DE1673101B2 - Verfahren und vorrichtung zum auftragen von proben bestimmter aminosaeuren auf eine chromatografische saeule - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Auftragen von Proben bestimmter Aminosäuren auf eine chromatografische mit Ioncnaustauscherharz gefüllte Säule, durch die eine Pufferlösung getrieben wird, bei dem die Prob;; vor dem Aufbringen in einer Flüssigkeit gelöst und vor dem Einleiten der Probenlösung der Zustrom der Pufferlösung abgeschaltet wird. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrich- !■ing zur Durchführung des Verfahrens.

Das übliche Auftragen von Proben auf eine chromatografische Säule ist ein komplizierter Vorgang, der im allgemeinen die folg.nden Arbeitsschritte enthält:

1. Vom oberen Ende der Säule wird der zum Einleiten der Pufferlösung in die Säule verwendete Verschluß abgenommen.

2. Die überstehende Pufferlösung wird abgesaugt, um die Harzoberfläche freizulegen.

3. Die Probe wird mit einer Pipette oder einem Mikroheber auf das freiliegende Harz aufgebracht, wobei jede Störung des gepackten Karzes sorgfältig zu vermeiden ist.

4. Mit der Säule wird ein zweiter Verschluß verbunden und die Probe mit Hilfe von Preßluft in den oberen Teil des in der Säule befindlichen Harzes gedrückt.

5. Der zum Einleiten der Luft verwendete Verschluß wird abgenommen und zum Waschen mit einer Pipette Pufferlösung auf das Harz aufgebracht. Die als Waschflüssigkeit verwendete Pufferlösung soll die Probenlösung, die an der Säulenwand zurückbleibt, nach unten spülen. Eine Störung des Harzes ist dabei zu vermeiden.

6. Der zum Einleiten der Luft verwendete Verschluß wird erneut angeschlossen und die waschende Pufferlösung mit Preßluft in das Hai:: gedrückt.

7. Die Arbeitsschritte 5. und 6. werden wiederholt. da normalerweise ein zweimaliges Waschen zu empfehlen ist. Wenn die Probcnlösung und die Pufferlösung mit Preßluft in das Harz gedrückt werden, muß die betreffende Lösung so weit abwärts getrieben werden, bis das Harz freiliegt. Dabei muß jedoch ein Trocknen des Harzes vermieden werden, was bei zu langem Einwirken der Preßluft leicht geschehen kann.

8. Der zum Einleiten der Luft verwendete Verschluß wird abgenommen und der Säulenabschnitt oberhalb des Harzes sorgfältig mit Pufferlösung gefüllt.

9. Der zum Einleiten der Pufferlösung verwendete Verschluß wird auf die Säule aufgesetzt. Anschließend wird mit Hilfe einer Verdrängungspumpe Pufferlösung in die Säule geleitet, wobei sorgfältig vermieden werden muß, daß am oberen Ende der Säule neben dem Verschluß Luft eingefangen wird.

So ist beispielsweise aus »Analytical Chemistry«, Band 30. Juli 1958, S. 1199, bekannt, die zu analysierende Amitiosäurelösung mit einer geeichten Pipette auf der Oberfläche des Harzes aufzubringen, nachdem die über dem Harz stehende Pufferlösung mit einer Pipette abgesaugt worden ist. Weiterhin ist es aus der Zeitschrift Tierphysiologie, Tiernahrung- und Futtcrmittclkunde, Band 18, 1963, S. 16J, zur Aminosäurenbestimmung bekannt, die über der Harzsäule stehende Pufferlösung mit einem dünnen Kunststoffschlauch in ein Becherglas abzusaugen, bis nur noch eine sehr dünne Schicht an Pufferlösung über dem Harz stehenbleibt. Danach läßt man die Analysenprobe vorsichtig, ohne das Harzbett aufzurühren, von einer Kugelschliffschale her in die chromatografischc Säule einfließen. Sobald die Analysenprobe so weit eingesunken ist, daß sich oberhalb des Harzes nur noch eine geringe Flüssigkeitsschicht befindet, wird mit der vorher abgesaugten Pufferlösung nachgewaschen.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung anzugeben, mit denen die aufgezählten Arbeitsschritte weitgehend reduziert und die Aminosäureproben leichter in die chromatografische Säule eingeführt werden können. ohne daß das Harz in der Säule gestört wird.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das einsanss beschriebene Verfahren nach der Erfindung" dadurch gekennzeichnet, daß als Löseflüssigkeit fü^die Probe eine Flüssigkeit mit einer höheren Dichte als die der Pufferlösung verwendet wird.

Durch diese Maßnahme wird erreicht, daß die zugeleitete Porbenmenge durch die Pufferlösung abwurf nach unten strömt und sich auf der Oberfläche des in der Säule befindlichen Harzes aufschichtet. Es i-t somit nicht mehr erforderlieh, die überstehende Pufferlösung abzusaugen. Weiterhin bietet das eriir.dungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß sofort nach dem Aufschichten der Probenlösur.g auf dem Harz Pufferlösung in die Säule geleitet wenden kann, wO.-'urch die Probenlösung in das Harz gedrückt wirj. Bei den herkömmlichen Verfahren mußte man vor der weiteren Zugabe von Pufferlösung entweder die Probenlösung mit Preßluft in das Harz drücken oder so lange warten, bis die Probenlösuna von selbst nahezu vollständig in das Harz eingesunken war.

