DE1940083B2 - Verfahren zur herstellung konzentrierter waessriger loesungen von mirakulin - Google Patents

Description

R¹

R²

ti)

R³

in der η eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist, R'¹. R². R³ und R* V/asserstoff, Alkylgruppen mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen oder eine Gruppe II darstellen,

R⁵

-(CH₂),-N

(II)

35

40

in der ρ eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und R⁵ und R⁶ Wasserstoff oder Alkylgruppen mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen sind, mit der Maßgabe, daß, wenn R' bis R⁴ ._}5 sämtlich Wasserstoffatome sind, π größer als 1 ist, wobei man bei Anwendung von Lösungsvermittlern der Gruppe 1) den pH-Wert des Homogenisats auf 6 oder höher und bei Anwendung von Lösungs-Vermittlern der Gruppe 2) den pH-Wert de? Homogenisats auf 3 oder höher einstellt, und die Verfahrensmaßnahmen bei höchstens 30⁰C ausführt, und
II) die nach dem Homogenisieren vorhandenen unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren über Glas entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der nach Stufe II) erhaltenen Lösung

(a) durch Fällung mit Aceton, Äthanol oder Amrnoniumsulfat oder

(b) durch Gelfiltration oder

(c) durch Ionenaustausch

beigemischte gelöste Stoffe einschließlich der Lösungsvermittler ganz oder teilweise abtrennt.

Die Süßungseigenschaften der Beere Synsepalum du'icificum sind seit mindestens 1852 bekannt (vgl. W. F. Daniell, Pharm. ].. Π [1852],S.445bis448)und wurden auch später, z.B. 1961, von F. R. Irvine (»Woody Plants of Ghana«, Oxford. S. 596 bis 598) beschrieben.

In einer Arbeit von G. E. 1 η g 1 e 11 u. a. (J. Agr. Food Chem. Taste Modifiers, 13, 284 bis 287 [1965]) ist angegeben, daß die chemische Art des aktiven Faktors, der tür die Süßungseigenschaften der Beere Synsepalurr dulcificum verantwortlich ist, unbekannt ist. In der Arbeit von Inglett u.a. werden verschiedene Versuche zur Extrahierung des aktiven Prinzips mit verschiedenen Lösungsmitteln beschrieben. Es wurde von einer Pulpe aus frischen Beeren ausgegangen, und es wurden mit verschiedenen Lösungsmitteln verschiedene Bestandteile der Pulpe durch Extraktion oder Dialyse entfernt, wobei immer der aktive Faktor als unlöslicher Bestandteil zurückblieb. Weder Behandlung mit Wasser noch mit 5%iger Bicarbonatiösung, 5%iger Harnstofflösung, 1- oder 5%iger Salzlösung, Dimethylsulfoxid. Dimethylformamid, Enzymen noch aufeinanderfolgende Extraktionen mit Lösungsmitteln mit zu- oder abnehmendem polarem Charakter ergaben jedoch Lösungen des aktiven Faktors.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung konzentrierter wäßriger Lösungen des aktiven Faktors, »Mirakulin« genannt, aus den Beeren von Synsepalum dulcificum. Unter Lösungen werden auch kolloidale Lösungen verstanden.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung konzentrierter wäßriger Lösungen von Mirakulin aus den Beeren von Synsepalum dulcificum ist dadurch gekennzeichnet, daß man

I) dus Fruchtfleisch, oder gegebenenfalls die Pulpe, entkernter frischer oder tiefgefrorener Früchte der vorgenannten Beeren in eine wäßrige Lösung der nachfolgend genannten Lösungsvermittler einbringt und homogenisiert:

1 a) Polyvinylpyrrolidon, Sorbitanmonooleatdipolyäthylenglykoläther, Polyäthylenglykole mit einem mittleren Molekulargewicht über etwa 200, Gelatine, Casein, Albumine, Peptone, Coffein, Aluminiumsulfat;

Ib) Ascorbinsäure, Weinsäure, acylierte Neuraminsäuren;
Protamine;

2a)

2b) Polypeptide, hergestellt aus basischen Aminosäuren;
2c) Polyamine der allgemeinen Formel I

R¹

R³

N-(CH,).- N

(D

R⁴

in der π eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist, R¹, R². R³ und R⁴ Wasserstoff, Alkylgruppen mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen oder eine Gruppe II darstellen,

