DE1648860A1 - Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Bakterienkonzentration in einem Medium - Google Patents

Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Bakterienkonzentration in einem Medium

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Description

I-ilti;^! "ur r3^Gti..,:.iunt; der Bakt^rienlcon^enr. ration la 3inei,i Median.
Die UvilnCuii·-* bi>f/elf fr. ';in Verfall fen zur Bestimmung der Bakterienkon;;: ent tia ti ou In einsru Medium soviie eine hier'für brauchbare Indil:atoi"/r:]:'rlclitu:i;3 und ihr Ho x's teilung ν erfahren.
Die !Crfinducj;: bascliäftlji- sich insbesondere «iit in wasserlöslichen Clen und Insbesondere Cclineidölon enthaltenen Bakterien, eignet r.icli aber uuoh zur Besbiuraung der Bakterienkonzentration in anderen liedieii, xvie Straliltriebwerks-Treibstoffen und anderen Erdölprodukten sox^ie in Molkereiprodulcten, und fernerhin für medizinische Dia^noseiiwecke, z,B. suv Erraittlung von Infektionen des IIarnsy afc ems.
Die Erfindung v/ird nachstehend sv/ar in Be^ug auf lösliehe öle beschrieben, ist aber, was zu bedenken ist, auch auf andere öle und Medien anwendbar,
L"sliche öle sind komplexe Gemische aus öl und sonstigen Materialien, die; mit V/asser vermischt stabile Emulsionen bilden. Normale mjeise enthalten sie emulgierbare Petroleumöle oder Erdöl-Fettülßcinische. Die Emulgatoren bestehen im allgemeinen aus Seifen von 15rdülsulforiaum, Harz, Tallöl oder Fettsäuren; es gibt aber auch brauchbare synthetische Emulgatoren.
Emulsionen löslicher öle benutzt man in der Industrie als Kühlmittel ,-.JOViIe alis Schmierstoff beim Schneiden, Bohren und Schleifen von Metall. .'lie dienen fernerhin zur Reibungsniinderung, Wärmezer-
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streuung, zur Verlängerung der Lebensdauer· -vcn sowie zur Verbesserung der OberfläGhengiätte der bearbeiteten lierkstüeke» Sie können fernerhin das Verwerfen aiascMnell bearbeiteten Metalls verhindern und hinterlassen auf dem Fertteerzeugnis einen RastSchutzfilm aus öl.
Viele Bakterien wachsen in Emulsionen löslicher öle und verursachen unerwünschte Ersehoinungen, wie üblen Geruch und Erniedrigung des ρττ-Wertes und dadurch bedingtes: Zusammenbrechen der Emulsion. Die Bakterien können fernerhin Infektionen z.B. der Haut hervorrufen und stellen insbesondere bei Nichtbeachtung von Hygienevorschriften eine industrielle Gefahr dar.
Eine Hauptschwierigkeit bei der Beschäftigung mit Bakterien in Medien wie löslichen ölen besteht im Fehlen einer Feldmethode aur Bestimmung der Konzentration von im Medium vorhandenen Bakterien, und daher erstrebt die Erfindung in erster Linie die Schaffung eines bequemen und einfachen Verfahrens zur Bestimmung der Anwesenheit und Konzentration von Bakterien in solchen Medien und weiterhin die Schaffung eines vergleichsweise billigon und bequemen Testindikators für dieses Verfahren und ein Herstellungsverfahren für ihn.
Die Erfindung besteht daher aus einem Verfahren zur Bestimmung der Konzentration lebensfähiger Bakterien in einem Medium, dessen Kennzeichen darin besteht, dass man eine Indikatorvorrichtung in das zu untersuchende Medium eintaucht oder sonstwie mit ihm in Berührung bringt, auf oder in der sich eine Substanz befindet, welche in Gegenwart von Bakterien eine solche Farbänderung erfahrern kann,
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" 5- 164886Ö
dass letztere die Konzentration, der lebensfähigen Bakterien im Mediu... anzeigt.
