DE1617304A1 - Antigen-Adjuvants-Zusammensetzung - Google Patents

Description

American Cyanamid Company, Yteyne, liew Jersey, V.St.A. Antigen-Adjuvanta-Zusammeneetzung

Die Erfindung betrifft neue Zusammensetzungen aus einer dispersen wässrigen Phase, die eine antigene Substanz enthält, und einer kontinuierlichen oder einer dispersen Ölphase, denen wenigstens 0,15 Vol.-$ der hydratisieren Reaktionsprodukte eines physiologisch annehmbaren Metallkations und einer physiologisch annehmbaren Fettsäure mit 12-24 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls ein Übliches Emulgiermittel zugemischt sind*

Antigene Stoffe wurde bereits in Adjuvantszueammensetzungen in Form von Wosser-in-flineralölemulsionen eingeführt, die Modifikationen der bekannten freund-Adjuvantien sind, in denen jedoch Antigene ohne Tuberkulosebakterien In der wässrigen Phase verwendet werden, wie ea bei den Üblichen Adjuvanezu·- sammenseteungen nach Freund der Fall ist.

Dabei entstanden Schwierigkeiten, wall es zwei Bestandteile gab. die medizinisch ale nicht wünschenswert angesehen wurden. Der eine war da« Mineralöl, das nach Injizieren einer

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Emuleion nicht in den Stoffwechsel der Körpergewebe eingeht, und der andere war das Emulgiermittel Mannidmonooleat, das su einer Gewebereizung führen kann» die manchmal eine Carsinogenese sowie sterile /.bazeBbildung begünstigen kann.

In der USA-Patentschrift 3 149 036 1st eine modifizierte Emulsion beschrieben, in der das Mineralöl durch ein Triglyceridöl, zum Beispiel Erdnußöl, ersetzt iet und in der getrock«-. nete oder nichthydratisierte Alumlnlumaalse von Fettsäuren verwendet werden. Das Emulgiermittel Mannidmonooleat blieb jedoch das gleiche. Wie man gefunden hat, war tatsächlich das. Mannidmonooleat bei weitem der nachteiligste Bestandteil, und obwohl Glyceridöle Mineralölen etwas vorzuziehen sind, blieben die Hauptnachteile, die durch das Mannidmonooleat bedingt werden, weiter bestehen. Es sei darauf hingewiesen, daß sowohl bei den unvollständigen Adjuvanszusammensetzungen nach Freund als bei den Emulsionen noch der USA-Patentschrift 3 149 036 die Emulsionen Wasser-in-Öl-Emulsionen und nicht Wasser-in-Ölin-Waeser-Emulsionen wartn.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, bei den hydra— tislerte Aluminiumaalze von Fettsäuren als Stabilisierungsmittel zur Stabilisierung der Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet werden. Dieae Emulsionen können in Wasser-in-Olin-Wasaer-Fmuleionen durch Verrühren in einer wässrigen Phase

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und anschließende Zugabe eines üblichen Emulgiermittels oder zusätzlicher Mengen der hydratisieren Aluiainiumsalze von Fettsäuren umgewandelt werden. Wenn dagegen von Tornherein ausreichende Mengen hydratisierter Aluminiuiasalze von Fettsäuren vorhanden sind, ist die zweite Zugabe des Salzes zur Überführung der Wasser-in-Öl-Emulaion in die Wesser-in-Ql-itx« Wasser-Emulsion nicht erforderlich.

Zur Vereinfachung wei-den diese beiden Typen im folgenden mit WO dew. WOW abgekürzt. Bei der Emulgierung der WO-Emulsion, nach deren Erzeugung zur Herstellung einer WOW-Emuleion kann man in dieser zweiten Eraulgierstufe ein Emulgiermittel üblicher Art, das Öl-in-Wasser-Emulsionen zu erzeugen vermag, in Wasser zur Herstellung einer WöW-Emulsion verwenden, da im wesentlichen die WO-Emulsion die disperse Phase let. Ein typisches Emulgiermittel ist beispielsweise Polyoxyäthyleneorbltanmonooleat. Die tfOW~£mulgionen haben günstigere Vie« koeitäten und zeigen ferner verbesserte immunologische Ergebnieee gegenüber den unvollständigen Emulsionen nach Freund und Voodnour (U ^A-Pe tent schrift 5 149 036) besondere hinsichtlich des MerkmalB₀ daß die Antikörperbildung rascher Ytrläuft_? ί·ηη Antigene in der wäearigen ?hose oder den wftiirigen Phaten vorliegen. Es kann mit anderen Worten ein angeaeeeener Antikörpertiter in einer geringeren Zähl von Hagen nach 4er Injektion erreicht werden.

^aADOFtt0_{NAL

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Eb ist häufig zweckmäßig, mehr als 1 Mol Fettsäure, z.B, Stearinsäure pro Mol mehrwertiges Kation bei der Zubersi tung der WO-Emulsicm au verwenden und dann zusätzliches
mehrwertiges Katicm oder ein übliches Emulgiermittel .dar zweiten wässrigen Phase ψογ Bildung der WOW-Emulsion-auzusetzen.

Zur Erzielung bester Ergebnisse wird es bevorzugt_r wenigstens einen liberwiegenden Teil des antlgeaen Materials nit der wässrigen Phase bei der Bildu&g der WO-Efaulsion eirisfufuhren, bevor die Emulsion weiter zu einer WOW-Enulsion emül¹*" giert wird. Wenn eine WOW-Emulsion ohne antigfenVs Material hergestellt wird, wird antigenes Materiel einfach der kontinuierlichen Wasserphase der WOW-Emulsion zugesetzt» Die Ergebnisse sind merklich schlechter als bei den erfindungsgemäßen WOW-Emulsionen, bei denen das antigene Material in die wässrige Phase eingeführt wird, mit der die WO-Emulsion gebildet wird. Das soll nicht heißen, daß erfindungsgemäß der Zusatz von antigenem Material in beiden Malen ausgeschlossen ist, jedoch muß wenigstens ein beträchtlicher Anteil des . antigenen Materials in der ersten WO-Emuleion vorliegen.

Eine vorgebildete WOW-Emulsion, die als Grundlage auf den Markt gebracht werden kann, der der Immunologe das antigene Material_ff das er zu verwenden wünscht, zusetzen kann, wird zwar gewöhnlich nicht bevorzugt, bietet jedoch manche^Vorteile.

. ■ " - BADORIGiNAL

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Die mehrwertigen iletallkatlonen, welche ale Fettsäuregalae bilden, können eich von beliebigen physiologisch annehmbaren Mehrwertigen Metallenableiten. Aluminium wird bevorzugt, Ijefriedlgendel· Ergebnifiaewerden aber auch mit dreiweytigea Tiaen erüielt* Ba sei darauf hingewiesen, daß die hydratiaierten basischen Fetteäureselze nicht notwendige:cweise reine ehemische JSliizelverbindungett sind, Belcanntlich kötmen ba8ische A3,ui»ini'.im JPettaäuresalze_f zürn 'Beispiel Aluminiurastoarate, 1 n. HolYerhältnissen hergeä^elXt werden, die nicht "ganagahlig" sind, l-.'enn beiepielsweiae das Verhältnis 'etwas größer als 1 ist, können sehr wohl Mischungen mit etwas Älimittiummonostearat und etwae Aluminiumdiatearat vorliegen. Damit soll lediglich zum Auedruck gebracht werden, daß die Erfindung keineswege auf beetiaunte oh«mieche iiinzelrerbindungen beechränkt let.