R⁵

-(CH₂Ij₁-N

(H)

R"

in der ρ eine ganze Zahl von 1 bis 8 ist und R⁵

und R⁰ Wasserstoff oder Aikyigruppen mil höchstens 4 Kohlenstoffatomen sind, mit der Maßgabe, daß. wenn R· bis R' sämtlich Wasserstoffatome sind, η größer als 1 ist. wobei man bei Anwendung von Lösungsverminiern der Gruppe 1) den pH-Wert des Homogenisats auf 6 oder höher und bei Anwendung von Lösungsvermittlern der Grappe 2) den pH-Wert des Homogenisats auf 3 oder höher einstellt, und die Verfahrensmaßnahmen bei höchstens 3O=C ausführt, und
II) die nach dem Homogenisieren vorhandenen unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugieren und/ oder Filtrieren über Glas entfernt.
Wenn man von frischen entkernten Früchten ausgeht, wird vorzugsweise eine Pulpe angewendet. Die Pulpe muß sofort bearbeitet werden, sonst geht die süßende Aktivität verloren. Auch bei Gefriertrocknen der Pulpe geht die süßende Aktivität größtenteils verloren. Die Früchte können ohne Verlust an süßender Aktivität tiefgefroren (-40 bis -80"C) gelagert und transportiert werden. Statt frischer Früchte kann man also tiefgefrorene Früchte verwenden und ihr Fruchtfleisch oder ihre Pulpe als Ausgangsmaterial für die Herstellung von konzentrierten Lösungen des aktiven Faktors einsetzen.

Die wirksamen Amine sind Polyamine, d. h» sie enthalten mehr als ein Stickstoffatom. Es wurde gefunden, daß Monoamine, wie Diethylamin und Piperidin, den aktiven Faktor nicht lösen. Beispiele der wirksamen Amine sind die sogenannten biogenen Polyamine: Spermin, N.N'-bis-(3-Aminopropyl)-1.4-diaminobutan und Spermidin, N-(3-Aminopropyl)-1,4-diaminobutan. Auch andere Polyamine, z. B. die von Von Braun und Pinkernelle, Ber.deutsch.Chem.Ges., 70 (1937), 1230 bis 1240, synthetisierten Amine der Formel

NH₂-(CHj)_n-NH-(CH₂)P-NH₂

gehören zu den erfindungsgemäß anwendbaren Lösungsvermittlern. Diäthylentriamin (mit π = ρ = 2) ζ. Β. bringt den aktiven Faktor in Lösung, wenn auch weniger gut als Spermidin. Auch 1,2-Diaminoäthan und 1,4-Diaminobutan sind brauchbar; Ι,ω-Diaminoalkane sind erfindungsgemäß anwendbare Lösungsvermittler.

Außer Spermin gehören auch Triäthylentetramin und Tris-(2-aminoäthyl)-a.min zu den erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen, ferner N-alkylsubstituierte Abkömmlinge der genannten Polyamine, wie die von Rom et sch u.a., HeIv. chim. Acta, 34 (1951), S. 1611 bis 1618, erwähnten Stoffe.

Die Herstellung des Präparats wird bei niedrigen Temperaturen (bei höchstens 3O⁰C) ausgeführt, vorzugsweise bei einer Höchsttemperatur von 5° C.

Die nach dem Homogenisieren vorhandenen unlöslichen Bestandteile werden durch ein Zentrifugieren, vorzugsweise bei 10 (KK) bis 30 000 χ g, und/oder durch Filtrieren über Glas entfernt. (Da der aktive Faktor an Papier adsorbiert, ist Filtrieren über Papierfilter zu vermeiden.) Wenn die so erhaltene, mehr oder weniger klare Lösung keine physiologisch unzulässigen Substanzen enthält, kann sie als solche zur Anwendung gelangen. Durch für die Trennung von Eiweißstoffen ar sich bekannte Methoden werden beigemischte gelöste Substanzen einschließlich der Lösungsvermittler ganz oder teilweise abgetrennt, wodurch eine weitere Konzentration erreicht wird. Solche Methoden sind Fällung mit Aceton, Äthanol oder Ammoniumsulfat.

Gelfiltration und Ionenaustausch. Die Reinheit der Konzentrate kann elektrophoretisch kontrolliert werden.

