DE1598859A1

DE1598859A1 - Reagentien fuer immunochemische Bestimmungen

Info

Publication number: DE1598859A1
Application number: DE19661598859
Authority: DE
Inventors: Dr Schuurs Antonius Herm Maria
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1965-04-15
Filing date: 1966-04-15
Publication date: 1972-03-16
Also published as: GB1143938A; ES325515A1; SE334706B; NL6504823A; CH477868A; US3551555A; BR6678733D0; DK113958B; BE679590A; DE1598859B2; NL125235C

Description

jSfMtJNOHEN 9 DR. ING. F. WTJESTHOFF

DIPL. ING. G. PULS _mDM 22 οβ »ι

DR.B.V.PEOHMANN

PATENTANWÄLTE PBOTXOTPATKWT UtKOIIK

1A-31 482

Beschreibung zu der Patentanmeldung

Έ. Y. Organon
Zloosterstraat 6, Oss - Niederlande

betreffend
Reagentien für immunoohemische Bestimmungen.

Die Erfindung bezieht sich auf neuartige immunochemische Reagentien und auf deren Herstellung. Die bei den damit durch· gefphrten Versuchen erhaltenen Präparate können haltbar gemacht werden, was ein besonderer Vorteil dieser Reagentien ist.

f Bei immunochemlsehen Methoden wird of Gebrauch gemacht

von inerten Teilchen als Träger für das Antigen bzw. für die Antikörper, um die Reaktion zwischen Antigen und Antikörper durch Zusammenklumpen der Teilchen sioKbar zu machen, ein Phänomen, das als "Agglutination" oder "Agglut!nieren¹¹ bezeichnet wird. Hierbei werden, gegebenenfalls unter Mitwirkung von Hllfestoffen, das Antigen baw. die Antikörper an die Teilchen angelagert oder von ihnen adsorbiert.

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Als Träger werden benutzt: Erathrocyten (siehe z.B. die Niederländische Patentschrift 106 360 und die dort erwähnte Literatur), ferner u· a. Bentonit, Collodium, Chole st einkristalle, Quarz und synthetische Harze, wie beschrieben in der Arbeit von R. Weinbach in Schweiz.Z.Path. Bakt. 2.1, 1044 (1958), und endlich auch gewisse Arten von synthetischem Latex, z.B. Polystyrol (s. US-Patentschrift 3 088 875). Insbesondere diese letzteren Arten von Latex finden aufgrund ihrer günstigen konstanten physikochemisehen Eigenschaften weite Verbreitung.

Zum Nachweis des Rheumafaktors werden gewöhnlich Latexpartikel benutzt, die mit menschlichem Gammaglobulin sensibilisiert sind. Es spielt dabei der äusserst günstige faktor eine Rolle, daß nur das an den Teilchen adsorbierte Gammaglobulin mit dem Rheumafaktor reagiert, während das überschüssige Gammaglobulin in der Lösung praktisch die Reaktion nicht stört. Das nicht adsorbierte Antigen macht jedoch im allgemeinen die Agglutinierungsreaktion weniger empfindlich, da es ebenfalls dazu fähig ist, in flüssiger Phase Antikörper zu binden, so dass mehr Antiserum benötigt wird, um das Agglutinieren zu bewirken. Dies ist ein grosser Nachteil, insbesondere bei Methoden, die auf der Verhinderung des Agglutinierens beruhen.

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jüS erscJieint wünschenswert, daß man die Teilchen eine solche Menge Antigen adsorbieren läßt, daß dann nur eine kleine Menge Antiserum (stark verdünnt) ausreicht, um eine klare Agglutinierung hervorzubringen. Mit einem derartigen Reagens kann schon eine sehr geringe Menge des Antigens in der Flüssigkeit festgestellt werden, die mittels Verhinderung der Agglutination untersucht werden soll} mit anderen Worten: man muß versuchen, Mittel zu finden, durch welche sich die Sensibilität dieser immunochemischen Reaktionen verbessern läßt. Ausserdem geht es darum, bei der Herstellung dieser Reagentien derartige Bedingungen zu wählen, daß das Reagens spezifisch für das zu bestimmende Antigen bzw. die entsprechenden Antikörper ist.

