DE1817858A1 - Harnstoff-Antibiotica-Addukte und ihre Herstellung - Google Patents

Description

' DR. I. MAAS ·

DR. F. VOITHENLEITMER
8 MÜNCHEN 40

SCHLEISSHEIMER STR. 299 -TEL. 3592201/205

X-2990/36 016

Ξΐί Lilly and Company, Indianapolis/ Indiana, V.St.A.

Harnstoff'-Antibigtica-Äddukte und ihre Herstellung (Ausscheidung aus P 1812471.5)

Gegenstand der Erfindung sind Addukte von Macrolidantibiotica mit Aldehydgruppen und Harnstoff, die je Hol Antibioticum 2 Mol eines Harnstoffs der Formel

NH₂-C-Am,

worin Am die Gruppe -NH-R, in der R einen Phenylrest, Tolylrest, Halogenphenylrest oder Trifluormethylphenylrest bedeutet, oder die Gruppe

R ■»
N

R"

darstellt, in der R¹ und R", die untereinander gleich

oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome,

2098S2/1U3 BADORIGiNAU

C -C.-Alkylreste oder C^-G.-Alkenylreste bedeuten, mit dar Maßgabe, daß die Summe der Kohlenstoffatome in der R¹ und R" den Wert 4 nicht überschreitet, enthalten, welche mit der Aldehydgruppe des Äntibioticums reagieren.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Addukten aus Macrolidantbiotica mit Aldehyd gruppen und einer Harnstoffverbindung, das darin besteht, daß man einen Harnstoff der Formel

H₂N-G-AiTi ,

Il

worin Am die Gruppe -NH-R, in der R einen Phenylrest, Tolylrest, Halogenphenylrest oder Trifluormethylrest bedeutet, oder die Gruppe

darstellt, worin R¹ und R",

die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome, C.-C.-Alkylreste oder C.-C.-Alkenylreste bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Summe der Kohlenstoffatome in R¹ und R" den Wert 4 nicht überschreitet, und das Antibioticum in einem neutralen oder basischen Medium in Mengen vermischt, die wenigstens 2 Mol Harnstoff pro Mol Antibioticum entsprechen.

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Das Antibioticum-Harnstoff-Addukt ist zur Verwendung als Wirkstoff eines Mittels für ein Tierfutter geeignet, das ein Tierfutter und eines oder mehrere der Addukte enthält.

Im Rahmen der Erfindung liegen ferner die neuen Verbindungen Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin und Dihydro-(ketorireduziert)-Desmycosin, die durch saure Hydrolyse eines Harnstoffaddukts von Dehydro-(ketonreduziert)-Tylosin oder Dihydro-(ketonreduziert)-desmycosin hergestellt werden. Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin und Dihydro-(ketonreduziert)-Demycosin sind antibiotisch wirksam und zur Verwendung in pharmazeutischen Mitteln und/oder Desinfektionsmitteln geeignet.

Es gibt verschiedene Macrolidantibiotica, die eine Aldehydgruppe enthalten. Dazu gehören beispielsweise Tylosin (USA-Patentschrift 3 178 341), Verbindungen der Leucomycinreihe (Tetrahedron Letters, 1967, S. 609), Spiramycin A, B, C und D (USA-Patentschriften 3 000 785 und 3 105 794), Carbomycin (US-Patentschrift 2 796 379) und Carbomycin B (USA-Patentschrift 2 785 104). Diese Antibiotica enthalten ferner andere reaktive Gruppen. Beispielsweise enthält Tylosin ausserdem eine Ketongruppe, eine Lactongruppe, Amingruppen, Äthergruppen und Hydroxylgruppen, sowie glycosidische Bindungen und Äthylenbindungen. Infolge der Anwesenheit solcher zahlreicher reaktiver Funktionen in jedem der Macrolidantibiotica haben sich Stabilitätsprobleme ergeben, die ihre therapeutische Anwendung begrenzt haben. Insbesondere tritt bei diesen ^r4acrolidantibiotica eine Reihe saurer hydrolytischer Reaktionen auf. Sie unterliegen ferner oxidativen Abbaureaktionen. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Versuche unternommen, die chemischer Veränderung ausgesetzten Stellen in den verschiedenen Macroliden zu schützen.

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Es wurde ferner festgestellt, daß die Behandlung von Wiederkäuern mit Antibiotica auf oralem Wege dadurch beeinträchtigt wird, daß die Pansenflora die Struktur des Antibioticummoleküls verändern kann. Beispielsweise hat sich herausgestellt, daß Wiederkäuerorganismen die Aldehydgruppen, die in vielen dieser Macrolidantibiotica vorhanden ist, zu einer primären Alkoholgruppe zu reduzieren vermögen. Bei dem Antibioticum Tylosin ist dieses Umwandlungsprodukt als Tylosin D bekannt (auch AM-684 genannt und in der USA- . Patentschrift 3 321 368 beschrieben). Tylosin D weist eine weit geringere antibiotische Aktivität auf als Tylosin und hat ein etwas anderes antibiotisches Spektrum. Durch den Schutz der Aldehydgruppen gegen Umwandlungen durch WiederkäuerOrganismen während der therapeutischen Behandlung von Wiederkäuern mit Macrolidantibiotica wie Tylosin konnte die therapeutische Wirksamkeit dieser Antibiotica stark verbessert werden.

