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Verfahren zur Stabilisierung von L-Asparaginase Das Enzym L-Asparaginase
(L-Asparagin-amidohydrola@, E.C. 3.5.1.1) ist bekannt. Ez kans durch Extraktion
aus E. coli-Zellen gewonnen werden [H. A. Campbell, L.T.
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Mashburn, E. A. Boyse, L. J. Old, Biochemistry 6 (1967), Seitem 721
bis 730, hier weitere Literatur]. L-Asparaginase hat vor einiger Zeit Bedeutung
erlangt als Heilmittel gegen solche Gewchwülste, die zu ihrem Wachstem L-Asparagin
benötigen L-Asparaginase kann nach den in der Enzym-Chemie üblichen Methoden angereichert
werden, z. B. durch Säulenchromatographie, fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat;
oder durch fraktionierte Fällung mit inerten Lösungsmitteln. Als besonders zweckmäßig
hat sich ein älterer Vorschlag zur Reinigung des Enzyms erwiesen [Deutsches Patent
. ... ... (Deutsche Patentanmeldung P 16 42 615.1); Deutsches Patent . ... ...
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(Deutsche Patentanmeldung P 16 94 254.4) und Deutsches
Patent.
... ... (Deusche Patentanmeldung P 17 67 157.7)].
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Dieser ältere Vorschlag besteht darin, L-Asparaginase mit Polyäthylenglykol
zu fraktionieren, wobei ein Zusatz von Herrstoff und das Einstellen auf den isoelektrischen
Punkt der Enzym zu besonders reinen Dräperaten führt. Eine Kombination dieser Maßnahmen,
gegebenenfalls unter Einbeziehung des weiteren älteren Vorschlages [Deutsches Patent.
... ... (Deutsche Patentanmeldung P 17 67 617.4); Deutsche Patent. ... ... (Deutsche
Patentanmeldung P 17 92 043.3)]. Glycin als Stabilisator bei einer Hitzedenaturierung
inaktiver Begleitproteine zu verwendne, hat @ei@@n @@istallisie@tor L-Asparaginase
geführt.
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Aus der Chemie der Proteine ist bekannt, daß man beim @rheisen mit
Enzymen mit mehreren Arten von Denaturierung recknen muß: z.B. der Hitzedenaturierung,
der Denaturierung durch extreme pH-Werte und der Oberflächendensturierung [J.Biol.Chem.
118 (1937) Seiten 163 bis 175]. Die Hitzedenaturierung tritt im allgemeinen dann
auf, wenn man Proteine auf Temperaturen erwärmt, die über 40°C liegen.
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Für die einzelnen Proteine beztehen als Folge einer unterschiedlich
festen Struktur Unterschiede hinsichtlich der Grenztemperatur, von der ab Densturierung
einsetzt. Ähnliches güt auch für die Denaturierung durch zu hohe oder zu niedrige
pH-Werte. Die Oberflächendenaturierung setzt dann ein, wenn durch Wechselwirkung
mit einer Oberfläche
oder durch Spreitung an einer Phasengrenzfläche
ebenfalls Wasserstoffbrücken des Proteins gelöst werden. Der letztere Fall kann
z. B. sehr leicht durch Schaumblldung beim Schütteln oder beim- Einblasen inerter
Gase veranlaßt werden.
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Schon ein einmaliges Umgießen einer Enzymlösung von einem Gefäß in
ein anderes kann eine Aktivitätsverminderung verursachen. Die Oberflächendenaturierung
tritt am isoelektrischen Punkt besonders deutlich in Erscheinung, wie aus der Literatur
bekannt ist. Weiterhin weiB man, daß die Empfindlichkeit angereicherter Proteine
mit zunehmendem ieinheitsgrad steigt und daß hochgereinigte Präparate ganz besonders
empfindlich gegen Denaturierungserscheinungen sind.