Die bisher benutzten Träger zeigen jedoch Erscheinungen, welche die Spezifität und Sensibilität der mit ihnen durchgeführten Schätzungen stark beeinträchtigen. Es ist in diesem Zusammenhang darauf hinzuweisen, daß es auch eine nicht-Bpezifische Agglutinierung bzw. Agglutinierungs~Verhinderung gibt, und zwar aufgrund von Reaktionen, die nicht durch immanochemische Erscheinungen hervorgerufen werden. So wurde beispielsweise beobachtet, daß mit Antigen beladene Teilchen spontan auch in Abwesenheit von Antiserum agglutinieren. In anderen Jfällen wurde gefunden, daß diese Teilchen nicht nur

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nach Vermischen mit spezifischem Antiserum agglutinierten, sondern auch wenn sie mit normalem Serum oder mit Antiserum gegen andere Antigene in Berührung kamen. In wieder anderen Fällen schien die zu einer völligen Agglutinierung benötigte Quantität an Antiserum anormal hoch zu sein. Wahrscheinlich lassen sich diese Erscheinungen erklären aufgrund der physikochemischen Eigenschaften der benutzten Teilchen und insbesondere aufgrund ihrer elektrochemischen Eigenschaften. Durch die Adsorption von proteinähnlichen Substanzen werden die Eigenschaften sehr stark beeinflußt, wobei die Menge und Natur des adsorbierten Materials eine wichtige Rolle spielt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man ein spezifisches und empfindliches Reagens für immunochemisehe Schätzungen herstellen kann, wenn man die suspendierten Teilchen zunächst ein Protein adsorbieren läßt, das gegenüber der Untersuchungsmethode inert ist, und dann erst die Adsorption des Antigens oder der Antikörper bewirkt. Auf diese Weise erhält man ein Reagens, mit dem noch sehr kleine Mengen an Antigen bzw. Antikörpern selektiv bestimmt werden können. Mit dem Ausdruck "inertes Protein" ist hier ein Eiweißstoff gemeint, der nicht an der immunochemischen Reaktion teilnimmt und das Antigen bzw. die Antikörper nicht schädlich

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beinflußt· 3?ür das erfindungsgemäße Verfahren können konjugierte oder niohtkonjugierte Proteine, ausserdem Peptide von verschiedenstem Molekulargewicht und Proteine pflanzlicher Herkunft benutzt werden·

Die erfindungsgemäß behandelten Teilchen ergeben mit dem korrespondierenden Antiserum, selbst wenn dieses in verhältnismäßig grosser Verdünnung vorliegt, eine spezifische Agglutinie rung. Dies bedeutet auch, daß eine Agglutinierungs-Verhinderung möglich ist, wenn in der zu untersuchenden Flüssigkeit sehr viel kleinere Mengen an Antigen anwesend sind, ao daß sich auf diese Weise sehr geringe Mengen, z.B. eine einzige internationale Einheit (I.TJ.) menschliches Choriongonadotropin (HGG) je ml Flüssigkeit nachweisen lassen. Eine I.U. entspricht praktisch 0,1 jag Hormon.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat ausserdem den Vorteil, daß weniger Antigen für die Sensibilisierung benötigt wird und daß die Qualität der Agglutinierung stark verbessert wird, so daß die Umschläge ausgesprochener sind und besser abgelesen werden können, sowie daß die Herstellung von sensibilisierten Teilchen weniger empfindlich und besser reproduzierbar wird. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der folgendet Die Reaktion auf Verhinderung des Agglutinierens kann auf einer Platte mit einer völlig benetzbaren Oberfläche durchgeführt werden (siehe Beispiel 1). Nach-

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dem die Reaktion stattgefunden hat, kann man das Gemisch in horizontaler Lage trocknen lassen· Das Eesuitat kann noch von dem getrookneten Material abgelesen und dieses als Nachweis aufbewahrt werden.

