DE1942900A1 - Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen - Google Patents

Description

PatentanwM·

DJpl.-lng. R. Beete IC 29>H .865P 22.8.1969

^D el,-Ing. Lamprecht

Munch·« U₁ SteinsdorfsUv \Q

Henry Ebenezer WADE, Salisbury (Wiltshire), Großbritannien

Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen

Die Erfindung betrifft die Abtrennung von L-Asparaginase aus Bakterienkulturen.

Das Enzym L-Asparaginase (3·5.1·1-L.Asparaginamidohydrolase in der Nomenklatur der Internationalen Enzym-Kommission 1961) zeigt Antitumorwirkung, wenn es aus bestimmten Ausgangssubstanzen gewonnen wird. Diese Wirkung wurde zuerst in Meerschweinchenserum und später in Escherichia coli und Serratia marceacens festgestellt. In der gleichzeitig eingereichten deutschen Patentanmeldung der gleichen Anmelderin (englische Priorität 40343/68) ist angegeben, daß !-Asparaginase mit starker Antitumorwirkung aus Kulturen der Gattung Erwinia gewonnen werden kann, insbesondere aus Stämmen der Art Erwinia oarotovora» Die L-Asparaginase ermöglicht eine neue, vielversprechende Sherapie mancher fälle von Leukämie und ausgebreitetem (disseminated) Krebs· Einige Fälle,- in denen

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fir. ?*;

. ein'Nachlassen von Human-Leukämie durch Asparaginase— Therapie festgestellt worden ist, sind im "Journal .-of tie American Medical Association", November 1967, Bd. 202, Nr. 9, S. 116,. angegeben.

Die Abtrennung von L-Asparaginase aus ßakterierikulturen in großem Maßstab ist jedoch schwierig durchzuführen, weshalb L-Asparaginase nur in geringen M_engen verfügbar ist, was die therapeutische Verwendung dieses Enzyms stark beeinträchtigt. ■

Bis jetzt wurde die Abtrennung von L-Asparaginase in größeren Mengen durch mechanisches Aufbrechen durchgeführt. Bei derartigen Verfahren wird die Bakterienhülle durch physikalische oder mechanische Prozesse wie Schallbestrahlung oder Zerreiben der Zellen mit Aluminiumoxyd aufgebrochen, so daß der Zellinhalt austreten kann. Anschließend · wird die L-Asparaginase von anderen löslichen Zellbestandteilen durch SaIzausfällung abgetrennt, normalerweise mit Ammonium- oder Natriumsulfat. Die auf. diese Weise ausgefällte L-Asparaginase kann dann weiter gereinigt werden, z. B. durch Säulenchromatographie.

Ein Verfahren zur Abtrennung der L-Asparaginase von einer Bakterienkultur von L-Asparaginase enthaltenden Bakterien ist gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterienkultur oder die daraus gewonnenen Bakterienzellen mit einer alkalischen Eeagenz behandelt werden, um den pH-Wert der Bakterienumgebung auf etwa 9,0 - 12,5 einzustellen, wodurch ein Teil der Bakterienzellbestandteile einschließlich der L-Asparaginase in löslicher Form freigesetzt· wird, so daß eine alkalische Lösung von L-Asparaginase gewonnen wird.

Die entstandene alkalische Löaund, äie uv a» L-Aspara-

. iuase enthält, kann dann durch, irgendein geeignetes üblich?:* .!^trennverfahren behandelt .werden, um die ·

L-^sparag^uase· abzutrennen. Normalerweise weisen diese Verfahren folgende öchritte auf: Neutralisieren der allcalieciien Lösung, um unerwünscnte jiakterienzellreste aus auf allen, während die !/-Asparaginase in Lösun_ö geha.1 ten wird; Konzentrieren der L-Asparaginase durch Ausfällen aus der Losung mit Alkohol, durch Salsausfällen oder durch Absorption mittels eines geeigneten Substrats; und sine Reinigung der L-Asparaginase durch erneutes Üv3oeiiQ...eron in ,v'asser und erneutes Ausfällen mittels Alkohols oder eines 3als2usatses oder durch Abtrennung mictels Säuienchrcmatographie. Es ist ersichtlich, daß · ä T^Terschiedene Abwandlungen dieser Isolierungs-verfahren, insbesondere in der .Reihenfolge der einzelnen Verfahrensschritte, möglich sind. " · ■