Die erfindungsgemäß erhaltenen konzentrierten Lösungen von Mirakulin können unmittelbar zur Verminderung oder Beseitigung des sauren Geschmacks von Erzeugnissen, wie Lebens- und Ger.ußmitteln. Mund- und Zahnpflegemitteln oder pharmazeutischen Mitteln, die normalerweise einen sauren

ίο Geschmack haben, einverleibt werden, nachdem gegebenenfalls physiologisch unerwünschte Lösungsvermittler ganz entfernt sind. Gewünschtenfalls können die konzentrierten Lösungen eingeengt oder zur Trockene eingedampft werden, wobei die Temperatur höchstens 30°C vorzugsweise Zimmertemperatur oder niedriger sein soll. Das Einengen oder Eindampfen kann z. B. in einem Dünnschichtverdampfer oder durch Gefriertrocknen der gefrorenen Lösung im Hochvakuum ausgeführt werden.

Die konzentrierten Lösungen des aktiven Faktors, die miueis Lösungsvermittler der ersten Gruppe erhalten werden, enthalten den aktiven Faktor in einer Form, welche einen isoelektrischen Punkt zwischen etwa 4 und 7 hat; der aktive Faktor, der mittels Lösungsvermittler der zweiten Gruppe erhalten wird, hat ein niedrigeres Molekulargewicht und einen isoelektrischtn Punkt von etwa 9.

Ausgehend von einer Lösung des aktiven Faktors mittels Lösungsvermittler der zweiten Gruppe wurde ein Präparat hergestellt, das in der analytischen Ultrazentrifuge nur ein Band zeigte. Dieses Präparat, das keinen Eigengeschmack hatte, aber noch immer die süßende Aktivität zeigte, ist also der fast reine aktive Faktor, der als »Mirakulin« bezeichnet wurde. Die Verfahren ergeben eine Ausbeute von bis zu 100 mg Mirakulin aus 1 kg Beeren.

Das Molekulargewicht, bestimmt mit der analytischen Ultrazentrifuge, ist etwa 42 000 (± 3000). Bei Hydrolyse werden neben den Aminosäuren auch Saccharide gebildet. In dem Band des Mirakulins nach Elektrophorese über Polyacrylamidgel wurden durch Oxidation mit Perjodsäure und die Schiffsche Methode Saccharide nachgewiesen. Damit wurde bestätigt, daß Mirakulin ein Glycoprotein ist.

Der isoelektrische Punkt ist etwa 9. Mirakulin ist geschmacklos, thermolabil, aber weitgehend stabil bei pH-Werten über 3 bis zu 12. Wenn man aber eine Lösung mit einem pH-Wert von 2 bei Zimmertemperatur 2 Stunden stehen läßt, ist die süßende Aktivität größtenteils verschwunden. Es wird von Proteasen angegriffen, wobei die süßende Aktivität verlorengeht. Sowohl bei der Sedimentationsanalyse in der Ultrazentrifuge als auch bei der Gelfiltration über Gele modifizierter Dextrane (vgl. P. FI ο d i η, »Dextran gels and their application in gel filtration«, ausgegeben von Pharmacia, Uppsala, 1962; und z. B. die österreichischen Patentschriften 2 14 413 und 2 23 141) war Mirakulin einheitlich, bei Stärkegeielektrophorese bei pH 4,3 und 10 wurde ein sehr schwaches Nebenband festgestellt.

Die elektrophoretische Mobilität in einem Polyacrylamidgel, hergestellt aus 15% monomerem Acrylamid und 0,1% N.N'-Methylen-bis-acrylamid in 0.03 M Kaliumacetatpuffer, pH 5,0 (vgl. Reisfeld, Nature. 195 [1962], 281; H. Determann, »Gelchromatographie«, 1967, S. 19 bis 21) relativ zu Hühnerei-Lysozym. war 0,55 (± 0,02) (2 St., 12 V/cm).