Die Jeweils verwendeten yette*l«ren mit 12 bie 24 Kohlenetoffatomen etnd nicht entscheidend,und die rrfindung iat nicht auf die Verwendung beetimmter Pettaäuren oder bestimmter Mischungen beschränkte Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit und hervorragenden physiologienhen Verträglichkßit werden jedoßh Pclmitineäure und 3tearineiiur·, infibeeondere Stearineilure bevor äugt, - .. ',-' -V'.:-'-''--"'"' ; ■:.." ·-"-' ;^;; ' ■■'·" ■■- ': ■·. - -

Außer der bevorzugten Stearin- und PalmitineHUre seien alo Beispiele fUr andere Pettsiiuren LaurinBäure, HyrietineMure,

BAD ORIGINAL j _Q g g _χ^ ^ g _{& 2}

/.raohinaäure, Bthensäure, Llgnocerinsäurβ, Rlolnoleinsäure* öleiiur·, Erueasäure, Linolsäure und dergleichen genannt.

Sie physiologisch annehmbaren Olyceridöle sind ebenfalls nicht kritiach, und man kann beliebige annehmbare öl verwenden, zum Beispiel ErdmiÖöl, Suffloröl» Sojabohnenöl, Bannwollsanienöl, Maisöl, Chaulmoograöl, Olivenöl, Seoamöl und Kokoenußöl. Leichte Mineralöle können ebenfalls zur Bildung der· erfindungsgemäSen WOW-Emulelorien verv/endet werden und liegen deshalb im Rahmen der Eifindung. In vielen der folgenden'- Beispiele wird ein bestimmtes beispielhaftes ül_c nämlich Erdnußöl_β verwendet, das eu hervorragenden Ergebnissen führt. DIt Krfinduoe ist Jtöooh kein·ew^i auf aeine Verwendung beschränkt, und man kenn sämtliche anderen öle, die physiologisch ennehabar aind, verwenatn. StlbetreretUndlloh sind auch Niechungtn rtaraua geeigntt.

Aufler den typiachtn mehrwertigen Metallen, Aluminium und Ei-ββη, dl· oben genannt wurdltn, sind weitere physiologisch an_r nehabare Netalle Mogneeiuai, Oar. Zink, Itanthan, Wienut und dergleichen.

Sie antlgenen Materialien, können von aehr unterachiedlioher Art sein. Beispielhaft sind aolohe, die mit Viren erhalten wurdtn, zum Beispiel Influtncavlrusontigene und Antigene

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verictoiedeuer Arten-von KbuI- und Klauenseuche,· .Antigene aus Ricke ttsieni^atte Bakterien, zunr Belepiel Tetanuetoxide und Polysaccharide, zum Beispiel solche, die aus Pnetiraokokken erhalten werden und dergleichen. Tumorantigene sind ebenfalls vorteilhaft* Ba sei darauf hingewiesen, daß das antigene Material aus patliogenen in einer Foπή vorliegen soll, in der es keine ernsten klinischen Symptome der Krankheit reruraaeht. Das antigene Material kann abgetütet, abgeschwächt öder in anderer Weise ausreichend harmlos für die praktische immunologis ehe Anwendung gemacht sein. BIe Erfindung bezieht eich auf verbesserte WO- und WÖVf-Eraulßiönen, welche Träger für die langeame Preisetaung von antigeneni liaterial sind« Eb ist ein Vorteil der Erfindung, daß beliebige der bekannten .'rten

γόη antigenen Stoffen verwendet werden können.. Andere, antigene Stoffe Bind Allergene, zum Beispiel Pollen, ntaub, Haer, Feder- oder Hautschuppen, Extrakte daraus, zum Beispiel Kreuzkraut, Hauahaltsstaub, Pollenextrakte, Graspollen und dergleichen, Einige der Antigene fallen in die Kategorie der Gifte. Ton Insekten oder Reptilien, zum Beispiel von liienen und ^feepen, Gifteehlrigen₉ Skorpionen und Lactrodectus mactans. Häufig werden antigene stoffe mit stabilisierenden oder koneervierecden Subatansen verethen, und es ist ein Vorteil der KrfinduBgt daß solche Stoffe die · töbilität der erhaltenen WO- oder WOVf-itaulaionen nicht eeretören» Bekanntlich haben die meisten aotigenen Stoffe Proteincharakter, sie Bind jedoch

selbstverständlich nicht darauf b-Sschrünkt, 3-5iepa2lijv.rc-? i-.e fallen darunter auch die Polysaccharide der rae;>;*:o!cüki^ren uiv: einige ,aßdere antigene Stoff® voa N?^kleinsrluretjp imä !i^ni.;··.;, in die erfind ungsgeaxäßen W0¥-EBiulsioßsn eing<?fiU»r"5 weröoa,

Die Menge an antigenam Material ist ebenfalls nicht kri \: üch_f sie muß jedoch aelbstTerstiuiölich i.msreieiien_P α»¹ sine, on^.emesasne /«ntikörperbilöung zu erzeugen» 3)ie.?e Menge wird als "wirksame Menge für die AntikÖrperMläung" beseichnet» T3ie wirksamen Mengen "bei äen verschiedenen antigsnen Stc?ffer· si nc? bekannt, und es ist bekannt» daß in vielen Killen Adjuvantien ein® Yerniinderuag der 'Dosierung oder ein längeres Anhaltender Antikörperschutawirkung oder beides ermöglichen,, I5.ie Vorteile von WOW-Emulsionen Hegen häufig nicht in drastisch veränderten wirksamen Mengen,, sondern in der sehnelleren Entwicklung v~n Aktikörpern und in vorteilhafteren phyaiko lischen Eigenschuften» Zu diesen Vorteilen der erfindungsgemäi?.?n WOW-Emulsionen komraen sicherere physiologische .Ugenechuftea hinzu.