Das.Verfahren gemäß der Erfindung zur Abtrennung von !-Asparaginase aus Bakterienkulturen kann bei Kulturen der Serratia mercescens angewendet werden, wird aber vorzugsweise bei der ΰ-atüung Erwinia, 'insbesondere den Ar.ten carotovora, chrysanthemi, aroideae und atroseptica, verwendet.

Dem Verfahren gemäß-der Erfindung liegt die Entdeckung der ungewöhnlich hohen Stabilität der L-Asparaginase , fj

wie sie aus 3rwinia und S· marcescens gewonnen wird, gegenüber alkalischen Reagenzien zugrunde. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist jedoch allgemein auch für andere Bakteriengattungen anwendbar, die eine ähnlich gegenüber alkalischen Reagenzien stabile !-Asparaginase enthalten, vorausgesetzt, daß die alkalischen Reagenzien die Bakterienzelle auflösen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird vorteilhafterweise durchgeführt, indem eine Suspension einer L-Aspara-

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ginase enthaltenden Bakterienkultur in einem geeignet 'gepufferten Mittel hergestellt und dann sorgfältig der pH-Wert des "Mittels, auf etwa 9 - 12,5 mit einer alkalischen Reagenz wie Natrium- oder Kaliurahydroxyd eingestellt wird."Bei diesem pH-Wert wird die Bakterienzelle aufgelöst, so daß anschließend die L-Asparaginase aus"der Suspension isoliert werden kann. Ein einfaches - .Isolieren bes.teht in der Feutralisierung oder schwachen . ."-Säuerung (d. h. nicht unter einen pH-Wert.von 3> um eine Zersetzung des Enzyms zu vermeiden) der Suspension, so daß die Masse des unwirksamen Proteins und Zellrestes ausfällt.

-Die iMeutralxsierung oder schwache Säuerung kann niit irgendeiner geeigneten Säure vorgenommen werden, normalerweise mit einer relativ schwachen Säure wie Essigsäure. Das Enzym L-Asparaginase bleibt unter diesen Bedingungen in der Lösung und kann"aus ihr durch Zusatz einer ausreichenden Menge eines löslichen Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, aar -Lösung isoliert werden, um das Enzym aus der Lösung als niederschlag zu verdrängen, wahlweise kann das Enzym durch Zusatz eines Alkohols zur wässrigen Lösung ausgefällt werden, oder das Enzym kann von einem Carboxymethylzellulose-Absorbens absorbiert werden.

ψ · Die Erfindung soll jetzt anhand der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels der Abtrennung von L-Asparaginase näher' erläutert werden.

Erwinia carotovora (hinterlegt bei der National Collection of Plant Pathogenic Bacteria N.C.P.P.B.Nr.1065) wurde aerob auf 3,5 tigern "Light-grade Xeatex" (English Grains Go. Ltd.) bei 30 ⁰C für 8 h gezüchtet. Die Bakte-/ rien wurden durch Zentrifugieren abgesetzt und-bei Zimmertemperatur in einer Pufferlösung gewaschen, die 30 mM ■-natriumchlorid", 1OmM 2-atnino-2(hydroxyiDethyl)propan- ■;--

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1:3-diol und 1 mM i-ithylendiamintetraessigsäure bei einem pH-Wert von 7 enthielt.

1OOO ml einer Suspension der Bakterien mit 16,7 mg iSakterienprotein/ml wurden bei Zimmertemperatur hergestellt (Stufe 1), und normales (n) Uatriumhydroxyd wurde langsam unter starkem Umrühren zugesetzt, bis ein pH-Wert von 12 erhalten war» Nach 3Q~ min (Stufe 2) wurde bei weiterem Umrühren der pH-Wert auf 5,5 durch langsamen Zusatz von In Essigsäure eingestellt. Der Zusatz sowohl von Natriumhydroxyd als auch von Essigsäure wurde sorgfältig überwacht, um örtliche Überkonzentrationen dieser Zusätze zu vermeiden.

