DE1813797C3 - Verfahren zur Gewinnung von in Schweine und Rinderherzen vorhandener Lipoproteid Lipase - Google Patents

Description

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Verfahren /ur Gewinnung von in Schweine und Rinderherzen vorhandener Lipoproteid-Lipase.

:)ic Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnune von in Sehweine- und Rinderherzen vorbändener Lipoproteid-Lipase. wobei man durch Extraktion von .-vceton-Trockcnpulver der Herzen mit einer ammoniakalischen Lösung und F.ltr.erung dieses Extraktes eine klare, die Lipoproteid-Lipase enthaltende Lösung gewinnt.

Aus »Journal ob Biological Chemistry, 215. Seiten 1 bis 14 (1455), ist es bereits bekannt, Lipoproteid-L.pase aus Acetonpulvern von Rattenherzen /u extrahieren. Die Extraktion dieses Pulvers erfolgt bei dem bekannten Verfahren mittels Menschenserum oder mittels einer mit Phosphat gepuderten Sal/Iösune oder mittels Ammoniak. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß es nicht großtechnisch durchführbar ist und daß das dabei erhaltene Produkt eine für die Verwendung in der Humantherapie ungenügende Reinheit aufweist.

Xufaabe der Erfindung ist es. ein Verfahren zur Gewinnung von Lipoproteid-Lipase anzugeben, das großtechnisch durchführbar ist und ein Produkt mit der gewünschten hohen Reinheit liefert.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Gewinnung von in Schweine- und Rinderherzen vorhandener Lipoproteid-Lipase, wobei man durch -nfälit und für die Behandlung von generalisierten r,d rar den Coronarien lokalisierten Atheromatosen ^odl-^{r a} _f ^r _;. ,,· Behandlung von Hyperhpamien, wie sie soxMc fur diL "^Diabetes oder durch Behandlung insbesondere ικ ^_^ Derivaten hervorgerufen mit ί«nisi _^ ^.^ derartige Verwendbarkeit wird, ge ei λ. ^ ^^ _{nicht bekannt}

Uie^s ^rt" _mäßc mehrstufige Verfahren wird

U^ ^i &; = _{ο|<ΐ1 durchg}eführt:

^ΙΠ\ς _f. _D;_c unmittelbar nach dem Schlachten aus

' ^MUI^ Schweinen oder Rindern entnom-

^{dcn gc>}„:^_c„"_{verdcn in} bekannter Weise fein zerrnen^n ικ-ΐ*. ^^^ _worauf das erhaltene Ma'nlkleinere ^ Rühren mit auf tiefer Temperatur

g"! »^{nlLr KI}\ * _aufoenommen wird. Nach dem geiialtenan λ ^ ^ _crhaltenen Mischung wird der

, ,^', ,V . _stan(j j_m Vakuum zu einem PuKer erhabene ·- _erhä|. _c;_n sosenanmes Aceton-

getrocknet ι

„ tiStcL· Maßnahmen wird bekanntlich eine rasch?Lntwassemng und Entfettung des Mahlgutes erreicht und durch die Verwendung von Aceton S sich die Möglichkeit, die Behandlung der Tkleinerten Schweine- oder Rinderherzen be, M r Temperatur, beispielsweise bei - 20 C ^n.", ,-führen, «odurch sich die enzymatisehe Aktiv, at u,r

τ· , α ι inacpn ohne aufwendise scnut/.mji·-

Lipoprote.d-L pasen ohne

η ahmen ernaiia"'. daß die als Ausgan--

se, ^d^^fJ'"^g3W^^l _ie. _und Rinderherz,-,

Arterien und G-

^^Sn. Andererseits kar, ^ JJ™^et *^cr _{Accton unter dcn} gleichen B

die ^l-^xtrakt'°ⁿ ™J _Ab7entrifuBieren wiederholt wer d.ngungen xor dem Abzentnrugi

^tlen; . p_vtraWtinn mit Aceton erhalten·.

Das bj, der^ ^J^l ^ enzymatischen PuKer IaUt sicn onnc

3» , Verfahrensstufe erhalten.

