DE1670553A1

DE1670553A1 - Verfahren zur Herstellung von Pyridoxal-5'-phosphat

Info

Publication number: DE1670553A1
Application number: DE19671670553
Authority: DE
Inventors: Koichi Ogata; Osamu Shoji; Noriyuki Sunahara; Kanac Yokogawa
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1966-03-04
Filing date: 1967-03-02
Publication date: 1971-02-11
Also published as: US3438860A; GB1178550A; CH478848A; BE694987A; FR1513107A

Description

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN DR. M. KÖHLER DIPL-ING. C. GERNHARDT

MDNCHEN HAMBURG TELEFON: 555476 δΟΟΟΜΟΝΟΗΕΝΙδ, *· ΜαΓΖ Ι3θ/ TELEGRAMME: KARPATENT N USSBAUMSTRASSE 10

W 13031/67

Dainippon Pharmaceutical Co₄₁, Ltd«, Osaka / Japan

Verfahren zur Herstellung von Pyridoxal-5'~ phosphat

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Herstellungsverfahren für Pyridoxal-5'-phosphat durch Oxydation von Pyridoxin-5¹-phosphat oder Pyridoxamin-5'-phosphat mit Enzymen von Mikroorganismen«,

Die Herstellung von Pyridoxal-5¹-phosphat, das nachfolgend als "PAL-P" abgekürzt wird, durch Oxydation von Pyridoxin-5¹^ phosphat, das nachfolgend als "PIIi-P" abgekürzt wird, oder von Pyridoxamin-5'-phosphat, das nachfolgend als '¹PAM-P" abgekürzt wird, mit Enzymen von Mikroorganismen ist von K_e Ogata und Mitarbeitern in Agr* Biol« Chern», Band 29, Mr _# 3, Seite 200 - 207 (1965) beschrieben« PAL-P zeigt eine Neigung, die Oxydationsaktivität der Enzyme zu hemmen« Deshalb wurde entsprechend der vorstehenden Literaturstelle Lysinmonohydrochlorid dem System zugefügt, damit die Hemmwirkung von PAL~P auf die Oxydationsreaktion vermindert wird. Durch die Zugabe

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BAD ORIGINAL

einer Aminosäure wird vermutlich das PAL-P in seine Schiffsche Base durch die Aminosäure überführt, wobei diese Schiffsche Base eine geringere Hemmwirkung als PAL-P auf die Oxydationsreaktion zeigt»

Jedoch ist der Vorteil einer derartigen Zugabe einer Aminosäure beschränkt, D.h», falls die Konzentration der Ausgangs- ^ materialien PIN-P oder PAM-P relativ niedrig ist, beispielsweise 1 mg je ml des Reaktionsgemisches, kann das Ausgangsphosphat mit hoher 'Geschwindigkeit in PAL-P überführt werden, jedoch fällt mit einem Anstieg der Substratkonzentration die Umwandlungsgeschwindigkeit stark ab.

Überraschenderweise wurde nunmehr gefunden, daß, falls die Oxydation von PIN-P oder PAM-P mit Enzymen von Mikroorganismen in Gegenwart von 1-20 MoMeilen einer α-Aminosäure, die eine Schiff·sehe Base mit PAL-P bilden kann, und mit 0,5-4 MoI- Ψ Teilen bestimmter Metallsalze je Mol-Teil des Ausgangsphosphates ausgeführt wird, das gewünschte PAL-P mit hoher Umwandlungsgeschwindigkeit erhalten wird, selbst wenn die Konzentration des Ausgangsphosphats in dem Reaktionsgemisch hoch ist₀

Die Umwandlungsgeschwindigkeiten in PAL-P im Fall der Oxydation von PIN-P in den angegebenen Konzentrationen mittels eines durch Ultraschall bewirkten Extraktes von AlC;aligenes faecalis sind in der nachfolgenden Tabelle in den Spalten

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BAD ORIGINAL,

3, 4, 5 und 6 aufgeführt. Die Versuche wurden unter identischen Bedingungen ausgeführt, ausgenommen daß die Mengen an Natriumglutamat und Zinksulfat, die in dem System vorhanden waren, in der in der Tabelle angegebenen vv'eise variiert worden waren_e