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Es wurde nun gefunden, daß Polyäthylenglykol die L-Asparaginase gegen
verschiedene Arten der Denaturierung stabillsiert. Dieses Ergebnis ist tberraschen,
da Polyäthylenglykol keine ausgesprochen oberflächenaktive Wirkung aufweist, die
etwa die OberflCchendenaturierung dadurch verhindern könnte, daß die Schaumbildung
unterarückt wird. Im Gegensatz zu dem frtlher als Stabilisator vorgeschlagenen Glycin
besitzt Polythylenglykol zwar freie Elektronenpaare an den Xthersauerstoffatomen,
jedoch praktisch keine zur Wasserstoffbrückenbindung befahigten Wasserstoffatome.
Dieser stabilisierende Effekt tritt bei Asparaginasen verschiedener Reinheitsgrade
auf.
Die Konzentration des zugesetzten Polyäthylenglykols kann in weiten Grenzen schwanken.
Die stabilisierende Wirkung ist schon bei einem Zusats von 10%, bezogen auf eingesetzte
L-Asparaginase, deutlich nachweisbar.
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Das Polyäthylenglykol kann sowohl in Lösung - vorzugsweise in wäBriger,
aber auch in alkoholischer = als auch in fester Form der L-Asparaginase-Lösung zugesetzt
werden.
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Die früher vorgeschlagene Stabilisierung des Enzyms mit Glycin wird
durch Zusatz von Polyäthylenglykol deutlich verstärkt.
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Die stabilisierende Wirkung von Polyäthylenglykol soll durch die folgenden
Beispiele erläutert werden: Beispiel 1 Ein L-Asparaginase-Präparat war in einer
Säule die D@@@rangel fraktioniert und die L-Asparaginase-haltige Fraktion dialysiert
worden. Die Lösung enthielt 12400 U mit einer spezifischen Aktivität von 251 U/mg
Protein.
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Die erste Hälfte dieser Lösung wurde gefriergetrochnet.
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Es wurde ein Präparat mit einer Aktivität von 5050 U (=81% der eingesetzten
Aktivität) und einer spezifischen Aktivität von 20@ U/mg Protein erhalten.
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Die zweite Hälfte der obigen Lösung wurde mit @@@ einer 50-%igen Lösung
von Polyäthylenglycol(er@@@ der gefriergetrocknet. Die Ausbeute betrug 6100 U (@@@
der eingesetzten Aktivität) mit einer spezifischen Aktivität von 244 U/mg Protein.
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Beispiel 2 Jeweile 5 ml einer 0,1-%igen Lösung von L-Asparaginas mit
einer Gehalt von 146 U/mg in 0,2 n Acetatpu@ter pH 5,0, wurden wie folgt in der
Wer@@t genommen: a) Es wurde 90 Minuten @@@ rein@@ Arg. in @ weize der geblasen,
daß eine intensive Schaumbildung eintrat.
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b) Es wurde wie unter a verfahren, jedoch der Lösung vorher 100 mg
Polyäthylenglykol vom MC 1500 zugesetzt.
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@@@ wurde 3 Stunden l@ng in verschlossenem @@@ @@@ c) Es wurde wie
unter c verfahren, jedoch der Lösung vorher @@@ mg Polyäthylenglykol zugesetzt.
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@@@ wurde 3 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt @@@ punkt.
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@@@ @@bestimmung der Lösung a bis c wurden @@@@ @@lten: a) U/ml =
<15 b) U/ml = 140 c) U/ml = 35 d) U/ml = 138 e) U/ml = 146 @@@ @@@ einem 0,1-%igen
Lösung von L-asparaginase @@@ @@@ten 146 U/mg in @/15 Phosphatpuffer, pH 7,0, @@@
@@@iel @ Vers@@@sanordung a und b, behandelt.
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@@@sing wurde gefunden a) U/ml = 76 b) U/ml = 14@
Beispiel
4 Ein L-Asparaginase-Präparat mit 100 U/mg Trockengewicht wurde in 0,1 m Trispuffer
(pH 8,0) in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst. 6,0 ml dieser Lösung wurden
mit 0,5 ml Wasser verdünnt und in einem Thermostaten auf 55oc erhitzt.
