DE19508087A1 - Herstellung und Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Oligo(His)-Rest - Google Patents

Description

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen monoklonalen Antikörper, gerichtet gegen eine oligomere Sequenz, bestehend aus Histidinresten, zu entwickeln und seine Verwendungsmöglichkeiten zu beschreiben.

In diagnostischen und therapeutischen Verfahren spielen heute in zunehmendem Maße rekombinante Proteine eine entscheidende Rolle. Zur Erleichterung der Detektion und Isolierung von rekombinanten Proteinen wird häufig in die Sequenz des interessierenden Proteins gentechnisch eine fremde Epitopregion, für die es ein spezifisches Nachweissystem gibt, eingefügt (Tagging). Die meisten der wenigen und meistens schlecht ,zugänglichen Taggingsysteme sind von viralen Proteinen (Poliovirus) abgeleitet und damit immunogen, wodurch ihr Einsatz z. B. in gentechnisch veränderten Zellen, die im Rahmen einer Gentherapie in einen Organismus übertragen werden sollen, nicht möglich ist. Zudem sind sie meistens auch nicht sehr gut charakterisiert.

Ein weiteres, bakterielles Proteinexpressionssystem basiert auf den pQe Vektoren, die von der Fa. Qiagen (Hilden) entwickelt wurden. Hier erfolgt ein "Tagging" der Proteine durch ein Oligopeptid bestehend aus meist 6 Histidinen, das gentechnologisch an den C- bzw. N-Terminus des rekombinanten Proteins kloniert wird. Diese Oligo-(His) Reste werden zum Reinigen der rekombinanten Proteine genutzt, wobei als Reinigungsprinzip eine Nickelsäuleaffinitätschromatographie dient. Der Oligo-(His) Rest gilt aber laut Hersteller (siehe Manual der pQe Vektoren der Fa. Qiagen, Hilden) als nicht antigen. Über die Toleranz des Immunsystems gegen den Oligo(His)-Teil wird auch die Einsetzbarkeit oligo(His)-getaggter rekombinanter Proteine in der humanen Therapie begründet.

Trotzdem hatten sich nach unserer persönlichen Information eine Reihe von Arbeitsgruppen bemüht, allerdings bisher ohne Erfolg und nach unseren Informationen haben es alle Gruppen in der Zwischenzeit wieder aufgegeben, einen Antikörper gegen den Oligo-(His) Rest zu erhalten, da er (s. u.) eine Vielzahl von Einsatzmöglichkeiten haben könnte.

Überraschenderweise ist es nun gelungen, bedingt durch ein besonderes Immunisierungs- und Screeningsystem einen solchen Antikörper zu erhalten und zu etablieren.

Der entscheidende Schritt, der zur erfolgreichen Erfindung des Antikörpers führte, war die Kombination mehrerer, verschiedener (His)-getaggter Proteine beim Immunisieren und Screenen der entstandenen Hybridomas. So wurde die Maus mit BSA, an das ein Oligo(His)-Peptid chemisch kovalent gebunden worden war, immunisiert und anschließend das Screening mit zwei verschiedenen, entweder N- bzw. C-terminal getaggten, in E.coll exprimierten, rekombinanten Proteine durchgeführt. Dadurch wurde der Selektionsdruck auf das Screeningverfahren so stark erhöht, daß nur solche Hybridomas selektiert wurden, die in der Tat gegen den Oligo(His)-Rest gerichtet waren.

Ein solcher Antikörper ist vielseitig einsetzbar.

1. ELISA Systeme

ELISA Systeme werden z. B. in der medizinischen Diagnostik und in wissenschaftlichen Studien mannigfaltig zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der unterschiedlichsten z. B. klinischen Parameter eingesetzt. Das gemeinsame Prinzip ist immer, daß an eine feste Phase das nachzuweisende Antigen gebunden (Coaten) wird und dann anschließend über ein enzymgekoppelter Antikörper, der eine Farbreaktion katalysiert, die photometrisch auswertbar ist, identifiziert wird. Je nach Antigen werden zum Coaten an die feste Phase unterschiedl ichste Techniken eingesetzt.