Tabelle Umwandlungsgeschwindigkeit von PIN-P

Zusatz

Menge des Zusatzes in 100 ml des Mediums

anfängliche Konzentration von PIN-P

mg/ml 3 mg/ml 5 mg/ml 10 mg/ml

Natriumglutamat

Zinksulfat

40

23

Natriumglutamat

Zinksulfat

3 g

100

58

34

20

Natriumglutamat

Zinksulfat

0 1,5 g

Natriumglumat

Zinksulfat

3 g 1,5 g

100

90

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Wenn man berücksichtigt, daß die Anwendung von Zinksulfat allein völlig die Oxydationsaktivität des Enzymes hemmt, ist es völlig überraschend, daß bei gleichzeitiger Anwendung von Natriumglutamat und Zinksulfat eine hohe Umwandlung erreicht wird, insbesondere dann, wenn die Konzentration an PIN-P hoch isto

Obwohl die Erfindung nicht durch den Reaktionsmechanismus in irgend einer Weise begrenzt ist, wird doch angenommen, daß das durch die Oxydationsaktivität der Enzyme der Mikroorganismen gebildete PAL-P in eine Metall/chelatverbindung seiner Schiff sehen Base mit der Aminosäure überführt wird, wobei diese Chelatverbindung keine Hemmwirkung auf die Oxydationsaktivität der Enzyme zeigt«,

Es wurde festgestellt, daß die zur Verwendung gemäß der Erfindung geeigneten Metallsalze diejenigen der Metalle Zink, Nickel, Magnesium, Eisen, Kupfer, Aluminium, Vanadium, Quecksilber und Arsen sind. Das Anion dieser Jalze ist für den Zweck der vorliegenden Erfindung nicht wesentlich, jedoch sind für praktische Zwecke Chloride oder Sulfate vorteilhaft» Salze von Zink, Nickel und Magnesium werden besonders bevorzugt. Die bevorzugte Menge derartiger Salze zur Verwendung liegen zwischen etwa 1 und 1,5 Mol-Teilen auf 1 Mol-Teil des Ausgangsphosphats, wobei bei Anwendung von mindestens 0,5 Mol-Teilen des Salzes

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die erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile sich einstellen,. Wenn die Menge des Metallsalzes die obere Grenze ( 4 Mol-Teile) erreicht, beginnt ein Hemmeffekt auf die Enzymaktivität auf Grund des Überschusses an Metallsalz sich einzustellen.

Die zur Verwendung gemäß der Erfindung geeignete α-Aminosäure kann als eine α-Aminosäure definiert werden, welche eine Schiff sehe Base mit PAL-P bilden kann₀ Die bevorzugten α-Aminosäuren M lassen sich durch folgende Formel wiedergeben

R-OH-OOOH

I
UH₂

worin R ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, die gewünschtenfalls durch eine Aminogruppe, Garboxygruppe, Garbamoylgruppe, Guanidingruppe, Hydroxy- oder Alkylthiogruppe mit bis zu 3 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann, bedeutet. Zu derartigen bevorzugten " α-Aminosäuren gehören: Lysin, α-α¹-Diaminopimelinsäure, Ornithin, Arginin, Glutamin, Glutaminsäure, Asparagin, Asparaginsäure, Valin, Glycin, Alanin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin und Methionin, Es scheint, daß das Kondensationsprodukt von Histidin, Tryptophan oder Cystein mit PAL-P unter den erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen eine Zyklisierung zeigt und dabei die Gruppierung -CH=N-, die für eine Schiffsche Base charakteristisch ist, nicht besitzt. Es läßt sich deshalb annehmen, daß Histidin,

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Tryptophan und Cystein für die Zwecke der Erfindung nicht geeignet sind und sich nicht als α-Aminosäuren, die Schiff sehen Basen mit PAL-P bilden können, bezeichnen lassen,, Beim erfindungsgemäßen Verfahren können solche α-Aminosäuren, die Schiffsche Basen mit'PAL-P bilden können, in einem Mengenverhältnis von 1-20 Mol-Teilen je 1-Mol-Teil des Ausgangsphosphats verwendet werden, wobei der Bereich von etwa 3-10 MoI- ^ Teilen besonders bevorzugt wird» Somit werden bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung auf einen Mol Teil des Ausgangsphosphats e'twa 1-1,5 Mol-Teile der Metallsalze und etwa 3-10 Mol-Teile der α-Aminosäure verwendete Weiterhin sollte im Pail der Verwendung einer gesteigerten Menge an Metallsalz ebenfalls auch bevorzugt die Menge der α-Aminosäure erhöht werden.