. Verfahren mn

4« Pulver wird wie ^^cmbekann^ _&mm^_

kauenh^crzen ""¹^^k™Ξ^Γund extrahiert, woniakalischen Losung suspendiert^uno

be. man nach dem Abfiltneren

^erhf- Erfindungsgemäß werden nun aus der in ^^^^Se^haltenen klaren Lösung zudu ve na^nrJ'^1!>\ . inaktiven Proteine danächst die dann ~^"^_r ^^ _Lösung Ammodurch ausgefa«»_;daß man der^ klären L g ₌Hat b« » -em^UigunV*.^ ^ zusetzt. i>aui u^u . ■ Puffer-Schlags wird das erhalte ^e ™ ™_o ^{l 6}^_{11 und aus} l«ung^au einen pH-Wert von 7 5 _c„ ^₅ ^

der hahenen L^ng _Ammoniu_m-

^{in bekani weise von}

dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß es groß-

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den Niederschlag mit verschiedenen omanischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise wasserfreiem Aceton und schließlich wasserfreiem Äthyläther, wobei diese Losungsmitteln ebenfalls auf tiefer Temperatur gehalten werden. Der auf die beschriebene Weise gewaschene Niederschlag wird schließlich im Vakuum getrocknet und in einer trockenen StickstolTatmo- !»phüre konditioniert.

Line weitere Möglichkeit besteht darin, den Niederschlag in Wasser zu lösen, die erhaltene Lösung win unlöslichen Teilchen abzuzentrifugieren. aus dem Zentrifugal die Lipoproteid-Lipasen durch Zi"-:itz win Trichloressigsäurc auszufällen, den aus den Lipoproteid-Lipasen bestehenden Niederschlag mehrmals mit verschiedenen organischen Lösungsmitieln zu waschen, im Vakuum zu trocknen und in einer trockenen Stickstoffatmosphäre zu konditionieren.

Das folgende Beispiel soll das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel

Stufe 1: H) kg fein zerkleinerte Schweineherzen, die unmittelbar nach der Schlachtung aus den Tierkörpern entnommen und in einem mit einer zirkulierenden Kühlflüssigkeit gekühlten Hochleistungsfleischwolf vermählen wurden, wurden in 100 1 Aceton mit einer Temperatur von — 20 C eingetragen. Das Aceton befand sich in einer mit Kühlschlangen und einem Turborührer ausgerüsteten, aus o\ydationsbeständi.'em Stahl bestehenden Wanne nach Grignard. Die erhaltene Mischung aus fein zerkleinerten Schweinehcizen und Aceton wurde etwa 10 bis etwa 3(1 min lang kräftig durchgerührt

Hierauf wurde der Inhalt der Wanne in eine kontinuierlich arbeitende Zentrifuge nach Grauss gebracht. Beim Zentrifugieren wurde das Lösungsmittel in das F.xtraktionsgefäß zur Behandlung neuer, unmittelbar nach der Schlachtung aus den Tierkörpern entnommener Herzen rückgeführt, während sich das bei der Acctonextraktion entwässerte und entfettete Pulver in der Zentrifugentrommel ablagerte Das hierbei gewonnene Pulver wurde gesammelt und nochmals unter kräftigem Rühren mit 10 bis 15 1 reinem, auf — 20° C gekühltem Aceton extrahiert. Nach erneutem Abschleudern wurde das erhaltene Pulver im Vakuum getrocknet, worauf das auf die beschriebene Weise hergestellte, durch Acetonextraktion entwässerte und entfettete Pulver unter einer StickstolTatmosphäre in Spezialbehältern aufbewahrt wurde. Ausgehend von lOkgSchweineher/en wurden 1,8 kg entwässertes und entfettetes Pulver erhalten

Stufe 2: Bei dem im folgenden beschriebenen Reinigungsverfahren wurden die verschiedenen Extraktionen und Fällungen in aus rostfreiem Stahl bestehenden Wannen nach Grignard durchgeführt. Die Wannen enthielten jeweils einen mit wasserdichten und inerten Gelenken versehenen Rührer und waren mit einem eine zirkulierende Kühlflüssigkeit enthaltenden Kühlsystem ausgestattet.

