DE60117479T2

DE60117479T2 - Transparenter Medaka

Info

Publication number: DE60117479T2
Application number: DE60117479T
Authority: DE
Inventors: Yuko c/o Bioscience Centre Nagoya-shi Wakamatsu; Minoru c/o Div. of Biological Scienc Hokkaido Univ. Tanaka; Masato c/o Div. of Applied Bioscienc Kyoto-shi Kyoto Univ. Kinoshita; Kenjiro c/o Bioscience Centre Nagoya-shi Ozato
Original assignee: Individual
Current assignee: Ozato Norihiko Saitama Jp; Wakamatsu Yuko Nagoya Jp
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2021-06-09
Also published as: EP1161862B1; EP1161862A2; US6737559B2; SG105489A1; DE60117479D1; EP1161862A3; JP2001346480A; JP3354918B2; US20020112252A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung eines neuen durchsichtigen Medakas, einen durchsichtigen Medaka, dessen Geschlecht bestimmt werden kann, und einen durchsichtigen Medaka, bei dem bestimmte Organe Lumineszenz erzeugen.
Hintergrund der Erfindung
Es sind fünfzehn Arten, die zur Gattung Oryzias (Medaka) gehören, bekannt, die im asiatischen Raum von Indien bis Japan verbreitetet sind. Eine Spezies, deren Lebensraum in Japan liegt, ist Oryzias latipes, die auch in Teilen von China und Korea verbreitet ist. Mit Ausnahme des Gebiets von Hokkaido ist sie über ganz Japan verteilt und pflanzt sich in der natürlichen Umgebung von Mai bis August fort.
Der gemeine wilde Medaka hat eine dunkle Körperfarbe, was an vier Pigmentzellenarten in der Haut des Medakas liegt: Iridophoren, Melanophoren, Xanthophoren und Leucophoren. Die Iridophoren sind silberfarbene Pigmentzellen, die Guaninkörnchen enthalten. Die Iridophoren sind vorwiegend in den Opercula, den Augäpfeln, der Körperwand und der Epidermis verbreitet. Bei Fischen sind sie hauptsächlich im Bauch verteilt. Die Melanophoren enthalten Melaninkörnchen und sind an der dunklen Körperfarbe des Medakas beteiligt. Die Xanthophoren haben Pigmentkörnchen, die Karotinoide und Pteridine enthalten, und sind an der orange-gelben Körperfarbe des Medakas beteiligt. Die Leucophoren enthalten weiße Körnchen, die mit Pterin und Harnsäure verdichtet sind, und sind an der weißen Körperfarbe des Medakas beteiligt. Abgesehen vom Wild-Typ, der eine dunkle Körperfarbe hat, sind verschiedene Mutanten hinsichtlich der Körperfarbe und Morphogenese bekannt. Dazu gehören der „Himedaka" mit gelblich-oranger Körperfarbe, der in großem Umfang als Aquariumsfisch und Futter für große Aquariumsfische produziert wird.
Der Medaka findet aufgrund seiner kleinen Körpergröße von 2–4 cm, einer kurzen Zeit von 2 Monaten bis zur Geschlechtsreife, der Tatsache, dass wegen seiner weiten Verbreitung die Wild-Typ-Population und eng verwandte Spezien leicht erhältlich sind und sein Genom 1/5 der Größe von Säugetieren hat und die Geschlechtsbestimmung wie beim Menschen durch X- und Y-Chromosomen erfolgt, breite Anwendung als einfaches und nützliches Versuchstier. Der Embryo von Medaka ist besonders nützlich, da er sehr transparent ist und einen leicht beobachtbaren inneren Aufbau aufweist. Allerdings ist nach dem Ausbrüten, da die Epidermis und das Peritoneum mit Pigmentzellen bedeckt sind, nur das Rückgrat durch den Körper hindurch sichtbar, und eine Beobachtung des inneren Körperaufbaus von außen wird schwierig.
Es sind kürzlich Versuche unternommen worden, in vivo Änderungen, die im inneren Aufbau auftreten, durch Einführen eines bestimmten Gens in Xenopus (Amphibie) [Louie, A. Y. u.a., In vivo visualization of gene expression using magnetic resonance imaging. Nature Biotechnology, 18, 321–325 (2000)]; und Mäusen [Service, R. F., Scanners get a fix on lab animals. Science, 286, 2261–2263 (1991)] sichtbar zu machen und ein Protein, ein Produkt dieses Genes, mit MRI (Magnetresonanztomographie), CT-Scanner (Computertomographiescanner) oder PET (Positronen-Emissions-Tomographie) aufzuspüren. Allerdings können diese Verfahren trotz der Tatsache, dass sie eine große und umfangreiche Einrichtung erfordern, nur unzureichende Bilder liefern.
Weiter gibt es Versuche bezüglich des lebenslänglichen Überwachens der Dynamik von bestimmten Organen durch Ausstatten dieser Organe mit Lumineszenz mittels GFP. Solche Untersuchungen werden mit Maustumorgewebe durchgeführt, eine Beobachtung kann aber nur bis zu einer maximalen subkutanen Tiefe von 2 mm erfolgen. [Yang, M. u.a., Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastasis. PNAS, 97, 1206–1211 (2000)]. Die Expression der GFP-Fluoreszenz in transgenem Medaka durch Einführen eines GFP-Gens, das mit einem Medaka-Genpromotor fusioniert wird, in befruchtete Eier ist bekannt.
[Hamada, K. u.a., Usefulness of the medaka β-actin promoter investigated using a mutant GFP reporter gene in transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol. Marine Biol. Biotech., 7, 173–180 (1998)]. Tanaka, Minoru und Kinoshita, Masato und Nagayama, Yoshitaka haben einen transgenen Medaka mit grüner Fluoreszenz nur in den Keimzellen als Ergebnis des Einführens des vasa-GFP-Gens in befruchtete Eier von Himedaka erzeugt [The 22nd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Programm, Abstrakt, Seiten 458 (1999), Tanaka, Minoru, Kinoshita, Masato und Nagahama, Yoshitaka, „Inbred medaka transgenics expressing GFP in germ cells"]. Allerdings kann selbst bei diesem transgenen Medaka eine Fluoreszenz nur bis zur Zeit direkt nach dem Brüten beobachtet werden. Danach ist der Körper mit Pigmentzellen bedeckt und eine Beobachtung wird unmöglich.
Aus den obigen Gründen ist es wünschenswert, ein Versuchstier zu entwickeln, bei dem eine lebenslange Beobachtung des inneren Körperaufbaus von außen möglich ist. Allerdings ist gegenwärtig bei Wirbeltieren kein solches Versuchstier bekannt.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen durchsichtigen Medaka zur Verfügung zu stellen, bei dem der innere Körperaufbau von außen nicht nur in der embryonalen Phase sondern auch in der Phase nach dem Ausbrüten beobachtet werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen durchsichtigen Medaka zur Verfügung zu stellen, dessen Geschlecht bestimmt werden kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen durchsichtigen Medaka zur Verfügung zu stellen, bei dem bestimmte Organe Lumineszenz erzeugen.
Die Erfinder haben umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um die obigen Probleme zu lösen, und es ist ihnen als Ergebnis eines selektiven Kreuzens von Medaka-Mutanten mit einer Defizienz an einem oder mehr Pigmentzellarten von den vier Pigmentzellarten, die die dunkle Farbe eines Medaka bilden, gelungen, einen Medaka zu erzeugen, bei dem der innere Körperaufbau nicht nur in der embryonalen Phase sondern auch in der Phase nach dem Ausbrüten von außen beobachtet werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung abgeschlossen ist.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen durchsichtigen Medaka mit einer Iridophoren-, Melanophoren-, Xanthophoren- und Leucophoren-Defizienz zur Verfügung. Das Geschlecht des Medakas kann durch Vorhandensein oder Fehlen von Leucophoren und/oder einem DNA-Marker bestimmt werden.
Der durchsichtige Medaka kann durch ein Verfahren erhalten werden, das folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen eines Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamms gu, eines Albino-Medaka-Mutantenstamms i-3 und eines Leucophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamms lf; und
(b) Wiederholtes Durchführen des selektiven Kreuzens der Stämme, bis ein durchsichtiger Medaka erzeugt ist.