Es ist ein Vorte5.1 der Erfindung, daß die Menge an hydra tialertem mehrwertigem basischem Pettsäureaala nicht kritisch ist. Selbstverständlich muß jedoch eine zur Stabilisierung der Emulsion ausreichende Menge vorhanden "sein, und im allgemeinen beträgt die untere Grenze 0,15 f° (Gewicht/Volumen, (w/v) besogen auf das Gesamt-^olunsen der £itiulsionen< > Größere

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BAD ORIGINAL

Mengen iron 0_Γ5 ft aufwärts,-zeitiges noefr höhere Stabilität sind deshalb lie'forzugt> Man kann nöck größere Hangen der hydra tisierteii mehrwertigen Metallfettsitüresalse vervendeTij und ■ ea gibt keine kritische obere Grenze. Selbst-yersrfcändlich dürfen aie iiftngen nicht so groß sein, daß keine gut fließfähige Eiaulaios-gebildet v/ii^d. Dieoe B^airigim^ ergLbi» sich- ßar aus praktLücken G-rundan ΐ5ή<ί stellt deshalh keine kritiecke 3eäökunß der Erfindung dar»

In .en meisten i^?äll£m v/eisen die erfi-iidnn^sgemäöen Ernulsionea thixaüz'oije Ei/jBttaßh-.fts-ri. in Yerachiedetiera Aus muß auf. ?I mal ist uies von Vorteil, weil es nicht erforderlich i -daF. sicfi die EaiMToion ste'sa i?i öünnflüsfjißora Zustand "befindet, ^a die Itijaktion, s.B eine .-«uliltutfme _$" ftrrch e ine Injektioßs spritze sj'a einer zeitweilig verminderten ViokOiiitat aufgrund dij£, thixatropen Ef feie to führt. Oa s Ba Iz -des- hydretisi ertön ■basischen mehrwertigen .ICatiatis ndt eiitor Pettaiitire kann :Ui vorgebildetem Zustfind itügegeben werden,, oder man kann die

i
Fettsäure in lern Ul liiaen_fi tiätigenfiillB «riter scfr/acrh.era Sr-

» und ein löeljtciiee OaI^ d«e Ketfillß, am ii.lpitt tö^icrGii t, 55iim Befepiel ein ßlilörid» KI.trat oder iitiij^it der wltseri -, gen Ph'fse_f fiewöfealicli unter ßlriatellus^ dea pii 4 und IO tintfcr Bildung böteachtil cfjea* Γ-iengön % den h/ydratlöierten mehrw^r-ui^ett Katiunf.et-fcaiiitreeti^izgh-.während der ßmölgi&r«ßg zur U&r&leL'\img der ersten Wö-ivwalölon ssu setÄen« Wenn dös FettöäureBai« in «itu hergßBfeellt werden

BAD ORiGlNiU,

—* *'"' 100813/1562

... 40 - ■'

man· die Fettsäure selbstverständlich auch in die wässrige Phase als Sals; mit eine:» physiologisch annshmbaratt Kation,* zum Beispiel als Hptriumsaia, einführen und darm sin lösliches SaIs des mehrwertigen Metalls, üixrn Beispiel Aluminiumsulfat zugeben.'Es ist sin Vorteil -i»r iSri'inctimg« daß die Verfahrensweise,, nach der die V/OVWEtaulsion in swci Stufen erzeugt wird, nicht entscheidend ist one? daß :3i«h. einfache zweckmäßige Betriebsbedingungen ergebene

Die Verhältnisse des Volumens der dispersen wFissri^an Phase (mit VW| bezeichnet) zu dem YoluEien der Ölphaae (mit Vo bezeichnet) und zu dent Volumen der kontinuierlichen wässrigen Phase (mit Vw« bezeichnet) in den erfindungsgemäßen WOVf--Emulsionen sind nicht besonders kritisch und können unter Erhaltung guter Aktivität innerhalb eines beträ-ehtHöhen Bereichs schwanken. (Bei der folgenden Erläuterung ist au beachten₉ daß während der mulgierung der auerat erzeugten WO· Emulsion in der kontinuierlichen wässrigen Phase eine beträchtliche Wanderung oder Migration der dispersen wässrigen Phase au der kontinuierlichen wässrigen Phase stattfinden kann, eo daß awar die ursprünglich angewandte» Pfaaeenrerhältniase 25/25/50 für Vw₁/Vo/liw^ betragen können, die fertige lmulaion ^eöoch. PhasenTerhältnisse ron ^0/25/65 aufweisen kann.) Im allgemeinen kann der Ulan teil in Volumen --■-<;& 5 - 60 <>/) betragen, wobei gute Ad juvansaktivitat «-rhalte·* bleibt. Der bevoi-sugte Bereich beträgt 20 ~ 30 ^L ietin ein Öl geholt unter 5 '/· angewandt wird,, wird da; Volumen de-

10 88 1 3 / 1 5 β 2

das für eine gute trsaunolügisGlie Reaktion erforderlich ist,- für die Injektion Übermäßig groß« -Wenn .ei Ö Ige hält τοπ ©ehr Öls 60 $ '..aragewondt v;lrd, wird die Ti sko ■ sitüt der fertigen Emulsion für cMe Injektion «Bäßgeiuessen hock. ■"'."·

Bei W0~Eriu1sionen kann das'Verhältnis- von Vw* au. Vo .etvä

5 s 95 bis.su 60 s 40 oder mehr betragen* Bas"■ Yerhäliöis'" ist für "die Brauchbarkeit der Kmulsion/als Aajiwuntien nieht eßtsch»ideaä_f sondern wird nur durch praktische Gründe bedingt-Für sehr niedrige Yerhältnisse won Yw^ gti Vo "kö-nnen hoehkonzentri«rte wässrige Jlntigenpraparate sur £rsielusig einer aus-= reichenden Antigeamassg in einem verniiEftigen Injektionsvo=· n erforderlich sein. Bei sehr hoheH Verhältnissen-von

TW., zu Vo wird die Viskosität der Emulsion fur eine leichte Injektion zu hoch.

Die Erfindung ist nicht auf irgendeine bestimmte Art des Rührens beschränkt« Je wurde jedoch --gefunden₉ daß 3ie Anwen-dung von Ultraschall au "her^f-^ffa^enden Ergebnissen in der zweiten Stufe führt und sehr vorteilhaft ist.

Die Erfindung wird anhand einer Reihe von Einzelbeispielen* die typische Fälle .darstellen, weiter erläutert» Wegen der thixotropen üatm? der meisten Emulsionen ist es KWeckmäSig, die Viskositäten durch eineft Hadelviskositätstest gu kennteich-

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nen_f der das Fließverhalten der Sisule ionen in eire-sr './eise vor gleicht, die dem Verhalten bei der praktischen /nw-näwn-gt wen die Emulsionen injislert werden«, sehr nahe koiu-r.it. Ber Ysv;..-:' ί'■<' "Nadelviskosität" bezeichnet die rcittiei-e Viskosität* die "^e⁵ diesem Test bestimmt wird, der folgendermaßen durc-lrpefuhrt v;5v

Eine 5 ml~-tandarinjektionsspritise wiru für mit einer 2₀5 em (1") langen O_c635 nsia(25-gaisge)-Ncdel (oder 0..-508 mm (20 gauge) für ¥0-£taulsiOKeii) versehen, mt dtr κ« prüfenden Flüssigkeit gefüllt uad in vertikaler Stell miß ß\it ήεν Nadel nach unten eingespannt. Auf den Kolben der Injektionssprit»'«f wird ein 2 kg-Gewicht gebrachir, und die Zeit zum .Auspressen ran

