals Inc | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995003400A1 (en) * | 1993-07-23 | 1995-02-02 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes |
| WO1995014769A1 (en) * | 1993-11-29 | 1995-06-01 | University Of South Florida | TRANSGENIC MOUSE PREPARED USING YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES (YACs) AND HOMOLOGOUS RECOMBINATION |
-
1995
- 1995-08-16 DE DE1995130107 patent/DE19530107A1/de not_active Ceased
-
1996
- 1996-08-14 WO PCT/DE1996/001518 patent/WO1997007227A2/de active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Molecular and Cellular Biology, 1990, Vol. 10, No. 8, S. 4163-4169 * |
| Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, Vol. 88, S. 4123-4127 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997007227A2 (de) | 1997-02-27 |
| WO1997007227A3 (de) | 1997-04-10 |
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