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Gleichzeitig wurden 6,0 ml derselben L-Asparaginase-Lösung mit 0,3
ml Wasser und 0,2 ml einer 5O-%igen Lösung von Polyäthylenglykol in Wasser versetzt
und derselben Temperaturbelastung ausgesetzt. Nach bestimmten Zeiten wurden Proben
aus den Ansätzen gezogen und auf ihre Aktivität geprüft. Die Ergebnisse sind in
der Tabelle 1 angegeben.
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Ein analoger Versuch wurde mit demselben L-Asparaginase-Präparat bei
60°C vorgenommen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle 1 enthalten.
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Beispiel 5 Ein L-Asparaginase-Präparat mit etwa 100 U/mg wurde in
einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 n Trispuffer (pH 8,0) gelöst. Zu Proben von
6,0 ml dieser Lösung wurden entweder 0,5 ml Wasser oder 0,5 ml von wäßrigen Lösungen
zugesetzt, die 50, 100 oder 200 mg Polyäthylenglykol enthielten. Die Lösung wurde
80 Minuten auf 55°C erhitzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 angegeben.
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Beispiel 6 Ein L-Asparaginase-Präparat mit 100 U/mg wurde in einer
Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 n Trispuffer (pH 8,0) gelöst. Zu Je 6 ml dieser
Lösung wurde gegeben: a) 0,3 ml Wasser b) 0,2 ml Wasser und 0,1 ml Polyäthylenglykol
(50-%ig in Wasser) c) OD2 ml Glycinlösung (100 mg/ml) d) 0,1 ml Polyäthylenglykol
(50-%ig in Wasser) und 0,2 ml Glycinlösung (100 mg/ml) Die Lösung wurden 80 Minuten
auf 60°C erhitzt und hierauf auf ihren Gehalt an L-Asparaginase geprüft. Die Ergebnisse
sind in der Tabelle 3 angegeben.
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T a b e l l e 1 Hitzebelastung von L-Asparaginase in Gegenwart von
Polyäthylenglykol
| Belastungsdauer Temperatur Aktivität der L-Asparaginase (U/ml) |
| (Minuten) (°C) ohne Zusatz mit Polyäthylenglykol |
| 0 55 86 104 |
| 20 55 74 103 |
| 40 55 62 101 |
| 60 55 61 94 |
| 80 55 43 94 |
| 0 60 91 96 |
| 20 60 49 69 |
| 40 60 33 48 |
| 60 60 26 40 |
| 80 60 16 32 |
L-Aparaginase mit 100 U/mg gelöst in 0,1 a Trispuffer (pH 8,0); Konzentration 0,92
mg/ml. Der Zusatz an Polyäthylenglykol betrug 15,1 mg/ml.
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T a b e l l e @ @@@ wer@@ L-Asparaginase in @@@ @@@ der @@@ @@@ Polyäthylenglykol.
| Konzentration an Verhältnis von Aktivität vor Aktivität nach
Aktivität in % des |
| Polyäthylenglykol Polyäthylenglykol dem Erhitzen 80 Minuten
bei Ausgangswertes |
| zum Enzym 55°C |
| mg/ml mg/ml U/ml U/ml |
| 0 0 92 43 47 |
| 7,5 6,2 98 86 78 |
| 15,0 16,3 98 94 96 |
| 30,0 32,6 98 91 93 |
Das L-Asparaginase-Präparat hatte eine spezifische Aktivität von 100 U/mg Trockengewicht.
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Die Konzentration in der Lösung betrug 0,92 mg/ml. Durch Polywachszusatz
wurde eine Steigerung der Aktivität von 92 U/ml auf 98 U/ml (=106%) beobachtet.
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T a b e l l e 3 Beständigkeit der L-Asparaginase in Gegenwart mehrerer
Stabilisatoren
| Aktivität der L-Asparaginase |
| nach 80 Minuten |
| Erhitzung auf 60°C |
| U/ml % des Ausgangs- |
| wertes |
| L-Asparaginase allein 14 15 |
| L-Asparaginase mit Polyäthylenglykol 44 48 |
| L-Asparaginase mit Glycin 52 57 |
| L-Asparaginase mit Polyäthylenglykol |
| und Glycin 83 90 |