Die aufzubewahrenden Lösungen wurden mittels aus oxydationsbeständigem Stahl bestehenden Scheiben oder Platten nach Seitz, die mit einem wasserdichten und mit einem mit einer zirkulierenden Kühlflüssigkeit gefüllten Behälter ausgestattet waren, filtriert.

Die aufzubewahrenden Niederschläge wurden je nach dem Volumen des zu sammelnden Niederschlags in einer gekühlten Vorrichtung nach Grauss oder in oiner gekühlten sonstigen Vorrichtung kontinuierlich von der Mutterlauge alventrifugiert oder abgeschieden.

Samtliehe Verfahrenssehritte wurden so rasch wie

j möglich unter Ausschluß ionisierender Strahlung und bei liefer Temperatur durchgeführt.

Während der /weiten Stute des Verfahrens der Erfindung wurden 250 g des in der ersten Stufe bei der Acetonextraktion erhaltenen Pulvers in 10 1 einer

ίο 0.025 η Ammoniaklösung einer Temperatur von - 2 C unter kräftigem Rühren in einer aus oxydationsbeständigem Stahl bestehenden, gekühlten Mischvorrichtung mich Grignard suspendiert. Die e· :.:ltene Suspension wurde etwa 30 min lang kräftig durchmischt, wobei dafür Sorge getragen wurde, daß die Temperatur der Suspension während des Durchmischens dauernd auf + 2 C blieb. Hierauf wurde die Suspension bei niedriger Temperatur filtriert, wobei c \\v a Uli einer klaren, bernsteinfarbenen Lösung erhalten wurden.

Stufe 3: In der 3. Stufe des Verfahrens der F.rrindung wurden 10 1 der bei der 2. Verfahrensstufe erhaltenen und auf einer Temperatur von + 2" C gehaltenen Lösung durch Zugabe von reiner Fssigsäure auf einen pH-Wert von ⁷,5 eingestellt. Au-. dieser Lösung wurden die inaktiven Proteine durch Zugabe von 1.875 kg Ammoniumsulfat ausgefällt (der Sättigungsgrad der Lösung an Ammoniumsulfat betrug 25 ° 0), indem die Mischung bei einer Temperatur /wischen etwa 0 und etwa + 2 C mit mittlerer Geschwindigkeit 10 min lang gerührt wurde. Der hierbei ausgefallene Niederschlag wurde aut einer auf 0" C gekühlten Filterpresse abfiltriert und verworfen. Das Filtrat wurde mit einer Dikaliumphosphat-Pufferlösung auf 10 1 aufgefüllt und auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt. Hierauf wurden aus dem erhaltenen Filtrat die Lipoproteid-Lipasen ausgefällt, indem der Lösung unter dauerndem Rühren weitere 1,375 kg Ammoniumsulfat einverleibt

4c wurden, so daß die Losung nunmehr zu 50" 0 mit Ammoniumsulfat gesättigt war. Während der Amnioniumsulfatzugabe wurde die Lösung auf etwa 0 C gehalten. Nach beendeter Ammoniumsulfatzugabe wurde die erhaltene Mischung noch etwa 10 min lang weitergerührt. Der hierbei gebildete, aus Lipoproteid-Lipasen bestehende Niederschlag wurde unter sorgfältiger Kühlung auf eine Temperatur von etwa 0 bis etwa + 2'¹ C abzentrifugiert.

Die Ausbeute an Niederschlag betrug 35 g. Dieser Niederschlag kann gegebenenfalls weiter gereinigt werden.

