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Verfahren zur Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Zusammensetzung
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Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Antigen- Adjuvans- Zusammensetzunglichen Öl besteht, mit einem Gehalt an einer (immunologisch) wirksamen Menge eines antigenen Ma- trials.
Antigene Stoffe wurden bereits in Adjuvans-Zusammensetzungen in Form von Wasser-in-Mineralöl-
Emulsionen eingeführt, die Modifikationen der bekannten Freund-Adjuvantien sind (s. M. C. Hardegree,
Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 123, S. 179 bis 184 ; [1966]).
In der USA-Patentschrift Nr. 3, 149, 036 ist eine modifizierte Emulsion beschrieben, in der das Mi- neralöl durch ein Triglyceridöl, z. B. Erdnussöl, ersetzt ist, und in der getrocknete oder nicht hydrati- sierte Aluminiumsalze von Fettsäuren verwendet werden. Das Emulgiermittel Mannidmonooleat blieb jedoch das gleiche. Wie nun gefunden wurde, war tatsächlich das Mannidmonooleat bei weitem der nachteiligste Bestandteil und obwohl Glyceridöle Mineralölen etwas vorzuziehen sind, blieben die Haupt- nachteile, die durch das Mannidmonooleat bedingt werden, weiter bestehen. Es sei darauf hingewiesen, dass sowohl bei den unvollständigen Adjuvans-Zusammensetzungen nach Freund als auch bei den
Emulsionen nach der USA-Patentschrift Nr. 3, 149, 036 die Emulsionen Wasser-in-Öl-Emulsionen und nicht Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen waren.
Versucht man, nicht hydratisiertes Aluminiummonostearat als einziges Stabilisierungsmittel für die in Frage stehenden Emulsionen zu verwenden (d. h. unter Weglassung des Mannidmonooleats), so wird eine instabile Emulsion ohne jedweden praktischen Wert erhalten.
Die Erfindung ermöglichst es, stabile, starke, gut verträgliche Wasser-in-Öl-Emulsionen und Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen ohne Verwendung von Mannidmonooleat herzustellen. Dies stellt einen erheblichen Vorteil dar. Aus zahlreichen Publikationen geht nämlich hervor, dass in bestimmten Ansätzen mit Mannidmonooleat bei Influenza-Vakzin (s. beispielsweise F. M. Davenport, Journal of Allergy, 32, S. 177 bis 189 [1961]) und in bestimmten Ansätzen von Tetanus-Toxoid (R. McLennon et al, Bulletin of World Health Organization 32, S. 683 bis 697 [1965]) Toxizitätsreaktionen beim Menschen auftreten.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung einer Antigen- Adjuvans- Zusammensetzung in Form einer stabilen Adjuvans- Wasser- in- Öl- Emulsion, wobei das Öl aus einem physiologisch verträglichen Öl besteht, mit einem Gehalt an einer (immunologisch) wirksamen Menge eines antigenen Materials besteht in seinem Wesen darin, dass man eine Mischung des Antigenmaterials und eines Hydroxyds eines physiologisch annehmbaren, zweiwertigen oder mehrwertigen Metalles in wässeriger Phase einem Gemisch aus einer physiologisch verträglichen Fettsäure mit 12 bis 24 Kohlenstoffatomen und dem physiologisch verträglichen Öl zusetzt.
Eine abgeänderte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man ein hydratisiertes Salz eines physiologisch annehmbaren, zweiwertigen oder mehrwertigen Metalles und
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eine physiologisch annehmbare Fettsäure in einer wässerigen Phase bildet, das Antigenmaterial zusetzt und das entstehende Gemisch dann einem physiologisch annehmbaren Öl zusetzt.
Die so erhaltenen Emulsionen können in Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen durch Verrühren in einer wässerigen Phase und anschliessende Zugabe eines üblichen Emulgiermittels oder zusätzlicher Men- gen eines hydratisierten Salzes eines physiologisch annehmbaren, zweiwertigen oder mehrwertigen Metalles und einer physiologisch annehmbaren Fettsäure umgewandelt werden. Wenn dagegen im Vor-
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pen im folgenden mit WO bzw. WOW abgekürzt.
Eine weitere abgeänderte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung besteht demgemäss darin, dass man zur Herstellung einer stabilen Adjuvans-Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion eine gemäss Anspruch 1 oder 2 erhaltene Emulsion in einer physiologisch annehmbaren wässerigen Phase weiteremulgiert. Bevorzugterweise wird daher ein übliches Emulgiermittel, das die Bildung von Öl-in-WasserEmulsionen begünstigt, entweder der als Zwischenprodukt auftretenden Wasser-in-Öl-Emulsion oder der zweiten wässerigen Phase vor der weiteren Emulgierung oder alternativ der schliesslich erhaltenen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion zugesetzt.