1 ml Flüssigkeit wird festgestellt. Unter diesen Bedingungen wermit der o_f635 mm ( 25-gauge)Nadal

den/2»6 Sekunden zum Auspressen von 1 ml Wasser benötigt_f v;Uh-rend 140 bis 150 Sekunden zum Auspressen von 1 ral des klassischen unvollstSßdigeη Adjuvana nach Freund, einer Wasser-in Öl Kmul sion erforderlich sind, die 50 Teile wässrige "hase einulgiert in einer Mischung aus 45 Teilen Drakeol 6 VR Mineralöl und 5 Tei len Amidmonooleat enthält« Mit der 0,5-08 mm(20 gauge)-Nadel vdrd Weseer. für eine genaue Messung zu rasch ausgetrieben, während dae unvollständige Ad juvane nach Preund 2 Sekunden pro ml erfordert.

fleratellunfi einer

Dieses Beispiel erläutert eine stabile

bei der die hydratieierten Reaktionsprodukte in situ gebildet

wurden. ^ \

BAD ORIGINAL

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■ .■■.. ."■.:■- 13 ν

Es -wurde· eine Zuaaanie&iietKung-"aus den folgenden'"De stand teile hergealrellt:

Λ/äsari-ge Glycinlfrsmig (0,5 jft) ■ 40,2

wfidiJi'iße liatrltimhydruXydloBUUf, (6 n) 1,2

Die Stearinsäure v/tvrde unter -Rühren mit einen» ntugne tischen RUhrstab durch rrwärmeii auf 50⁰V in -tem Erdnußöl "gelöst und die erhaltene "Lüannß wurde in einen YfaringirtisQher gegosaen. D.J3'/lurainiumsulfo-t- octadecahydrat wurde in fler.-v/äsarigen Glycin!öaung unter Huhren beL ZimmertenTperntur ßelöat. Der pH-viert der L· auiig v/urde dann mit der väasrigen 6n Hatrd-um-. hydroxydlöaung auf 7»2-eingestellt, und die erhaltene -Suepeneion wurde langsam ku der Ölphaae in dem Waringmigeher zugesetzt. ■ ■ ■- ^; ------ ^:

Die tolg&nQe 'i^!öbell# zäifit die Kigenaohaften der vofstehend hergestellten

tOUt3/tSil

Tabelle I

Stabile Tröpfchen in '/asser bei

Zimmertemperatur ja

Elektrische Leitfähigkeit negativ

# wässrige Phase bei 1 780 p

während 45 Minuten, eraeugt O

Viskosität 30 Sek

> . ■■■■ ■ ■ ■

Viskosität bezieht sich auf die Zeit, die zum iiuspresssn vo/ 1,0 ml Emulsion aus 5 ral Injektionsspritze durch eins 2,5 cm (!") lange, hypodermale 0,508 ram (20 gauge)-Koöel mit einer Kraft von 2 kg erforderlich ist.

Herstellung einer Ad.iuvanszusammensgtgunp;

Biases Beispiel erläutert die Bildung der hydratisierten Reaktionsprodukte in der wässrigen These vor dem Emulgieren.

Γ.8 wurde eine Zusanmenaetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

ErdnuOöl ■·■ ■_.._■[ 50,0

SttarineMre . 0,90 '

W leeer 46*87

HetrlumhydvoxvdlÖäung (6 n) ^. i_t58

iÄDORIQäNAL

IQII 1-3V "*'

Das Alußiiniuiasulfatocted©eafeydrat vmrde in'-der halmen. Menge des deionisierten Wassers-gelöst,..und der pH-Wert" wurde sit der wässrigen Matriümliydroxydlösung auf 7*03 «ingesteilt. Barm wurde die Stearinsäure in dem übrigen /irfceil des öeioHisierten Yfassers gelöst. Die Aluminiumliydrox'/flsospensiöri. xrerdie hierauf tropfenweise der Stearinsäuresuspension ziagesetst", und die gebildete Suspension wurde tropfenweise su dem Erdnußöl gegeben das vorher in einen ViGringmischer gebxaßiit - worden war.-

fοI. .ende !Eabelle seigt die Eigeiaseliaften der vorstehend hergestellten Zusammensetsung.

Tabelle II

Stabile Tröpfchen in Wasser bei

Zimnierteraperatur ja

Elektrische !leitfähigkeit negativ

i* wässr« Phase bei' 1 780 XJpK während

45 Minuten erzeugt O

Viskosität 14 Sekunden

Beispiel 3

Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte des Hagnesium-

k-tions

Dieses Beispiel erläutert- eine stabile Mjuvans^uslÄensetEung unter Verwendung von hydratisieren lieaktions^r^uic^en'

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Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt?

Erdnußöl 48 ₉0

. Stearinsäure 2,0

H'jgnesiumchloridhexfi hydra t 0,8

wässr. Glycinlösung (0,3 in) 47?4

wässr. Fatriumhydroxydlösung (6 n) 1 _tQ

Die Stearinsäure wurde unter Rühren ralt einem magnetischen Rührstab in dem Tfrdnußöl durch Erwärmen auf 50⁰C gelöst, und die erhaltene lösung wurde dann in einen tfaringmischer gegossen. Bas Magnesiumchloridhexahydrat wurde in der wässrigen G-Iycinlösung gelöst, und der pH-Wert wurd« mit der wässrigen Natrium-' hydroxydlösung auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde langsam zu der Ölphase in dem '.feringmischer gegeben.

Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der vorstehend hergestellten Zusammensetzung;

gajjelle.,111

Stabile Tröpfchen in V/asser

bei Zimmertemperatur ja

Elektrische Leitfähigkeit negativ

ia was sr. Phase "bei 1 780 UpM während

45 Hinuten erzeugt 0

Viskosität " 28_5j-|»ekundejß.::

109813/1562 _BAD

161730A

17 ~, ' Λ

Verwendung äer hydratiaierten Reaktionsprodukte von laiirinsäure

Dieses Beispiel erläutert eine stabile AdjuYänsausammsnöstaung uEiter Yerv/endung der hydratiaierten Reak.tionsprodukte τοη iaurinsäure.

Es ;\ruräe eine Zusaniiaensetzüttg aus den folgenden Bestandteilen hergestelltι

Erdnußöl 48

LaurinBäure 2,0

Aluminiurasulfatoctadecahydriit 1»1

wässr. ßiycinlöaung (0,3 m) 46,5

wässr« NatriumhydroxydlöBung (6 n) 2s4

Die Laurinaäure v/urdc unter'Rühren mit einem magnetischen HÜhretab in dem ^r'rdnußöl durch .Erwärmen auf 50⁰G gelöst, und die erhaltene Lösung wurde ih einen V/aringniischer gegossen.« Das AluminiUDiaulfritöctadecahydrat wurde in der wäsorigen Glycinlösung durci. Rühren bei Zimmertempevntür gelöst* und der pH-Wert wurdw mit der wöaorigen 6 η Natriumhydroxydlöaung auf 7,1 eingestellt.,Die erhaltene uuapension wurde donm Inngeam zu der öl phase In tiem Viaringmlßcher gegeben»

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Die folgende Tabelle seigt die-Eigenschaften ier vorstehend hergestellten Z_us aamensetsungϊ

Tabelle IV

Tröpfchen in Wasser

bei Zimmertemperatür . 3 a

Elektrische Leitfähigkeit · negativ

io wässsr* Phase bei 1 780 XipM

während 45 Hinuten eraeugi; 0

Viskosität ' 11 Sekunden

hydratisierter Rfcaktiuna.^rpdnkte. deg? Ce_rjkations.