Die Erfindung besteht fernerhin aus einem Bestimmungsmittel für üiß Kdiij"v*tration lebender Bakterien in einem Medium mit dem Koumeio^en, dass es aus einer Indikatorvorrichtung besteht, auf odor in der SiCi-1 eine Substanz befindet, Vielehe in Gegenwart von Bakterien eine solche Farbänderung erfahren kann, dass diese KnöTirv; hei:,i Eintauchon der Vorrichtung in ein au untersuchendes Medium oder bei sonstiger Berührung mit ihm die Konzentration de;' im Medium vorhandenen Bakterien anzeigt.
Pernerhin besteht die Erfindung auch noch aus einem Verfahren üur Her*; teilung eines Testindikators zur* Bestimmung', der Konzentration lebensfähiger Bakterien in einem Medium, dessen Kennzeichen darin besteht, dass man auf einem Stück absorbierenden Materials verschiedene Bezirke mit Losungen von Methylenblau und einem Zusat! imprägniert, der das Methylenblau im angewendeten Material zurückzuhalten vermag, und das so imprägnierte Materialstück in Streife-α schneidet, wobei die Lösungen das Methylenblau in unterschiedlicher Konzentration enthalten, sodass Bezirke mit streifenlängs zunehmender Methylenblaukonzentration entstehen.
Die Substanz kann auf oder in verschiedenen Teilen der Indikatorvorrichtung in unterschiedlicher Konzentration vorhanden sein,sodass die Konzentration der im Medium vorhandenen, lebensfähigen Bakterien durch das Ausmass der in diesen verschiedenen Teilen der Indikatorvorrichtung auftretenden Farbänderung angezeigt wird.
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BAD ORIGINAL
Diese Substanz kann solcher Art sein, dacs sie infolge Gaucrctöffentzugs aus dem .Medium durch die von Bakterien gebildete Red-uktase eine Farbänderung erleidet, und besteht vorzugsweise aus Methylenblau, Die Erfindung ist jedoch nicht auf die "erwendung von Methylenblau' • beschränkt, vielmehr kann man auch andere BaLterlenstoffwechsel anzeigende Verbindungen verwenden. GewünschtenfalIs kann dor Test-' indikator auch zwei oder- mehrere solcher.öubstandren tragen..
De1- Testindikator kann aus absorbierendem M.otorialj i;;.B.-Filterpapier. . bestehen. -
Vorzugsweise wird di^ Substanz in eine Ziis aminen: ätzung eingebracht, die einen Zusatz' enthält, welcher sie _auf oder in dem Τ^ε ο indikator zurückzuhalten vermag. Ein geei~^ter Zusatz dieser /u.-*t iat Albumin.-Man kann aber statt dessen hierfür aucL andere Substanzen, z.B. Alginate s vervfenden, vjobei llatriumalginat v/erren seiner vergleichsweise hohen Löslichkeit den Vorzug verdient.
Ein-typisches"- Ausführungsbeispiel besteht darin, dass man Methylenblau und Albumin auf Filtrierpapier aufbringt und auschliesäend d&a ■ Albumin durch 30 Minuten langes Austrocknen bei 650C denaturiert. Das Methylenblau kann man in Gewichts/Volumen-Konzentrationen von l:8000 bis 1:40000 Teilen Verdünnungsmittel, aufbringen. Einfachorv.'eise bringt man das Methylenblau in den Konzontrationsstufen 1:8000, 1:1β000, 1:2^000, 1:32000 und 1:40000 auf verschiedene Bezirke des Materials auf.
v Zv/ecks erleichterten, weiteren Verständnisses der Erfindung werden nachstehend ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgernäsoen Testindikators und seine Anwendungsweise beschrieben.
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BAD ORiGiNAl.