Jedes Enzym von Mikroorganismen, welche PIN-P oder PAM-P zu PAL-P oxydieren können, kann gemäß der Erfindung eingesetzt ™ werden* Mikroorganismen, welche geeignete Enzyme bilden, sind durch K, Ogata und Mitarbeiter in Agr., Biol» Chenu, Band 29, Nrβ 3, Seite 200 - 207 (1965) beschrieben, von denen besonders Alcaligenes faecalis, Micrococcus ureae, Azotobactor agili, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi und Pseudomonas polycolor bevorzugt werden. Die durch derartige Mikroorganismen gebildeten Enzyme können in Form von intakten Zellen oder eines durch Ultraschall erhaltenen Extraktee verwendet werden, wobei

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die vorteilhafteste Form für die Verwendung ein Autolysat ist»

Die Oxydationsreaktion gemäß der Erfindung wird vorteilhafter Weise unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das angewandte Enzym aktiv ist, beispielsweise pH 8 - 10, insbesondere pH 8-9, bei Temperaturen im Bereich von etwa 20 - 35⁰C, vorzugsweise etwa 30⁰C, gewünschtenfalls in Gegenwart geeigneter Coenzyme» Damit der pH-Wert des Reaktionsmediums innerhalb des optimalen Bereiches, wie er bekannt ist, gehalten wird, können ™ geeignete Pufferlösungen, beispielsweise Tris-HOl-puffer, Carbonatpuffer, Dimethylglycinpuffer und Glycin-NaOH-puffer verwendet werden_c

Weiterhin wurde gefunden, daß das gewünschte PAL-P aus dem bei der vorstehend aufgeführten Oxydationsreaktion erhaltenen Reaktionsgemisch sehr vorteilhaft durch folgende Stufen isoliert werden kann, daß aus der Reaktionslösung das bei Erniedrigung des pH-Wertes der Lösung unterhalb etwa 2 gebildete Aggregat ä abgenommen wird, dann das gewünschte PAL-P in Form eines Qalcium- oder Bariumsalzes der Schiff*sehen Base-Metallchelat-Verbindung bei einem pH-Wert von 5,0 - 8,0 ausgefällt wird, worauf der Niederschlag in einer wässrigen Lösung einer nicht-oxydierenden Säure gelöst, die dabei erhaltene wässrige Lösung mit einem Kationenaustauschharz behandelt und das PAL-P aus dem Harz eluiert wird»

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Falls der pH-Wert der Reaktionsflüssigkeit auf einen Wert unterhalb 2 durch Zugabe einer Säure, beispielsweise Salzsäure, eingestellt wird, bilden die Zellen und andere Proteinstoffe in der Flüssigkeit Aggregate„ Nach Entfernung der Aggregate wird die Abtrennung von PAL-P aus der Lösung als Calcium-, oder Bariumsalze der Schiff¹sehen Base-Metallchelat-Verbindung durchgeführt entweder durch

β Zugabe von mindestens 1 Mol-Teil eines Calcium- oder Bariumsalzes auf 1 Mol-Teil des Ausgangsphosphates zu der Lösung, falls mindestens 1 Mol-Teil je Mol-Teil des Ausgangsphosphates an Metallsalz bei der Umsetzung verwendet wurde, oder

2, durch Zugabe, falls das Metallsalz in einer Menge von weniger als einem Mol-Teil je Mol-Teil des Ausgangsphosphates bei der Umsetzung eingesetzt wurde, des gleichen Metallsalzes in einer ausreichenden Menge, damit die Gesamtmenge des in dem System vorhandenen Metallsalzes auf mindestens 1 Mol-Teil je Mol-Teil des Ausgangsphosphates kommt, und von mindestens 1 Mol—Teil je Mol-Teil des Ausgangsphosphates eines Calcium- oder Bariumsalze s.

oder Als zur Zugabe zu der Lösung geeignete Calcium- Bariumsalze seien Salze anorganischer Säuren, beispielsweise Calciumchlorid, Bariumchlorid, Calciumcarbonat, Bariumcarbonat, Calciumhydroxyd und Bariumhydroxyd, und Salze organischer Säuren, beispiele-

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weise Ctaloiumacetat und Bariumacetat aufgeführt. Bei den Calcium- oder Bariumsalzen der Schiff·sehen Base-Metallchelat-Verbindung wurde eine sehr niedrige Löslichkeit in Wasser bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5>0 bis 8,0 gefunden. Deshalb scheidet sich, nach Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf einen Wert im Bereich von etwa 5,0 - 8,0, gegebenenfalls durch Zugabe eines Alkalis, das PAL-P aus der Lösung als Caleium- oder Bariumsalz der Ohelatverbindung aus. Zugabe von Methanol oder Aceton trägt in diesem Fall dazu bei, daß die Niederschlagsbildung noch quantitativer wird, wobei die ausreichende Menge an Methanol oder Aceton ein gleiches Volumen oder ein geringeres Volumen beträgt»