Dieses Verfahren umfasst weiter:

(c) Bereitstellen eines Iridophoren-defizienten Mutantenstamms il-1; und
(d) weiteres Durchführen des selektiven Kreuzens mit dem Stamm il-1.

Der Schritt (a) kann weiter das Bereitstellen eines Medaka-Mutantenstamms FLF umfassen, der beim Weibschen Leucophoren-Defizienz aufweist. Wenn ein solcher Medaka-Mutantenstamm FLF bereitgestellt wird, kann ein selektives Kreuzen des sich ergebenden durchsichtigen Medakas mit einem durchsichtigen Medaka aus dem obigen Schritt (d) durchgeführt werden.
Mindestens ein bestimmtes Organ des durchsichtigen Medakas kann aufgrund der Expression eines hybriden Genkonstrukts Lumineszenz erzeugen, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens umfasst, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das in dem Organ spezifisch exprimiert wird. Das fluoreszierende Protein ist typischerweise ein grün fluoreszierendes Protein. Das Organ kann ein Gonadenorgan sein.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Sichtbarmachen wenigstens eines bestimmten Organs eines durchsichtigen Medakas zur Verfügung, wobei das Verfahren das Sichtbarmachen wenigstens eines bestimmten Organs eines durchsichtigen Medakas durch Lumineszenz aufgrund der Expression eines hybriden Genkonstrukts umfasst, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens umfasst, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das in dem Organ spezifisch exprimiert wird. Das Verfahren kann umfassen:

(i) Einführen eines hybriden Genkonstrukts in einen Medaka, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens umfasst, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das spezifisch in einem Organ eines Medakas exprimiert wird;
(ii) Ausführen des selektiven Kreuzens des erhaltenen Medakas mit einem wie oben definierten durchsichtigen Medaka; und
(iii) Sichtbarmachen des Organs in dem aus (ii) erhaltenen durchsichtigen Medaka durch Lumineszenz aufgrund der Expression eines Gens, welches das fluoreszierende Protein codiert.