Bei der Emulgierung der WO-Emulsion, nach deren Erzeugung zur Herstellung einer WOW-Emulsion, kann man in dieser zweiten Emulgierstufe einEmulgiermittel üblicherArt, das Öl-in-Wasser-Emulsionen zu erzeugen vermag, in Wasser zur Herstellung einer WOW-Emulsion verwenden, da im wesentlichen die WO-Emulsion die disperse Phase ist. Ein typisches Emulgiermittel ist beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonooleat. Die WOW-Emulsionen haben günstigere Viskositäten und zeigen ferner verbesserte immunologische Ergebnisse gegenüber den unvollständigen Emulsionen nach Freund und Woodhour (USA-Patentschrift Nr. 3, 149, 036), besonders hinsichtlich des Merkmals, dass die Antikörperbildung rascher verläuft, wenn Antigene in der wässerigen Phase oder den wässerigen Phasen vorliegen.
Es kann mit andern Worten ein angemessener Antikörpertiter in einer geringeren Zahl von Tagen nach der Injektion erreicht werden.
Es ist häufig zweckmässig, mehr als 1 Mol Fettsäure, z. B. Stearinsäure, pro Mol mehrwertiges Kation bei der Zubereitung der WO-Emulsion zu verwenden und dann zusätzliches mehrwertiges Kation oder ein übliches Emulgiermittel der zweiten wässerigen Phase vor Bildung der WOW-Emulsion zuzusetzen.
Zur Erzielung bester Ergebnisse wird es bevorzugt, wenigstens einen überwiegenden Teil des antigenen Materials mit der wässerigen Phase bei der Bildung der WO-Emulsion einzuführen, bevor die Emulsion weiter zu einer WOW-Emulsion emulgiert wird. Wenn eine WOW-Emulsion ohne antigenes Material hergestellt wird, wird antigenes Material einfach der kontinuierlichen Wasserphase der WOWEmulsion zugesetzt. Die Ergebnisse sind merklich schlechter als bei den erfindungsgemässen WOW-Emul- sionen, bei denen das antigene Material in die wässerige Phase eingeführt wird, mit der die WO-Emul- sion gebildet wird. Das soll nicht heissen, dass erfindungsgemäss der Zusatz von antigenem Material in beiden Malen ausgeschlossen ist, jedoch muss wenigstens ein beträchtlicher Anteil des antigenen Materials in der ersten WO-Emulsion vorliegen.
Eine vorgebildete WOW-Emulsion, die als Grundlage auf den Markt gebracht werden kann, der der Immunologe das antigene Material, das er zu verwenden wünscht, zusetzen kann, wird zwar gewöhnlich nicht bevorzugt, bietet jedoch manche Vorteile.
Die mehrwertigen Metallkationen, welche die Fettsäuresalze bilden, können sich von beliebigen physiologisch annehmbaren mehrwertigen Metallen ableiten. Aluminium wird bevorzugt, befriedigende Ergebnisse werden aber auch mit dreiwertigem Eisen erzielt. Es sei darauf hingewiesen, dass die hydratisierten basischen Fettsäuresalze nicht notwendigerweise reine chemische Einzelverbindungen sind. Bekanntlich können basische Aluminium-Fettsäuresalze, z. B. Aluminiumstearate, in Molverhältnissen hergestellt werden, die nicht ganzzahlig sind. Wenn beispielsweise das Verhältnis etwas grösser als 1 ist, können sehr wohl Mischungen mit etwas Aluminiummonostearat und etwas Aluminiumdistearat vorliegen. Damit soll lediglich zum Ausdruck gebracht werden, dass die Erfindung keineswegs auf bestimmte chemische Einzelverbindungen beschränkt ist.
Die jeweils verwendeten Fettsäuren mit 12 bis 24 Kohlenstoffatomen sind nicht entscheidend, und die Erfindung ist nicht auf die Verwendung bestimmter Fettsäuren oder bestimmter Mischungen beschränkt. Wegen ihrer leichten Zugänglichkeit und hervorragenden physiologischen Verträglichkeit werden jedoch Palmitinsäure und Stearinsäure, insbesondere Stearinsäure, bevorzugt.
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Ausser der bevorzugten Stearin- und Palmitinsäure seien als Beispiele für andere Fettsäuren Laurinsäure, Myristinsäure, Arachinsäure, Behensäure, Ugnocerinsäure, Ricinoleinsäure, Ölsäure, Erucasäure, Linolsäure u. dgl. genannt.
Die physiologisch annehmbaren Glyceridöle sind ebenfalls nicht kritisch, und man kann beliebige annehmbare Öle verwenden, z. B. Erdnussöl, Suffloröl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Maisöl, Chaulmoograöl, Olivenöl, Sesamöl und Kokosnussöl. Leichte Mineralöle können ebenfalls zur Bildung der erfindungsgemässen WOW-Emulsionen verwendet werden und liegen deshalb im Rahmen der Erfindung. In vielen der folgenden Beispiele wird ein bestimmtes beispielhaftes Öl, nämlich Erdnussöl, verwendet, das zu hervorragenden Ergebnissen führt. Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf seine Verwendung beschränkt, und man kann sämtliche andere Öle, die physiologisch annehmbar sind, verwenden. Selbstverständlich sind auch Mischungen daraus geeignet.
Ausser den typischen mehrwertigen Metallen, Aluminium und Eisen, die oben genanntwurden. sind weitere physiologisch annehmbare Metalle Magnesium, Cer, Zink, Lanthan, Wismut u. dgl.