Die Behandlung der Trägerteilchen, die im folgenden stets als "Vorsensibilisierung" bezeichnet wird, wird vorzugsweise wie folgt durchgeführt: die Teilchen werden aus ihrer Suspension durch Zentrifugieren sedimentiert, worauf sie in einer Lösung des inerten Proteins, vorzugsweise in einem Puffer suspendiert werden, wobei eine Adsorption des Proteins an den Teilchen stattfindet. Der nächste Schritt ist die Entfernung des überschüssigen inerten Proteins, die beispielsweise durch Zentrifugieren der Teilchen bewirkt werden kann« Dann wird auf übliche Weise die Adsorption des Antigens bzw. des Antikörpers durchgeführt, die im folgenden stets als "Sensibilisierung" bezeichnet wird. Es hat sich jedoch auch als möglich erwiesen, die Sensibilisierung in der Lösung des inerten Proteins durchzuführen, wobei dann das Antigen bzw. der Antikörper unmittelbar nach der Homogenisierung der Teilchen in der Lösung des inerten Proteins addiert wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit größtem Vorteil auf synthetischen Latex, z.B. Polystyrollatex, Styrol-Butadien-Latex, vorzugsweise solchen mit einer Teilchengröße von

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etwa 0,5 bis 1,3 u, angewendet werden. Es ist bekannt, daß dieser Latex durch Einarbeiten einer oberfläcJienaktiven Substanz stabilisiert werden kann und obgleich, die Suspensionsflüssigkeit vor der Adsorption des Antigens entfernt wird, ist doch sicherlich nicht die gesamte oberflächenaktive Substanz von der Oberfläche der Teilchen verschwunden. Es ist bekannt, daß diese Substanzen Proteine denaturieren können, wodurch, die immunochemischen Eigenschaften der Proteine ungünstig beeinflußt werden können. Nach Anwendung der erfindungsgemäßen Methode waren jedoch keinerlei nichtspeζifisehe Agglutinationen bzw. keine Verhinderung derartiger Agglutinationen bei diesem Latex zu beobachten, so daß der Schluß erlaubt ist, daß derschädliche Einfluß der zurückbleibenden oberflächenaktiven Substanzen bei der Vorseneibilisierung durch das inerte Protein neutralisiert wird, so daß das angewendete Antigen für die Agglutination voll verfügbar ist.

Ausserdem wurde gefunden, daß man ausgezeichnete Resultate erhält, wenn man ein Serumalbumin, z.B. Rinderserumalbumin, oder auch Eialbumin oder Milehalbumin verwendet. Andere inerte Proteine, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, sind beispielsweise Serumglobuline, Hämoglobin und Laktoglobulin. Auch. Gemische aus inerten Pro-

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teinen können verwendet werden. Die Wahl des inerten Proteins hängt ab von der Art der immunochemischen Bestimmung.

Das Mengenverhältnis zwischen inertem Protein und Trägersubstanz und die jeweiligen Konzentrationen, welche die besten Resultate ergeben, hängen ab von der Natur des inerten Proteins, vom Träger und von dem betreffenden Antigen bzw. Antikörper.

Das Verfahren kann bei verschiedenen pH-Werten und in verschiedenen Puffersystemen durchgeführt werden.

Schliesslich hat sich gezeigt, daß die Stabilität des Reagens und die Agglutinierungsreaktion selbst verbessert wird, wenn man die Vorsensibilisierung und/oder die eigentliche Sensibilisierung bei höherer Temperatur, vorzugsweise zwischen 50 und 60⁰C durchführt. Als Reaktionszeit genügt im allgemeinen eine Periode von 1 bis 20 Stunden. Der gleiche Effekt wird erreicht, wenn die Teilchen bei höherer Temperatur bis zu 100° gebrütet (inkubiert) werden, nachdem die Vorsensibilisierung und/oder die eigentliche Senuibilisierunf bei Raumtemperatur durchgeführt waren. Es wurde gefunden, daß nach der Sensibilisierung eine Inkubationszeit von 1 bis 20 Std.,je nach der angewandten Temperatur, eine günstige