Es wurde so viel Ammoniumsulfat zugesetzt, daß eine Sättigung von 35 $ (20 ) erreicht wurde, und unwirksames Protein wurde durch Zentrifugieren entfernt, so daß die L-Asparaginase in der Supernatanz (Stufe 3) übrigblieb. Weiteres Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, um die Endkonzentration auf 65 io Sättigung zu bringen. Das ausgefallene Enzym wurde zurückgewonnen und durch Zentrifugieren abgesetzt (Stufe 4)· Das Enzym wurde in Wasser mit dem gleichen Gewicht gegeben, gegen einen 0,02 M Natriumphosphat-Puffer mit dem pH-Wert 6 (0,02 M bezogen auf Na⁺) dialysiert und durch Zentrifugieren geklärt (Stufe 5).

Die Lösung der !-Asparaginase wurde bei einer Konzentration von etwa 1000 I.U»/ml durch eine Oarboxymethylzellulose-Säule (Whatman CM52) geschickt, die mit dem gleichen Phösphatpuffer abgeglichen worden' war. Etwa 1 ctd Bettvolumen der Zellulose wurde für jeweils 20.000 I.ü» des zugeführten Enzyms verwendet. Die Säule mit dem adsorbierten Enzym.wurde mit dem 5faehen Volumen des Puffers, gewaschen, und dieser Teil über einer stark rot gefärbten Zone wurde entfernt und in einem gleichen

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\^rolumen Wasser suspendiert. Der pH-Wert wurde auf 10 durch langsamen Zusatz von 1n NaOH zu der umgerührten . Zellulose-Suspension eingestellt. Die erzeugte Unzymlösung (etwa 40 rag Protein/ml), wurde aus der Zellulose mittels Filtration durch eine Sinterglassäule und Verdrängung des adsorbierten Enzyms durch einen 0,01M Hatriumkarbonatpuffer mit dem pH-Wert 10 (0,02M in bezug auf Üa ) zurückgewonnen (Stufe 6). Der Extraktionswirkungsgrad und die Produktwirkung für ;jede Stufe des Abtrennungsverfahrens sind in der folgenden Tabelle angegeben.. ■

Stufe : Bnzymrückge- Spezifische

winnung w irkung

■ - j^^J [_Intern· Einheiten

" '■ /rag Protein]

1. Bakteriensuspension 100 3,1

2. Nach Einstellung auf 68 3,7 einen pH-Wert you 12

3· Supernatanz vom Zentri- 73 29

fugieren mit 35 % gesättigtem Atnmoniumsulfat bei einem pH-Wert

von 5,5 :""..

4· Absatz vom Zentrifugie- 62 53

ren mit 65 $ Ammoniumsulfat . . -

5. Dialysiertes und gekläi«- 60 60 tes Aramoniurasulfat von

Stufe 4 ..-.;■ .."■■"

6. Carboxyraethylzellulose 55 450-500 (CM)-Produkt

Eine Untersuchung des OarboxyTnethylzelluloseprodukts (OK-Produkts) durch Elektrophorese und analytisches Zentrifugieren zeigte das Vorhandensein einer vorherrschenden Komponente mit einigen kleineren Verunreinigungen, die etwa 20 ^σβ> des gesamten Produkts bildeten. ;

Die intravenöse Injektion von weniger als 10 Ι.ΙΓ· des GM-Produkts in eine G3H-Maug^nÄoH 4 <i Waonstum eines

' ^ W= , 0,09815/1285 ^;- ". ^:: v; -v _v

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rs bewirkte einen Rückgang des Tumors. 4 mg Jki-i'r^dukt führten- ::u kein.rlei toxischen Symptomen eel Verabreichung der waus auf dem gleichen wege.