Die antigenen Materialien können von sehr unterschiedlicher Art sein. Beispielhaft sind solche, die mit Viren erhalten wurden, z. B. Influencavirusantigene und Antigene verschiedener Arten von Maulund Klauenseuche, Antigene aus Rickettsien, aus Bakterien, z. B. Tetanustoxide und Polysaccharide, z. B. solche, die aus Pneumokokken erhalten werden u. dgl. Tumorantigene sind ebenfalls vorteilhaft.
Es sei darauf hingewiesen, dass das antigene Material aus Pathogenen in einer Form vorliegen soll, in der es keine ernsten klinischen Symptome der Krankheit verursacht. Das antigene Material kann abgetötet, abgeschwächt oder in anderer Weise ausreichend harmlos für die praktische immunologische Anwendung gemacht sein. Die Erfindung bezieht sich auf verbesserte WO-und WOW-Emulsionen, welche Träger für die langsame Freisetzung von antigenem Material sind. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass beliebige der bekannten Arten von antigenen Stoffen verwendet werden können. Andere antigene Stoffe sind Allergene, z. B. Pollen, Staub, Haar, Feder-oder Hautschuppen, Extrakte daraus, z. B. Kreuzkraut, Haushaltsstaub, Pollenextrakte, Graspollen u. dgL Einige der Antigene fallen in die Kategorie der Gifte von Insekten oder Reptilien, z.
B. von Bienen und Wespen, Giftschlangen, Skorpionen und Lactrodectus mactans. Häufig werden antigene Stoffe mit stabilisierenden oder konservierenden Substanzen versehen, und es ist ein Vorteil der Erfindung, dass solche Stoffe die Stabilität der erhaltenen WO- oder WOW-Emulsionen nicht zerstören. Bekanntlich haben die meisten antigenen Stoffe Proteincharakter, sie sind jedoch selbstverständlich nicht darauf beschränkt. Beispielsweise fallen darunter auch die Polysaccharide der Pneumokokken und einige andere antigene Stoffe vom Nukleinsäuretyp, und können in die erfindungsgemässe WOW-Emulsionen eingeführt werden.
Die Menge an antigenem Material ist ebenfalls nicht kritisch, sie muss jedoch selbstverständlich ausreichen, um eine angemessene Antikörperbildung zu erzeugen. Diese Menge wird als "wirksame Menge für die Antikörperbildung" bezeichnet. Die wirksamen Mengen bei den verschiedenen antigenen Stoffen sind bekannt, und es ist bekannt, dass in vielen Fällen Adjuvantien eine Verminderung der Dosierung oder ein längeres Anhalten der Antikörperschutzwirkung oder beides ermöglichen. Die Vorteile von WOW-Emulsionen liegen häufig nicht in drastisch veränderten wirksamen Mengen, sondern in der schnelleren Entwicklung von Antikörpern und in vorteilhaftere physikalischen Eigenschaften. Zu diesen Vorteilen der erfindungsgemässen WOW-Emulsionen kommen sicherere physiologische Eigenschaften hinzu.
Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass die Menge an hydratisiertem mehrwertigem basischem Fettsäuresalz nicht kritisch ist. Selbstverständlich muss jedoch eine zur Stabilisierung der Emulsion ausrei- chende Menge vorhanden sein, und im allgemeinen beträgt die untere Grenze O, lfi1/o (Gewicht/Volu - men, w/v) bezogen auf das Gesamtvolumen der Emulsionen. Grössere Mengen von 0, 5% aufwärts zei- : igen noch höhere Stabilität und sind deshalb bevorzugt. Man kann noch grössere Mengen der hydrati- sierten mehrwertigen Metal1fettsäuresalze verwenden, und es gibt keine kritische obere Grenze. Selbstverständlich dürfen die Mengen nicht so gross sein, dass keine gut fliessfähige Emulsion gebildet wird.
Diese Bedingung ergibt sich nur aus praktischen Gründen und stellt deshalb keine kritische Beschränkung der Erfindung dar.
In den meisten Fällen weisen die erfindungsgemäss erhältlichen Emulsionen thixotrope Eigenschaften in verschiedenem Ausmass auf. Manchmal ist dies von Vorteil, weil es nicht erforderlich ist, dass sich die Emulsion stets in dünnflüssigem Zustand befindet, da die Injektion, z. B. eine subkutane, durch eine Injektionsspritze zu einer zeitweilig verminderten Viskosität auf Grund des thixotropen Effektes führt.
Das Salz des hydratisierten basischen mehrwertigen Kations mit einer Fettsäure kann in vorgebildetem Zustand zugegeben werden, oder man kann die Fettsäure in dem Öl lösen, nötigenfalls unter schwachem
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Erwärmen, und ein lösliches Salz des Metalles, das nicht toxisch ist, z. B. ein Chlorid, Nitrat oder Sulfat der wässerigen Phase, gewöhnlich unter Einstellung des pH-Wertes zwischen 4 und 10 unter Bildung beträchtlicher Mengen Hydroxyd und des hydratisierten mehrwertigen Kationfettsäuresalzes während der Emulgierung zur Herstellung der ersten WO-Emulsion zusetzen. Wenn das Fettsäuresalz in situ hergestellt werden soll, kann man die Fettsäure selbstverständlich auch in die wässerige Phase als Salz mit einem physiologisch annehmbaren Kation, z.