Ferner wurde festgestellt, daß die orale Verabreichung von Antibiotica, darunter den Macroliden und den Tetracyclines an Wiederkäuer für therapeutische Zwecke oder zur Erhöhung der Putterverwertung oder Gewichtszunahme gewöhnlich von unerwünschten Nebenwirkungen begleitet wird. Wenn diese Antibiotica in Mengen verabreicht werden, mit denen diese Zwecke erreicht werden, wirken sie sich nachteilig auf die Pansenflora aus. Infolgedessen wird der Verdauungsmechanismus der Wiederkäuer in Unordnung gebracht, und die Tiere hören gewöhnlich mit oder ohne Anfälle von Diarrhöe auf zu fressen. Beispielsweise haben Bell et al. J. Anim. Sei. 9, 647^ (1950) und Proc. Soc. Exptl. Biol. and Med. 76, 284 (1951) festgestellt, daß die Verabreichung von Chlortetracyclin die Verdaubarbeit von rohen Fasern und trockenen Stoffen bei Kühen unter-¹ drückt. Die Bedeutung des Pansens bei der Verdauung von

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Fasern (die fast völlig aus Futtercellulose bestehen), kann nicht stark genug betont werden. Die Unterdrückung des Celluloseverdauungsprozesses verlangsamt das Wachstum der Tiere, die Milcherzeugung usw. Ähnliche Ergebnisse wurden von Luther et al. ("European Symposium on Antibiotics and New Growth Factors in Animal Nutrition", Rom, Italien, IO - 12 Mai, 1955) für die Antibiotica Polymixin B, Chloramphenicol, Bacitracin, Dihydr©streptomycin, Oxytetracyclin, Penicillin G und Carbomycin erhalten. Schließlich haben Hungate et al., J. Anim. Sei. 14, (1955) bei einigen Tests in vitro gefunden, daß durch Anwesenheit hoher Mengen von Chlortetracyclin die gesamten Fermentationsprodukte bei einer typischen Pansenflora verringert werden.

Abgesehen von diesen Untersuchungen ist es allgemein bekann, daß in den Anfangsabschnitten der oralen Behandlung von ausgewachsenen Wiederkäuern mit Antibiotica häufig eine Zeit der Anorexie mit/oder ohne Diarrhöe auftritt, Diese unerwünschten Nebenwirkungen wurden auch dann festgestellt, wenn Macrolidantibiotica, beispielsweise Tylosin, an Wiederkäuer verabreicht werden.

Es besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur oralen Verabreichung von Antibiotica an Wiederkäuer.

Die hierin beschriebenen Antibioticum-Harnstoff-Addukte enthalten "je Molekül Macrolidantibioticum mit einer Aldehydgruppe zwei Molekül einer Harnstoffverbindung. Zwar werden diese Verbindungen hierin als Addukte bezeichnet, es wird jedoch darauf hingewiesen, daß diese Addukte definierte Verbindungen sind und daß zwischen der Aldehydgruppe des Antibioticums und 2 Molekülen

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der Harnstoffverbindung eine Umsetzung stattfindet, wie das Verschwinden des charakeristischen Aldehydsignals in dem Kernresonanspektruia des Addukts zeigt. Zur Herstellung der neuen Addukte, in denen 2 Mol des Harnstoffs je Mol Macrolidantibioticum mit einer Aldehydgruppe gebunden sind, sind Harnstoffe der Formel

NH₂-C-Am

0
I

geeignet, worin Αία die Gruppe -NH-R, in der R einen Phenyl· rest, Tolylrest, Halogenphenylrest oder Trifluormethylphenylrest bedeutet, oder

darstellt, worin R¹ und R",

die untereinander gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoffatome, C.-C.-Alkylreste oder C^-C,-Alkenylreste bedeuten, mit der Maßgabe, daß die Summen der Kohlenstoffatome in R^f und R" den Wert 4 nicht überschreitet. Beispiele für Tolylreste und Halogenphenylreste, für die R stehen kann, sind o-Tolyl, m-Tolyl, p-Tolyl, o-Chlorphenyl, m-Bromphenyl und p-Fluorphenyl. Einzelbeispiele für Alkylreste und Alkenylreste, für die R¹ und R" stehen können, sind Methyl, Äthyl, Allyl, n-Propyl, Isopropyl und η-Butyl. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Addukte geeignete Harnstoffe sind beispielsweise N-Methy!harnstoff, Ν,Ν-Diäthylharnstoff, rt-n-Butylharnstoff, N-AlIylharnstoff, N-Crotylharnstoff,

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_w *7 »

N-Methyl-H-ally!.harnstoff, N-Phenylharnstoff, N-(ρ-• Chlorphenyl)-harnstoff, H-(o-Tolyl)-harnstoff und I¹J- (p-Trifluormethylphsnylharnstof f.

Zu den Macrolidantibiotica mit einer Aldehydgruppe, die sich mit zwei Mol eines Harnstoffs der oben angegebenen Formel I umsetzen, gehören beispielsweise Tylosin, Macrocin, Desmycosin, Lactenocin, Carbomycin, Carbomycin B, Niddamycin (Desacetylmagnomycin B), Spiramycin A, B, C und D, und Glieder der Leucomycinreihe, Laucomycin A₃.