Das UV-Spektrum bei pH 4,3 und 13 ist ein normales Eiweißspektrum mit Maxima bei 278 nm (pH 4,3, E =

m-VrTIg, ε = 4! 500 cm ■ · mmol. M = 42 000) bzw. bei 283nm(pH 13. E = l.I3cm-/mg, ε = 46 200 cm-/ mmol). Die spezifische optische Drehung in einer Lösung in 0,02 M Kaliumacetatpuffer (pH 4,3):[<i] = - 30.2= (c· - 0.33 g/l). Die Sedimentationskonstante S. -■ 4.6 (±0,2) · 10-¹³sec (bestimmt in 0,02 M Kaliumacetatpuffer, pH 4,3). die Diffusionskonstantc JD^ = 9,4 (± 0,3) · 10-⁷cm-7sec (bestimmt in 0,o2 M Kaliumacetatpuffer, pH 4,3).

Die Mikrobiuretmeihode zeigte Eiweißgehalte zwifchen 77 und 80%. Die normalen Aminosäuren waren anwesend, wobei Glycin. Arginin und Lysin qualitativ fm stärksten waien. Aus dem UV-Spektrum wurden Gehalte von 2.6% Tryptophan und 3,1 Tyrosin berechnet. Der Zuckergehalt wurde berechnet auf 21 % ι > •ach der Carbazol-Methode mit Glucose als Vergleichs- »ubstanz und auf 15% mit Fructose als Vergleichssub-■tanz.

Mirakulin kann trocken oder in gefrorener Lösung bei -25"C ohne wesentlichen Verlust an süßender ^o Aktivität gelagert werden. Seine Inaktivierung erfolgt fcngsam bei Zimmertemperatur und schnell bei 100⁰C. Eine Menge von 0,1 mg = 2,5 · 10-⁹MoI genügt, um die saure Geschmacksempfindung in süß zu ändern.

Man kann die physiologisch erträglichen Konzentrate sowie auch Mirakulin zu verschiedenen Lebens- und Genußmitteln, wie Joghurt, Buttermilch, Quark, Mayonnaise, Fruchtsäften. Jam oder Marmelade, zusetzen. Die Menge des einzuverleibenden Konzentrats oder aktiven Faktors hängt vom Gehalt des Mirakulins und vom Lebens- oder Genußmittel ab. Sie kann durch einen einfachen Versuch schnell ermittelt werden. Ein Zusatz des fast reinen Mirakulins zu z. B. Joghurt in einer Menge von 2,5 mg/1 gibt einen süßen Geschmack. Bei kleineren Mengen wird der saure Geschmack abgeschwächt, aber der süße Geschmack ist noch nicht vorhanden. In Beerensaft braucht man etwa die zehnfache Menge: 20 mg/1 ergibt den süßen Geschmack.

Die Stabilität in Milchprodukten ist überraschend gut; nach 4 Tagen bei Zimmertemperatur oder 14 Tagen bei 4^Z C wurde die gleiche Wirkung festgestellt. Die Stabilität in Beerensaft war weniger gut, was dem niedrigen pH-Wert des Saftes (pH 2.8) zuzuschreiben ist. Vorzugsweise sollen die erfindungsgemäßen Erzeugnisse deshalb einen pH-Wert über 3 haben.

Bei Verwendung des Mirakulins bzw. seiner konzentrierten Lösungen in sauren Mund- und Zahnpflegemitteln, z. B. in einem Zahnreinigungspräparat, dessen Herstellung in der deutschen Patentschrift 11 49 498 so beschrieben ist, in einer Menge von 0,025 bis 0,050 mg je Tablette von 1,5 g wird dem Zahnreinigungspräparat ein sehr guter Geschmack erteilt. Vorzugsweise kann das Mirakulin oder eine konzentrierte Lösung davon als Überzug angewendet werden.

Auch für andere Sorten Mund- und Zahnpflegemittel, die einen niedrigen pH-Wert haben oder haben sollen, »ind Mirakulin und dessen konzentrierte Lösungen geeignete Mittel, um unter Aufrechterhaltung des niedrigen pH-Wertes den sauren Geschmack zu beseitigen oder zu lindern.

Auch können Mirakulin und dessen konzentrierte Lösungen zum Süßen von pharmazeutischen Mitteln, wie Vitamin C oder Acetylsalicylsäure, verwendet werden. Zugabe von 0,025 bis 0,050 mg zu 100 mg Vitamin C verlieh ihm einen angenehmen süßen Geschmack. Solche Mittel können wie üblich zu Tabletten, Dragees u. dgl. verarbeitet werden.