Die Weiterreinigung wurde entsprechend den vorstehend erwähnten zwei Methoden wie folgt durchgeführt.

a) Der in Stufe 3 erhaltene Niederschlag wurde sorgfältig mit dem Sfachen Volumen, beispielsweise mit etwa 250 bis 300 ml, reinem, vorher auf — 20^r C gekühltem Äthanol aufgenommen, vvorauf das 1 ösungsmittel bei tiefer Temperatur abzentrifugiert wurde. Anschließend wurde der erhaltene Niederschlag mit etwa 1 bis 1,5 1 auf — 20° C gekühltem. 90prozentigem Äthanol gewaschen. Das Waschen wurde in der gekühlten Zentrifuge so lange fortgesetzt, bis das im Niederschlag enthaltene Ammoniumsulfat vollständig entfernt war. Hierauf wurde der Niederschlag mehrmals mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln gewaschen. Er wurde beispielsweise dreimal mit jeweils dem 5fachen VoIu-

men, beispielsweise H)IiO ml. wasserfreiem, auf Temperatur '.on etwa 0^r C abzentrif'igiert. Da der

— 20 C gekühltem Aceton und schließlich dreimal Niederschlag mit der Trichloressigsäure höchstens

mil jeweils dem ?fachen Volumen, beispielsweise kurze Zeit, das heißt höchstens etwa 5 min. in Be-

MM) ml. wasserfreiem, auf — 20 C" gekühltem Ath\l- rührune stehen soll, weil die Trichloressigsäure be-

äthcr gewaschen. :· kanmlich Hnzym-denaturierend wirken kann, war es

Der in der beschriebenen Weise gewaschene Nie- erforderlich, daß das Abzcntrifugieren in einer

derschlag wurde im Vakuum in Gegenwart von Phos- stark gekühlten Hochleistungszentrifuge durchgeführt

phorsäureanhydrid getrocknet und in trockener wurde. Der hierbei erhaltene Niederschlag wu'de

Stickstoffatmosphäre konditioniert. Die Ausbeute an schließlich mehrere Male mit verschiedenen organ'i-

gereinigten Lipoproteid-Lipasen betrug etwa ? g. io sehen Lösungsmitteln gewaschen. Im vorliegenden

b) Der in Stufe ?· erhaltene Niederschlag wurde Falle wurde der Niederschlag dreimal mit jeweils dem

in 2 1 destilliertem Wasser mit einer Temperatur von 5fachen Volumen, beispielsweise UK)OmI. wasser-

höchstens + 2' C gelost. Zur Entfernung unlöslicher freiem, auf —20" C gekühlten Accion und an-

Teilchen wurde die erhaltene I' -ung bei tiefer Tem- schließend dreimal mit jeweils dem 3fachen VoIu-

peratur zentrifugiert. 15 men. beispielsweise fiOO ml. wasserfreiem, auf

Die Fällung des Zielproduktes erfolgte bei einer —20- C gekühlten Athyläther gewaschen.

Temperatur von (· C durch Zugabe von Trichlor- Der gewaschene Niederschlag wurde im Vakuum

essigsäure bis zu einer Endkonzenualion von etwa in Gegenwart von Phosphorsäureanhydrid getrocknet

5 ° u. wozu etwa 100 g Trichloressigsäure erforderlich und in trockener SxickstoftaUnosphäre konditioniert,

waren. Der beim kräftigen Rühren der erhaltenen 20 Die Ausbeute an gereinigten Lipoproteid-Lipasen

Mischung ausgefallene Niederschlag w arde bei einer betrug etwa 2 2..

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Gewinnung von in Schwein,.- und Rinuerherzen vorhandener Lipoproteiü-Lipase. wobei man durch Extraktion von Aceton-Trockenpuiver der Herzen mit einer ammoniakalischen Lösung und Filtrierung dices !ixtraktes eine klare, die Lipoproieid-Lipase enthaltende Lösuiiü eewinnt, dadurch gekenn-/eichnel. daß man der klaren Lösung Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad son 25 " „ /u-etzt. den inaktiven Niederschlag abnitriert, das Filtrat mit einer Pufferlösung auf einen pH-Wert \on 7.5 einstellt. Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 50",, zusetzt und den die Lipoproteid-Lipase enthalten-(ien Niedersehlaa abtrennt.