Wieder können das fluoreszierende Protein ein grün fluoreszierendes Protein und das Organ ein Gonadenorgan sein.
(STII-Stamm), wobei a. Organe zeigt, die durch den Körper zu sehen sind; b. die Rückenansicht und die Bauchansicht zeigt.
3: Ein Elektrophoresemuster, das ein Ergebnis einer PCR-Analyse des DNA-Markers SL1 im STII-YI-Stamm zeigt. 3a: Das Ergebnis einer Elektrophorese bezüglich der DNA eines durchsichtigen, weiblichen STII-YI-Medakas. Die Spuren 1 und 12 zeigen Größenmarker der DNA; die Spuren 2 bis 7 zeigen ein einzelnes Weibchen des anderen Stamms (FLFW.Y^HNI); und die Spuren 8–11 zeigen vier einzelne Weibchen (A, B, C und D) des STII-YI-Stamms. 3b: Das Ergebnis einer Elektrophorese bezüglich der DNA eines durchsichtigen, männlichen STII-YI-Medakas. Die Spuren 1 und 14 zeigen Größenmarker der DNA; die Spuren 2 bis 10 zeigen ein einzelnes Männchen eines anderen Stamms (FLFW.Y^HNI); und die Spuren 11 bis 13 zeigen drei einzelne Männchen (C, D und E) des STII-YI-Stamms.
Diese Beschreibung umfasst einen Teil oder den ganzen Inhalt, der in der Beschreibung und/oder den Zeichnungen der japanischen Anmeldung Nr. 2000/172375, bei der es sich um einen Prioritätsbeleg der vorliegenden Anmeldung handelt, offenbart ist.
Die Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
(1) Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass er Iridophoren-, Melanophoren-, Xanthophoren- und Leucophoren-Defizienz aufweist.
„Durchsichtig", wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bedeutet, dass beim Medaka nicht nur in der embryonalen Phase sondern auch in der Phase nach dem Ausbrüten der innere Körperaufbau, wie beispielsweise Gehirn, Rückenmark, Blutgefäße, Kiemen, Herz, Leber, Nieren, Milz, Darm und Fischblase, makroskopisch von außen beobachtet werden kann.
„Defizient" bedeutet, dass beim Medaka die obigen vier Pigmentzellarten (Iridophoren, Melanophoren, Xanthophoren und Leucophoren) völlig fehlen oder, falls sie vorhanden sind, in sehr geringen Zahlen vorliegen oder, wenn die obigen Zellen vorhanden sind, kein intrazelluläres Pigment oder nur Spuren von Pigment vorliegen, und die Beteiligung dieser Pigmentzellen an der Körperfarbe des Medakas nicht makroskopisch beobachtet werden kann.
Medaka der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel durch wiederholtes selektives Kreuzen von Körperfarben-Medaka-Mutanten miteinander erzeugt werden, die eine Defizienz bezüglich ein oder mehr Pigmentzellen der 4 Pigmentzellarten (Iridophoren, Melanophoren, Xanthophoren und Leucophoren) aufweisen, allerdings ist die Herstellung der vorliegenden Erfindung nicht auf dieses Verfahren beschränkt.
„Selektives Kreuzen" bedeutet das Auswählen einzelner Tiere mit dem gewünschten Phänotyp oder Genotyp aus einer zu kreuzenden Generation, wodurch die nächste Generation entsteht.
Beispiele für eine Körperfarben-Medaka-Mutante, die zum selektiven Kreuzen verwendet werden, umfassen eine Iridophoren-defiziente Medaka-Mutante (wie beispielsweise den gu-Stamm oder il-1-Stamm), eine Albino-Medaka-Mutante (wie beispielsweise den i-3-Stamm) oder eine Leucophoren-defiziente Medaka-Mutante (wie beispielsweise den lf-Stamm), sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Medaka-Stämme werden im Bioscience Center, Nagoya Univ. aufbewahrt und können von dort bezogen werden.
Konkret kann der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung durch wiederholtes selektives Kreuzen mit dem Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm gu, dem Albino-Medaka-Mutantenstamm i-3 und dem Leucophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm lf erzeugt werden.
Weiter gehört zu dem durchsichtigen Medaka der vorliegenden Erfindung ein durchsichtiger Medaka, der durch zusätzliches selektives Kreuzen zwischen einer oder mehrerer Arten von Stämmen zur Erhöhung der Transparenz erzeugt wird. Konkret wird ein durchsichtiger Medaka mittels weiteren selektiven Kreuzens des obigen durchsichtigen Medakas mit dem Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm il-1 erzeugt.
Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung kann dadurch erhalten werden, dass er vom Bioscience Center, Nagoya Univ. bezogen wird, wenn er nicht durch das obige Verfahren erzeugt wird.
(2) Weiter hat der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung eine Iridophoren-, Melanophoren- und Xanthophoren-Defizienz, und sein Geschlecht kann durch das Vorhandensein oder Fehlen von Leucophoren und/oder eines DNA-Markers bestimmt werden.
„Die Geschlechtsbestimmung durch das Vorhandensein oder Fehlen von Leucophoren" bezieht sich auf die Bestimmung, ob ein Tier männlich oder weiblich ist, durch mikroskopische Beobachtung des Vorhandenseins oder Fehlens von Leucophoren in der Zeit anschließend an die zwei Tage alte Phase des obigen durchsichtigen Medakas.
„DNA-Marker", wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, bezieht sich auf DNA-Marker, die für das genetische Geschlecht spezifisch sind. „Geschlechtsbestimmung durch DNA-Marker" bedeutet, dass die Bestimmung, ob ein Tier männlich oder weiblich ist, durch das Feststellen von DNA-Markern als Ergebnis einer PCR bezüglich der DNA des einzelnen Medakas durchgeführt wird.
Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung, für den eine Geschlechtsbestimmung möglich ist, kann zum Beispiel durch wiederholtes selektives Kreuzen des obigen durchsichtigen Medakas der vorliegenden Erfindung mit einem Stamm, bei dem ein Geschlechtsunterschied nur im Hinblick auf die Existenz von Leucophoren ersichtlich ist, und/oder einem Stamm, der einen DNA-Marker trägt, erzeugt werden, die Herstellung ist aber nicht darauf beschränkt.
Der Stamm, bei dem ein Geschlechtsunterschied nur im Hinblick auf die Existenz von Leucophoren offensichtlich ist, und der Stamm, der einen DNA-Marker trägt, können unterschiedliche Stämme oder der gleiche Stamm sein. Ein Beispiel für einen Stamm, bei dem ein Geschlechtsunterschied nur im Hinblick auf die Existenz von Leucophoren ersichtlich ist, ist zum Beispiel Qurt [Wada, H. u.a., Sex-linked inheritance of the lf locus in the medaka fish (Oryzias latipes). Zool. Sci. 15: 123–126 (1998), erhältlich durch Beziehen von der Abteilung für Integrierte Biowissenschaften, Aufbaustudium für Grenzwissenschaften, Universität Tokyo]. Ein Beispiel dafür, bei dem es um den gleichen Stamm geht, ist der FLF (weiblicher leucophorenfreier) Stamm, von denen nur das Männchen Leucophoren und einen DNA-Marker [SL1] aufweist (Matsuda, M. u.a., Isolation of a sex chromosome-specific DNA sequence in the medaka, Oryzias latipes. Genes Genet. Syst. 72, 263–268 (1997))]; der durch Beziehen vom Bioscience Center, Nagoya Univ. erhalten werden kann. Allerdings gibt es keine Beschränkung auf diese Beispiele. Auch ist ein DNA-Marker als solches nicht auf den obigen SL1 beschränkt und es kann jeder, dem Fachmann bekannte DNA-Marker verwendet werden.
Konkret wird der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung, für den eine Geschlechtsbestimmung möglich ist, durch wiederholtes selektives Kreuzen des obigen durchsichtigen Medakas der vorliegenden Erfindung mit dem obigen Medaka des FLF-Stamms erzeugt.
Weiter gehört ein durchsichtiger Medaka mit einem stark erhöhten Transparenzniveau, der durch selektives Kreuzen von einem oder mehreren Stämmen erhalten wird, auch zu den durchsichtigen Medaka der vorliegenden Erfindung, für die eine Geschlechtsbestimmung möglich ist. Konkret kann er mittels weiteren selektiven Kreuzens des durchsichtigen Medakas, der aus dem weiteren, obigen selektiven Kreuzungsschritt (d) mit dem Stamm il-1 hervorgeht, und dem durchsichtigen Medaka, der aus dem wiederholten selektiven Kreuzen zwischen einem Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm gu, einem Albino-Medaka-Mutantenstamm i-3, einem Leucophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm lf und einem Medaka-Stamm FLF, der beim Weibchen Leucophoren-defizient ist, folgt, erzeugt werden.
Abgesehen von dem obigen Herstellungsverfahren kann der durchsichtige Medaka, für den eine Geschlechtsbestimmung möglich ist, vom Bioscience Center, Nagoya Univ. bezogen werden, wo der Medaka erhalten wird.
(3) Weiter ist der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung durch die Erzeugung einer Lumineszenz in einem bestimmten Organ durch Einführen eines hybriden Gens, das eine Fusion eines Promotors eines Gens ist, das organspezifisch exprimiert wird, mit der codierenden Region des ein fluoreszierendes Protein codierenden Gens ist, in den durchsichtigen Medaka der vorliegenden Erfindung gekennzeichnet.
Beispiele für bestimmte Organe mit Lumineszenz umfassen Gonadengewebe (Keimzellen), Gehirn, Nerven, Leber und Muskeln, sind aber nicht darauf beschränkt, und können je nach dem Zweck eines Experiments ausgewählt werden.
Als Promotor eines Gens, das organspezifisch exprimiert wird, kann jeder Promotor ausgewählt werden, je nach dem Organ, das Lumineszenz erzeugen soll. Zum Beispiel kann ein vasa-Genpromotor, der für Gonadengewebe (Keimzellen) spezifisch ist, verwendet werden.