Eine /um Süßen einer bestimmten Menge eines Lebens- oder Genußmitteis geeignete Menge des, Mirakulins oder einer trockengedampften oder gefriergetrockneten konzentrierten Lösung davon kann auf an sich bekannte Weise mit Füllstoffen, Bindemitteln und Gleitmitteln zu einer Tablette verarbeitet werden. Solche Tabletten sollen in dem Lebens- oder Genußmittel ziemlich schnell auseinanderfallen, aber hart genug sein, um nicht vor der Anwendung in Pulver zu zerfallen oder zu zerbrechen.

Geeignete Füllmittel sind z. B. Milchpulver, Lactose und Stärkederivate. Eine Tablette genügt z.B. zum Süßen eines Glases Joghurt (200 bis 250 ml), aber der Verbraucher kann, wenn er es wünscht, mehrere Tabletten benutzen. Für Joghurt oder solche Erzeugnisse kann man nicht klar lösende Substanzen, wie Milchpulver, anwenden, für klare Produkte, wie Fruchtsäfte, sind klar lösende Mittel, wie Lactose, bevorzugt. Die Menge der in einer Tablette anwesenden Lactose ist meistens zu klein, um an sich das Erzeugnis süß zu machen. Die Tabletten werden vorzugsweise durch direkte Tablettierung hergestellt, d.h. durch Kompression eines trockenen, frei fließenden Mirakulin enthaltenden Gemisches in Abwesenheit von Feuchtigkeit.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand von Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

1.1 bis 2,2 g Fruchtfleisch (Naßgewicht) aus 2 bis 4 g Beeren von Synsepalum dulcificum wurden mit 5 ml einer l%igen Lösung von Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 20 000) in Wasser homogenisiert Der pH-Wert des Homogenisats wurde mit einer gesättigten Natriumcarbonatlösung auf 7 gebracht Schließlich wurde während 30 min bei 10 000 χ g zentrifugiert.

Der auf diese Weise erhaltenen Flüssigkeit wurde bei 20⁰C ein gleiches Volumen Aceton unter Rühren zugesetzt. Der gefällte aktive Faktor wurde während 10 min bei 1200xg abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde nach Waschen mit 2 Volumina eines Aceton-Wassergemisches (2 :1) in 6 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7, aufgenommen. Unlösliches Material wurde bei 10 000 χ g (30 min) abzentrifugiert Die erhaltene Lösung, die zu 1 1 Joghurt zugesetzt wurde, verlieh dem Erzeugnis einen angenehmen süßen Geschmack.

Die gleichen Ergebnisse wurden erreicht bei der Extraktion mit einer 5%igen Lösung von Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400) in Wasser, 1% Coffein in 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,0,1% Sorbitanmonooleatdipolyäthylenglykoläther in 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7, und 3% Pepton in Wasser.

Beispiel 2

4,4 bis 8,8 g Fruchtfleisch (Naßgewicht) aus 8 bis 16 g Beeren wurden mit 20 ml einer l%igen Gelatinelösung in Wasser oder in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7, homogenisiert. Der pH-Wert des Homogenisats wurde mit einer verdünnten KOH-Lösung auf 7 gebracht, worauf das Gemisch 30 min bei 10 000 χ g zentrifugiert wurde.

Die so erhaltene Lösung konnte unmittelbar, z. B. als Zusatz zu Joghurt, verwendet werden.

Die erhaltene Lösung wurde weiter gereinigt durch Gelfiltration über ein modifiziertes Dextran A (vgl. H. Determann. »Gelchromatosranhie« I

besondere S. 28). Das modifizizierte Dextran A wurde mit Wasser gequollen und in eine Säule von 3 χ 11 cm (Bettvolumen 78 ml) gebracht. Die Lösung des aktiven Faktors (etwa 25 ml) wurde mit Wasser durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 150ml/Std. perkoliert. Das Eluat mit Elutionsvolumer. 25 bis 50 ml einschließlich enthielt den aktiven Faktor. Es konnte so für Süßungszwecke, z. B. in Joghurt, angewendet werden.

Beispiel 3

1.1 bis 2.2 g Fruchtfleisch (Naßgewicht) aus 2 bis 4 g Beeren wurden mit 5 ml einer 2%igen wäßrigen Natriumcaseinatlösung, pH = 10, homogenisiert. Das Homogenisat wurde 30 min bei 10 000 χ g zentrifugiert. Die dabei erhaltene aktive Flüssigkeit wurde mit verdünnter Säure auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht, und das gefällte Casein wurde bei lOOOOxg während 30 min abzentrifugiert. Die erhaltene Lösung enthielt den aktiven Faktor und konnte als solche, z. B. in Joghurt, angewendet werden.