Vorzugsweise wird die Probe in einer Lösung von Rohrzucker in Wasser gelöst. Insbesondere Protein- und bzw. oder Peptidhydrolysate können gut in Rohrzuckermischungen mit "hohem spezifischem Gewicht aufgelöst werden.

Eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit einem lösbaren oberen Säulenverschluß ist nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß mehrere Bohrungen aufweist, durch welche die Probenlösung und die Pufferlösung unabhängig voneinander in die Säule einleitbar sind. Dadurch ist ein Wechsel des SäulenverschluFses nicht erforderlich.

Vorzugsweise weist eine der Bohrungen einen von außen zugänglichen, verschließbaren Anschluß auf, durch den die Probe bei abgeschaltetem Zustrom der Puffer lösung in die Säule cinleitbar ist, und zum Einleiten der Pufferlösung in die Säule während der Eluierung ist eine andere Bohrung vorgesehen, die strömungsmäßig mit cin^r verschließbaren, als Überlauf ausgebildeten Auslaßöffnung in Verbindung steht, durch welche die beim Einleiten der Probe aus der Säule verdrängte Pufferlösung nach außen abfließt. Diese Anordnung ist äußerst einfach und zweckmäßig.

Zum Einleiten der Probe in die Säule in der hierfür vorgesehenen Bohrung ist vorzugsweise eine mit einem äußeren Anschluß versehene, vertikal angeordnete Kapillarröhre vorgesehen, über deren unteres Ende ein Schlauch gezogen ist, mittels dem die Ausflußöffnimg für die Probe an einer vorgewählten Stelle oberhalb des in der Säule befindlichen Harzes festgelegt ist. Der Anschluß, durch den die Probe eingeleitet wird, weist bei einer Weiterbildung der Erfindung einen Hohlraum auf, in den flüssigkeitsdicht die Spitze einer Injektionskanüle cinführbar ist. Diese bevorzugte Ausbildung der Erfindung stellt sicher, daß die Probenlösung ohne Störung des Harzes bequem zugeführt werden kann.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung wird an Hand von Figuren beschrieben.

F i g. 1 ist ein Vertikalschnitt durch den oberen Teil einer chromatografischen Säule mit einem erfindungsgemäßen Verschluß:

F i g. 2 ist ein Schnitt durch einen Teil des Verschlusses.

In der Zeichnung ist das obere Ende einer chromatografischen Säule 10 dargestellt, die mit einem Verschluß 12 verschlossen ist. der vorzugsweise aus einem Kunststoff besteht. Ein unterer Teil 14 des Verschlusses 12 ist fest in das obere Ende der Säule 10 eingepaßt. Ein O-förmiger Dichtungsring 16 bildet eine Flüssigkeits- und Gasdichtung zwischen der Innenfläche der Säule 10 und der Außenfläche des Teils 14. Am oberen Ende der Säule 10 ist der Verschluß 12 abnehmbar mit zwei Klemmen 18 befestigt.

Mit dem oberen Teil der Sau': 10 stehen eine vertikal verlaufende Bohrung 20 und Ouerbohrungen 22 und 24 in Verbindung, die im Verschluß 12 ausgebildet sind. In eine Ausnehmung 30 des Verschlusses 12 ist flüssigkeits- und gasdicht ein Teil 28 einer Fassung 26 eingeschraubt. Durch die Fassung 26 wird die durch eine mit dem Auslaß einer Verdrängungspumpe verbundene Röhre 32 zugeführte Pufferlösung in die Säule 10 geleitet. Ein hohler Stöpsel 34 ist in eine Ausnehmung 36 am oberen Ende des Verschlusses 12 gas- und flüssigkeitsdicht eingeschraubt. Mit dem unteren Ende des Stöpsels 34 steht das obere Ende einer Kapillarrohre 38 gas- und flüssigkeitsdicht in Verbindung. Vom unteren Ende des Stöpsels 34 aus ragt die Röhre 38 durch die vertikale Bohrung 20 bis in den oberen Teil der Säule 10 unterhalb des Gehäuses 14. Auf die Röhre 38 ist ein Polyäthylenschlauch 40 gezogen, der in den oberen Teil der Säule 10 bis zu einem Punkt oberhalb der Oberfläche 43 des Harzes verlängert ist, mit dem die Säule 10 gefüllt ist. Der Polyäthylenschlauch 40 kann auf irgendeine gewünschte Länge geschnitten sein und bildet ein Hilfsmittel, um den Auslaß der Kapillarröhre 38 bezüglich der oberen Fläche 43 der Harzpackung einzustellen.