Die erfindungsgemäSen Bis-Harnstoffe werden durch Sättigen dar wässrigen oder alkoholischen Lösungen, die das Macrolidantibioticum, gewöhnlich "in Salzform, enthalten, mit der Harnstoffverbindung hergestellt. Es entsteht ein dicker Sirup,, der bei Zimmertemperatur stehengelassen wird, bis die Analyse, vorzugsweise durch Dünnschichtchromatographie, ergibt, daß praktisch das gesamte Antibioticum in ein Bis-Harnstoffaddukt übergeführt worden ist. Wenn der analytische Nachweis zeigt, daß die Bildung des Addukts praktisch vollständig ist, wird das Produkt durch Verdünnen der Reaktionsmischung mit 1 bis 2 Volumenteilen Wasser, Einstellen des pH-Werts der wässrigen Mischung auf etwa 9,0 und anschließendes Sättigen der Mischung mit Natriumchlorid isoliert. Der entstandene Niederschlag wird durch Filtrieren oder durch andere übliche Maßnahmen abgetrennt und durch Auflösen in einem organischen Lösungsmittel, gewöhnlich Chloroform, Waschen der organischen Schicht mit Wasser, Abtrennen der organischen Schicht und Entfernen der Lösungsmittel bei vermindertem Druck gereinigt. Durch Umkristallisieren des erhaltenen festen amorphen Rückstands aus einem wasserfreien organischen Lösungsmittel kann dann das gewünschte Addukt als weißer kristalliner Feststoff erhalten werden.

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Die hierin beschriebenen Antibioticum-Harnstoff-Addukte ermöglichen ein Verfahren zur oralen Verabreichung von Antibiotica an Wiederkäuer, bei dem das Antibioticum in Form eines Derivats verabreicht wird, das gegen chemischen Abbau im Pansen praktisch beständig und ferner antibiotisch inaktiv ist, das aber nach Eintritt in den Labmagen in eine antibiotisch aktive Substanz umgewandelt wird, so daß das Antibioticum seine volle therapeutische oder wachstumsfördernde Wirkung erlangt, ohne die Microflora des Pansens zu stören.

Die Vorteile der Erfindung zeigen sich bei Verwendung eines Bis-Harnstoffaddukts eines Macrolidantibioticums, z.B. von Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt, zur Behandlung von Wiederkäuern gegen Infektionen durch grampositive Organismen CRD, ähnlichen Erkrankungen und dergleichen, oder zur Erhöhung der Gewichtszunahme, der Futterverwertung oder von beiden. Diese Bis-Harnstoff-Addukte der Macrolidantibiotica sind praktisch antibiotisch inaktiv und wirken sich nicht nachteilig auf das Wachstum oder den Metabolismus der wichtigen Pansenmicroflora aus. Sie sind ferner chemisch stabil und bei dem praktisch neutralen pH-Wert des Pansens hydrolysebeständig. Wenn diese Bis-Harnstoff-Addukte jedoch in den sauren Labmagen gelangen, sind sie bei den dort herrschenden pH-Werten chemisch unbeständig und werden rasch zu dem ursprünglichen Antibioticum oder in manchen Fällen zur einer Mischung des ursprünglichen Antibioticums und einem antibiotisch aktiven Produkt des sauren Abbaus des ursprünglichen Antibioticums hydrolysiert. Durch die Erfindung wird mit anderen Worten die orale Verabreichung von Antibiotica an Wiederkäuer der oralen Verabreichung von Antibiotica an Nichtwiederkäuer angeglichen. Im letzteren Fall gelangt das aktive Antibioticum unmittelbar in den Magen, der einen sauren

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pH-Wert aufweist, aus dem es entweder als solches oder als antibiotisches Produkt des sauren Abbaus absorbiert werden kann.

Erfindungsgemäß kann also ein Antibioticum an Wiederkäuer auf oralem Wege verabreicht werden, ohne daß die Microflora des Pansens gestört wird und ohne daß infolgedessen intestinale Störungen, Anorexie und Diarrhöe oder andere Störungen hervorgerufen werden, da wahrscheinlich die Zerstörung des Gleichgewichts der Microflora im Pansen zu diesen verschiedenen unerwünschten Nebenwirkungen führt, die bei der Verabreichung von Antibiotica an Wiederkäuer auftreten, weil zu der gestörten Microflora un^· weigerlich die celluloseverdauenden Organismen gehören. Erfindungsgemäß wird die volle therapeutische und/oder Wachstumsfördernde oder die Futterverwertung verbessernde Wirkung des Antibioticums ohne die üblicherweise auftretenden unerwünschten Nebenwirkungen erzielt.

Wenn beispielsweise das Bis-Harnstoff-Addukt von Tylosin an Kühe in einer Menge von 250 mg/Kuh und Tag verabreicht wird, wird, wenn überhaupt, nur ein geringes Absinken · der Futteraufnahme zu Beginn, wie es beispielsweise bei Verabreichung von Tylosin allein auftritt, und keine merkliche Wirkung auf die Celluloseverdauung oder die Verwertung von Stickstoff, der nicht aus Protein stammt, festgestellt. Ferner tritt Diarrhöe noch Appetitmangel auf.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Tylosin als Beispiel für ein vorteilhaftes Antibioticum, wird Tylösin-Bis-Harnstoff-Addukt an Kühe, Schafe oder Ziegen in Abhängigkeit davon, ob ein rascher therapeutischer Erfolg gewünscht wird, oder ob das Antibioticum an Tiere einfach im Rannen eines Fütterungsprogramms verabreicht wird, um die Gewichtszunahme· und den allgemeinen

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Gesundheitszustand, oder die Futterverwertung oder beide zu verbessern, in Mengen von 1 bis 1000 mg/Tier und Tag verfüttert. Die Wiederkäuer, an die Tylosin-Bis-Harnstoff*-Addukt in diesen Mengen verfüttert wird, weisen alle vorteilhaften Merkmale auf, die von der Verabreichung des Antibioticums zu erwarten sind, jedoch ohne die Nebenwirkungen, die gewöhnlich bei Verabreichung von Tylosin selbst auftreten.