Klinische Erprobungen der !—Asparaginase, abgetrennt aus Erwinia carotovora durch das Verfahren gemäß 'der .'JriinQvung, haben das Vorhandensein von kleinen Mengen ei tics Stoffes gezeigt, der einen Temperaturanstieg bei den Patienten verursacht, denen die !-Asparaginase -verabreicht worden ist. Obwohl ein derartiger pyrogener Stoff nicht notwendigerweise gefährlich ist, ist er in therapeutischen Substanzen unerwünscht, so daß er vorzugsweise entfernt wird. Zweckmäßigerweise wird die Entt'ernun. durch einen weiteren Reinigungsschritt vorgenommen, bei dem eine !Ösung der ii-Asparaginase mit einem -Lluoiiniufflhydrcxydgel kontaktiert wird, so daß der pyrogene Stoff im wesentlichen vollständig durch das Gel entfernt wird. Eine vorherige Kontaktierung des Aluminiumhydrcxydg?ls mit 'Glutaminsäure erhöht die ,virkung und den Wirkungsgrad des Gels bei der Entfernung des pyrogenen Stoffes.

!-Isparaginase, die aus Erwinia carotovora durch das Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennt ist, entspricht zwar einem: Produkt, das 3*5·5·1.1· !-Asparagin amidohydrolase in der Terminologie der Internationalen Enzym-Kommission genannt ist, weicht aber in seinen Eigenschaften stark von der bisher bekannten !-Asparaginase a.b_v s. ü. der aus Escherichia coli gewonnenen. Eine Aminosäure-Analyse von Proben der !-Asparaginase aus E. coli (hergestellt von Farbenfabriken bayer A.G.) verglichen mit denen von Erwinia carotovora führte zu folgenden Ergebnissen?

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	- e .-	19429OU
Aminosäure	Es eh. ,co-li.	Er. carotοvora
Asp	■· 180	131
Thr._	120	89
8er	'60	·.-■■■ 64 :-
GIu	84	80
Pro	48	49
Giy	108	1.23-
. AIa	120	105
YaI	120	98
CyS	6	. < 2
Met.	24	33
He	48	61
\ Leu	84	104
Tyr	54.	48
Phe	36	27 ·
lys	84	67 ■
His	12	25
Arg ■	%	68
Trp	12	0

Ähnlich ergaben Vergleichsmessungen des isoelektriir sehen Punkts .(durch isoelektrische i^vokus sie rung) einen pH-Wert von. 5,2 (für E. coli) und etwa 8,5 (für Er* carotovora); ferner Glutaminasewirkungen von 2 - 3 i° der Asparaginase (für E, coli) verglichen mit 5 - 7 i>. (für Er* carotovora). Außerdem sind die beiden Asparaginase-Arten serologisch ziemlich unterschiedlich, Mir beide gewonnene Antisera zeigen keine Gegentcrcßsireaktion gegenüber der anderen Asparaginase. Das hat den klinischen Vorteil,, daß in Fällen, bei denen die Behandlung mit einer,Asparaginase eine Empfindlichkeit aufkommenläßt (also eine allergische Reaktion sich zeigt), mit der zweiten Asparaginase die Behandlung fortgesetzt werden kann· Das Molekulargewicht der aus Erwinia gewonnenen Asparaginase

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_ ₉._- ■■;. 1942 9ÖÜ

beträgt normalerweise etwa 130.000 - 150.000.

Die Behandlung von Leukämie und ausgebreitetem Krebs wird normalerweise durch Injektion von L-Asparaginase in einer physiologischen Lösung wie der Kochsalzlösung vorgenommen, obwohl unter gewissen umständen auch eine orale Verabreichung möglich ist. Typisch für eine intravenöse Injektion ist eine 10 - 20 mg Protein/ml-Lösung von L-Asparaginase in physiologischer Kochsalzlösung. Eine typische Dosis beträgt etwa 0,05 - 5,0 mg/kg Körpergewicht des Patienten.