Um die großtechnischen Produktionsbedingungen zu vereinfachen, werden in einigen Verfahren nicht die gereinigten Antigene an die feste Phase gekoppelt, sondern ein für verschiedene Antigene gemeinsam einsetzbares Reinigungsprinzip, z. B. Streptavidin. Dies hat den Vorteil, daß unterschiedliche Antigene mit der gleichen Technik an eine vorbereitete feste Phase über ein gemeinsames Prinzip gekoppelt werden können. Eine Voraussetzung ist, daß die Antigene eine Affinität zu dem gleichen Reinigungsprinzip haben. Im Falle von Streptavidin müssen die verschiedenen Antigene biotinyliert sein. Ein wesentlicher Nachteil hierbei aber ist, daß durch die nachträgliche Kopplung mit Biotin oder anderen Haptenen, Epitope an den Antigenen zerstört werden können. Ein weiteres Reinigungsprinzip könnte ein erster Primärantikörper gerichtet gegen das zu untersuchende Antigen sein. Diese Technik aber hat gleich mehrere Nachteile: (i) So ist natürlich ein antigen­ spezifischer Antikörper zum Coaten für nur dieses Antigen einsetzbar, (ii) man benötigt wenigstens zwei Antikörper, die gegen verschiedene Epitope des gleichen Antigens gerichtet sein müssen und (iii) diese Epitopregionen dürfen sich nicht beeinflussen und auch nicht posttranslational verändert werden.

Speziell im Falle von rekombinanten Proteinen, kann man gentechnologisch Epitopregionen, in das zu untersuchende Protein einfügen und dann über einen entsprechenden Antikörper das Antigen an die feste Phase Coaten. Solche Systeme haben allerdings den Nachteil, daß sie speziell für das ELISA System zu entwickeln sind und die Proteine in dieser Form nicht therapeutisch verwendbar sind, dann aber fehlt nach wie vor genau die Technik zur Quantifzierung der tatsächlich zum therapeutischen Einsatz kommenden rekombinanten Proteine (z. B. Interferone, Zytokine).

Allerdings schließt schon per definitionem ein Tagging System, das keine immunogene Veränderung bewirken darf, wenn es den Einsatz der getaggten rekombinanten Proteine in der Therapie erlauben soll, die Entwicklung eines Antikörpers gegen die Tagging-Region aus. Homopolymere Aminosäuresequenzen, wie auch z. B. ein Oligo(His)-Teil, gelten als nicht immunogen, wie auch die Angaben des Herstellers (Qiagen, Hilden) deutlich aussagen und die Tatsache, daß eine Reihe von Wissenschaftlern vergeblich versucht haben, einen solchen Antikörper zu induzieren. Darüberhinaus spricht auch die Klassenzugehörigkeit des in der Erfindung beschriebenen anti-His Antikörpers zu den IgMs ebenfalls für die geringe Antigenität dieser Region. Das große Interesse einerseits einen solchen Antikörper zu haben und die große Schwierigkeit ihn zu bekommen andererseits, macht die Besonderheit der Erfindung des anti-(His) Antikörpers deutlich.

Der anti-His Antikörper erfüllt nun ideal die Vorausetzung als gemeinsames Reinigungsprinzip an die feste Phase gecoated zu werden, um dann die verschiedensten Oligo(His)-getaggte rekombinanten Proteine nach einem vergleichbaren Verfahren coaten zu können.

2. Blottingsysteme

Mittels Gelelektrophorese-Techniken können Proteine und Nukleinsäuren nach Molekulargewicht getrennt werden. Nach Transfer auf Membranen lassen sie sich mittels verschiedener Nachweisverfahren detektieren.

Im Western-Blotting Verfahren werden die Blots mit einem Primär-Antikörper inkubiert, der gegen das zu detektierende Antigen gerichtet ist und im zweiten Schritt mit einem Detektionssystem, meist einem enzymgekoppelten Sekundär- Antikörper, der eine meßbare Farb- oder eine Lichtreaktion induzieren kann, nachgewiesen.

Mit der gleichen Technik lassen sich mit dem anti-His Antikörper Oligo(His)­ getaggte Proteine nachweisen. Die Technik, vor allem modifiziert als Doppelblotting- Technik (s. u.), die es erlaubt mehrere Antikörper sequenziell auf demselben Blot zu detektieren, kann damit eingesetzt werden

• - zum Nachweis, daß ein rekombinantes Protein in Prokaryonten effektiv und mit dem His-Tag exprimiert wird, also z. B. als Kontrolle, ob die Klonierung funktioniert hat, oder wie effektiv die Expression ist.
• - um in Extrakten von transfizierten eukaryontischen Zellen endogenes von transfiziertem Protein zu unterscheiden.