Beispiele für ein fluoreszierendes Proteingen sind beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein (nachfolgend einfach als „GFP" bezeichnet) Gen von Aequorea victoria, ein blau fluoreszierendes Protein (BFP) Gen und ein gelb fluoreszierendes Protein (YFP) Gen, ohne darauf beschränkt zu sein. Diese fluoreszierenden Proteingene sind von CLON TECH Inc. (1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA) erhältlich.
Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung, der durch die Erzeugung von Lumineszenz in einem bestimmten Organ gekennzeichnet ist, kann zum Beispiel durch Erzeugen eines transgenen Medakas, in den ein hybrides Gen eingeführt wird, das eine Fusion eines Promotors des Gens, das spezifisch in dem Organ exprimiert wird, das Lumineszenz erhalten soll, mit der codierende Region des Fluoreszenzproteingens ist; und wiederholende selektive Kreuzung des transgenen Medakas mit einem oder mehreren Körperfarbe-Medaka-Mutantenstämmen hergestellt werden.
Die Herstellung des hybriden Gens, das durch Fusion des obigen Promotors eines Gens, das in einem Organ spezifisch exprimiert wird, mit der obigen codierenden Region eines Fluoreszenzproteingens hergestellt wird, und die Erzeugung des transgenen Medakas, in den das hybride Gen eingeführt wird, können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel durch ein Verfahren, das in den Beispielen der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Ein Beispiel für den obigen transgenen Medaka ist der vasa-GFP-Stamm, hergestellt durch Einführen eines hybriden Gens, das durch Fusion des Promotors des vasa-Gens, das in den Keimzellen (d.h. dem Gonadengewebe) spezifisch exprimiert wird, mit der codierenden Region des GFP-Gens erzeugt wird (Tanaka, Minoru u.a., The 22nd Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan, Programm, Zusammenfassung, oben), aber der transgene Medaka ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiele für einen Körperfarben-Medaka-Mutantenstamm, der mit dem obigen transgenen Medaka gekreuzt werden soll, umfasst einen dem Fachmann bekannten Medakastamm, den obigen durchsichtigen Medakastamm der Erfindung und einen neuen Stamm, der durch Genaustausch bzw. Crossover von Geschlechtschromosomen zur Herstellung des obigen durchsichtigen Medakas der Erfindung erzeugt wird, ist aber nicht darauf beschränkt.
Konkret kann der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung, der in einem bestimmten Organ Lumineszenz ausstrahlt, durch wiederholtes selektives Kreuzen mit dem Medaka des vasa-GFP-Stamms; dem durchsichtigen Medaka, erzeugt durch wiederholtes Durchführen von selektivem Kreuzen zwischen einem Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamm gu, einem Albino-Medaka-Mutantenstamm i-3 und einem Leucophoren-defizienten Medaka-Stamm lf; und dem durchsichtigen Medaka, der aus dem wiederholten selektiven Kreuzen zwischen dem Stamm gu, dem Stamm i-3, dem Stamm lf und dem FLF-Stamm oben (d.h. dem obigen durchsichtigen Medaka, für den eine Geschlechtsbestimmung möglich ist) resultiert, erzeugt werden. Weitere Beispiele für den bevorzugten durchsichtigen Medaka der vorliegenden Erfindung, die in einem bestimmten Organ Lumineszenz erzeugen, sind der durchsichtige Medaka („STII-YII-vasa-GFP" in den Beispielen), erzeugt durch wiederholtes selektives Kreuzen des obigen weiblichen durchsichtigen Medakas, der aus dem wiederholten selektiven Kreuzen zwischen dem Stamm gu, dem Stamm i-3, dem Stamm lf und dem obigen FLF-Stamm (d.h. dem obigen durchsichtigen Medaka, für den eine Geschlechtsbestimmung möglich ist) resultiert, mit dem Leucophoren-defizienten männlichen durchsichtigen Medaka („STII-YI-vasa-GFP(lf) in den Beispielen), erzeugt durch Genaustausch von Geschlechtschromosomen in einem solchen durchsichtigen Medaka, der durchsichtige Medaka („STIII-YI-vasa-GFP" in den Beispielen), erzeugt durch wiederholtes selektives Kreuzen des durchsichtigen Medakas, der aus dem weiteren obigen selektiven Kreuzungsschritt (d) mit dem Stamm il-1 resultiert, mit dem durchsichtigen Medaka, der aus dem wiederholten selektiven Kreuzen des Stamms gu, des Stamms i-3, des Stamms lf und des FLF-Stamms resultiert, und der durchsichtige Medaka (STIII-YII-vasa-GFP" in den Beispielen), erzeugt durch wiederholtes selektives Kreuzen des weiblichen durchsichtigen Medakas des STIII-YI-vasa-GFP-Stamms mit dem Leucophoren-defizienten (lf) männlichen durchsichtigen Medaka („STIII-YI-vasa-GFP(lf) in den Beispielen), der durch Genaustausch der Geschlechtschromosomen in dem durchsichtigen Medaka des Stamms erzeugt wurde.
Der durchsichtige Medaka, der in einem bestimmten Organ Lumineszenz erzeugt, kann auch durch direktes Einführen des obigen hybriden Gens in den durchsichtigen Medaka der Erfindung erzeugt werden.
Das direkte Einführen des hybriden Gens kann mit Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel ein Verfahren zur Mikroinjektion eines Gens in das Cytoplasma des einzelligen Embryos.
Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung, der in einem bestimmten Organ Lumineszenz erzeugt, kann abgesehen von den oben beschriebenen Verfahren vom Bioscience Center, Nagoya Univ. bezogen werden, wo der Medaka gehalten wird.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird ausführlich durch Veranschaulichung mit den folgenden Beispielen erläutert, aber diese Beispiele sind nur veranschaulichend und sollen den Umfang der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1
Erzeugung des durchsichtigen Medakas
(1) Herstellung des STII-Stamms
Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung wurde mit drei Stämmen der Körperfarben-Mutante (gu, i-3 und lf) als kreuzende Eltern erzeugt, ausgewählt aus 120 Mutantenstämmen, die hauptsächlich aus spontanen Mutanten bestanden, die von Tomita, Hideo seit den frühen 60er Jahren gesammelt und in der Nagoya Universität aufbewahrt wurden. Diese drei Stämme sind für ein oder mehrere Arten von Pigmentzellen von den vier Arten, die für jeden Medaka die Körperfarbe bilden, defizient. Bestimmte Eigenschaften für jeden Stamm sind wie folgt und in der Tabelle 1 gezeigt.
(Bestimmte Eigenschaften jedes Stamms)
gu: Iridophoren-defiziente Mutante (1a)
Die Iridophoren sind silberfarbene Pigmentzellen, die in der Bauchhaut von Fischen vorherrschen. Das weiße Funkeln des Bauchs beruht auf dem Vorhandenseins dieser Zellen. Bei der gu-Mutante ist die Guaninanreicherung in den Iridophoren gering. Insbesondere wird eine geringe Anreicherungsmenge im Peritoneum von erwachsenen Fischen beobachtet. Sie wurde bei von Tomita, Hideo in Nagashima-Cho, Mie-Pref. 1978 gesammelten Medaka gefunden.
i-3: Albino-Mutante (1b)
Diese Mutante zeigt eine Defizienz an melanotischem Melaninpigment, weist die schlechte Anreicherung des gelben Pigments auf und hat eine große Anzahl Leucophoren, und demzufolge ist die Haut weiß. Da sie kein Melanin in ihrer Retina hat, erscheinen die Augen rot. Es wird kein Melanin im Peritoneum beobachtet. Diese Mutante wurde bei von Tomita, Hideo in Tottori-City 1976 gesammelten Medaka gefunden.
lf: Leucophoren-defiziente Mutante (1c)
Die Leucophoren sind weiße Zellen, die zusammen mit Melanophoren an den Änderungen der Körperfarbe beteiligt sind. Dieser Stamm hat keine Leucophoren. Er wurde von Tomita, Hideo in Toyokawa-City 1971 gesammelt.
Tabelle 1, elterliche Stämme zum Kreuzen
Mittels der drei obigen Stämme wurden ausgewählte Kreuzungen wiederholt, um einen Medaka zu erhalten, der alle spezifischen Merkmale von jedem elterlichen Stamm hat, wie in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₆ wurde ein Medaka mit allen spezifischen Merkmalen der elterlichen Stämme, d.h. ein Medaka mit Iridophoren-, Melanophoren-, Xanthophoren- und Leucophoren-Defizienz (Genotyp: gu/gu, i-3/i-3, X^lf/X(Y)^lf, Phänotyp: gu, i-3, lf), erhalten.
Dieser Medaka kat keine Körperfarbe (d.h. eine durchsichtige Körperwand und ein durchsichtiges Peritoneum), so dass folglich die inneren Organe, wie beispielsweise die Eingeweide und das Gehirn, von außen beobachtet werden können (2). Nachfolgend wird dieser durchsichtige Medakastamm als „STII (durchsichtiger Medaka II)" bezeichnet.
(2) Erzeugung des STIII-Stamms
Um einen weiteren durchsichtigen Medaka mit einem größeren Transparenzniveau als der oben erhaltene STII-Medakastamm zu erhalten, wurden der STII-Stamm und der Körperfarben-Mutantenstamm il-1 (dessen spezifische Merkmale unten und in der Tabelle 3 gezeigt sind) gekreuzt, wie in der nachfolgenden Tabelle 4 gezeigt ist. Beim Kreuzen wurden zwei Kreuzungsreihen, die die Kreuzungsrichtungen 1a→2a und 1b→2b aufwiesen, parallel durchgeführt. F₂, Weibchen, mit vierfacher Mutation wurde aus der Kreuzung in Richtung 1a→2a erhalten. Weiter wurde ein ähnlicher F₂, Männchen, aus der Kreuzung in der Richtung 1b→2b erhalten. Der gewünschte durchsichtige Medaka F₃ wurde durch Kreuzung mit diesem Männchen und Weibchen (Kreuzung Nr. 3) erhalten.
(Spezifische Merkmale des Stamms)