B. als Natriumsalz, einführen und dann ein lösliches Salz des mehrwertigen Metalles, z. B. Aluminiumsulfat, zugeben. Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass es für die Gewinnung der WOW-Emulsion nicht entscheidend ist, diese in zwei Stufen zu erzeugen und dass sich einfache zweckmässige Betriebsbedingungen ergeben.
Die Verhältnisse des Volumens der dispersen wässerigen Phase (mit Vw bezeichnet) zu dem Volumen der Ölphase (mit Vo bezeichnet) und zu dem Volumen der kontinuierlichen wässerigen Phase (mit Vw bezeichnet) in den erfindungsgemässen WOW-Emulsionen sind nicht besonders kritisch und können unter Erhaltung guter Aktivität innerhalb eines beträchtlichen Bereiches schwanken. (Bei der folgenden Erläuterung ist zu beachten, dass während der Emulgierung der zuerst erzeugten WO-Emulsion in der kontinuierlichen wässerigen Phase eine beträchtliche Wanderung oder Migration der dispersen wässerigen Phase zu der kontinuierlichen wässerigen Phase stattfinden kann, so dass zwar die ursprünglich angewen-
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betragen, wobei gute Adjuvansaktivität erhalten bleibt.
Der bevorzugte Bereich beträgt 20 bis 3rP/o. Wenn ein Ölgehalt unter 5% angewendet wird, wird das Volumen der Adjuvansemulsion, das für eine gute immunologische Reaktion erforderlich ist, für die Injektion übermässig gross. Wenn ein Ölgehalt von mehr als 60go angewendet wird, wird die Viskosität der fertigen Emulsion für die Injektion unangemessen hoch.
Bei WO-Emulsionen kann das Verhältnis von Vw zu Vo etwa 5 : 95 bis zu 60 : 40 oder mehr betragen. Das Verhältnis ist für die Brauchbarkeit der Emulsionen als Adjuvantien nicht entscheidend, sondern wird nur durch praktische Gründe bedingt. Für sehr niedrige Verhältnisse von Vw zu Vo können hochkonzentrierte wässerigeAntigenpräparate zur Erzielung einer ausreichenden Antigenmasse in einem vernünftigen Injektionsvolumen erforderlich sein.
Bei sehr hohen Verhältnissen von Vw zu Vo wird die Viskosität der Emulsion für eine leichte Injektion zu hoch.
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<tb>
<tb> ge-Vol-%
<tb> Erdnussöl <SEP> 49
<tb> Stearinsäure <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 0, <SEP> 6 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 48, <SEP> 2 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6 <SEP> n) <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab durch Erwärmen auf 500C in dem Erdnussöl gelöst und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Das Aluminiumsulfat-octadecahydrat wurde in der wässerigen Glycinlösung unter Rühren bei Zimmertemperatur gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wurde dann mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 2 eingestellt, und die erhaltene Suspension wurde langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer zugesetzt.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle I
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<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> bei
<tb> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> lo <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb>
<tb> Viskosität <SEP> 30 <SEP> sec
<tb>
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Viskosität bezieht sich auf die Zeit, die zum Aus- pressen von 1, 0 ml Emulsion aus 5 ml Injektions- spritze durch eine 2, 5 cm (1") lange, hypodermale
0, 508 mm (20-gauge)-Nadel mit einer Kraft von
2 kg erforderlich ist.
Beispiel 2 : Herstellung einer Adjuvanszusammensetzung
Dieses Beispiel erläutert die Bildung der hydratisierten Reaktionsprodukte in der wässerigen Phase vor dem Emulgieren.
Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> Vol. <SEP> -% <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 50, <SEP> 0
<tb> Stearinsäure <SEP> 0, <SEP> 98 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP>
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 46, <SEP> 87 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6 <SEP> n) <SEP> 1, <SEP> 58 <SEP>
<tb>
Das Aluminiumsulfatoctadecahydrat wurde in der halben Menge des deionisierten Wassers gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen Natriumhydroxydlösung auf 7, 08 eingestellt. Dann wurde die Stearinsäure in dem übrigen Anteil des deionisierten Wassers gelöst.
Die Aluminiumhydroxydsuspension wurde hierauf tropfenweise der Stearinsäuresuspension zugesetzt, und die gebildete Suspen-
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sion wurde tropfenweise zu dem Erdnussöl gegeben, das vorher in einen Waringmischer gebracht worden war.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung.
Tabelle II
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<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> bei
<tb> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 14 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 3 : Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte des Magnesiumkations
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung unter Verwendung von hydratisierten Reaktionsproduktes des Magnesiumkations.
Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> Vol. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 48,0
<tb> Stearinsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Magnesiumchloridhexahydrat <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 47, <SEP> 4 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6 <SEP> n) <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Er- wärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde dann in einen Waringmischer gegossen. Das Magnesiumchloridhexahydrat wurde in der wässerigen Glycinlösung gelöst, und der PH- Wert wurde mit der wässerigen Natriumhydroxydlösung auf 7, 0 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle III
EMI6.3
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> % <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 28 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 4 : Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte von Laurinsäure
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung unter Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte von Laurinsäure.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> VoL <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 48
<tb> Laurinsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 46, <SEP> 5 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6 <SEP> n) <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Die Laurinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Das Aluminiumsulfatoctadecahydrat wurde in der wässerigen Glycinlösung durchRühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 1 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle IV
EMI7.2
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei
<tb> 1780 <SEP> Umdr/min <SEP> während
<tb> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 11 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 5 : Verwendung hydratisierter Reaktionsprodukte des Cerikations
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung unter Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte eines Cerikations.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> Vol.-%
<tb> Erdnussöl <SEP> 49
<tb> Stearinsäure <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Ceriammoniumsulfatdihydrat
<tb> Ce <SEP> (SO4) <SEP> [ <SEP> (NH4) <SEP> 2 <SEP> SO <SEP> 2 <SEP> 2H2 <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 47
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 1, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Das Ceriammoniumsulfatdihydrat wurde dann in der wässerigen Glycinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 2 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
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Tabelle V
EMI8.1
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> % <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 14 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 6: Herstellung einer Adjuvanszusammensetzung, die Tetanustoxoid in der dispersen wässerigen Phase enthält
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung, in der die disperse wässerige Phase Tetanustoxoid enthält.
Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt :
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<tb>
<tb> Vol. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 48, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Stearinsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m),
<tb> enthaltend <SEP> 43 <SEP> Lf-Einheiten
<tb> Tetanustoxoid/ml <SEP> 46, <SEP> 6 <SEP>
<tb> wässeriges <SEP> Natriumhydroxyd <SEP> (6 <SEP> n) <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen.
Das Aluminiumsulfatoctadecahydrat wurde dann in der wässerigen Glycinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 0 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle VI
EMI8.3
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 30 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 7: Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte eines Ferrikations
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung unter Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte eines Ferrikations.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt,
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<tb>
<tb> Vol. <SEP> -%
<tb> Erdnussöl <SEP> 48
<tb> Stearinsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> F <SEP> errichloridhexahydrat <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> deionisiertes <SEP> Wasser <SEP> 46, <SEP> 4 <SEP>
<tb> wässeriges <SEP> Natriumhydroxyd <SEP> (6n) <SEP> 2, <SEP> 6 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Er- wärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Das Ferrichloridhexahydrat wurde dann in der wässerigen Glycinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur aufgelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 6, 8 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer zugesetzt.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle VII
EMI9.2
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min <SEP> 0
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt
<tb> Viskosität <SEP> 18 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 8 : Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte von Ölsäure
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung unter Verwendung der hydratisierten Reaktionsprodukte von Ölsäure.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
EMI9.3
<tb>
<tb> Vol. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 48, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Ölsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 46, <SEP> 6 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
EMI9.4
fatoctadecahydrat wurde dann in der wässerigen Glycinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 1 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer zugesetzt.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
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Tabelle VIII
EMI10.1
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 16 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 9 : Verwendung anderer Ausgangsstoffe für das Metallkation
Dieses Beispiel zeigt, dass Aluminiumchloridhexahydrat mit Erfolg an Stelle von Aluminiumsulfatoctadecahydrat verwendet werden kann.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
EMI10.2
<tb>
<tb> Vol. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Erdnussöl <SEP> 49
<tb> Stearinsäure <SEP> 1
<tb> Aluminiumchloridhexahydrat <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 48, <SEP> 4 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 1, <SEP> 3 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Dann wurde das Aluminiumchloridhexahydrat in der wässerigen Glycinlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur gelöst, und der PH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 3 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer zugegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle IX
EMI10.3
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> % <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 25 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 10 : Herstellung einer Adjuvanszusammensetzung
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung, in der die wässerige Phase aus phosphatgepufferter Salzlösung besteht.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
EMI10.4
<tb>
<tb> VoL-%
<tb> Erdnussöl <SEP> 49
<tb> Stearinsäure <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 0,5
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb>
<tb> Viol.-%
<tb> phosphatgepufferte <SEP> Salzlösung <SEP> 47, <SEP> 3 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 2, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Dann wurde das Aluminiumsulfatoctadecahydrat in der phosphatgepufferten Salzlösung durchRührenbeiZimmertemperatur gelöst, und der PH- Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7,0 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle X
EMI11.2
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei
<tb> 1780 <SEP> Umdr/min <SEP> während
<tb> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 31 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 11 : Herstellung einer Adjuvanszusammensetzung
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung einer stabilen Adjuvanszusammensetzung, in der die kontinuierliche Ölphase aus Sojabohnenöl besteht.
Es wurde eine Zusammensetzung aus folgenden Bestandteilen hergestellt :
EMI11.3
<tb>
<tb> Vol. <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Sojabohnenöl <SEP> 48
<tb> Stearinsäure <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Aluminiumsulfatoctadecahydrat <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Glycinlösung <SEP> (0, <SEP> 3 <SEP> m) <SEP> 46, <SEP> 4 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Sojabohnenöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen. Dann wurde dasAluminiumsulfatoctadecahydrat in der wässerigen Glycinlösung durchRühren beiZimmertem- peratur gelöst, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7, 0 eingestellt.
Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle XI
EMI11.4
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser
<tb> bei <SEP> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb>
<Desc/Clms Page number 12>
Tabelle XI (Fortsetzung)
EMI12.1
<tb>
<tb> 0/0 <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min <SEP> 0
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt
<tb> Viskosität <SEP> 19 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 12 : Verwendung anderer Ausgangsstoffe für ein metallisches Kation
Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Alaungel als Ausgangsstoff für das metallische Kation der erfindungsgemäss erhältlichen Adjuvanszusammensetzung.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
EMI12.2
<tb>
<tb> Vol.
<tb>
Erdnussöl <SEP> 49
<tb> Stearinsäure <SEP> 1
<tb> Glycin <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Suspension, <SEP> enthaltend <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> g <SEP> Alaungel
<tb> pro <SEP> 100 <SEP> ml <SEP> (durch <SEP> Neutralisieren <SEP> von
<tb> Kaliumaluminiumsulfat <SEP> bis <SEP> PH <SEP> 7 <SEP> mit
<tb> Natriumhydroxyd <SEP> und <SEP> Waschen <SEP> des
<tb> Niederschlages <SEP> mit <SEP> deionisiertem <SEP> Wasser,
<tb> bis <SEP> Sulfationen <SEP> entfernt <SEP> sind) <SEP> 48, <SEP> 8 <SEP>
<tb> wässerige <SEP> Natriumhydroxydlösung <SEP> (6n) <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Die Stearinsäure wurde unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in dem Erdnussöl durch Erwärmen auf 500C gelöst, und die erhaltene Lösung wurde in einen Waringmischer gegossen.
Das Glycin wurde zu der Alaungelsuspension zugegeben, und der pH-Wert wurde mit der wässerigen 6n-Natrium- hydroxydlösung auf 7, 0 eingestellt. Die erhaltene Suspension wurde dann langsam zu der Ölphase in dem Waringmischer gegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Eigenschaften der wie vorstehend angegeben hergestellten Zusammensetzung :
Tabelle XII
EMI12.3
<tb>
<tb> Stabile <SEP> Tröpfchen <SEP> in <SEP> Wasser <SEP> bei
<tb> Zimmertemperatur <SEP> ja
<tb> Elektrische <SEP> Leitfähigkeit <SEP> negativ
<tb> % <SEP> wässerige <SEP> Phase <SEP> bei <SEP> 1780 <SEP> Umdr/min
<tb> während <SEP> 45 <SEP> min <SEP> erzeugt <SEP> 0
<tb> Viskosität <SEP> 8 <SEP> sec
<tb>
Beispiel 13 : WOW-Emulsion unter Verwendung von üblichem Emulgiermittel
Dieses Beispiel erläutert die Bildung einer bimultiplen Emulsion, wie sie von Seifriz, Journal of Physical Chemistry, Bd. 29, S. 738, [1925] beschrieben wurde.
Ferner erläutert das Beispiel, dass die neue erfindungsgemäss erhältliche Adjuvanszusammensetzung in einem wässerigen Medium ohne Zerstörung der ursprünglichen Wasser-in-Öl-Emulsion unter Bildung der bimultiplen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion emulgiert werden kann.
Es wurde eine Zusammensetzung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt :
<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
<tb>
<tb> VoL-%
<tb> Emulsion <SEP> nach <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 15
<tb> Emulgiermittel <SEP> (Polyoxyäthylensorbitanmonooleat) <SEP> l <SEP>
<tb> phosphatgepufferte <SEP> Salzlösung <SEP> 84 <SEP>
<tb>
Das Emulgiermittel Tween 80 wurde in der phosphatgepufferten Salzlösung durch Rühren bei Zimmertemperatur mit einem magnetischen Rührstab gelöst. Dann wurde die nach der Arbeitsweise von Beispiel 1 hergestellte Zusammensetzung der Salzlösung zugesetzt. In die Mischung wurde der Kopf eines Ultraschallgenerators bis zu einer Tiefe von 5 ml eingesenkt. Die Mischung wurde 5 sec mit Ultraschall gerührt. Das Rühren wurde insgesamt viermal wiederholt.
Es wurde eine multiple Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion gebildet. Die Bildung dieser multiplen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion wurde durch Phasenkontrast- und Interferenzmikroskopie bestätigt.
Beispiel 14 : Erdnussöl-WOW-Emulsion, die kein übliches Emulgiermittel enthält
Dieses Beispiel zeigt, dass stabile aktive bimultiple Adjuvansemulsionen gemäss der Erfindung her-
EMI13.2
mercurithiosalicylat (Merthiolate) werden 0, 484 g Aluminiumsulfatoctadecahydrat gelöst, und der pHWert wird mit 0, 6 ml wässeriger 6n-Natriumhydroxydlösung auf 9, 0 eingestellt. Dann werden 0, 88 ml Tetanustoxoid (630 Lf-Einheiten/ml) zugegeben, und die erhaltene Suspension wird mit Glycinpuffer auf 25 ml verdünnt. In 24 ml raffiniertem Erdnussöl USP werden l, 242 g Stearinsäure unter Rühren durch Erwärmen auf 60 C gelöst. Die wässerige Phase wird der Ölphase tropfenweise bei 25 CuntergutemRüh- ren zugesetzt.