Beispiel 4

Fruchtfleisch von 2 g Beeren (1,1g Fruchtfleisch, Naßgewicht) wurde mit 5 ml einer 0,01%igen N-Glykolylneuraminsäurelösung in Wasser homogenisiert. Der pH-Wert des erhaltenen Homogenisats wurde auf 8 gebracht mit einer konzentrierten Natriumbicarbonatlösung, worauf das Gemisch während 30 min bei 10 000 χ g zentrifugiert wurde. Die Lösung war gut für Süßungszwecke verwendbar.

Die Extraktion verlief analog mit 5% Ascorbinsäurelösung in Wasser.

Beispiel 5

2.2 g Fruchtfleisch, Naßgewicht, wurden mit 5 ml einer l%igen Salminsulfatlösung in Wasser homogenisiert. Nach dem Homogenisieren war der pH-Wert des Gemisches 3 bis 3,5. Das erhaltene Gemisch wurde bei 10 000 χ g (30 min) zentrifugiert

Gleiche Resultate wurden erzielt, wenn der pH-Wert des Gemisches nach dem Homogenisieren, aber vor dem Zentrifugieren, auf Werte bis zu 10 gebracht wurde. Der für die weitere Behandlung des Extrakts erforderliche pH-Wert kann also vor oder nach dem Abzentrifugieren der unlöslichen Bestandteile eingestellt werden.

Der auf diese Weise erhaltene Extrakt enthielt eine große Menge Salmin, das entweder durch Ionenaustausch oder durch Gelfiltration entfernt wurde.

Entfernung des Salmins durch Ionenaustausch

Der pH-Wert der Lösung wurde auf etwa 10 eingestellt, und die Lösung wurde durch eine Säule von durch ein Carboxymethylderivat modifiziertem Dextran B (vgl. die österreichische Patentschrift 2 23 141 und die Firmenschriften der Pharmacia AB in Uppsala), das kationenaustauschende Eigenschaften besitzt, perkoliert

Das modifizierte Dextran B wurde mit 0,02 M Natriumglycinatpuffer (pH-Wert 10,5) gewaschen und in eine Säule (1 χ 34 cm, Bettvolumen 27 ml) gebracht Die Lösung des aktiven Faktors wurde auf die Säule gegeben und mit demselben Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 25 ml/Std. perkoliert Der aktive Faktor war im Eluat mit Elutionsvolumen von 16 bis 35 ml einschließlich anwesend. Diese Lösung war frei von Salmin (gemäß Stärkegelelektrophorese bei pH-Wert 43).

Diese Lösung konnte unmittelbar verwendet werden. Entfernung des Salmins durch Gelfiltration

Die Lösung des aktiven Faktors wurde auf einen pH-Wert von 7 gebracht, worauf der Lösung eine solche Menge festes NaCl zugegeben wurde, daß diese 0,1 M an NaCl enthielt. 1 ml dieses Gemisches wurde einer Gelfiltration über ein modifiziertes Dextran unterworfen, wobei es mit einer Lösung von 0,1 M NaCl in 0,02 M ίο Kaliumphosphatpuffer, pH = 7, aus einer 1,5 χ 21 cm Säule (Bettvolumen = 36 ml) eluiert wurde (Elutionsgeschwindigkeit 20 ml/Std.). Das Eluat mit Elutionsvolumen von 13 bis 19 ml einschließlich enthielt den aktiven Faktor, während das Eluat mit Elutionsvolumen von 20 bis 35 ml einschließlich das Salmin enthielt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung des aktiven Faktors wurde mittels Filtration über eine mit Wasser gewaschene Säule von modifiziertem Dextran A von Salzen befreit. Sie kann dann als solche verwendet werden.