Ein Einsatz des anti-His Antikörpers ist auch möglich zum Nachweis von Nucleinsäuren und anderen Antigenen nach Einführung des Oligo(His) als Hapten.

3. zellbiologische und immunhistologische Techniken

Die gleichen Nachweisprinzipien, wie bei den Blotting Verfahren sind auch auf Zell bzw. Gewebematerial durchführbar.

Damit ist der Antikörper einsetzbar

• - zum Nachweis His-getaggter Proteine in Zellen und Geweben über mit Enzymgekoppelte Sekundär-Antikörper und nachfolgenden Farbreaktionen, bzw. durch Einsatz von z. B. mit Fluoreszenzfarbstoffen-gekoppelten Sekundär- Antikörpern mittels Epifluoreszenzmikroskopie oder Immunogold oder ähnlichen elektronendichten Materialien zur Elektronenmikroskopie. Einschränkungen bzw. Erweiterungen sind bedingt durch den Nachweis der gewebabhängigen Expression endogener Histidin-reicher Proteine (s. u.).

4. Detektion 5. Monitoring 6. Targeting

Häufig werden in eukaryontischen Zellen zu analytischen Zwecken bzw. um den Nachteil rekombinante Proteine in prokaryontischen Zellen zu exprimieren, denen dann typische eukaryontische posttranslationale Veränderungen fehlen können, zu umgehen, zur Expression von Proteinen transfiziert. Darüberhinaus werden eukaryontische Zellen transfiziert (z. B. Stammzellen), um diese dann wieder in einen menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Organismus zurückzutransferieren und darüber eine Genübertragung auf einen Organismus zu erreichen. Nach einklonieren eines Oligo(His)-Tags bzw. durch Cotransfektion mit einem Oligo(His)­ getaggten Protein kann der anti-His Antikörper zur Detektion der transfizierten Zellen (z. B. zur Bestimmung der Transfektionseffizienz), bzw. zum Monitodna eingesetzt werden, z. B. zum Verfolgen, in welchen Geweben eines transgenen Organismus das transgene Protein exprimiert wird bzw. wo sich die transfizierte Zelle und ihre Tochterzellen befinden. Darüberhinaus läßt sich der anti-His Antikörper auf gentechnisch so veränderte Zellen einsetzten, um mittels Zellsortertechnik die transfizierten Zellen von den nicht transfizierten Zellen zu separieren. Zur Zeit besteht keinerlei Möglichkeit eine transfizierte, transgene Zelle z. B. in einen humanen Organismus zur Gentherapie eingeschleußt, wieder aus dem Organismus zu entfernen. Der anti-His Antikörper, bzw. humanisierte, bzw. für die betreffende Spezies adaptierte Derivate, bzw. von der variablen Region abgeleitete anti-His B- bzw. T-Lymphocyten könnte gegebenenfalls hier therapeutisch eingesetzt werden z. B. mit dem Ziel genmanipulierte Zellen, die sich nicht so verhalten, wie erwartet, bzw. ihren Dienst erfüllt haben, aus dem Organismus wieder gezielt zu entfernen bzw. ihr Verhalten weiter zu verfolgen. Der anti-His Antikörper, bzw. von der variablen Region abgeleitete Derivate eignen sich somit zum

8. Identffizieren 9. Verfolgen 10. Isolieren 11. Zerstören

von gentechnisch veränderten Zellen basierend auf der Oligo(His)-Struktur.

Eine weitere Anwendungsmöglichkeit des anti-His Antikörpers basiert auf einer weiteren überraschenden Entdeckung. Beim Untersuchen verschiedener Gewebeextrakte bzw. Extrakten von Zellkulturzellen mittels der SDS Gelelektrophorese und Western-Blottings zeigte sich, daß gewebe- bzw. zelllinienabhängig endogene Histidin-reichen Proteine exprimiert werden, die ebenfalls mit dem anti-His Antikörper detektiert werden können. Das Muster reicht von einer Vielzahl von endogenen Histidin-reichen Proteinen bis zu einem Fehlen von Histidin-reichen endogenen Proteinen. Dies schränkt einerseits die generelle Anwendbarkeit des anti-His Antikörpers als Detektionsmittel auf transfizierten Zellen ein, sie erweitert aber den Einsatz, auf die Suche nach und Funktionsbestimmung von

12. endogenen Histidin-reichen Proteinen

als auch zur Identifzierung und Charakterisierung von

13. Geweben, primären Zellen und Zellinien

basierend auf ihrem Proteinmuster an Histidin-reichen Proteinen. Letztlich eignet sich der Antikörper damit zum Screenen und Identifizieren von für die Transfektion von His-getaggten Konstrukten besonders geeigneten Zellen bzw. Zellinien, sowie zu einer Charakterisierung des Differenzierungsmusters und -grades eines Gewebes.