Dieses Beiapiel erläutert eine stabile ^djuvunsr,-us.'jRiaiensefcsunft unter Verwendung -der hydra tivierten Reaktionsprodukte einea Cerikütions.

E₈ wurde eine ZusiimmenaetKung aus den rolgünden Bentnndteilen hergestellt!

"Erdnußöl . 49 atenrinsäure l_s0

Gariümraoniunisülfatdlhydrü ~^u,

Oe (SO₄) ₂ [(KH₄) ₂SO₄ J .,211,,O 1,2

wäßar. GlycU'ilöKuri}", {ü, j5 m) 47 v/fiser. Nöt

1 09 8 1 3 / 1 5 6 2bad original'··

Die Stearinsäure würde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Frdnußöl durchErwärmen auf 5O⁰G gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Das Ceriammoniumsulfatdihydrat 'wurde dann in der wässrigen ßlycinlösung durch Rühren bei ZiniBierteciperatür gelöst, und

der ρϊί-Wert wurde mit der wässrigen 6n Hatriumhydroxydlösung auf 7,2 eingestellt. Me erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem ¹Sa ringmiseher 'gegeben.

Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der vorstehend hergestellten Zusammensetzung-?

Tabelle ¥ '

Stabile Tröpfchen in Wasser

bei Zimmertemperatur ja

Elektrische Leitfähigkeit negativ

$> wässrige Phase bei 1 780 UpM

während 45 Hinuten erzeugt■/"■ 0

Viskosität 14 Sekunden

Beispiel 6

Herstellung einer Ad.iuvanszusammeneetaun^, die, Tetanustoxoid in der dispersen wässrijscen Phase enthält

Dieses Beispiel erläutert eine stabile AdjuTanszusammensetzurig, in der die disperse wässrige Phase Tetanustoxoid enthält-.

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Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Vol.-sS

Erdnußöl 48,0

Stearinsäure 2₉0

/luminiurasulfatoctadecahydrat 1,1

wäesr» Glyclnlösung (0,3 ra)_s

enthaltend 43 Lf-Einheiten

Tetanustoxoid pro ml 46.6

wässr. Natriumhydroxyd (6 n) 2,3

Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnußöl durch Erwärmen auf 50⁰C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Viaringmischer gegossen. Das Aluminiumsulfatoctadecahydrat wurde dann in der wässrigen Glycinlösung urch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässrigen Gn-Natriumhydroxydlösung auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann .langsam zu der Ölphase in dem Waringmlecher gegeben.

Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der vorstehend ,hergestellten Zusammensetzung: ί

; BAD ORIGINAL-. .."■-■

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V-I

Stabile Tröpfchen in tfacrser bei Zimiaeirtemperiitur·

Elektrische Leitfähigkeit

% wässr. Phase bei 1.780 UpM während 45 Minuten erzeugt

Viskosität -. -■

ja negativ

30 Sekunden

Ve-rwendunfi" der hydratigierteH^Rgalctio i'errlications

Diee.es Beispiel erläutert eine stabile Adju'vanszusainmensetssung unter Vervendung der hydratiaierten Reaktionsprodukte eines Perrik-tions.

Ks wurd-e eine Zusammensetzung aus den folgenden BGQtandteilen hergestellt:

Erdnußöl

3tearins(iure

PerrlöhlortdHexeiiydrot deionieit χ tee Wasser wiiaer. liatriuohydrqjiyal (6 »Ji

Vol. 48

BADORI61NAL

Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit eineia magnetischen RUhrstab in dem Erdnußöl durch Erwärmen auf 5O°C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Paring mi schar gegossen.. Das Ferrichloridhexahydrat wurde dann in der wässrigen Glycinlöaung durch Rühren hei Zinniarteuperatur aufgelöst, und der pH-'./ert wurde mit der wässrigen- en-ffatriumhydroxydlösung auf 6,8 eingestellt« Bie erhaltene Suspension wurde dann längs«a zn der Ülphase in dem '.'aringmlscher zugesetzt.

Die folgende Tabelle zeigt, dia Eigenschaften der vortrtehend hergestellten Zusammensetzung:

TaTbelle._VTI

Stabile Tröpfchen in Wasser

bei Zimmertemperatur ' ' 3&

Elektrische Leitfähigkeit negativ ■· ^

i* wässr. Phase bei t 780 UpM

während 45 Minuten erzeugt 0

Viskosität ^⁰ Sekunden

Beispiel Ö Yerwen^unp derhvxlratigiert^ ^cektionapr^dukte von, ölsäure

Diese» Beispiel erläutert eine stabile /\d,1uvanezusoDiraensetzung unter Verwendung der hydrotieierten ReakWon^proiliiKte- νόίί öii

Ea wuroe-'«Ines Jiusannienfletzung ans den

Erdnußöl 48,0

Ölsäure 'ζ 2,0

Aluminiumsulfatoetadeeahydrat 1»1

wässr. Glyeinlösung (0,3 ra) 46,6

wassr. ίία triumhyd r oxy älö sung (6 ft) 2,3

Die Ölsäure wurde unter Röhren mit einem magnetischen Ruhr-Stab in dem Erdnußöl durch Erwärmen auf 5O⁰C gelöst, und die erhaltene Lösung würde in einen Waringmischer gegossen. Das Aluminiumsulfat octadecshydrat wurde dann in der wässrigen Glyeinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Vfert wurde mit der wässrigen 6n-=Katriumhydroxydlösung auf 7»1 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in 1IeTiTWaringniaeher zugesetzt.

Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften dervorstehend

hergestellten Zusammensetzung/ ~

'■^;v "'■ ' - -- ■ "^:? '■■: -^: '■ -■ 'Ί ' ^; yebelle VIII '^:^" ''■_:'-'' * ^:·'- ' ■ ^ .. ·

Stabile' iröpf^hen £n ^Tneeer-. ^.

bei Zliiaiertemi>eratür ' ja

' ^Λ ·. negativ

' 16 Sekunden

BAD ORiCaJiSLAi^ ^¹ '"'

-—^^" -toÄk ta/ ist*

Jl «äier* Pnaae bei t 78Ö währtnd 45 Minuten ereeugt

ä^Il䣣§iLj!illSg§J^

Dieses Beispiel zeigt» daß Aluminiurachloridhiüäshydrat γα.H,- I-Jrf< Ig anstelle von -Aluminiurasulfatootadeeahyärat verwendet -v^rfis*} kr«;:in.-

Eb wurde eine Zusammensetzung aus den folgende« Bestandteile;·: hergestellt:

Erdnußöl 49

Stearinsäure 1

Aluminlumchlorldäöxahydrai 0,3

wäsar. GlycinlLiaiing (0,5 m) 48,4

wäaer. ifatriumhydroxydlöeung (6 n) 1,3

Die Stearinsäure wurde, unter Rühren mit einem magnetischen RUhratab in dem 'rdnußöl durch iirv/ärmen auf 50⁰C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen iaringmiacher gegossen. Dann wurde.das Aluminiumchloridhexahydrat in der wässrigen Glycin lösung durch Ruhren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit Jer wässrigen 6n Natriutnhydroxydlösung auf 7,3 eingestellt. BIe erhaltene Suspension wurde dann langsam eu der öl phase in dem v/aringmischer zugegeben.

Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der vorstehend

hergestellten Zusammensetzung: g^ ORiGINAL

109813/1562 . . ■ ■■

lie IX

Stabile Tröpfchen in Wasser be' ZlmEertempervtur

Elektrische Leitfähigkeit..;-

>v/ässr, Piiaöe Oe; 1 780 fahrend 45 Minuteπ erzeugt

ja ■■" negativ

0
••■25 Sekunden

Her"s t e H

Di eaeß Beispiel'.erläutert eine stabile Ad;j«vanaz;us3fimme2isot?;ur]g, in der die wässrige Phase aus phospli^tgepufferter ::al2lösimg teht ,'."."■"

Es wurde eine ZuBammensetzung aus den folgencl'en'-Bestaridteileii hergestellt:

.-tgepufferte; Saiälööung waser. Natriumhydroxydlöaunß Jß n)

49
•1,.Q 0,5

47,2 2,2

BAD ORfQIMAt,"

Lie Stearinsäure wurde unter Rühren sit eines inr.gn.etisehen H'ihrstab in dem -'rdnußöl durch li^waraisn auf 5O'^JO gelöst, unddie erhaltene Lösung wurde- in einen Vsringmlseker gegossen=,

Dann wurde das Aluminiumsuifa-toutadecahydrat iii der ph.oa.ph.at~ gepufferten 'Salzlösung dureh Rohren feel Zim^ertempsraturgelost, und der pH-Vferfe wurde alt.der wässrig??* 6n !Tätrläsi-hyd-TOxydlösung auf 7,0 eingestellt. Ms erhaltene'Süäpsfisiori wurde dann langsam-'zu tier Ölphase Im dsm liiarinRiiischer gegsb

Die folgende'Tabelle seigt die SigensciiofteiV üs? vorstehend hergeateilten Zusammensetzungi

Tabelle X

Stabile Tröpfchen in Wasser

bei Zimmertemperatur j

Elektrische Leitfähigkeit > * ^

°j» wässrig Phase bei 1 780 UpM ■ - -:

während, 45 itinuten eraeugt . 0 ,.

Viskosität 31 Sekunden

Beispiel 11 , HerstelluaR einer Ad^uvanszusnnimensetzunA

Dieses Beispiel erläutert eine stabile Adjuvansausanimensetsung, in der die kontiniuerliche Ölphaae aus Sojobohneuöl besteht.

BADORiGINAL

109813/1S62

Es wiarde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Soyabohnenöl · 48

Stearinsäure 2,0

AluißiniUfflsulfatoetadecahyärat 1»1

wässr. Glycinlösung (0, 3m) 46,4

wässr. liatriumhydroxydlösung (6 n) 2,5

Die Stefirinsäure wurde unter Rühren mit einen magnetischen RUhrstab in dem Sojaljohnenöl durch Erwärmen auf 50⁰C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Vforingmiseher gegossen* Dann wurde das Aluniiniuiasulfatoctadeeahydrat in der wässrigen Glycinlösung durch RUhren bei Zimmertemperatur gelöst,und der pH-Wert wurde-mit der wässrigen 6n-Katriumhydroxydlösung auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann langsam au der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.

Die foigende Tabelle keigt die Eigenechaften der vorstehend hergestellten Zusammensetzung:

IADORfGtNAL '

4 λ η ο ι ι / 1 c e

Stabile Tröpfchen in Wasser bei Zimmertenipertitur

Elektrische Leitfähigkeit

$ wäsar. Phase bei 1 780 UpM während 45 Minuten eraeugt

Viskosität

Tabelle	,Jl	O
		19 Selmnien
Beispie	1 12

Verwendung anderer Ausgangsstoffe für ein metallische8.-...Kation

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Aloungel als Ausgangsstoff für das metallische Kation der erfihdungsgemäßen /djuvantszusammensetssung.

Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandte.ilen hergestellt:

Vol.-ft

Erdnußdl 49

Stearinsäure ' 1

Ölyein 1,1

Suspension, enthaltend 0,46 g Alaungel pro

100 ml (durch Neutralisieren von Kaliumalu-

miniuasulfet bis pH ? mit Natriumhydroxyd und

Waschen des Niederschlags mit delonieiertem W, bis Sulfationen entfernt sind) 48,8

' IfatriumhyciroxydlöBung (6 n·) 0,1

■ BADORieiNAL

109813/1562

Bie Stearinsäure wurde unter Rührees ciit einem--"magnetischen-Rührst ab In aeta Erdnußöl durch Erwärmen auf 5O⁰O gelöst, xmß die erhaltene Lösung wurde In einen Waringmischer gegossen« Bas-.glycin vrurde au der jllawngelausgension Eugegeben_s und-der ßK-'.;c?rt viurde mit der wässrigen 6n ErntrinrnhydiOxycllöauiig ε-iuf 7,0 eingestellt. "Die erhaltene öpsgsnsiun wurdo dann langsam; au der Ölphaae In dem Iferingmischer gegeben.

Die folge ade" Tabelle ueigt die EigenacFi.often der vorstehend hergestellten ZusnjaniensetKimg:

- Tabelle XII

Stabile Tröpfchen in Wasser bei ■■-.'·.."'

Zimmertemperetür ^ ja

Elektrische !leitfähigkeit negativ

i* wässr. Phase bei 1 780 ITpH

während 45 Minuten erzeugt "0

Viskosität - 8 Sekunden

unter VerwentonK von ubllcheni Eniul^le.rmj/fctel·

Dieeeβ Beispiel erliiiit^rt die^Bildung einer bimult^iplen Emulsion, wie sie Von SeiJrjtiSr. Journal af Physical Öhemistry, Bd. 29» S» 73Bt (1925) fceacfcrieben wurdie. Ferner erläutert dns Beiapiel, daß die neue Adjuvanezuoummsnaetzung gemUß der

Erfindung in einem wässrigen Medium ohne Zerstörung der ursprünglichen Wasser-in-Öl-Emulsion unter Bildung der bimultlpien Wasaer-in-öl-iii-Wasser-Eiaulsion emulgiert v/erden kann.

Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgendan Bestand teilest hergestellt:

Emulsion nach Beispiel 1 i5

Emulgiermittel Xufien OO 1

phosphatgepufferte üjlzlösung 84

Das .,Emulgiermittel Tween 80 wurde in der phosphatgepufferten S izlöeung durch Rühren bei Zimmertemperatur mit einen magnetischen Mhrstab gelöst. Dann wurde die nach der Arbeitsweise von B ispiel T. hergestellte Zusammensetzung der Salzlösung zugesetzt. In die Mischung wurde der Kopf eines Ultraachallg:«— nerators bis zu eifter Tiefe von 5 ml eingesenkt. Die Mischung wurde 5 Sekunden- mit tritraschall gerührt, Das Rühren xvurde insgeoamt viermal wiederholt. ^ ^

Ee wurde eine multiple Waaser-dn-Öl-in ■Waeser-Emulsion gebil det. Die Bildung dieser multiplen Wasaer-in-öl"in-VTosser sion wurde durch Phaaenkontrast- und Xnterferenemikroakopie

" - ■ ' Beispiel Λ4

BrdnuBSl-ffOW-Emulsion. die kein

Dieses Beispiel zeigt, daß stabile aktive Mmultiple Aäjwrans emulsionen gemäß der Erfindung hergestellt werden kennen* in denen 1_S5 fo M AlUDiiniumsonostearat in hydratlsierter Porrn 'ala

f
einziges stabilisierendes Mttel Terwendet werden*

In 10 nil Glyeinpuffer (C,3 m Glyeinlösung_s pH .7 mit einem Gehalt von 0*01 ?* Herthiolate}. werden 0₉484 g Alus-iniunieu decahydrat gelöst, und der pH-Wert wird mit 0,6 El «äesriger 6 η Natriumhydroxydlösung auf 9*0 eingestellt. Dans werden 0_c88 ml Setanustoxoiä (650 Lf-Einheiten p3?o ml) zugegeben, und die erhaltene Suspension 'jfird mit Glycinpuffer auf 25 ml ver-

dünnt. In 24 ml raffiaiertem Erdnußöl ÜSP weräen 1,242 gStearinsäiire unter Rühren durch Erwärmen auf 60⁰C gelöst. Die wässrige Phase wird der Ölphase tropfenweise bei" 25°C iißter gutem Rühren «ugesetäV Eö öilde^

«ion w$rd[ ζνί 5(>/sß. ,feinerH^luminiufOiydroiydBuppenBion ssugesetzt, die durch Auflösen, yon O,96£S g Aluminiümeulfatoctadecahydrät in 0_#3 m ^.ycinpüffer, Einstellen dee pHrWerts pit 1,2 ml 6 η

mX 9»0^.«ai4i Vjerdlinnen mit ttiycinpuffer öuf 50 ml

Hergeßtellt wird· Öle ittechung^ Hif inJögeeait 10 Sekunden inten« ■iv Bit dea Kopf «ill·« Oltr« echellgen era tore gerührt, Ea bildet

BAD original . 109 813/15 6 2

sich eine bimultiple Wasser-in-öl-in-Waseer-Eraulsion» die 6 Lf-Einheiten Tetanustoxoid pro ml enthält. Die Durclimes.beider meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 1 bis 9 riikr«m_t und wenigstens SO fo dieser Tröpfchen enthalten innere Vfee^er tröpfchen. Bei 45 Minuten langem Zentrifugieren mit JOOrg vmrde keine getrennte Ölschicht festgestellt.

Eine Gruppe von Mäusen wurde mit einer subkutanen Einsseläenis dieser Emulsion von O_t5 ml immunisiert. Eine zweite Gruppe wurde. mit einer subkutanen 0,5 al Einzeldoeis von wässrigem Toxoid (6 Lf.-Einheiten/ml) immunisiert. Eine dritte Gruppe erhielt kei ne Injektion. Nach 14 Togen wurden sämtliche Hause einer Belastungsprüfung mit verschiedenen Dosen von Tetanustoxin durch intramuskuläre Injektion entsprechend den Angaben in Tabelle XIII unterworfen«

1098 13/1 562

Tabelle XIII

gesamte Tiere (4 T-ge nacU iosin)

Toxincloisis

, 200 100 ■:■·..

,1 / 0..Ö1 ' 0,001

wassr. V"

ρ/ίο ο/ίο ·2/ιρ

'1O 5/10

keine

Ό/iq o/ro ίο/ίο . ίο/το

■-■■"-■ 54 -

Beispiel 15

Erdnuß-WO'rf-Emulaion. die kein "ttl)llgheg_^uljd^gg-ittglJIi^TkJ-U

Es v.'ird eine Emulsion wie in Beispiel 14 hergestellt mit der Abänderung, daß 5,25 ml Taiv/an-Strain-Iiiflueasa-Vaeeiiie in 0,3 m Glycinpuffer (5280 KükenzellenagglutiHiereinheiten■·-pro ml) anateile von 0,88 n£L Tetanustoxoid verwendet werden* Die-fertige Emulsion ist eine Wasser-in-öl-in-V/asser-EEfKilsion, die 200 QGA-Einheiten pro ml enthält, Die Durchmesser ier meisten 0*1 tröpfchen liegen im Bereich von 3 - 12 Mikron und v^eiiigstena 90 i> der Tröpfchen enthalten innere V/asaertröpfchen..

12 Hausen in einer Gruppe wurde jeweils eine subkutane 0,5 ml-Dosis dieser Emulsion verabreicht, während t-2 Mäusen einer zweiten Gruppe jeweils eine subkutane Dosis von wässriger Taiwan-Vattcine mit einem Gehalt von 200 CCA-Einheiten pro ml verabreicht wurde. Nach 4 Vfochen wurde den Hausen Blut entzogen, und die Seren wurden auf /.ntikörpertiter nach der Hethode von SaIk, J. Immunology, 49t 87-98 (1944) geprüft. Der HI-Titer der vereinigten Seren von Hausen, die die Emulsion von Beispiel 2 enthielten, betrug 1280, während derjenige der Hause, die die ' wässrige Vaccine erhielten, 40 betrug. •.--^>^.-

109813/1562

; ■- 35 r

Beispiel 16
Hine:ral51~WQ¥KEiaulgiori, die kein ilbllcJj.ea_.Eraul_:glerEittel enthält

Es wird eine Emulsion wie in Beispiel 14 mit der Ausnahme hergestelltj daß 5,25 ml Taiwan-Strain-Inflwenza-Yaccine in 0,3 ra Glycinpuffer (3280 Kükenaellenaggluiiaiereinheiten pro ml) anstelle von O₉SS ml Tetanustoxoid und 24 ml Mineralöl (BrakeoX β YR) anstelle von 24 ml Erdnußöl U. S-. P. Terwendet werden. Die fertige Emulsion ist eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-EBiulsion, die 200 CCA-Einheiten pro ml enthält. Die Durchmesser der meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 3 =· 9 Mikron und wenigstens 80 $> dieser Tröpfchen enthalten innere Wassertröpfchen. Die "KadelviBkosität" (siehe oben) beträgt 6 Sekunden pro ml gegenüber einem Wert von 2,6 Sekunden pro ml für Wasser. 45 Hinuten langes Zentrifugieren der Emulsion mit. 300 χ g erzeugt keine feststellbare Ölschicht, und etwaiges Aufrahmen kann durch gelindes .Schütteln vollständig rückgängig gemacht werden.