Der dabei erhaltene Niederschlag wird in einer wässrigen Lösung einer nicht-oxydierenden Säure, beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure gelöst und mit einem Kationenaustauschharz behandelt» D.h_e die Lösung wird in eine Kolonne eines Kationenaustauschharzes gegossen, wodurch die Ohelatverbindung auf dem Harz adsorbiert wird. Wenn dieses Harz mit Wasser, vorzugsweise Sauerstofffreiem Wasser, in Berührung gebracht wird, wird das gewünschte PAL-P selektiv eluiert. Kristalle von PAL-P-Monohydrat werden erhalten, wenn das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt wird. Beispiele für bei der Erfindung geeignete Kationenauetauschharze sind Dowex 50 W χ 8 (H⁺-form), Amberlite IR 120 (H⁺-form) und Diaion SK-1B(H⁺-form).

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- to -

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin, wobei die Prozentangaben auf das Gewicht/ Volumen bezogen sind, falls nichts anderes angegeben ist*

Beispiel 1

Alealigenes faecalis wurde auf einem Medium aus 1,0 $ Glucose, £ 1,5 # Pepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,5 S* K₂HPO₄, 0,1 # KH₂PO₄, 0,2 i» NaCl und 0,02 <£ MgSO₄₄TH₃O gezüchtet. Wobei der Rest aus Leitungswasser bestand»

Der anfängliche pH-Wert des Mediums betrug 7_f2 und der Mikroorganismus wurde in 120 ml des in einem 500 ml-Kolben befindlichen Mediums unter Schütteln während 72 Stunden bei 30⁰C kultiviert» Die gewonnenen Zellen wurden zweimal mit einer 0,8 #-igen Kaliumchloridlösung gewaschen« Die gewaschenen Zellen wurden in 100 ml eines 0,1 m-Kaliumphosphatpuffere mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert und mit einem Ultraschallgerät Kaijo-Denki 19 Kc/s während 20 Minuten bei Temperaturen zwischen 0 und 10% behandelt· Die intakten Zellen und die Zellhäute wurden entfernt und die erhaltene überstehende Lösung zur folgenden Umsetzung verwendet·

Das Reaktionssystem bestand aus 100 ml des vorstehend aufgeführten Ultrasohallextraktes, 100 ml eines m-'Brie-HOl-puffers (pH 8,6), 600 mg PIN-P-monohydrat (2,25 aillimol), 5 g Lysinmonohydroohlorid (16,4 millimol) und 1,2g Zinksulfat-Heptahydrat (4,17 millimol) und wurde bsi 30*C während 10 Stunden

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unter Schütteln der Umsetzung unterworfen· Dabei wurden 2,95 mg/ml PAL-P gebildet, wobei die Umsetzung 98 $> betrug. Das Lysinmonohydrochlorid wurde nach der Neutralisierung zugegeben»

Das PAL-P wurde durch spektrophotometrische Messung des zwischen PAL-P und Phenylhydrazin gebildeten Komplexes nach dem Verfahren von Wada und Snell ( <J„ Biol Chem., Band 236, Seite 2089 (1961) bestimmt,

Beispiel 2

Alcaligenes faecalis wurde in einem Medium aus 2,0 i» Glycerin, 2,0 % Maisquellflüssigkeit, 0,5 & K₂HPO₄, 0,1 # KH₂PO₄, 0,2 # NaOl und 0,02 # MgS0₄.7H₂0, Rest Leitungswasser, mit einem anfänglichen pH—Wert von 7^2 gezüchtet. Die Kultivierung wurde mit 140 ml dieses Mediums in einem 500 ml-Kolben durchgeführt, der 72 Stunden bei 30Έ geschüttelt wurde. Die abgenommenen Zellen wurden autolysiert, iivdem sie mit 100 ml Toluol während 1 Stunde geschüttelt wurden.

Ein Reaktionssystem aus 100 ml des auf diese Weise erhaltenen Autolysats, 100 ml eines 1 m-Natriumcarbonatpuffers (pH 8,6), 1000 mg PIN-P-monohydrat (3,74 millimol), 6,5 g Natriumglutamat-Monohydrat (34,7 millimol) und 2 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat (9,83 millimol) wurde bei 30*"C während 15 Stunden unter Schütteln umgesetzt und dabei 5 mg/ml PAL-P gebildet. Die Umwandlung be-

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trug 100 #· Das PAL-P wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt*

Beispiel 3

100 ml des nach Beispiel 2 erhaltenen Autolysats wurden zu einem Flüssigkeitsgemisch aus 100 ml eines 1 m-Natriumcarbonatpuffers (pH 8,5), 2000 mg PIN-P-monohydrat (7,48 millimol), 6 g Natriumglutamat-Monohydrat (32,0 millimol), 10,2 mg FIa-

—2
vin-Mononucleotid-Dihydrat (2x10 millimol) und 2,2 g NiCl₂,6H, (9,26 millimol) zugesetzt und bei 3O⁰C während 30 Stunden unter Schütteln umgesetzte 10 mg/ml PAL-P wurden mit einer Umwandlung von 100 # gebildet. Das PAL-P wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt.