De;nge.iilU3G vje-rdeii auf einem Stück absorbierendem Material, z.B. Filtrierpapier, durch parallele Linien Bezirke aufgezeichnet,und
/wird
aiii Boi-.irk. u-.δ den anderen'uiit einer Methylenbiau-Älburainlösung imprägniert, vjofür Flethylenblaulosungen mit den Gewichts-Voluuen-Konaentrabionen l:8000, I:l6000, 1:2^000, 1:32000 und 1:64000-benutzt worden.
Nach-Imprägnierung mit den verschiedenen Lösungen wird das Papier 30 Minuten lang bei o5°C getrocknet, wodurch nicht nur das Papier .ijetroeknot, sondern auch das Methylenblau durch das VJas-serunl'jslich-Liaohon den Albuuins "fixiert" und so daran gehindert wird, bei der g nachstehend' erläuterten Untersuchung des Mediums in dieses "auszulaufen" . ■ ' - -
iJacb dem Trocknen -,jird das Stück Filtrierpapier oder sonstiges absorbier end αο· Material .nit einer Unterlage aus steiferem Material vorteilen und senkrecht zu den Trennlinien zwischen den mit den verochiedcnartigeii Lösungen imprägnier ten Bezirken streifenweise zerschnitten. Auf diese Weise erhält man langrechteckige Streifen, die je in Längerichbung abwechselnd gefärbte und ungefärbte Querbezirke aufweisen, wobei die gefärbten Bezirke streifenlängs zunehmend in- . ' tensiver gefärbt sind. ■
Vor Iagebrauclvnahme werden die Streifen in der Weise geeicht, dass ßi&ri ijie genormte Zeit lang in verschiedene Medien eintaucht, die bekannte Konzentrationen von lebensfähigen Bakterien enthalten. Durch Beobachtung öor so entfärbten Bezirke kann man dann das Entfärbungsauotnass in ntreifoulangs-r-iohtung mit der Konzentration der in einem Modium vorhandenen, lnbensfähigen Bakterien in Beziehung setzen.
BAD
Im praktischen Gebrauch braucht man also nur einen Streifen die genormte Zeit lang in ein Medium einzutauchen und das Ausnif-^c dor Entfärbung zu beobachten. Dann kann man durch Vergleich mit einer auf Grund der Eichversuche hergestellten Noruif arbskala eine uo/nimitative Aussage ubev die Konzentration aee in den Mediut.; vorhahd^non, lebensfähigen Bakterien ablesen. Die Praxis hat gefolgt, öoc:; oino Eintauchzelt' von 10 bis 20 Minuten ausreicht, aber den Umstrnden entsprechend variiert werden kann.
Die weissen Zwischenstreifen helfen bei der Bestimmung, we Io LrJ Bezirke ganz oder /teilweise entfärbt sind, da eine Ctatidardweioa-™ fläche insbesondere- dann die Beurteilung verbessert, v/erm das Medium die Streifen anfärbt.
Um die Ablesung von .Testergebnissen zu erleichtern, kann .nan auf die gefärbten Streifenbezirke ein Zeichen, z.B. das Viort "verunreinigt", oder eine sonstige Markierung in einer Farbe aufdrucken ocer sonstwie aufbringen, die praktisch mit der Farbe des ' am sohv/ächsten getönten Bezirks übereinstimmt. Das Zeichen wird mit unver;;aschbarer Tinte oder sonstigem färbenden .Material erzeugt, das durch Berührung tk mit dem Medium nicht beeinträchtigt wird. In diesem Fall wird- de.? dunkelste, für den Test zweck zu entfärbende Bezirk durch der. am dunkelsten gefärbten angezeigt, in dem das Zeichen bei oder nach Berührung mit dem Medium sichtbar wird. ■-.-,·
Die Erfindung-wird durch die nachstehenden, nicht einschränkenden Beispiele erläutert» In jedem Falle wurden gefriergetrocknete Kulturen" von aus verunreinigten Kühlflüssigkeiten oder Turbinenölen. gewonnenen Organismen mit Peptonwasser rehydratisiert und 5 bis 6 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Mengen lebensfähiger Bakterien, die in den verschiedenen Kulturen vorhanden waren, wurden dann nach
i - "
α·\., ai'fiuöui^sgemänseii Verfahren bestimmt und die Ergebnisse mit.- ö"i, Ζί"^\ηχ~οΐ- verglichen,■ welche nach der bekannten "Miles■■ & Misra" Kof-iodF1, sinke j. Ilyc· ;2§. (1933), 732, durchgeführt- worden waren.