Zur Verabreichung von Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt oder anderen Macrolid-Bis-Harnstoff-Addukten oder anderen basenbeständigen Antibioticumderivaten an Wiederkäuer werden die Verbindungen in dieser Form mit. dem Futter vermischt. Sie können auch mit Gelatine oder anderen Stoffen dieser Art überzogen und dann mit dem Futter gemischt werden. Schließlich können sie in Bolusform verabreicht werden _r wie es bei der Verabreichung von therapeutischen Antibioticumdosen an Rinder üblich ist.

Die folgende Tabelle zeigt, daß Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt, eine typische basenbeständige antibiotisch inaktive Form eines Antibioticums, auf die celluloseverdauenden Organismen im Pansen keine Wirkung hat. Für diesen Versuch wurde ein Panseninokulum aus Pansenflüssigkeit hergestellt, die einem Stier, der ein Futter mit hohem Cellulosegehalt erhielt, über eine Fistel entnommen wurde. Zur Herstellung dieses Inokulums wurde der Panseninhalt durch vier Lagen Gaze abgeseiht. Der von der Gaze zurückgehaltene Anteil wurde in einer gleichen Volumenmenge Phosphat-Carbonat-Puffer bei 37 C resuspendiert und erneut durch die Gaze abgeseiht. Die erhaltene Pansenflüssigkeit wurde etwa 3O Minuten absitzen gelassen. Während dieser Zeit setzten sich dia Protozoen am Boden ab, während kleine Mengen teilchenförmigen Materials

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an die Oberfläche stiegen. Die Protozoen und die flüssige Phase wurden abgetrennt und als Panseninokulum verwendet. Vor der Verwendung wurde das Inokulum mit einer gleichen Volumenmenge eines vorher mit Kohlendioxid gesättigten Phosphatbicarbpnatpuffers folgender Zusammensetzung verdünnt: -

Bestandteil Zusammensetzung der Nährpuffermischung

3/1

0,316 0,152 2,260 0,375 O.,375 0,112 0,038 0,008 0,004 0,004 0,002 0,001

Das verdünnte Inoculum wurde mit Cellulose in einer Menge von 5 g/Liter und Harnstoff in einer Menge von 1 g/Liter versetzt. Die Hischung wurde in KohlendioxydatTiiosphäre 3O Minuten lang inkubiert. Dann wurden aliquote Proben von jeweils 25 ml entnommen und in kleinen Brutkolben übergeführt, die mit Einweggasventilen versehen waren, damit überchissiges Gas entweichen konnte und anaeroba Bedingungen aufrechterhalten wurden. Die ßrutkol.oen wurden uit verschiedenen -antibiotisehem Stoffen

"^{J> ;} " 709852/ 1 1 /_t 3 _

BAD ORJQfNAL

HaH2	P04	4
KH2PO4	2
NaHCO3	4
KCl	4
MaCl	4
HgSO	4
CuCl	2
FeSO
iinSO
ZnSO
CuSO
CuCl

in verschiedenen Mengen versetzt und 24 Stunden lang inkubiert. Nach beendeter Inkubation wurde der pH-Wert festgestellt» Hierauf wurden in jeden Kolben 5 ml 20-prozentiger Metaphosphorsäure gegeben. Der Kolbeninhalt wurde eingefroren, dann aufgetaut und zentrifugiert. Zur gaschromatographischen Bestimmung flüchtiger Fettsäuren mit kurzer Kette wurde der überstehenden Flüssigkeit eine Probe entnommen. Der übrige Kolbeninhalt wurde mit 20 ml 80-prozentiger Essigsäure und 2 ml Salpetersäure vermischt , und die Mischung wurde 30 Minuten lang auf 130 ⁰C erwärmt, um sämtliche Stoffe ausser Cellulose abzubauen. Nach dem Erwärmen wurden in jeden . Kolben 20 ml Äthylalkohol gegeben, und das unlösliche Material, hauptsächlich Cellulose, wurde abzentrifugiert.

Die Kolben wurden mit Tylosin, Chlortetracyclin und Oxytetracyclin in einer Konzentration von 1 mcg/rnl versetzt. In einen Kolben wurde Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt in einer Menge gegeben , die nach Hydrolyse des Addukts 1 mcg/ml Tylosin ergab. Ein Kolben diente als Kontrolle. In der folgenden Tabelle I sind die Ergebnisse dieses Versuchs aufgeführt. In Spalte 1 ist die Art der Behänd-· lung und in Spalte 2 der Mittelwert der verdauten Cellulose in Prozent (3 Inkubationen) angegeben.

Tabelle

Mittelwert der verBehandlung . , dauten Cellulose,

Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt	69,6
Tylosin	30,3
Chlortetracyclin	12,9
Oxytetracyclin	16,8
Kontrolle	76,3

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Tabelle II zeigt die Wirkung der gleichen Antibiotica auf die Bildung flüchtiger Fettsäuren. In Spalte 1 ist die Behandlung und in Spalte 2 der Mittelwert der flüchtigen Fettsäuren in mMol/ml angegeben.

Tabelle II

Behandlung	Mittelwert"für flüchtige Fettsäuren, mM/ml
TylQsin-Bis-Harnstoff- Addukt	27,0
Tylosin	8,6
Chlortetracyclin	3,4
Oxytetracyclin	2,0
Kontrolle	29,2

Aus den vorstehenden Ergebnissen ist zu ersehen, daß sich das Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt nur wenig oder überhaupt nicht auf den Prozentsatz verdauter Cellulose oder auf die Bildung flüchtiger Fettsäuren durch die Pansenflora auswirkt, während die anderen Antibiotica, darunter Tylosin allein, einen nachteiligen Einfluß auf diese beiden Pansenfunktionen ausüben.

Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt hat sich auch bei der praktischen Anwendung als sehr wirksam erwiesen. Die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse wurden bei einem 28 Tage dauernden Fütterungsversuch mit StierJährlingen erhalten, die Futter mit hohem Rauhfuttergehalt erhielten. In Spalte 1 ist die Zahl der Stiere in jeder Fütterungsgruppa, in Spalte 2 die tägliche Antibioticummenge pro Stier, sofern Antibioticum verabreicht wurde, in Spalte 3 die tägliche Gewichtszunahme pro Stier in kg (pounds), in Spalte 4 die tägliche Futtermenge pro Stier in kg

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(pounds) und in Spalte 5 die Futtermenge in kg angegeben pro kg Gewichtszunahme.

Tabelle III

Zahl der tägli- Gewichts- Futter pro Futter,kg Stiere in ehe Anti- zunähme pro Stier und (lbs.) jeder Gruppe bioticum- Stier und Tag, Gewichtsmenge im Tag,kg kg (lbs.) zunähme . Futter (lbs.) . kg (lbs.)

Keine

O_r6O (1,33) 9,39 (20,7)

15,5

Tylosin 250 mg

O,63 (1,38) 9,58 (21,1)

15,3

Tylosin-Bis-Harn- stoff-Addukt mit 250 mg Tylosinacti-Vität O,68 (1,50)

9,62 (21,2)

14,1

Wie aus der vorstehenden Tabelle zu ersehen ist, war die tägliche Gewichtszunahme bei Stieren, die Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt erhielten, größer als bei Stieren, die eine äquivalente Menge Tylosin erhielten oder bei einer Kontrollgruppe, und die Futterverwertung (Futtermenge : Gewichtszunahme) war ebenfalls erhöht. Ferner zeigten die Stiere, die Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt erhielten, keine der unerwünschten Nebenwirkungen, die oben beschrieben wurden.

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Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt kann zur Behandlung von Wiederkäuern verwendet werden, die unter verschiedenen pathogengen Zuständen, darunter beispielsweise folgenden leiden:

Leberabszeß, verursacht durch Sperophorus necrophorus, Klauenseuche, verursacht durch Clostridium chauvoei, Enterotoxämie, verursacht durch Clostridium· perfringens; Malignes ödem, verursacht durch Clostridium septicum, -Tetanus, verursacht durch Clostridium tetani und Pneumonie, wahrscheinlich durch einen Komplex von Viren, Mycoplasmä und Bakterien verursacht.

Dosierungen von Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt'bis zu 250 mg/Tier und Tag wirken gegen alle oben genannten Organismen prophylaktisch und verhindern ausserdem Pneumonie. Zur Behandlung pathologischer Störungen können höhere Dosierungen bis zu 2000 mg/Tier und Tag erforderlich sein.

Ferner kann Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt zur Eliminierung von Coccidien bei Rindern und Schafen verwendet werden.

Diese Gocciden sind Parasiten, welche Epithelzellen des Intestinaltrakts befallen, in denen sie sich zuerst asexuell vermehren und dann in den Wirtszellen sexuell reproduzieren. Um alle Anzeichen für die Organismen und ihre schädigende Wirkung auf das Tier zu beseitigen, können Dosierungen bis zu 2000 mg/Tier und Tag erforderlich sein. Die Coccidien mit der stärksten pathogenen Wirkung auf Rinder sind Eimeria bovis und E.zurnii, obwohl auch E. cylindrica, E. ellipsoidalis, E. bukidnonensis, E. auburnensis und E. allabamensis, wenn auch in geringerem Ausmaß, pathogen sein können. Bei Schafen sind die Organismen mit der stärksten pathogenen Wirkung Eimeria ninakohlyakimovae, E. arloingi und E. ahsata. Auch E. faurei, E. intracta und ti. parva können pathogen wirken, wenn auch in fjoringore η Ausmaß.

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BAD ORlGINAU

Bis-Harnstoff-Addukte anderer Macrolidantibiotica mit einer Aldehydgruppe, beispielsweise Magnamycin, Spira mycin A, Macrosin, Desmycosin, Lactenocin, Carbomycin, Carbomycin B, Niddamycin, anderen Vertretern der Spiramycinreihe und Vertretern der Leucomyeinreihe können in der gleichen Weise hergestellt werden. Diese Addukte können an Wiederkäuer zu therapeutischen 'Zwecken oder zur Verbesserung der Gewichtszunahme und/oder Futterverwertung in einem üblichen Wiederkautermastprogramm in der gleichen Weise wie das Tylos±n~Bis~Harnstoff-Addukt oral verabreicht werden. Diese anderen Bis-Harnstöff-Addukte sind ebenfalls beim pH-Wert des Pansens praktisch beständig und antibiotisch inaktiv, werden jedoch nach Eintritt in den Labmagen zum ursprünglichen Antibioticum hydrolysiert, das dann in dieser Form wirken kann. Wie bei Tylosin-Eis-Harnstoff-Addukt treten bei ihrer Verabreichung höchstens minimale Nebenwirkungen auf. Der Dosierungsbereich ist der gleiche wie für das Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt. ·

Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß auch andere basenbeständige antibiotisch inaktive Derivate verschiedener Antibiotica, die sich bereits zum Kästen von Rindern und anderen Wiederkäuern brauchbar erwiesen haben, hergestellt werden können, beispielsweise Ionenaustauschharzderivate, basenunlösliche Säureadditionssalze und dergleichen.

In den folgenden Ausführungsbeispielen ist die Herstellung von Harnstoffaddukten einiger Macrolidantibiotica beschrieben.