Beispiel 4

100 ml des nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren erhaltenen Autolysats von Alcaligenes faecalis, 100 ml eines 1 m-Natriumcarbonatpuffers (pH 8,6) _f 2 g PIN-P-Monohydrat, 6,5 g Natriumglutamat-Monohydrat und 2,0 g Zinksulfat-Heptahydrat wurden vermischt und bei 3O⁴¹C während 15 Stunden unter Schütteln umgesetzt. Die erhaltene Reaktionsflüssigkeit wurde auf einem pH-Wert von 1,0 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt und die dabei aggregierten Zellen und Proteine entfernt. Zu der verbliebenen Lösung wurden 200 ml Methanol zugesetzt und anschliessend weitere 6 g Calciumchlorid zugegeben. Dann wurde das

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System auf pH 5»O mit Natriumhydroxyd neutralisiert, wobei sich das dunkelgelbe Calciumsalz der Schiff¹sehen Base-Chelatverbindung ausschiede Der Niederschlag wurde in konzentrierter Salzsäure gelöst und nach Einstellung des pH-Wertes auf 2,0 durch Dowex 50 Wx8(H⁺) gegeben, wobei das Produkt daran adsorbiert wurde ο Das PAL-P wurde mit sauerstofffreiem Wasser eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck bei Temperaturen von unterhalb 50⁰C konzentrierte Dabei wurden 18,2 g PAL-P-Monohy« drat in Form von Kristallen erhalten,,

Das Produkt erwies sich als vollständig reines PAL-P-Monohydrat auf Grund von Elementaranalyse, Ultraviolett- und Infrarot— Absorptionskurven, Elektrophorese und PapierChromatographie,

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Claims

1R70553 -H-Patentansprüohe

1. Verfahren zur Herstellung von Pyridoxal-5*-phosphat durch Oxydation von Pyridoxin-5¹-phosphat oder Pyridoxamin-5'-phosphat mit Enzymen von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation in Gegenwart von 1-20 Mol einer zur Bildung einer Schiff»sehen Base mit Pyridoxal-5'-phosphat geeigneten gü-Aminosäure, und von 0,5-4 Mol eines' Zink-, Nickel-, Magnesium-, Eisen-, Kupfer-, Aluminium-, Vanadium-, Quecksilber- oder Arsensalzes, jeweils bezogen auf 1 Mol des Ausgangsphosphats ausführt und das gebildete Pyridoxal-5^f-phosphat aus der erhaltenen Reaktionslösung gewinnt»

2, Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation in Gegenwart von 3-10 Mol einer t?G-Amino säure der Formel

H-CH-COOH

worin R ein Wasserstoff atom, eine niedere Alkylgruppe mit 1-5 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte niedere Alkylgruppe mit 1-5 Kohlenstoffatome, die als Substi- tuenten einen Amino-, Carboxy-, Carbamoyl-, Guandidin-, Hydroxy-oder Alkylthiorest mit 1-3 Kohlenstoffatomen

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tragen kann, "bedeutet, und von 1-1,5 Mol des Metallsalzes, jeweils bezogen auf 1 Mol des Ausgangsphosphats ausführt,

3 ο Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, daduron gekennzeichnet, daß man zur Gewinnung des gebildeten Pyridoxal-5^r-phosphats den pH-Wert der erhaltenen Reaktionslösung auf unterhalb etwa 2 erniedrigt, das dabei gebildete Aggregat aus der Lösung abtrennt, das Pyridoxal-5'-phosphat in Form eines Calcium- oder Bariumsalzes seiner Schiff^fschen Base-Metallchelat-Verbindung bei einem pH-Wert von 5,0 - 8,0 aus der Lösung ausfällt, den so erhaltenen Niederschlag in einer wässerigen Lösung einer nieht-oxydierenden Säure gelöst, die wässerige Lösung auf eine Säule eines Kationenaustauschharzes aufbringt und das Pyridoxal-5^r-phosphat aus dem Harz eluiert,

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