Pur die Durchführung des erfindungsgernässen Verfahrens benutzte man ;it.iT-i.-°-u aus 1-Io.l-Filtrierpapier, die In Längsrichtung in zehn .iior'.ro -ir!:e aufgeteilt und so behandelt waren,, dass je ein Abschnitt u:.; den - crx-n-en mit einer Methylenblau-Albuininlösung imprägniert wai'. Die ΙΊν,/"yl^nblau-Konr^ntratior; nahm streif enlängs. in der Weise au, d-.co oic im ersten gefärbten Bezirk (im Gevilchts-Volumenverhältnis) 1:''GüfC. betrug, während für- die übrigen vier gefärbten Bezirke ~g "üüSJ-i'-o Lösungen mit Mpthylenblaukonzentrationen von 1:52000, 1:2 OCC, 1:löOOO und l:8000 benutzt vmrden,
Dei äo"-· Untersuchung viurdeii die. Peptonwasser-Kulturen j'e in zwei T-^iIe -eteilt, von denen Jeweils--der eine nach dem" erfindungsgei;;llGaea Y-.Tfahi.'er: und der andere liacl"' der Miles & Misra-Methode auf 'iahteri-ir.koncentration -untersucht wurde. Im. ersteren-FaIIe wurden die nrUpai'iei'lon Streifen 15 Minuten lang in die 57 warme Brühe eingetaucht und danacli'herausgenommen, worauf die entfärbten Besirke notiert wurden. '
Die so gevjonnenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle in geordneter Folge zusammengestellt. In der ersten Spalte ist die Anzahl der entfärbten Bezirke angegeben, wobei mit der Zählung bei dem Bezirk mit der niedrigsten Methyleriblaükonzentration begonnen wurde. Bei den durch ein Kreuz gekennzeichneten Versuchen war auch noch der nachfolgende Bezirk etwas entfärbt. .""."-'"
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SADORiGINAL
Kr-findung.;.
. Anzahl ent-'■*färbt er· Be-
, Anzahl lobensfllhiger Organismen je ml (nach Miles & Misra)1·. , , » ,
Esch.Coli Dtaphyloc. Bacter. Sp. j aeuäoriion.-Sp. Proteus Gp. Sti'eptoccui Mischkultur
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Aus ol^yie Tabelle ir,t irslchtlic^, dass -viinchen der Anzahl der oar.fD.'bcc:ii Bezirks und der Konzentration der lebensfähigen Bakterien in dsu.i die jovjailige Verfärbung ergebenden Medium eine Beziehung folgend er Ar,-, besteht: -
iUiv;ahl der entfachten Grösseiiordnung^ der Bakterien-
R^täirlre konzentration ___ - (-ungefähre Anzahl/ml)
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lö*7 und darüber
-v'u&'srise Medien, ;.;.B. Motorenti-jibstoffe, *./erden in der IJeise uat-".i-;-;u?läb, fiass-;aaii eina ab^einespeiie Menge davon- mit der gleichen Il'-vn;-;o Rin.'iBi'-Lösu-i-? verriii .:ο"'γγ,. indem wan sie beispielsvjeise 3 Minu-.-.OU l-Vnr; ii-Ί eineivi Yoc'r.o.x J R - Mlccber x-ei-arbeitefc, die Schichten ai-'j-i VJi^a1U' trennen lässt und di« wlissri^e Schicht mit dem erfindun^o^UitKiien Repj.ira :ai".reifo!"i in angegebeaer Weise untersucht.