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Beispiel 1

■" ■ . Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt

100 g Tylosintartrat werden in einer. Lösung von 100 g Harnstoff in 100 ml Wasser gelöst. Die erhaltene. Mischung wird stehengelassen, bis die Dünnschichtchromatographie ergibt, daß die Bildung des Addukts praktisch beendet ist. Für die Dünnschichtchromatographie wird Kieselsäuregel als Substrat in Verbindung mit einem 1:9 Lösungsmittelsystem aus Diethylamin und Äthylacetat verwendet. In diesem System verbleibt das Tylosin-Bis-Harnstoff-Äddukt an der Aufgabestelle, während Tylosin kurz hinter der Lösungsmittelfront wandert.

Zur Isolierung des Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukts wird die Reaktionsinischung mit 2 Volumenteilen Wasser versetzt. Dann wird der pH-Wert der Lösung mit 10-prozentiger wässriger Watriumhydroxydlösung auf etwa 9 eingestellt. Hierauf wird festes Natriumchlorid zugegeben, bis sich das rohe Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt als gelblicher, gummiartiger Feststoff abscheidet, der abfiltriert wird. Der Filterkuchen v/ird in Chloroform gelöst, und die Chloroformlösung wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Entfernung des Chloroforms bei vermindertem Druck wird Tylosin-Bis-Harnsotff-Addukt als blaßgelber amorpher Feststoff erhalten, der bei vermindertem Druck gründlich getrocknet wird, um möglichst viel noch vorhandenes Chloroform zu entfernen. Der getrocknete Feststoff wird dann in trockenem Aceton in einer Menge von 5 mg/g Feststoff gelöst und die erhaltene Lösung wird gekühlt. TyIosin-Bis-Harnstoff-Addukt kristallisiert in Form von weißen Wadeln aus, die abfiltriert werden. F. 220 bis 222 ⁰C.

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Analyse, Ber. für ^C47^H3₃ ^K5^O ₁₈ ^{: c} 56,22, H 8,39; M 6,96

Gef.: C 56,O5> H 8,32; S 6,72.

Ein Kernresonanzspektrum des Addukts zeigt kein Protonensignal, das der Aldehydgruppe zuzuschreiben ist. Das Äddukt ist gegen Organismen, die üblicherweise zur Prüfung von Tylosin verwendet werden, mikrobiologisch inaktiv.

Tylosin wird aus seinem Bis-Harnstoff durch Auflösen des Äddukts in wässriger Lösung, die mit Hilfe von Standardpuffern bei einem pH-Bereich von 4 bis 7 gehalten wird, chemisch regeneriert. Ferner wird etwas Desmycosin, ein Produkt der sauren Hydrolyse von Tylosin, erhalten.

Durch Verwendung von N~Methy!harnstoff anstelle von Harnstoff wird nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise Tylosin-bis-(iT-methylharnstof f) addukt erhalten.

Anstelle von Harnstoff oder N-Methylharnstoff in dem vorstehenden Beispiel können andere Harnstoffe der Formel I zur Herstellung von Bis-Harnstoff-Addukten mit Macrolidantiblotica verwendet v/erden. Zu solchen Harnstoffen, die ein Bis-Harnstoff--Addukt bilden, gehören Allylharnstoff, N,I\i-Diäthylharnstof f, iLthylharnstoff und b!~Methyl-L'J--n--propylharnstoff« Diese Harnstoffverbindungen sind sämtlich in Wasser löslich, und die oben beschriebene Arbeitsweise kann ohne Abt^nderung zur Herstellung der Bis-Harnstoff-Addukte verwendet werden.

BfcD ORIGINAL 209852/1 U3

Für andere Harnstoffe., z. B. N- (m-Tolyl) -harnstoff, M-Phenylharnstoff, ti- (tert. -Butyl) -harnstoff und N-(p-Trifluormethylphenyl)-Harnstoff werden anstelle wässriger Lösungen alkoholische Lösungen des Harnstoffs und des ■Tylosinsalzes verwendet.

Beispiel 2 Magnamycin-Bis-Harnstoff-Addukt

2 g Magnamycin werden in 5,0 ml gesättigter,.wässriger Harnstofflösung gelöst, die durch Zugabe von 10-prozentiger wässriger Salzsäure nach Bedarf bei einem pH iia Bereich von 5,0 bis 5,5 gehalten wird. Nach 12 Tage langem Stehen bei Z irnmerteraperatur wird die Lösung mit 4 Volumenteilen Wasser verdünnt. Die wässrige Lösung wird mit Chloroform in Anteilen von je 40 ml bei folgenden pH-Werten extrahiert: 5,0, 5,5, 6,0 6,5 und 7,O. Der pH-Wert der Lösung wird vor jeder Extraktion durch Susatz von 10-prozentiger wässriger Natriumhydroxydlösung auf den gewünschten Viert eingestellt. Das Harnstoffaddukt ist in jedem dieser Extrakte enthalten, aber nur die bei pH 6 und 7,0 erhaltenen Extrakte ^ sind praktisch frei von Magnamycin. Die bei diesen höheren pH-Werten erhaltenen Extrakte werden vereinigt, und Kagnämycin-Bis-Harnstoff-Addukt wird nach der in Beispiel 1 für Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt beschriebenen Ilethode isoliert.und gereinigt. Es werden 0,5 g eines weißen Feststoffs mit einem typischen MagnamycinspektruFi in ultravioletten Bereich ( €^^{40 m}/^U =13 000)

Iu α. Χ

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erhalten. In den NMR-Spektrum des Addukts fehlt das Aldehydprotonsignal. Die biologische Prüfung des Bis-Harnstoff-Addukts ergibt, daß es gegen Organismen, die für ein übliches Magnamycintestverfahren verwendet werden, inaktiv ist.