STII:

Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung.

il-1:

Weniger Iridophoren in der Körperoberfläche und den Opercula. Er wurde 1972 in Yamagata-City gesammelt und im Bioscience Center, Nagoya Univ. aufbewahrt.

Tabelle 3, elterliche Stämme zur Kreuzung
Tabelle 4, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₃ wurde ein durchsichtiger Medaka mit spezifischen Merkmalen des ST-II-Stamms und des il-1-Stamms (Genotyp: gu/gu, i-3/i-3, il-1/il-1, X^lf/X(Y)^lf und Phänotyp: gu, i-3, il-1, lf) erhalten.
Dieser Medaka hat weniger Iridophoren als der STII-Stamm und weist ein leicht höheres Transparenzniveau bezüglich der Körperwand, dem Peritoneum und der Opercula auf. Darüber hinaus gibt es keine große Lichtreflexion von der Körperoberfläche. Demgemäß können die inneren Organe klarer beobachtet werden. Nachfolgend wird dieser Medakastamm als „STIII (durchsichtiger Medaka III)" bezeichnet.
Außerdem wurden die vier Stämme der Körperfarben-Mutante (gu, i-3, lf, il-1), wie im Beispiel verwendet, in unterschiedlichen Gebieten vor mehreren Jahrzehnten in Japan gefunden und gesammelt, wie oben erwähnt, und seit dieser Zeit wurden sie sonst nirgendwo auf der Welt gefunden. Demgemäß würde eine Kreuzung zwischen diesen drei (gu, i-3, lf) oder vier (gu, i-3, lf, il-1) Stämmen kaum jemals in der Natur auftreten, daher ist es nicht möglich, die Medakastämme (STII und STIII) der Erfindung durch ein weitgehend biologisches Verfahren zu erzeugen.
Beispiel 2
Erzeugung eines durchsichtigen Medakas, bei dem eine Geschlechtsbestimmung leicht durchgeführt werden kann.
Bei Experimenten, die an einer Reproduktion beteiligt sind (zum Beispiel ein Experiment im Hinblick auf die Wirkung von Endokrin disruptiven Chemikalien), ist es notwendig, das Geschlecht eines Versuchstiers in den frühen Stufen der Ontogenese und ohne Fehler festzustellen. Die Geschlechtsbestimmung eines Medakas erfolgt in üblicher Weise mit Bezug auf die Morphologie der Analflosse und der dorsalen Flosse, ein papilläres Verfahren bezüglich der Analflosse beim Männchen, das Ovipositionsverhalten und die Körperfarbe (d-rR-Stamm). Diese Verfahren sind problematisch im Hinblick auf die Zahl der Tage nach dem Ausbrüten, die erforderlich ist, bevor eine Geschlechtsbestimmung möglich ist: bei einer Beobachtung der Morphologie der Flosse oder einem papillären Verfahren ist ein langer Zeitraum von 1,5–2,5 Monaten notwendig; im Fall des Ovipositionsverhaltens werden 2–3 Monate benötigt; und ein Beobachten der Körperfarbe im d-rR-Stamm erfordert 2–3 Wochen.
Wir haben gemäß dem nachfolgend beschriebenen Verfahren einen durchsichtigen Medaka erzeugt, bei dem eine schnelle Geschlechtsbestimmung möglich ist.
(1) Erzeugung des STII-YI-Stamms
Der STII-Stamm, der durch das Verfahren im Beispiel 1 erzeugt wurde, und ein Stamm FLF, der durch Kreuzen mit der Leucophorenmutante lf und dem Wild-Typ in der Nagoya Univ. im Jahr 2000 (spezifische Merkmale sind nachfolgend und in der Tabelle 5 gezeigt) erzeugt wurde, wurden als Kreuzungseltern verwendet, und diese wurden, wie in der Tabelle 6 unten gezeigt, gekreuzt.
(Spezifische Merkmale der Stämme)

STII:

Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung.

FLF:

Dieser wurde durch Kreuzen der obigen Leucophoren-Mutante lf mit dem Wildtyp der Nagoya Univ. im Jahr 2000 erzeugt. Da das lf-Gen in diesem Stamm auf dem X-Chromosom angeordnet ist, fehlen dem Weibchen Leucophoren. Da der lf-Genlocus des Y-Chromosoms vom Wild-Typ ist, besitzt das Männchen Leucophoren. Weiter hat der Medaka dieses Stamms einen geschlechtsspezifischen DNA (PCR) Marker (SL1). SL1 ist eine Basensequenz, die sich nahe dem männlichen Geschlechtsbestimmungsfaktor auf dem Y-Chromosom befindet, und es wird davon ausgegangen, dass sich seine homologe Region auf dem X-Chromosom befindet. Bei diesem Marker ist ein Polymorphismus bekannt. Da er im FLF-Stamm auf dem Y-Chromosom kürzer als auf dem X-Chromosom ist, werden beim Männchen zwei Banden (L) und (H), die vom Y-Chromosom bzw. X-Chromosom stammen, und beim Weibchen eine einzelne Bande (H), die vom X-Chromosom stammt, im PCR festgestellt. Andererseits besteht beim obigen STII-Stamm im Hinblick auf SL1 kein Unterschied zwischen dem X-Chromosom und dem Y-Chromosom, so dass bei beiden Geschlechtern, männlich und weiblich, im PCR eine einzelne Bande festgestellt wird. Der SL1 weist im FLF-Stamm auch keinen Unterschied zum X-Chromosom auf [d.h. (H)]. Wie in der nachfolgenden Tabelle 6 gezeigt, wurde mittels selektiver Kreuzung das Y-Chromosom des FLF-Stamms in die F₁-Generation eingeführt, um SL1 (L) einzubringen [Bezüglich Einzelheiten von SL1 wird auf Matsuda, M. u.a., Isolation of a sex chromosome-specific DNA sequence in the medaka, Oryzias latipes. Genes Genet. Syst. 72, 263–268 (1997) Bezug genommen]. Es sind für die Geschlechtsbestimmung durch diesen Marker bis jetzt keine Fehler bekannt geworden (d.h. Fehler = 0).

Tabelle 5, elterlicher Stamm zum Kreuzen
Tabelle 6, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₃ wurde ein durchsichtiger Medaka mit spezifischen Merkmalen sowohl des STII-Stamms als auch des FLF-Stamms (Phänotyp: Weibchen: gu, i-3, lf, H und Männchen: gu, i-3, +^lf, H/L) erhalten. Das Transparenzniveau war bei den Männchen aufgrund des Vorhandenseins von Leucophoren etwas schlechter, war aber gleich dem STII-Transparenzniveau bei Weibchen. Nachfolgend wird dieser Medakastamm als „STII-YI" bezeichnet.
Das genetische Geschlecht dieses Medakas wurde durch das Vorhandensein von Leuocphoren im zwei Tage alten Embryo festgestellt. Weiter wurde das genetische Geschlecht mittels eines DNA-Markers (SL1) bestätigt.
Der FLFW.Y^HNI-Stamm [Der Stamm besitzt drei Bestimmungsmarker der genetischen Geschlechtlichkeit. Bei dem einen handelt es sich um das Vorhandensein oder Fehlen von Leucophoren (vorhanden in %/fehlen in &); bei dem zweiten handelt es sich um die Körperfarbe (gelblich-orange für %/weiß für &); und bei dem dritten handelt es sich um den SL1-Marker (%: zwei Banden/&: einzelne Bande). Nicht veröffentlicht] wurde als Kontrolle verwendet. Ein Teil der Schwanzflosse eines erwachsenen Fisches wurde abgeschnitten und die DNA wurde mittels eines herkömmlichen Verfahrens extrahiert [Nukleinsäureextraktionsmittel SepaGene (Sanko Pure Chemicals)]. Ein PCR wurde mit 2 Primern für die SL1-Erfassung [Vorwärtsprimer pH05.5-F (5'-CCTGCAATGGGAAATTATTCTGCTC-3': SEQ ID NO: 1), Rückwärtsprimer pH05.5-RV (5'-CTTTTGTGTCTTTGGTTATGAAACGATG-3': SEQ ID NO: 2)] unter den in der Tabelle 7 und Tabelle 8 unten gezeigten Bedingungen durchgeführt.
Die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten mittels 1% Agarosegel/TBE sind in der 3a (Weibchen) und b (Männchen) gezeigt. Die Proben, die in jeder Spur verwendet wurden, sind nachfolgend in der Tabelle 9 gezeigt. Eine Probe des λ-BstPI Verdaus des Bakteriophagen λc1857Sam7 (Takara) und der 100 pb großen DNA-Leiter (Takara), die als DNA-Marker verwendet wurden, sind DNA- Größenmarker zur Bestätigung der 1,3 kb langen Bande (1371 bp von λ-BstPI) bzw. der 1,5 kb langen Bande (1500 bp der 100 bp großen DNA-Leiter). Tabelle 7, Zusammensetzung des Reaktionsgemischs
Tabelle 8, PCR-Bedingungen

Thermozykler:: Gene Amp PCT System 2400-R (Perkin Elmer)

^*1: λ-BstPI Verdau (Takara): DNA-Größenmarker, der ein verdauter Bakteriophage λc1857Sam7 durch Enzym BstPI (Takara) ist.
^*2: 100 bp DNA-Leiter (Takara): DNA-Größenmarker.

(Ergebnisse)
Gemäß dem in der 3 gezeigten Elektrophoreseergebnis wurden bei allen männlichen Medaka zwei Banden und bei allen weiblichen Medaka eine Bande festgestellt.
(2) Erzeugung des STII-YII-Stamms
Da ein Männchen des STII-YI-Medakastamms, das in (1) oben erhalten wurde, Leucophoren besitzt, liegt sein Transparenzniveau unter dem eines Weibchens. Um diesen Punkt zu verbessern wurde ein durchsichtiger Stamm ohne Leucophoren sowohl beim Männchen als auch beim Weibchen erzeugt.
Ein Weibchen des STII-Stamms und ein Männchen des Leucophoren-defizienten (lf) [STII-YI(fl)]-Stamms (spezifische Merkmale von jedem Stamm werden nachfolgend und in der Tabelle 10 beschrieben), der durch Genaustausch des X-Chromosoms und Y-Chromosoms in dem obigen STII-YI-Stamm erzeugt wurde, wurden als elterliche Stämme zum Kreuzen verwendet, wie in der folgenden Tabelle 11 gezeigt.
(Spezifische Merkmale der Stämme)

STII:

Der durchsichtige Medaka der vorliegenden Erfindung.