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Claims (1)

1. ■ Patentansprüche

   1. Verfahren zur Abtrennung von !-Asparaginase aas einer Bakterienkultur, die !-Asparaginase enthält,, d a d ur c h g e k e η η ζ e i c h η e t , daß die Bakterienkultur oder

   die daraus gewonnenen Bakterienzellen mit einer alkalischen Reagenz behandelt werden, um den pH-Wert der .Bakterienumgebung auf etwa 9»0 — 12,5 einzustellen, wodurch ein Teil der Bakterienzellbestandteile eins-chließlich der L-Asparaginase -in löslicher Porm freigesetzt wird, so daß eine alkalische Lösung von L-Asparaginase gewonnen wird.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichne t , daß der pH-Wert 11 - 12,5 beträgt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch- g e kennzeichnet , daß die Bakterien zur Gattung Erwinia gehören.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zur Art Erwinia carotovora gehören.

   5. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zur Art Erwinia aroideae gehören· ~

   6» Verfahren nach Anspruch 3j dadurch gekennzeichnet , daß die Bakterien zur Art Erwinia chrysanthemi oder Erwinia atroseptica gehören.

   7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zur Art Escherichia coli gehören.

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   ■_ . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d urch ^e kennzeichne t , daß die in löslicher Form freigesetzte L-Asparaginase anschließend von der alkalischen Lösung isoliert wird.

   9» Verfahren' nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Lösung mit Säure behandelt wird, um Bakteriensellreste auszufällen, während die L-Asparaginasß in Lösung gehalten wird.

   10. Verfahren nach Anspruch 9»dadurch gekenn- z e i c h η e t , daß so viel Säure zugesetzt wird, daß ein pH-Wert von etwa 5-5 erreicht wird. "

   11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 «4 10, dadurch gekennz-eichnet , daß die in Lösung befindliche L-Asparaginase durch Zusatz von Alkohol ausgefällt wird» - '

   12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8-10, dadurch gekennzeichnet , daß die in Lös'ung befindliche L-Asparaginase durch Zusatz eines Salzes zur ■ Lösung ausgefällt wird.

   13« Verfahren nach einem der Ansprüche 8-10, da-- i

   durch gekennzeic h η e t , daß die L-Asparaginase selektiv von einem absorbierenden Substrat absorbiert wird*

   14. Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, .daß das absorbierende Substrat Oarboxymethylzellulose ist. .

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   OHSGHNALiMSPECTSD

   1-94.2.90Ö

   •15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 - 14, d a· du rc h g e k e η ii ζ e i c h η e t , daß die !-Asparaginase im wesentlichen pyrogenfrei durch Kontaktierung mit einem Aluminiumhydroxy%el gemacht wird.

   |16· Verfahren nach Anspruch 15, d a d u r c h g e k en η ζ e i α h η e t , daß das AluHJiniumhydroxydgel vorher mit Glutaminsäure aktiviert worden ist.

   17· Ir-Asparaginaae, hergestellt durch ein Verfahren nach · einem der vorhergehenden Ansprüche.

   18. !-Asparaginase, hergestellt aus Bakterien der Gattung Brwinia durch eiii Verfahren nach eiiaem der vorhergehenden Ansprüche, mit einem-Molekulargewicht von etwa 130.000 -· 150.000, einem isoelektrisohen Punkt von ungefähr 8,5 sowie einem Aminosäuregehalt und einer Glutaminase-V/irkung iro wesentlichen wie'eben angegeben.

   19· Ii"9sung von !-Asparaginase nach Anspruch 1ü oder 19 in physiologischer Kochsalzlösung mit einer Konzentration von etwa 10 --, 20 mg Protein/iDl lösung.

   20. !-Asparaginase nach einem der Ansprüche 17 - 19 in einer- therapeutischen Dosis zur Behandlung von !eukämie oder ausgebreiteteaä JCrebs beim Menschen.

   21. !-Asparaginase nach Anspruch 17 oder 18 in einer therapeutischen Dosis von etwa 0,05 - 5 mg/kg sur Jßehandlung von !euleämie oder ausgebreiteten Krebs beim Menschen.

   22. !-Asparaginase nach Anspruch 17 oder 16 in einer therapeutischen Dosis als Medikament in der Humanmedizin.

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