Du. i,l':rhoi jedoch nicht alle Bakterien in die wässrige Phase überonVv-).j '.υιό« i-ian das Messergebnis noch mit einem Korrekturfaktpr vorsehen, um eine wahre Airzeigje über die Bakterienkonzentrat lon im ,-.u οi'ha-lten._ Man erfährt diesen Faktor für ein bestimmtes in d^i" VJ eis o, das ο man einer gemessenen Menge davon die Bakterien'durch ein Mikroporenfilter■entzieht und die extrahierten Bakterien auf-der platte auszählt. Solche mikroporösen Filter werden von der Millipore Filter Corp., Bedforä, Mass., V.St»Am. unter der ne'/.eichnung "Millipore" in den Handel gebracht. Die BakterienaunzähJimp; kann beispielsweise nach der im Handbook of Practical Bacteriology, rj, Aufl., beschriebenen Mäckie & McCartney-Methode in der Modifikation gemHss den von der Milliporci Filter Corp. herausge-
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gebenen Technical Data Manuals ADM ίθ und ADM 30 "crfoi.^en·; 'r)t::-.Ot . dessen kann man auch eine probe des Mediums auf eineu Gculter-^il-.-c hen zähl er oder ein-e.n ähnlichen Gerät auf seinen Gesaratger-alt an Bakterien untersuchen. Da aber dieser Zähler keinen Untersci led zwischen lebensfähigen Bakterien und anderen itn Medium Vorhand fine n. Teilchen macht, ist diese Zählmethode weniger zuverlässig als oie ersterwähnte.
Tenn man für die einzelnen nicht-wässrigen Medien den ,Korrektur-, faktor festgestellt hat, kann man das erfindungsgei.Usse Vorfahr"=.-. auf sie in gleicher Heise anwenden, wie es bei wässrigen Medien. benutzt wird. .
Die Erfindung schafft, somit eine vergleichsweise einfachere>ueh,e, schnelle und wirtschaftliche Feldmethode zur Bestimmung der Bakterienkonzentrat ion in einem Medium. Man erkennt mehr und mehr das Problem der bakteriellen Verseuchung von löslichen ölen,"Motcrentreibstoffen und sonstigen Medien, und die Erfindung hilft kräftig · bei der Lösung dieses Problems. Ersichtlicherweise ist die -Erfindung in Bezug auf Verunreinigungen durch Bakterien vielseitig verschiedener Art anwendbar. .

Claims (1)

  1. Gastrol Limited
    Gulld-ΓοΓά ; -Haus Udv: ales, .Australien
    P at e Uta n.s.p rü c .Ix e
    1) ^erfahren zur Bestimmung der Konzentration lebensfähiger 3f..kt-3ri^v. in einem Mediuu, dadurch gekennzeichnet, dass man in das ::u untersuchende Medium eine Indikatorvorrichtung eintaucht oder soasi-v.-ic mit Um in Berührung bringt, auf oder in der sich eine Gubstan.; befindet, vrelche in Gegenwart \*-oii Bakterien eine solche Farb£indOä.'un;: orfahreii kann, dass letztere die Konzentration der | l^bou:-f■hi.T'^n bakterien im Medium anzeigt.
    Ir)'"Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ;jra eine Indikatorvorrlchtung vervjendet, bei der die Substanz auf r-ri'U' i; veröchiedonen Bezirken In unterschled'lielier Konzeiitratibn ν orr. τ. id en int ixnd das aus mass der in diesen Bezirken auftretenden Farbäiv.i"X1UHg als Mass für die Bakterienkonzentration "verwendet-·
    ") Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
    σ ρ rs i.-an eine Indikatorvorrichtung verwendet, bei der die Substanz
    /ist
    einer ^usammensetnung einverleibt,- welche einen Zusatz enthält, der die ßuostanr; im Gebrauchs falle auf oder In der Indikatcrv or richtung iurilolchalton kann. ' . ;. -" _."" _ - -■__' ;
    h) Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Indikafcorvorriehtung verwendet, die Methylenblau als Substanz enthält. -"■"..