Eine nach der Arbeitsweise von Beispiel 15 durchgeführte Prüfung der Ad,juvansoktivität ergab einen HI-Titer von 1280 bei den Mäusen, aie die TTmulsion von Beispiel 16 erhielten #. im Vergleich eü einem Titer von 20 bei den Mäusen, die die wriserige Vaccine erhielten.

~ 36 -

Beispiel 1J.
Mineralöl-WOW-EmulBion. die kein übliches, Emulflierraittel enthält

Dieses Beispiel zeigt, daß stabile aktive Adjuvansemulsionen gemäß der Erfindung hergestellt v/erden können, in. denen das Molverhältnis von Aluminium zu Stearinsäure 1 % 3> beträgt=

In 10 ml Glycinpuffer (0,3 m Glycinlösung, pH 7, mit einem Gehalt von 0,01 $ Merthiolat werden 0,404 g Aluminiumsulfatoctadecahydrat gelöst, und der pH-Viert wird mit 0,6 ral wässriger 6 n-Natriumhydroxydlösung auf 9,0 eingestellt. Dann werden 5,25 ml Taiwan-Straln~Influenza-V ccine in 0,3 m Glycinpuffer zugegeben, und die erhaltene Suspension wird mit Glycinpuffer auf 25 ml verdünnt. In 24 ml leichtem Mineralöl (Drakeöl 6 VR) werden 1,242 g Stearinsäure unter Rühren durch Erwärmen auf 6O⁰C gelöst. Die wässrige Phase wird tropfenweise unter gutem Rühren zu der ölphase zugesetzt, wodurch eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wird. Diese Emulsion wird zu 50 ml 0,3 m Glycin=#atriumhydroxyd<Puffer von pH 9 zugesetzt und 10 Sekunden lang mit dem Kopf eines Ultraschallgenerators behandelt. Eine bimultiple Wasser-in-ölin-Wasser-Emulsion, die 200 GCA-Einhelten/ml Taiwan-Influenza-Antigen enthält, mit einem pH-V/ert von 8,4 und einer "Nadelviskosität" von 3,6 Sekunden/ml wird gebildet. Bei 45 Minuten langem Zentrifugieren mit 300 χ g bildet sich keine ölschicht.

Eine Prüfung der Adjuvansaktivität nach Beispiel 15 ergab einen HI-Titer von 1280 für die Emulsion und von 20 für die

1 0 9 8 1 3/1562 _BAD ORIGINAL

1817304

»-■■■■■■

Vaccine.

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung, von stabil en sionen mit hydratisiertön S.lzen von dreiwertigem' Einen iJtear-insäu-re. Die Arbeitsweise wirr] unter Verwendung von leich— ,

tem Hinerijlöl" erläutert, jedoch können die gleichen WO¥-Eraul.sioaen unter Verwendung; eines gleichen Volumens der in den vorstehentSen B. Lspielen angegebenen G-lyceridöle anstelle des leichten Mineralöls hergeatellfc: Λ/erden* 'Dii nieh diesßs Beispiel auf ein Verfahren zur Herstellung der Emulsion besieht, wird kein Antigen beschrieben, jedoch kann öelbst'v-erstfindlich ein Antigen v;ie in den vorotehenden Beispielen toesctirishen «ugeaetat werden.

In TO inl Glycinpuffer (0,3 in Ölycinlöaüng, pH 7, mit einem

Gehalt von 0,01 5ί Hertioläte) werden 0,234 S FeCa, gelöat_v und ^

der pH-Wert wird mit 0,6 ml wäßariger 6ή Niatriurahydroxydlo- *.

sung auf 9,0 eingcBteilt. Dleöe Suspension wird mit Glucin- .

puffer auf 25 ml verdünnt. In 24 ml leichtem Mineralöl werden 1p242 g utearlneäure unter fillhreri durch Krwärmen auf 60⁰G gelöst. Die wässrige Phase wird tropfenweise■unter gutem Rühren bei 24⁰C zuάβΐ ölphoöe gegeben, wabe! sicheine Wä8£jbr-in-ül-EmuTBion bildet, iJteoe Kmulßion wird zu 50 ml/ einer Suspension zugesetzt, die durch Auflösung von 0,468 /; PeCl^ in 0,3 m Glycinpuffer, EinutolXen dös pil-Werta mit

BAD ORIQlNAL - " - ■ '

<--.·, 109813/1562

1₀2 nl 6n iiatriiishydrozyii auf 9 wad anachlisCenCe Tsrdrniidfc,;
mil; G Iy c in puffer ruf 50 nil heivss stellt Mira» Με ^ixelvimn ν/ί .-ν· mit dem Kopf eines Ultraschallgenerators inss.3B;.:ir& 10 ns;;«M" v^ inte naiv gerührt. Es bildet sieh eine Vigisltiple "iiGSSL-r-^ii*-
öl-iß-V/f»i5S8r-EKtulsion_e Bio OurcliKosaere de-r rii-ijtt-fi
Öl tröpfchen, liegen im Bei'sicli. too 1 ΐ;ϊ;ϊ 10 Uilirocij r.a« viei;ignt; 70 # dieser Tröpfchen onthalt^n inv;2re νίη^ί,^ν tropfe hin. ΐΐαχ -ίΓ» Minuteu langem Zentrifugieren ait 300 s g ;-iKSflG I-eii^i ;iü': cv^t-Ölaebiciit featgestallt.

BAD ORIÖiNAL

1098 13/1562

Claims (5)

Pa t e a t a. η' s ρ r U. c -h e

1. Adjuvaßssusammesasetgtmg aus einer v.^rasser--in-Öl»Emulsioß oder einer Wasser~in~öl~in~Wasser-Emulsi on ₉-.wobei das Öl aus einem physiologisch annehmbaren Öl besteht, .dadurch gekennzeichnetj daß sie wenigstens 0,15. ?S w/V eines hydratisierten Saises eines physiologisch annehmbaren mehrwertigen Metalls und einer physiologisch "annehmbaren Fettsäure

mit 12 "bis 24 Kohlenstoff at omen und ein anti genes"" Material in einer Menge enthält» die für eine- immunologisch' befriedigende Antikörperbildung ausreicht. ...

2. Ausführungsform nach "Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet_s daß die •■/asser-in-öl-in-V/asser-Emülsion außerdem 0.1 bis 4 ^L;» eines üblichen Emulgiermittels des Typs enthält," der die Bildung von Öl-in-Wasser-Emulsionen fördert.

3. Zusammensetzung nach Ansprucii 1 oder 2, dadurch gekennseiehnet, daß das mehrwertige Hetallkation.. Aluminium und die Pet.tsäure Stearinsäure ist und das iiolverhältnis von Aluminium zu Stearinsäure 1 : 1 beträgt..

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 odfsr 2., dadurch net, öa'ß sie als Öl Erdnußöl oder Mineralöl enthält«

5. Zusammensetzung, rih'eh Anspruch 1 oder 2» dadurch gekt-naseichnet_? dRß sie a?.n antigetieii liatei-iol. iHMkti^ierteo

viruöanti.gen enthiOt;.

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