Es bildet sich eine Wasser-in-Öl-Emulsion. Diese Emulsion wird zu 50 ml einer Aluminiumhydroxydsuspensionzugesetzt, die durch Auflösen von 0, 968 g Aluminiumsulfatoctadecahydrat in 0, 3 m Glycinpuffer, Einstellen des pH-Wertes mit 1, 2 ml 6n-Natriumhydroxyd auf 9, 0 und Verdünnen mit Glycinpuffer auf 50 ml hergestellt wird. Die Mischung wird insgesamt 10 sec intensiv mit dem Kopf eines Ultraschallgenerators gerührt. Es bildet sich eine bimultiple Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emul- sion, die Lf-Einheiten Tetanustoxoid/ml enthält. Die Durchmesser der meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 1 bis 9 p, und wenigstens 803to dieser Tröpfchen enthalten innere Wassertröpfchen.
Bei 45 min langem Zentrifugieren mit 300 xg wurde keine getrennte Ölschicht festgestellt.
Eine Gruppe von Mäusen wurde mit einer subkutanen Einzeldosis dieser Emulsion von 0, 5 ml immunisiert. Eine zweite Gruppe wurde mit einer subkutanen 0, 5 ml Einzeldosis von wässerigem Toxoid (6 Lf-Einheiten/ml) immunisiert. Eine dritte Gruppe erhielt keine Injektion. Nach 14 Tagen wurden sämtliche Mäuse einer Belastungsprüfung mit verschiedenen Dosen von Tetanustoxin durch intramuskuläre Injektion entsprechend den Angaben in Tabelle XIII unterworfen.
<Desc/Clms Page number 14>
Tabelle XIII
EMI14.1
<tb>
<tb> Überlebende <SEP> gesamte <SEP> Tiere <SEP> (4 <SEP> Tage <SEP> nach <SEP> Toxin)
<tb> Toxindosis <SEP> 200 <SEP> 100 <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 12, <SEP> 5 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 001 <SEP> 0, <SEP> 0001 <SEP>
<tb> (lug)
<tb> wässeriges <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 2/10
<tb> Toxoid
<tb> Emulsion
<tb> Emulsion <SEP> 1/10 <SEP> 2/10 <SEP> 5/10 <SEP>
<tb> von <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP>
<tb> keine <SEP> 0/10 <SEP> 0/10 <SEP> 10/10 <SEP> 10/10
<tb> Injektion
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
Beispiel 15: Erdnuss-WOW-Emulsion, die kein übliches Emulgiermittel enthält
Es wird eine Emulsion wie in Beispiel 14 hergestellt mit der Abänderung, dass 5, 25 ml TaiwanStrain-Influenza-Vaccine in 0, 3 m Glycinpuffer (3280 Kükenzellenagglutiniereinheiten/ml) an Stelle von 0, 88 ml Tetanustoxoid verwendet werden.
Die fertige Emulsion ist eine Wasser-in-Öl-in-WasserEmulsion, die 200 CCA-Einheiten/ml enthält. Die Durchmesser der meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 3 bis 12 jn und wenigstens 9coco der Tröpfchen enthalten innere Wassertröpfchen.
12 Mäusen in einer Gruppe wurde jeweils eine subkutane 0, 5ml-Dosis dieser Emulsion verabreicht, während 12 Mäusen einer zweiten Gruppe jeweils eine subkutane Dosis von wässeriger Taiwan-Vaccine mit einem Gehalt von 200 CCA-Einheiten/ml verabreicht wurde. Nach 4 Wochen wurde den Mäusen Blut entzogen, und die Seren wurden auf Antikörpertiter nach der Methode von Salk, J. Immunology, 49, 87 bis 98 [1944] geprüft.
Der HI-Titer der vereinigten Seren von Mäusen, die die Emulsion von Beispiel 2 enthielten, betrug 1280, während derjenige der Mäuse, die die wässerige Vaccine erhielten, 40 betrug.
EMI15.1
16 : Mineralöl-WOW-Emulsion,Influenza-Vaccine in 0, 3 m Glycinpuffer (3280 Kükenzellenagglutiniereinheiten/ml) an Stelle von 0, 88 ml Tetanustoxoid und 24 ml Mineralöl an Stelle von 24 ml Erdnussöl U. S. P. verwendet werden. Die fertige Emulsion ist eine Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, die 200 CCA-Einheiten/ml enthält. Die Durchmesser der meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 3 bis 9 ,u und wenigstens 80% die- ser Tröpfchen enthalten innere Wassertröpfchen.
Die "Nadelviskosität" (s. oben) beträgt 6 sec/mlgegenüber einem Wert von 2, 6 sec/ml für Wasser. 45 min langes Zentrifugieren der Emulsion mit 300 xg erzeugt keine feststellbare Ölschicht, und etwaiges Aufrahmen kann durch gelindes Schütteln vollständig rückgängig gemacht werden.