Eine weitere Überraschung war, daß sich das Muster der Histidin-reichen Proteine, die der Antikörper erkannte, bei gleichen Geweben von Tieren mit unterschiedlichem Geschlecht hinsichtlich einer Proteinbande unterschieden. Somit besteht auch eine Einsatzmöglichkeit des anti-His Antikörpers zur

14. Geschlechtsbestimmung.

Darüber hinaus kann der anti-His Antikörper eingesetzt werden zum

15. Reinigen Histidin-reicher natürlicher und rekombinanter Proteine.

Üblicherweise werden hierzu Antikörper an eine Matrix immobilisiert (z. B. Sepharose 4B), wodurch eine Immunaffinitätsmatrix entsteht. Über diese Affinitätsmatrix wird aus Extrakten, die das zu isolierende Antigen enthalten, das Antigen isoliert. Der anti-His Antikörper kann somit sowohl zum Reinigen und Charakterisieren endogener Histidin-reicher Proteine, als auch zur lsolierung von Histidin-reicher rekombinanter Proteine eingesetzt werden.

Beispiele 1. ELISA

Bei einem ELISA werden als feste Phase bevorzugt Träger aus Kunstoff, meist Polystyrol bzw. Polyvinylchlorid, verwendet. Die Detektionsgrenze liegt typischerweise bei 0.1 bis 1.0 fmol.

Das Coaten erfolgt mit Proteinkonzentrationen von 0.5 bis max. 20 µg/ml. Zum Coaten lagen die Proteinlösungen 1 : 100 verdünnt in PBS vor. In jede Vertiefung der ELISA-Platte wurde ein Volumen von 100 µl pipettiert und die Platte wurde für vier Stunden bei 37°C bzw. bei 4°C über Nacht inkubiert. Als Proteinlösungen wurden für direkte ELISAs His-getaggte rekombinante Proteine (z. B. Gluthation-S Trnnsferase mit einem Oligo(His)-Tag oder ohne) oder für Capture ELISAs Überstand der Hybridomalinie eingesetzt.

Die freien Bindestellen wurden durch Inkubation mit einer antigenfreien Proteinlösung blockiert. Als Blockierungslösung diente z. B. 0.5%ige Caseinlösung, wovon 200 µl pro Vertiefung eingesetzt wurden. Die Blockierungszeit war 2 Stunden.

Im Falle des direkten ELISA wurde mit unverdünntem Zellkulturüberstand der anti-His Hybridomalinie inkubiert für 60 min bei 37°C. Die Platte wurde zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurde pro Vertiefung 100 µl eines im Verhältnis 1 : 1000 mit PBS verdünnten anti-IgM Antikörpers, konjugiert mit z. B. Peroxidase, zugegeben und für 30 min inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS erfolgte die Detektion mit z. B. o-Phenylidendiamin (OPD) und H₂O₂ als Substrat für die Peroxidase. Die Auswertung des ELISAs erfolgte photometrisch mittels ELISA Reader bei 492 nm.

Im Falle des Capture ELISA wurde im zweiten Schritt mit 200 pl eines Totalextraktes (1 mg/ml) verdünnt 1 : 10 bis 1 : 1000 in PBS aus E. coll enthaltend ein His-getaggtes Protein bzw. das gleiche rekombinante Protein aber ohne His-Tag als Kontrolle inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurde mit einem spezifischen ersten Antikörper (z.B mit einem anti-GST Serum, entwickelt im Kaninchen (verdünnt 1 : 10000 in PBS) inkubiert und die Detektion erfolgte mit einem anti-Kaninchen Antikörper konjugiert mit Peroxidase wie oben für anti-Maus IgM beschrieben. Der His-Tag der getesteten Proteine befand sich entweder am N- bzw. am C-Terminus. Unabhängig von der Lage des Oligo(His)-Tags erkannte der Antikörper nur das jeweilige getaggte rekombinante Protein.