Magnamycin wird aus Magnamycin-Bis-Harnstoff-Addukt durch 20 Minuten lange Behandlung des Addukts bei 120 C und pH 5 im Autoklaven zurückgewonnen.

Beispiel 3 Spiramycin-Bis-Harnstoff-Addukt

2 g Spiramycin A werden in 50 ml gesättigter wässriger Harnstofflösung gelöst, die durch Zusatz von 10-prozentiger wässriger Salzsäure nach Bedarf im Bereich von pH 4,5 bis 5,0 gehalten wird. Nach 12 Tage langem Stehen bei Zimmertemperatur wird die Lösung mit 4 Volumenteilen Wasser verdünnt, und wie in Beispiel 2 einer Extraktion mit steigendem pH-Wert unterworfen mit der Ausnahme, daß die Extrakte bei pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 .und 9,0 erhalten werden. Für jede Extraktion werden 40 ml Chloroform verwendet. Die bei pH 8,0, 8,5 und 9,0 gewonnenen Extrakte werden vereinigt und ergeben 1,0 g Spiramycin-Bis-Harnstoff-Addukt in Form eines weißen Feststoffs. Das Ultraviolettspektrum des Addukts ist praktisch das gleiche wie das von nichtumgesetztem Spiramycin A (£ _ma ^m/^U = 23 000). Das NMR-Spektrum ist dem von Spiramycin A vergleichbar mit der Ausnahme, daß das Aldehydprotonsignal verschwunden ist,

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Das Spiramycin-Bis-Harnstoff-Addukt wird durch Auflösen von 20 rng des Addukts in 1 ml Äthanol, Susatz von 4 ml eines Puffers von pH 5,5 und 20 Hinuten lange Behandlung der ilischung in einem Ai
Spiramycin übergeführt.

der ilischung in einem Autoklaven bei 120 C wieder in

In analoger Weise können Bis-Harnstoff-Addukte anderer iiacrolidantibiotica mit einer Aldehydgruppe, zum Beispiel von Macrocin, Desp;ycosin, Lactenocin, Carbomycin, Carbomycin B, i:Iiddamycin, anderen Vertretern der Spiramycinreihe und Vertretern der Leucomycinreihe hergestellt werden.

Die erfindungsgeinäßen Verbindungen sind auch als Ausgangsstoffe zur Heretellung von Derivaten der verschiedenen oben genannten Macrolidantibiotica vorteilhaft. Beispielsweise ermöglicht die Umsetzung der Tylosinaldehyd gruppe mit Harnstoff unter Bildung eines Bis-Harnstoff-Addukts, das alkalibeständig ist, die Reduktion der Tylosinketongruppe mit Watriümborhydrid, wodurch nach saurer Hydrolyse der zwei Harnstoffmoleküle je nach dem pH-Wert und der Dauer der sauren Hydrolyse ein neues Dehydrodesmycocin oder ein neues Dihydrotylosin erhalten wird. Mit Tylosin oder Desmycosin kann die vorstehend beschriebene Reduktion selbstverständlich nicht durchgeführt werden,' da die in diesen beiden Antibiotica vor*- handene Aldehydgruppe im Vergleich zu der Ketongruppe durch Hatriamborhydrid bevorzugt reduziert wird. Die so erhaltenen Verbindungen, wie Dihydro-(ketonreduziert)-jjylosin und Dihydro-(ketonreduziert) Desmycosin weisen ein antibiotisches Spektrum auf, das dem von Tylosin bzw. Desmycosin vergleichbar ist. Diese neuen Antiniotica v/erden in der gleichen Weise wie Tylosin-und Desmycosin zur Bekämpfung des Wachstums von Mikroorganismen, zum

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Beispiel von S. aureus, Sarcina lutea und B. subtilis, verwendet. So können beispielsweise Lösungen von Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin und Dihydro(ketonreduziert)-Desmycosin zum Desinfizieren von Krankenhäusern, Larboratoriumsglasgeräten und dergleichen, verwendeb x/erden.

Beispiel 4 Bis-Harnstof f-Addukt von Dihydro- (ketonreduziert).-Tylosin

17 g Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt und 650 rag Katriumborhydrid werden in 450 ml 95~prozenticem Ethanol gelöst. Die Reaktionsmischung wird über Nacht stehen gelassen und dann mit 400 ml Wasser verdünnt.- Das Äthanol wird im Vakuum verdampft und die erhaltene wässrige Lösung wird mit 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroforraschicht wird abgetrennt, getrocknet und im Vakuum vom Chloroform befreit, wodurch, man einen amorphen weißen Feststoff als Rückstand erhält. Dieser weiße Feststoff ergibt ir-. Dünnschichtchromatogramm einen einzigen Fleck. Durch Umkristallisieren des weißen Feststoffs aus Aceton wird kristallines Qihydro-(ketonreduziert)-Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt erhalten.

Beispiel5 Dihydro-(ketonreduziert)-Desmycosin

9,1 g Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin-Bis-HarrstofP-Addukt v/erden in 300 ml Wasser gelöst. 0er pH"-l7ert dor Lösung wird durch Zugabe von 10-prozentiqer V7".ssriger Salzsäure auf etwa 2,8 eingestellt. Die Hy i

,..,.- BAD

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. - 23 -

wird 4 Tage bei 2ipimertenperatur stehengelassen. Dann wird die wässrige Reaktionsmischung mit Methylendichlorid· bei folgenden pH-Werten extrahiert: 6,O₇ 6,5, 7,0, 8,0 und 9,0. Der pH-Wert der Lösung wird für jede Extraktion durch Susatz von 10-prozentiger wässriger Natriumhydra xydlösung höher eingestellt. Die bei pH 7,O und 3,0 erhaltenen Extrakte werden vereinigt und ergeben im Dünnschichtchronatogramm nur einen einzigen Fleck. Nach Eindampfen der vereinigten Extrakte bleiben 5,2 g Oihydro-(ketonreduziert)-Desmycosin als amorpher weißer Feststoff zurück. Durch Auflösen des Feststoffs in der Mindestmenge heißen Chloroforms und anschließendes langsames Abkühlen der Lösung erhält man 2,2 g kristallines Dihydro-(ketonreduziert)-Desmycosin, das sich ira Bereich von 70 bis 80 ⁰C zersetzt.