STII-YI:

Leucophoren-defizientes (lf) Männchen, erzeugt durch Genaustausch des X-Chromosoms und Y-Chromosoms im STII-YI-Stamm.

Tabelle 10, elterliche Stämme zum Kreuzen
Tabelle 11, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₁ wurde der durchsichtige Medaka mit spezifischen Merkmalen der STII- und STII-YI-Stämme (Phänotyp: Weibchen: gu, i-3, lf, H und Männchen: gu, i-3, lf, H/L) erhalten. Das Transparenzniveau von Männchen und Weibchen war dasselbe wie bei STII. Nachfolgend wird dieser Medaka-Stamm als „STII-YII" bezeichnet.
Die Geschlechtsbestimmung dieser Medaka wurde durch Feststellen der SL1-Bande des DNA-Markers mittels PCR wie in STII-YI von (1) oben festgestellt (Daten nicht gezeigt).
(3) Erzeugung des STIII-YI-Stamms
Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, um einen Stamm zu erzeugen, der ein höheres Transparenzniveau der Körperwand, des Peritoneums und der Opercula als der STII-YI-Stamms hat. Der STIII-Stamm wurde anstelle des STII-Stamms als elterlicher Stamm verwendet, und dieser wurde mit STII-YI gekreuzt, erhalten in (1) oben (spezifische Merkmale sind in der Tabelle 12 gezeigt), wie in der nachfolgenden Tabelle 13 gezeigt ist.
Tabelle 12, elterlicher Stamm zur Kreuzung
Tabelle 13, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
Bei der Generation F₃ wurde ein durchsichtiger Medaka mit den spezifischen Merkmalen der STIII- und STII-YI-Stämme (Phänotyp: Weibchen: gu, i-3, il-1, lf, H und Männchen: gu, i-3, il-1, +^lf, H/L) erhalten. Das genetische Geschlecht dieses Medakas wurde durch das Vorhandensein von Leucophoren im zwei Tage alten Embryo wie beim STII-YI-Stamm bestimmt. Weiter wurde das genetische Geschlecht durch einen DNA-Marker (SL1) bestätigt, und zwar mittels DNA, die aus der Schwanzflosse eines erwachsenen Fischs isoliert wurde. Bei diesem Stamm war das Transparenzniveau aufgrund des Vorhandenseins von Leucophoren beim Männchen leicht reduziert, aber es wurde beim Weibchen dasselbe Transparenzniveau wie bei STIII erhalten. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STIII-YI" bezeichnet.
(4) Erzeugung des STIII-YII-Stamms
Da das Männchen des STIII-YI-Stamms, das in (3) oben erhalten wurde, Leucophoren aufweist, liegt sein Transparenzniveau unter dem des Weibchens. Um diesen Punkt zu verbessern, wurde ein Stamm ohne Leucophoren beim Männchen und Weibchen erzeugt.
Der STIII-Stamm (zuvor erwähnt, Beispiel 1 (2)), Weibchen, wurde als elterlicher Stamm verwendet und mit dem Leucophoren-defizienten (lf) Männchen [STIII-YI(lf)] gekreuzt, das durch Genaustausch des X-Chromosoms und Y-Chromosoms im obigen STIII-YI-Stamm (spezifische Merkmale sind in der Tabelle 14 gezeigt) erzeugt wurde, wie in der nachfolgenden Tabelle 15 gezeigt.
Tabelle 14, elterlicher Stamm zum Kreuzen
Tabelle 15, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₁ wurde ein durchsichtiger Medaka mit spezifischen Merkmalen von STIII und STIII-YI (Phänotyp: Weibchen: gu, i-3, il-1, lf, H und Männchen: gu, i-3, il-1, lf, H/L) erhalten. Das Transparenzniveau war fast dasselbe wie von STIII bei Weibchen und Männchen. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STIII-YII" bezeichnet.
Die Geschlechtsbestimmung dieser Medaka wurde durch Feststellen der Bande eines DNA-Markers (SL1) mittels PCR wie beim STII-YI-Stamm von (1) oben durchgeführt (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3
Erzeugung eines durchsichtigen Medakas, gekennzeichnet durch die Herstellung von Lumineszenz im Gonadengewebe (Keimzellen)
Wir haben einen Stamm erzeugt, bei dem vasa-GFP-Fluoreszenz in den Gonadengeweben (Keimzellen) nicht nur in den frühen Phasen des Tiers sondern durch sein gesamtes Leben hindurch beobachtet werden kann, indem man ein Hybridgen, das durch Fusionieren einer Promotorregion eines vasa-Gens, das spezifisch in den Keimzellen exprimiert wird, mit der codierenden Region des GFP (grün fluoreszierendes Protein: Protein von Aequorea victoria und emittierende grüne Fluoreszenz durch bestrahlendes blaues Licht) Gens hergestellt wurde, in den durchsichtigen Medaka der vorliegenden Erfindung einführt.
Zuerst wurden Medakaovarien mit flüssigem Stickstoff gefroren und zerdrückt, bis sie homogenisiert waren. Dann wurde Gesamt-RNA gereinigt, und mRNA wurde weiter gereinigt. Danach wurde cDNA mittels dieser als Matrize synthetisiert. Letztere wurde in einen Vektor insertiert und in einen Phagen gepackt, um eine Ovarien-cDNA-Bibliothek herzustellen (Shinomiya, Ai, Tanaka, Minoru, Kobayashi, Tohru und Hamaguchi, Tetsu, „Identification and migration route of primordial germ cells of medaka using expression of vasa homologous gene as an indicator," Proceedings of the 32nd Annual Meeting of the Japan Society of Developmental Biologists, Seite 56, 1999). Medaka-vasa-cDNA wurde aus dieser Bibliothek isoliert.
Die Tatsache, dass das vasa-Protein eine DEAD-Box hat, bei der es sich um eine RNA-Bindungsdomäne handelt, und diese Region bei Tieren konserviert ist, ist bekannt. Daher wurden Primer, die für Tiere in dieser Region üblich sind (Vorwärtsprimer-1: 5'-ATGGCNTG(T/C)GCNCA(A/G)ACNG-3' (SEQ ID NO: 3) und Rückwärtsprimer-2: 5'-(A/G)AANCCCAT(A/G)TC(T/C)AACAT-3' (SEQ ID NO: 4)] entworfen. Ein PCR wurde mittels der Gesamt-cDNA-Bibliothek von Medaka als Matrize durchgeführt (94°C 10 min lang, 94°C 30 sec lang, 55°C 1 min lang, 72°C 1 min lang für einen Zyklus, insgesamt 39 Zyklen). Ein amplifiziertes kurzes vasa-cDNA-Fragment wurde mittels Agarosegel zum Clonieren gereinigt. Nach dem Bestätigen des Fragments als Medaka-vasa-cDNA durch Nukleotidsequenzierungsbestimmung wurde ein Screenen der Medaka-cDNA-Bibliothek durchgeführt, wobei wieder das Fragment als Sonde verwendet wurde.
Als Ergebnis wurden cDNAs voller Länge, die wie man dachte die ganze Aminosäure-Codierungsregion enthielten, zum Clonieren isoliert. Die Medaka-vasa-cDNA wurde durch Bestimmen der Nukleotidsenquenzierung bestätigt (Proceedings of the 32nd Annual Meeting of the Japan Society of Developmental Biologists, siehe oben).
Als Nächstes wurde das Medaka-vasa-GFP-Gen konstruiert. Das vasa-GFP-Gen war ein Hybridgen, bei dem die Promotorregion des Medaka-vasa-Gens (Olvas) mit der Codierungsregion des GFP-Gens fusioniert wurde. Die 3'-Region des Medaka-vasa-Gens (Olvas) wurde mit 2 Primern (T7; 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3': SEQ ID NO: 5, und VI-8; 5'-AGGAGGTGCCGTCATGGCTGGAG-3': SEQ ID NO: 6) mit einer Matrize von clonierter DNA amplifiziert [XLE13; 3'-Stelle des Medaka-vasa-Gens (Olvas)].
Das so erhaltene Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen PstI/EcoTI gespalten und die Termini wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet. Dieses Fragment wurde zur Stul-Restriktionsstelle des GFP-Vektors cloniert (pEGFP: CLONTECH Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA) und das sich ergebende Fragment wurde als pEGFP-3V bezeichnet.
Weiter wurde ein 5,1 kb langes genomisches Fragment, das die vasa-Gen(Olvas)-Promotorregion enthielt, mittels Primern (VP1M; 5'-CCTCCCAGTCGTCCATATGAATCGTCTGAT-3': SEQ ID NO: 7, und VP3; 5'-AGAGGATCCAATAGAATGAGTAATGGTTCTCTATTTC-3': SEQ ID NO: 8) mit Phagen-DNA [V5; enthaltend den meisten Teil des Medaka-vasa-Gens (Olvas)] als Matrize amplifiziert. Das so erhaltene Fragment wurde mit NdeI gespalten, mit T4-DNA-Polymerase an den Enden geglättet und weiter mit KpnI gespalten. Dieses Fragment wurde zu KpnI/geglättetes Ende der NcoI-Stelle des pEGFP-3V-Vektors cloniert, um einen Vektor (VEGFPA) für den Gentransfer zu erzeugen. Da das GFP-Gen im Handel erhältlich war, wurde es zur Benutzung gekauft (CLONTECH Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA).