2. Western-/Immunoblotting

Eine Reihe von Proteinextrakten von verschiedenen Zelkulturzellen (z. B. HaCat, 3T3, RT112, XPTA, Raji, H9, primäre Endothelzellen; siehe auch Fig. 2) bzw. verschiedenen Geweben (z. B. Gehirn, Leber, Milz periphere Blutlymphocyten; siehe auch Fig. 3) von verschiedenen Spezies (z. B. Mensch, Ratte; siehe auch Fig. 3) wurden mittels SDS PAGE und Immunoblotting aufz. B. PVDF Membran untersucht. Antigene in dem jeweiligen geblotteten Extrakt wurden entweder direkt mit dem anti-His Antikörper gefolgt von einem anti-Maus IgM Enzymkonjugat unter Einsatz eines Detektionsprinzips basierend aufz. B. dem ECL System (Amersham- Buchler, Braunschweig) bzw. alkalischer Phosphatase und BCIP/NBT als Substrat identifiziert (für typische Beispiele siehe Fig. 2 und 3) oder mit zwei, darunter der anti-His-Antikörper, Antikörpersystemen sequentiell, wobei nach der Detektion des ersten Primärnntikörpers die Immunkomplexe von dem Blot heruntergewaschen wurden und der Blot mit dem zweiten Primär/Antikörper Detektionssystem folgte (ein typisches Beispiel siehe Fig. 1), nachgewiesen.

Als Transfer Technik wurde z. B. die Semi-dry Blotting Technik eingesetzt. Eln typischer Transfer auf PVDF Membran erfolgte bei 0.8 mA/cm². Das Blockieren der Membran erfolgte über Nacht bei 4°C mit z. B. 0.5% Casein in Tris pH 7,4 (150 mM NaCl; TBS) bzw. 5% BSA in TBS.

Beim direkten Nachweis (siehe auch Fig. 2 und 3) wurde der Blot mit Zellkulturüberstand der anti-His Hybridomalinie (verdünnt 1 : 3 bis 1 : 10 in TBS) für typischerweise 45 min inkubiert und für ca. 30 min mit TBS enthaltend bis zu 0.05% Tween 20 gewaschen. Danach wurde mit dem zweiten Antikörper z. B. anti-Maus IgM (Sigma, St. Louis) verdünnt nach Angaben des Herstellers (1 : 1000 bis 1 : 10000), der mit einem Nachweissystem gekoppelt war (z. B. alkalische Phosphatase oder Peroxidase) für 30 min inkubiert, gewaschen mit TBS und durch Zusatz des geeigneten Substrates (ECL bzw. BCIP/NBT) entwickelt. Eine unproblematisch detektierbare Menge war ca. 1 µg.

Wurde der Blot sequentiell mit zwei Primär-Antikörpern entwickelt (Siehe auch Beispiel Fig. 1), dann wurden die Immunkomplexe im ersten System typischerweise mit dem ECL System detektiert und als zweites Nachweisverfahren diente alkalische Phosphatase und BCIP1NBT als Substrat. Nach dem ersten Detektionsschritt wurde der Blot reäquilibriert mit TBS für 15 min und dann die Immunkomplexe mit Glycin/HCl (0.2 M ph 2.3, 500 mM NaCl) eluiert. Der Blot wurde für ca. 4 h ereneut geblockt und mit dem zweiten Primär-Antikörper inkubiert und weiter prozessiert wie oben und direkt beschrieben.

Claims (1)

1. Verwendung des anti-His Antikörpers und den aus seinen variablen Regionen ableitbaren Derivaten als Detektionssystem unter Einsatz von
   1. ELISA-
   2. Blotting Techniken
   3. zellbiologischen und immunhistochemischen Verfahren
   sowie zu
   4. Detektion
   5. Monitoring
   6. Targeting
   von gentechnisch manipulierten Zellen, mit dem Ziel, diese zu
   7. identifizieren
   8. verfolgen
   9. isolieren
   10. zerstören
   sowie zum Nachweis und Charakterisierung von
   11. endogenen Histidin-reichen Proteinen
   12. Geweben, primären Zellkulturen, Zellinien
   13. Geschlechtszugehörigkeit
   sowie zum
   14. Reinigen Histidin-reicher natürllcher als auch rekombinanter Proteine.