Eine nach der Arbeitsweise von Beispiel 15 durchgeführte Prüfung der Adjuvansaktivität ergab einen HI-Titer von 1280 bei den Mäusen, die die Emulsion von Beispiel 16 erhielten, im Vergleich zu einem Titer von 20 bei den Mäusen, die die wässerige Vaccine erhielten.
Beispiel 17: Mineralöl-WOW-Emulsion, die kein übliches Emulgiermittel enthält
EMI15.2
den 0, 484 g Aluminiumsulfatoctadecahydrat gelöst, und der PH- Wert wird mit 0, 6 ml wässeriger 6n-Natriumhydroxydlösung auf 9,0 eingestellt. Dann werden 5,25 ml Taiwan-Strain-Influenza-Vaccine in 0, 3 m Glycinpuffer zugegeben, und die erhaltene Suspension wird mit Glycinpuffer auf 25 ml verdünnt. In 25 ml leichtem Mineralöl (Drakeol 6 VR) werden 1, 242 g Stearinsäure unter Rühren durch Erwärmen auf 600 C gelöst. Die wässerige Phase wird tropfenweise unter gutem Rühren zu der Ölphase zugesetzt, wodurch eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wird. Diese Emulsion wird zu 50 ml 0, 3 m Glycin-Natriumhydroxyd-Puffer von pH 9 zugesetzt und 10 sec lang mit dem Kopf eines Ultraschallgenerators behandelt.
Eine bimultiple Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion, die 200 CCA-Einheiten/ml TaiwanInfluenza-Antigen enthält, mit einem pH-Wert von 8,4 und einer "Nadelviskosität" von 3, 6 sec/ ml wird gebildet. Bei 45 min langem Zentrifugieren mit 300 x g bildet sich keine Ölschicht.
Eine Prüfung der Adjuvansaktivität nach Beispiel 15 ergab einen HI-Titer von 1280 für die Emulsion und von 20 für die wässerige Vaccine.
Beispiel 18 : Mineralöl-WOW-Emulsion, die kein übliches Emulgiermittel enthält
Dieses Beispiel erläutert die Herstellung von stabilen Emulsionen mit hydratisierten Salzen von dreiwertigem Eisen und Stearinsäure. Die Arbeitsweise wird unter Verwendung von leichtem Mineralöl erläutert, jedoch können die gleichen WOW-Emulsionen unter Verwendung eines gleichen Volumens der in den vorstehenden Beispielen angegebenen Glyceridöle an Stelle des leichten Mineralöls hergestellt werden.
Da sich dieses Beispiel auf ein Verfahren zur Herstellung der Emulsion bezieht, wird kein Antigen beschrieben, jedoch kann selbstverständlich ein Antigen, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, zugesetzt werden.
EMI15.3
werden 0, 234 g fecal. gelöst, und der pH-Wert wird mit 0, 6 ml wässeriger 6n-Natriumhydroxydlösung auf 9, 0 eingestellt. Diese Suspension wird mit Glycinpuffer auf 25 ml verdünnt. In 24 ml leichtem Mineralöl werden 1, 242 g Stearinsäure unter Rühren durch Erwärmen auf 600C gelöst. Die wässerige Phase wird tropfenweise unter gutem Rühren bei 24 C zu der Ölphase gegeben, wobei sich eine Wasser-in- Öl-Emulsion bildet.
Diese Emulsion wird zu 50 ml einer Suspension zugesetzt, die durch Auflösung von
<Desc/Clms Page number 16>
0, 468 gFeCl in 0, 3 m Glycinpuffer, Einstellen des PH-Wertes mit 1, 2 m16n-Natriumhydroxyd auf 9 und anschliessende Verdünnung mit Glycinpuffer auf 50 ml hergestellt wird. Die Mischung wird mit dem Kopf eines Ultraschallgenerators insgesamt 10 sec intensiv gerührt. Es bildet sich eine bimultiple Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsion. Die Durchmesser der meisten Öltröpfchen liegen im Bereich von 1 bis 10 Il, und wenigstens 70 ? o dieser Tröpfchen enthalten innere Wassertröpfchen.
Bei 45 min langem
EMI16.1
:Adjuvans-Wasser-in-Öl-Emulsion, wobei das Öl aus einem physiologisch verträglichen Öl besteht, mit einem Gehalt an einer (immunologisch) wirksamen Menge eines antigenen Materials, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung des Antigenmaterials und eines Hydroxyds eines physiologisch annehmbaren, zweiwertigen oder mehrwertigen Metalles in wässeriger Phase einem Gemisch aus einer physiologisch verträglichen Fettsäure mit 12 bis 24 Kohlenstoffatomen und dem physiologisch vertäglichen Öl zusetzt.
2. Abänderung des Verfahrens nachAnspruchl, dadurch gekennzeichnet, dass man ein hydratisiertes Salz eines physiologisch annehmbaren, zweiwertigen oder mehrwertigen Metalles und eine physiologisch annehmbare Fettsäure in einer wässergien Phase bildet, das Antigenmaterial zustzt und das entstehende Gemisch dann einem physiologisch annehmbaren Öl zusetzt.
EMI16.2
2 erhaltene Emulsion in einer physiologisch annehmbaren wässerigen Phase weiteremulgiert.