Beispiel 6

2,2 g Fruchtfleisch, Naßgewicht, wurden mit 5 ml einer 2%igen Triäthylentetraminlösung in Wasser homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit Essigsäure auf einen pH-Wert = 7 gebracht und während 30 min bei 28 000 xg (20⁰C) zentrifugiert. 2 ml Flüssigkeit wurden auf eine mit Wasser gewaschene, mit modifizierten Dextran A versehene Säule (1,5 χ 20 cm; Bettvolumen 39 ml) aufgebracht und mit Wasser (20 ml/Std.) eluiert. Der aktive Faktor befand sich im Eluat mit Elutionsvolumen von 18 bis 26 ml einschließlich und war frei von Arnin (gemäß Ninhydrinreaktion). Die erhaltene Lösung kann als solche verwendet werden.

Die Extraktion mit Spermidin und anderen wasserlöslichen Polyaminen verlief analog.
Beispiel 7

88 g Fruchtfleisch (Naßgewicht) aus 160 g Beeren wurden mit 200 ml einer 2%igen Sperminlösung in Wasser homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit verdünnter Essigsäure auf einen pH-Wert = 7 gebracht und 30 min bei 28 000 χ g zentrifugiert (bei 20°C).

Der erhaltenen Lösung (250 ml) wurde bei 0⁰C per 100 ml 24,3 g festes Ammoniumsulfat unter Rühren zugegeben (40% Ammoniumsulfatsättigung), und der pH-Wert wurde mit einigen Tropfen konzentrierter NaOH-Lösung (z. B. 30% NaOH) wieder auf 7 gebracht Nach 30 min Rühren bei 0°C wurde der gebildete Niederschlag bei 20 000 χ g (30 min; 0⁰C) abzentrifugiert Dann wurde der Flüssigkeit (270 ml) je 100 ml 13,2 g festes Ammoniumsulfat (60% Ammoniumsulfatsättigung) zugegeben, und es wurden dieselben Maßnahmen, wie mit der oben beschriebenen Lösung, ausgeführt (pH-Wert auf den gewünschten Wert bringen, rühren, zentrifugieren). Der erhaltene Niederschlag wurde in 25 ml Wasser aufgenommen, und das wenige unlösliche Material wurde bei 20 000 χ g (15 min; 0°C) abzentrifugiert Die dabei erhaltene überstehende Flüssigkeit enthielt den größten Teil des ursprünglich anwesenden aktiven Faktors. Sie wurde auf eine mit Wasser gewaschene Säule von modifiziertem Dextran (5 χ 95 cm, Bettvolumen = 1900 ml) aufgebracht und mit Wasser mit einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Std eluiert Das Eluat mit Elutionsvolumen von 1600 bis 1800 ml einschließlich wurde gefriergetrocknet, und der Rückstand wurde in 2 ml 0.06 M Kaliumacetatpuffer, pH 43, aufgenommen. Das

609521/186

unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren (20 000 χ g, 15 miin, 0°C) entfernt, und die Lösung wurde auf eine mit Wasser gewaschene, mit modifiziertem Dextran A versehene Säule (2 χ 42 cm, Bettvolumen 132 ml) aufgebraicht. Die Säule wurde mit Wasser eluiert (25 ml/Std.) und das Eluat von 56 bis 75 ml gesammelt und gefriergetrocknet. Dies ergab 14 mg fast reines

der Beschreibung angegebenen Mirakulins wurden mit diesem

Mirakulin. Die in
Eigenschaften des
Präparat ermittelt.

Statt Spermin können andere wasserlösliche Polyamine verwendet werden; die Aufarbeitung eines mit Triäthylentetramin erhaltenden Extrakts ergab dieselben Resultate.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung konzentrierter wäßriger Lösungen von Mirakulin aus den Beeren von Synsepalum Culciftcum, dadurch gekennzeichnet, daß man

I) das Fruchtfleisch, oder gegebenenfalls die Pulpe, entkernter frischer oder tiefgefrorener Früchte der vorgenannten Beeren in eine wäßrige Lösung der nachfolgend genannten Lösungsvermittler einbringt und homogenisiert:

la) Polyvinylpyrrolidon,Sorbitanmonooleatdipolyäthylenglykoläther, Polyäthylenglyko-Ie mit einem mittleren Molekulargewicht is über etwa 200. Gelatine, Casein, Albumine. Peptone, Coffein, Aluminiumsulfat;
Ib) Ascorbinsäure. Weinsäure, acyücite Neuraminsäuren;

2a) Protamine:

2b) Polypeptide, hergestellt aus basischen

Aminosäuren:
2c) Polyamine der allgemeinen Formel I