    3) Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch-gekennzeichnet, dass man eine'ihdikatorvorrichtungverwendat, die Albumin als Zusatz
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    BADiORIGlNW.
    enthält.
    ο) Verfahren nach Anspruch 'J oder 3, dadurch ^RkeiinOPiah dass rään die Indikatorvorrichtung IG bit; 2c Minuten laug in das Medium eintaucht.
    7) Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man das Ausmas-s der*Farbänderung durch Vergleich mit einer Nornifarbskala feststellt.
    8) Mittel sur Bestimmung der Konzentration lebensfähiger Bakterien in einem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Indikatorvorrichtung besteht, auf oder in der sich eine Substanz befindet, welche in Gegenwart von Bakterien eine solche Farbänderung"erfahren kann, dass diese Änderung beim Eintauchen der Vorrichtung in ein zu untersuchendes Medium oder bei sonstiger-«Berührung hiit ihm die Konzentration- der im Medium vorhandenen Bakterien angeigt. . - .. " ■
    . 9) Mittel nach Anspruch S, dadurch pokemv,;-lohnet, dass die Substanz auf oder in verschiedenen Bezirken der Indikatorvcrrichtung in unterschiedlicher Konzentration vorhanden ist.
    10) Mittel nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, • dass die Substanz einer Zusammensetzung einverleibt ist, -Vielehe einen Zusatz enthält, der die 3ubstanz im Gebrauchsfalle auf oder in der Indikatorvorrichtung zurückhalten kann. '-.--.
    109833/1828 aan™^"
    BAD QRJGiNAL
    11) Mittel nach einen] der Ansprüche 8 bis IG, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz aus Methylenblau besteht.
    12) Mittel nach Anspruch lOj da.durch gekennzeichnet, cl-;»f3S der Zusatz aus Albumin besteht.
    .15) MIutel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, da-3α daß Albumin durch Trocknung denaturiert ist«
    : . l'li) Mittel nac1· Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dnßs der Zusatz aus eine;,-!..Alginat .besteht.
    15) Mittel nach einem der Ansprüche 8 bis 1^, dadurch ^ekennseichriet, dass die Indikatorvorrichtung aus Filtrierpapier oder πonstigern absorbierendem Material besteht». -
    l5) Mittel nach nineni der Ansprüche 8 bis 15, dadurch jjeke.r-"anlehnet, dass die Indikatorvorrichtung ans einein Streifen beuteln-, der in Längsrichtung in eine Heilte von Bezirken unterteilt i.jt, welche die Substanz in streifenlängs, wachsender Konzentration \ eritlialten. .
    17) Mittel nach Anspruch l6> dadurch gekennzeichnet t dass die i/;of;i,rbtou Bezirke durch ungefärbte Bezirke voneinander getrennt
    18) Verfahf/en /.Ut* He cat el lung einec Indikatorvorrichtttiig -;ur BentlniLiUng der Kbiii-jentratlon lebensfähiger Bakterien In einem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Stück absorbierendes Material bezirksv/eisQ mit unterschiedlich konzentrierten Methylen-
    109833/1326 BAD original
    blaulösungen, die auch noclr einen das Methylenblau im Mauerial fixierenden Zusatz enthalten, imprägniert und nach'!^.cU^nincn:.;: derart streif env/eise. unterteilt, dass die Methylenblau': «^irl:^ streifenlängs fortschreitend kennen1!-rioctor nind.
    19) Verfahren nach Anspruch 13, oadur-h r :-ol;em"-: -i ;\c,v*.':., dass man" die methjrleiiblau-imprägnierten TlszlS-zn duioVi ..ici.t .;c erle voneinander trennt»
    BAD ORIGINAL
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