Analyse, Ber. für C₃₃H₅₆NO₁₄: C 60,05; H 8,62; N 1,84 . . Gef.: C 59,76; H 8,48; Ii 1,86.

Dihydro-(ketonreduziert)-Desmycosin kann aus Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt durch 1,5 Stunden lange Hydrolyse bei pH 3,6 und 100 ⁰C hergestellt werden. Durch Extraktion der Hydrolysemischung mit Methylendichlorid wird direkt die gewünschte Verbindung erhalten.

Dihydro-(ketonreduziert)-Desmycosin inhibiert das Wachstum von S. aureus, Sarcina lutea und B. subtilis, wenn es in dem Kulturmecliurn in. einer Konzentration von 10 mcg/ml enthalten is*?.·

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Beispiel 6 Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin

10 g Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin-Bis-Harnstoff-Addukt werden in der Mindestmenge warmen Äthanols gelöst, und die Äthanollösung wird mit 450 ml eines Phosphat-Citrat-Puffers vom pH 4,8 verdünnt. Der pH der Lösung wird durch Zugabe von Zitronensäure auf 5,0 eingestellt. Die Lösung wird 30 Minuten auf etwa 90 ⁰C erwärmt. Durch Extraktion der Reaktionsmischung mit Methylendichlorid bei einem pH im Bereich von 5,0 bis 5,5 (der pH wird nach Bedarf mit verdünnter Natriumhydroxydlösung eingestellt) werden 5,7 g Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin als weißer amorpher Feststoff erhalten. Der Feststoff liefert im Dünnschichtchromatogramm einen Fleck, der mit anderer Geschwindigkeit als Tylosin in dem gleichen System wandert. Dihydro-(ketonreduziert)-Tylosin inhibiert das Wachstum von S. aureus, Sarcina lutea und B. subtilis, wenn es in dem Kulturmedium in einer Konzentration von 10 mcg/ml enthalten ist.

Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß andere Derivate der Tylosinketoncarbonyigruppe hergestellt und ähnliche Umwandlungen mit den anderen Macrolidantibiotica durchgeführt werden können, wenn die Aldehydgruppe durch Harnstoff blockiert ist. ■

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OHOfNAL INSPECTED-

Claims (2)

Patentansprüche

1. ■ Verfahren zur Herstellung von (ketonreduziertem) Dihydrotylosin oder (ketonreduziertem Dihydrodesmycosin, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Vermischen von Tylosin oder Desmycosin und eines Harnstoffs der Formel

H₂N-C-Am

worin Am den Rest -HH-R, in dem R ein Phenyl-, Tolyl-, Halogenphenyl- oder Trifluormethylphenylrest ist, oder

-Nl

.R¹

R"

bedeutet, in dem R¹. und R" unabhängig voneinander C -C₄~Alkylreste oder C₃-C,-Alkenylreste sind und die Summe der Kohlenstoffatome in R¹ und R" den Wert 4 nicht überschreitet, in einem neutralen oder basischen Medium in Mengen, die wenigstens 2 Mol des Harnstoffs je Mol Tylosin oder Desmycosin ergeben, ein Addukt aus dem Harnstoff und Tylosin oder Desmycosin mit der Struktur

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BAD

erzeugt, worin bedeuten:

R-

R, 3

Z die Gruppe /-■ -\ oder /\ . \

\oder

R₁ ein Wasserstoffatom und
R₉ den Rest -O-Forosamin oder

R₁ und R₉ zusammen mit dem Kohlenstoffatom an das sie gebunden sind, eine Ketogruppe,

R₃ ein Wasserstoffatom oder einen Methylrest, TJ

4 einen Methylrest oder Äthylrest, Rr einen Methylrest oder eine Methoxygruppe,

einer der Reste R_g und R₇ den Rest -O-Mycaminose-0-My-, caros'e und der andere ein Wasserstoff atom, eine Hydroxygruppe, einen Acetoxyrest oder einen Propionylrest, Rg ein Wasserstoffatom oder den Rest -CH₉-0-Mycinose und Rg den Rest eines Harnstoffs der Formel

H₂W-C-Am ,

worin Am den Rest -IiII-R, in dem R ein Phenyl-, ToIy 1-, Ilalogenphenyl- oder Trifluorruethylrest ist, oder

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bedeutet, in dem R¹ und R" unabhängig voneinander Wasserstoff atome , C^C^-Alkylreste oder C₃~C,-Alkenylrest*e' ''" sind und die Summe der Kohlenstoffatome in R¹ und R" den Wert 4 nicht überschreitet, die Ketongruppe in dem Tylosin- oder Desnycosinteil des Addukts reduziert und das so erhaltene Addukt von (ketonreduziertem) Dihydrotylosin oder (ketonreduziertem) Dihydrodesmycosin hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reduktion mit Natriumborhydrid durchführt.

3. (Ketonreduziertes> Dihydrotylosin und (ketonreduziertes)Dihydrodesmycosin.

2 0 9 fl 5 2 / 1 U 3 . ©?liOiNAL IHSFECTSD