Befruchtete Eier von Himedaka wurden nach 30 Minuten der Oviposition gesammelt und angebrachte Fäden wurden mit einer Zange entfernt. Der obige Vektor VEGFPA wurde in das Zytoplasma des einzelligen Embryos durch Mikroinjektion injiziert. Die injizierten Eier wurden bei 25°C gehalten und die Expression der GFP-Fluoreszenz wurde durch ein fluoreszenzstereoskopisches Mikroskop beobachtet. Das Embryo und die Fischbrut, die GFP-Fluoreszenz exprimierten, wurden getrennt und bis zum Erwachsenenalter aufgezogen. Geschlechtsreife Tiere wurden mit normalen Tieren gepaart (ohne Geninjektion) und gekreuzt, um Embryos der nächsten Generation (F₁) zu erhalten. Diese wurden mittels PCR auf GFP-Fluoreszenz und GFP-Gen durchsucht. Durch diesen Vorgang wurden elterliche Tiere (F₀), die das GFP-Gen an ihre Nachkommen weitergaben, ermittelt. Die Nachkommen (F₁) von diesen elterlichen Tieren wurden gekreuzt, um vasa-GFP-transgene Medaka zu erzeugen [für den ausführlichen Vorgang siehe Keiko Hamada u.a., „Usefulness of the medaka β-actin promoter investigated using a mutant GFP reporter gene in transgenic medaka (Oryzias latipes)", Mol Marine Biol Biotech (1998) 7(3), 173–180; Tanaka Minoru u.a, The 22nd Annual Meeting of the Molecular Biology Society, Programm, Kurzfassung, vorstehend]. Dieser Stamm wird als „vasa-GFP" bezeichnet (der von der Div. Biological Sciences, Graduate School of Science, Hokkaido Univ. bezogen werden kann).
(1) Erzeugung des STII-YI-vasa-GFP-Stamms
Ein Männchen des obigen vasa-GFP-Stamms, ein Männchen und ein Weibchen des STII-Stamms der vorliegenden Erfindung und ein Männchen des STII-YI-Stamms (spezifische Merkmale von jedem Stamm sind in der Tabelle 16 gezeigt) wurden als elterliche Stämme zum Kreuzen verwendet und einer wiederholten selektiven Kreuzung unterworfen, wie in der nachfolgenden Tabelle 17 gezeigt.
Tabelle 16, elterliche Stämme zum Kreuzen
Tabelle 17, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₅ wurde ein Medaka erhalten, die alle spezifischen Merkmale der drei elterlichen Stämme, vasa-GFP, STII und STII-YI, zeigte (Phänotyp: Weibchen, gu, i-3, vasa-GFP, lf, H und Männchen: gu, i-3, vasa-GFP, +^lf, H/L). Das genetische Geschlecht wurde wie im Beispiel 2 (1) durch Leucophoren und einen DNA-Marker (SL1) bestimmt. Das Transparenzniveau des Männchens war aufgrund des Vorhandenseins von Leucophoren etwas schlechter und das des Weibchens war dasselbe wie von STII. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STII-YI-vasa-GFP" bezeichnet.
Da dieser Medaka einen durchsichtigen Körper aufweist, kann das Verhalten der Fluoreszenz produzierenden Keimzellen über die gesamte Lebenszeit des Tiers nicht nur im embryonalen Stadium sondern auch im Wachstumsverlauf nach dem Ausbrüten bis zum Erwachsenalter beobachtet werden.
(2) Erzeugung des STII-YII-vasa-GFP-Stamms
Da ein männlicher Medaka des STII-YI-vasa-Stamms, erhalten in (1) oben, Leucophoren aufweist, liegt das Transparenzniveau im Vergleich zu dem der Weibchen niedriger. Um diesen Punkt zu verbessern, wurde bei den Männchen und Weibchen ein Stamm ohne Leucophoren erzeugt.
Ein Weibchen des obigen STII-YI-vasa-GFP-Stamms und ein Männchen des Leucophoren-defizienten (lf) [STII-YI-vasa-GFP(lf)]-Stamms, erzeugt durch Genaustausch des X-Chromosoms und des Y-Chromosoms im obigen STII-YI-vasa-GFP-Stamm (spezifische Merkmale jedes Stamms sind in der Tabelle 18 gezeigt) wurden gekreuzt, wie in der nachfolgenden Tabelle 19 gezeigt ist.
Tabelle 18, elterlicher Stamm zum Kreuzen
Tabelle 19, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₁ wurde ein Medaka mit spezifischen Merkmalen der beiden Arten der elterlichen Stämme, STII-YI-vasa-GFP und STII-YI-vasa-GFP(lf), erhalten. Das genetische Geschlecht wurde mittels DNA-Marker (SL1) bestimmt, wie im Beispiel 2 (1). Die Transparenzniveaus der Weibchen und Männchen waren dieselben wie die von STII. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STII-YII-vasa-GFP" bezeichnet.
Da dieser Medaka eine durchsichtige Körperwand und ein durchsichtiges Peritoneum und Gonadengewebe (Keimzellen), das Lumineszenz erzeugt, aufweist, kann das Verhalten von Keimzellen über die gesamte Lebenszeit der Tiere hindurch nicht nur im embryonalen Zustand sondern auch im Wachstumsverlauf nach dem Ausbrüten bis zum Erwachsenenalter beobachtet werden.
(3) Erzeugung des STIII-YI-vasa-GFP-Stamms
Wir haben weitere Untersuchungen durchgeführt, um einen Stamm zu erzeugen, der ein höheres Transparenzniveau der Körperwand, des Peritoneums und der Opercula als der STII-VI-vasa-GFP-Stamm aufweist. Ein Weibchen des STIII-Stamms (oben, Beispiel 1 (2)) wurde als elterlicher Stamm anstelle des STII-Stamms verwendet und es wurde selektiv und wiederholt mit einem Männchen des STII-YI-vasa-GFP-Stamms, erhalten in (1) oben (spezifische Merkmale von jedem Stamm sind in der Tabelle 20 gezeigt), gekreuzt, wie in der nachfolgenden Tabelle 21 veranschaulicht.
Tabelle 20, elterliche Stämme zum Kreuzen
Tabelle 21, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₃ wurde ein Medaka mit den spezifischen Merkmalen der beiden Arten von elterlichen Stämmen, STIII und STII-XI-vasa-GFP, erhalten. Das genetische Geschlecht wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2 (1) durch Leucophoren und einen DNA-Marker (SL1) bestimmt. Das Transparenzniveau des Männchens war aufgrund des Vorhandenseins von Leucophoren etwas schlechter und das des Weibchens war dasselbe wie das von STIII. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STIII-YI-vasa-GFP" bezeichnet.
Dieser Medaka hat ein hohes Transparenzniveau der Körperwand, des Peritoneums und der Opercula, und die Gonadengewebe (Keimzellen) erzeugen Lumineszenz. Demgemäß kann das Verhalten der Keimzellen durch die gesamte Lebenszeit der Tiere hindurch nicht nur in der embryonalen Phase sondern auch im Wachstumsverlauf nach dem Ausbrüten bis zum Erwachsenenalter beobachtet werden.
(4) Erzeugung des STIII-YII-vasa-GFP-Stamms
Da der STIII-YI-vasa-GFP-Medakastamm, Männchen, erhalten in (1) oben, Leucophoren aufweist, ist das Transparenzniveau im Vergleich zu dem des Weibchens niedriger. Um diesen Punkt zu verbessern, wurde ein Stamm ohne Leucophoren beim Männchen und Weibchen erzeugt.
Ein Weibchen des obigen STIII-YI-vasa-GFP-Stamms und ein Männchen des Leucophoren-defizienten (lf) [STIII-YI-vasa-GFP(lf)]-Stamms, erzeugt durch Genaustausch des X-Chromosoms und des Y-Chromosoms im obigen STIII-YI-vasa-GFP-Stamm (spezifische Merkmale von jedem Stamm sind in der Tabelle 22 gezeigt), wurden selektiv und wiederholt gekreuzt, wie in der nachfolgenden Tabelle 23 gezeigt.
Tabelle 22, elterliche Stämme zum Kreuzen
Tabelle 23, Kreuzungsdaten
(Ergebnisse)
In der Generation F₁ wurde ein Medaka mit spezifischen Merkmalen der beiden Arten der elterlichen Stämme, STIII-YI-vasa-GFP und STIII-YI-vasa-GFP(lf), erhalten. Das genetische Geschlecht wurde mittels des DNA-Marker (SL1) auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2 (1) abgegrenzt. Die Transparenzniveaus der Weibchen und Männchen waren dieselben wie die von STIII. Nachfolgend wird dieser Stamm als „STIII-YII-vasa-GFP" bezeichnet.
Dieser Medaka weist ein hohes Transparenzniveau der Körperwand, des Peritoneums und der Opercula auf, und die Gonadengewebe (Keimzellen) erzeugen Lumineszenz. Demgemäß kann das Verhalten von Keimzellen durch die ganze Lebenszeit der Tiere hindurch und nicht nur in der embryonalen Phase sondern auch im Wachstumsverlauf nach dem Ausbrüten bis zum Erwachsenenalter beobachtet werden.
Wirkungen der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein durchsichtiger Medaka zur Verfügung gestellt werden, der als Forschungsmittel für die Biologie, die Medizin und die Fischerei, als Versuchstier zum Testen von toxischen Chemikalien, als Lehrmaterial für die Pädagogik in der Grundschule, Mittelstufe und Oberstufe und als Aquariumsfisch nützlich ist.
Sequenzprotokoll freier Text