Ein weiterer Stöpsel 42, der in eine Ausnehmung 44 des Verschlusses 12 eingeschraubt ist, steht mit der Querbohrung 24 in Verbindung, die einen Überlauf bildet, wenn der Stöpsel 34 abgenommen wird. Während des Betriebs der Säule 10 und des Abstreifvorgangs, wobei gleichzeitig die Pufferlösung durch die Fassung 26 zugeleitet wird, sind die Stöpsel 34 und 42 durch eine Kappe 46 (F i g. 2) fest verschlossen.

Die F i g. 1 ist der Zustand der Vorrichtung zum Zeitpunkt der Probeneinführung in die Säule 10. Zu diesem Zeilpunkt sind die Kappen 46 von den Stöpseln 34 und 4? abgenommen, und die Verdrängungspumpe ist abgeschaltet.

Die Rohrzuckcr-Probcnlösung wird in die Säule 10 mit Hilfe einer Injektions-Kanü'e eingeführt, deren unterer zylindrischer Endabschnitt flüssigkcits- und gasdicht in den Stöpsel 34 eingesetzt ist, dessen Kappe 46 abgenommen ist. Wenn die Rohrzucker-Probenlösung eine größere Dichte als die Pufferlösung aufweist, dann strömt sie durch die Pufferlösung abwärts und wird somit auf der Oberfläche 43 des in der chromatografischen Säule 10 befindlichen Harzes aufgeschichtet. Die Pufferlösung, die sich zur Zeit der Abschaltung der Verdrängungspumpe oberhalb des Harzes in der Säule 10 befindet, wird bei Einführung der Rohrzuckcr-Probenlösung aus der

Säule 10 verdrängt und strömt zwischen der Wand der Bohrung 20 und der Kapillarrohre 38 bzw. dem Schlauch 40 hindurch zur Qucrbohurng 24 und von dort durch den Stöpsel 42 nach außen.

Nach dem Einführen der Probe wird die Injektionskanüle aus dem Stöpsel 34 entfernt. Anschließend werden die Stöpsel 34. 42 durch die Kappen 46 flüssigkcits- und gasdicht verschlossen. Danach wird mittels der Pumpe Pufferlösung in die Säule JO geleitet, wodurch die Rohrzuckcr-Probenlösung in das Harz gedrückt wird.

Die chromatografische Analyse läuft dann in üblicher Weise ab, wie es beispielsweise in einer eignen älteren Anmeldung in Verbindung mit der Analyst von Aminosäuren beschrieben ist.

Bei der praktischen Durchführung hat sich eint Rohrzuckcr-Probenlösung mit folgender Zusammen sctzung als äußerst zufriedenstellend erwiesen:

50 g Rohrzucker werden in so viel Wasser aufgelöst, daß sich K)OmI Rohrzuckcrlösung ergeben. Die Rohrzuckcr-Probenlösung wird durch Zugabe vor drei Teilen Probe zu einem Teil Rohrzuckerlösunj ίο bereitet. Gewöhnlich werden 0,2 ml Rohrzucker-Probcnlösung, bestehend aus 0,15 ml Probe unc 0,05 ml Rohrzuckcrlösung, in der bereits erläuterter Weise in die Säule 10 eingeleitet.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Auftragen von Proben bestimmter Aminosäuren auf eine chromatografische r ' Ionenaustauscherharz gefüllte Säule, durch die eine Pufferlösung getrieben wird, bei dem die Probe vor dem Aufbringen in einer Flüssigkeit gelöst und vor dem Einleiten der Probenlösung der Zustrom der Pufferlösung abgeschaltet wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Löseflüssigkeit für die Probe eine Flüssigkeit mit einer höheren Dichte als die der Pufferlösung verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß als Löseflüssigkeit für die Probe eine Lösung von Rohrzucker in Wasser verwendet wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, mit einem lösbaren Säulenverschluß, dadurch gekennzeichnet, daß der Verschluß (12) mehrere Bohrungen (20, 22, 24) aufweist, durch welche die Probenlösung und die Pufferlösung unabhängig voneinander in die Säule (10) einleitbar sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichne L, daß eine der Bohrungen (20) einen von außen zugänglichen, /erschließbaren Anschluß (34) aufweist, durch den die Probenlösung bei abgeschaltetem Zustrom er Pufferlösung in die Säule einleitbar ist, und daß zum Einleiten der Pufferlösung in die Säule während der Eluierung eine andere der Bohrungen (22) vorgesehen ist, die strömungsmäßig mit einer verschließbaren, als Überlauf ausgebildeten Auslaßöffnung (24, 42) in Verbindung steht, durch welche die beim Einleiten der Probe aus der Säule verdrängte Pufferlösung nach außen abfließt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Einleiten der Probenlösung in die Säule in der hierfür vorgesehenen Bohrung (20) eine mit einem äußeren Anschluß versehene, vertikal angeordnete Kapillarrohre (38) vorgesehen ist, über deren unteres Ende ein Schlauch (40) gezogen ist, mittels dem die Ausflußöffnung für die Probenlösung an einer vorgewählten Stelle oberhalb des in der Säule befindlichen Harzes (43) festgelegt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder5, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Einleiten der Probenlösung dienende Anschluß (34) einen Hohlraum aufweist, in dem flüssigkeitsdicht die Spitze einer Injektionsnadel einführbar ist.