SEQ ID NO. 1: Vorwärtsprimer pHO5.5-F.
SEQ ID NO. 2: Rückwärtsprimer pHO5.5-RV.
SEQ ID NO. 3: Übliche, bei Tieren aufgefundene Sequenz. Die Sequenz wird hier als Vorwärtsprimer verwendet, um das kurze Fragment der vasa-cDNA zu amplifizieren.
SEQ ID NO. 4: Übliche, bei Tieren aufgefundene Sequenz. Die Sequenz wird hier als Rückwärtsprimer verwendet, um das kurze Fragment der vasa-cDNA zu amplifizieren.
SEQ ID NO. 5: Primer T7, der zur Amplifizierung der 3'-Region des vasa-Gens verwendet wird.
SEQ ID NO. 6: Primer VI-8, der zur Amplifizierung der 3'-Region des vasa-Gens verwendet wird.
SEQ ID NO. 7: Primer VP1M, der zur Amplifizierung des 5,1 kb langen genomischen Fragments, umfassend die Promotorregion des vasa-Gens, verwendet wird.
SEQ ID NO. 8: Primer VP3, das zur Amplifizierung des 5,1 kb langen genomischen Fragments, umfassend die Promotorregion des vasa-Gens, verwendet wird.

Alle hier angeführten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen werden hier durch Bezugnahme in vollem Umfang aufgenommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Durchsichtiger Medaka mit einer Iridophoren-, Melanophoren-, Xanthophoren- und Leucophoren-Defizienz.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 1, dessen Geschlecht durch die An- oder Abwesenheit von Leucophoren und/oder eines DNA-Markers bestimmt werden kann.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 1, der erhältlich ist durch ein Verfahren, umfassend: (a) Bereitstellen eines Iridophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamms gu, eines Albino-Medaka-Mutantenstamms i-3 und eines Leucophoren-defizienten Medaka-Mutantenstamms lf; und (b) wiederholtes Durchführen des selektiven Kreuzens der Stämme, bis ein durchsichtiger Medaka erzeugt wird.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 3, erhältlich durch ein wie in Anspruch 3 definiertes Verfahren und ferner umfassend: (c) Bereitstellen eines Iridophoren-defizienten Mutantenstamms il-1; und (d) weiteres Durchführen des selektiven Kreuzens mit dem Stamm il-1.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 3 oder 4, der durch ein wie in Anspruch 3 definiertes Verfahren erhältlich ist, in dem der Verfahrensschritt (a) ferner das Bereitstellen eines Medaka-Mutantenstamms FLF umfasst, der bezüglich des Weibchens Leucophoren-defizient ist.
Durchsichtiger Medaka, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend: (e) Bereitstellen eines wie in Anspruch 4 definierten durchsichtigen Medakas und eines wie in Anspruch 5 definierten durchsichtigen Medakas; und (f) Durchführen des selektiven Kreuzens dieser Medakas.
Durchsichtiger Medaka nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wenigstens ein besonderes Organ aufgrund der Expression eines hybriden Genkonstrukts Lumineszenz erzeugt, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das in dem Organ spezifisch exprimiert wird, umfasst.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 7, wobei das fluoreszierende Protein ein grün fluoreszierendes Protein ist.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Organ ein Gonadenorgan ist.
Verfahren zum Sichtbarmachen wenigstens eines bestimmten Organs eines durchsichtigen Medakas, wobei das Verfahren das Sichtbarmachen wenigstens eines bestimmten Organs eines wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 definierten Medaka durch Lumineszenz aufgrund der Expression eines hybriden Genkonstrukts umfasst, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das in dem Organ spezifisch exprimiert wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, umfassend: (i) Einführen eines hybriden Genkonstrukts in einen Medaka, wobei das Konstrukt eine codierende Region eines Gens, das ein fluoreszierendes Protein codiert, die operativ mit einem Promotor eines Gens verknüpft ist, das spezifisch in einem Organ eines Medakas exprimiert wird, umfasst; (ii) Ausführen des selektiven Kreuzens des erhaltenen Medakas und einem wie in einem der Ansprüche 3 bis 6 definierten durchsichtigen Medaka; und (iii) Sichtbarmachen des Organs in dem aus (ii) erhaltenen durchsichtigen Medaka durch Lumineszenz aufgrund der Expression eines Gens, welches das fluoreszierende Protein codiert.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei das fluoreszierende Protein ein grün fluoreszierendes Protein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Organ ein Gonadenorgan ist.
Durchsichtiger Medaka, erzeugt durch ein wie in einem der Ansprüche 3 bis 6 definiertes Verfahren.
Durchsichtiger Medaka nach Anspruch 14, dessen Geschlecht durch die An- oder Abwesenheit von Leucophoren und/oder eines DNA-Markers bestimmt wurde.