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Wirkung hat. Insbesondere wurden bei einer Inkubation von 1 Std. bei 100° (nach dem Sensibilisieren) Teilchen mit ausgezeichneten Eigenschaften erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit Hilfe von festen Trägersubstanzen aller Art durchgeführt werden, wie Bentonitteilchen, Quarzteilchen, Erythrocyten, Cholesterinkristallen, Ionenaustauscherharzen (z.B."Dowex 2-X8" und "Amberlite CG-400^M), unlöslichen organischen i'arbstoffen und Collodiumteilchen. Verwendet man nicht vorbehandelte Träger, so können in dem adsorbierten Antigen oder Antikörper Strukturänderungen auftreten, und zwar durch Anwesenheit von stark aktiven Stellen an der adsorbierenden Pläohe (Adsorptions-Denaturation). Da diese Strukturänderungen sich auf das Agglutinieren der Antigene schädlich auswirken, ist die erfindungsgemäße Vorsensibilisierung, bei welcher die stark aktiven Stellen durch das inerte Protein besetzt werden, von grossem Nutzen bei allen derartigen Trägern. Ausserdem muö auch angenommen werden, daß sich an der Oberfläche der Trägerteilohen tiefe Poren finden, in welchen Antigen adsorbiert wird, das dann nicht mehr mit dem Antikörper reagieren und ein Agglutinieren verursachen kann. Auch an diesem Phänomen erweist eioh der Vorteil der erfin-

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dungsgemäßen Vorbehandlung, durch welche bei der Vorsensibilisierung die tiefen Poren mit inertem Protein ausgefüllt werden.

In der Praxis lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise sehr gute Resultate erreichen, wenn es sich um Bestimmung des menschlichen Choriongonadotropine im Urin schwangerer Frauen handelt. Verwendet man beispielsweise als inertes Protein für die Vorsensibilisierung Rinderserumalbumin und als Träger Polystyrollatex, so erhält man ein Reagens, das ausserordentlich empfindlich und sehr spezifisch ist. Das Verfahren kann auch mit Vorteil verwendet werden bei immunochemischen Bestimmungen, die auf der Agglutinierung von anderen Antigenen oder ihren Antikörpern bzw. auf der Verhinderung dieser Agglutinierung beruhen. Als Beispiel sei erwähnt das Wachstumshormon menschlicher oder tierischer Herkunft, das die SOllikelreifung bewirkende Hormon, Seruaproteine, wie fy -Globulin (zum Nachweis des Rheumafaktors) und Antigene bakteriellen Ursprungs, wie diejenigen von Treponema reiter! und T. pallidum.

Zu den in Präge kommenden Bestimmungen können die Suspensionen der Trägerteilchen, wie sie durch die erfindungsgemäße Behandlung erhalten werden, als solche verwendet wer-

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den, sie können aber auch z.B., durch. Gefriertrocknen, vorher in Pulverform überführt werden. Gegebenenfalls kann man aus derartigen Pulvern Tabletten herstellen, die , zusammen mit den bei der Tablettenherstellung notwendigen Bindemitteln, sämtliche zur Durchführung der immunoehemisehen Bestimmung notwendigen Bestandteile enthalten. Diese Tabletten lassen sich in Pufferlösungen ohne weiteres zu homogenen Suspensionen suspendieren, die für die immunochemischen !Reaktionen geeignet sind.

Die Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung:

Beispiel 1

Es wurde der von den Difco Laboratories, Detroit, Michigan, hergestellte und unter dem Hamen "Bactolatex" in den Handel gebrachte Polystyrollatex verwendet. Aus 10 ml Latex wurden die Teilchen durch Zentrifugieren sediment iert und dann in 10 ml eines 0,14—mol. Boratpuffers vom pH-Wert 8,3» in welchem 2 mg Minderserumalbumin (BSA) je ml

suspendiert.

gelöst waren,/Die Suspension wurde 20 Minuten bei 20° gehalten (inkubiert) und darauf wieder zentrifugiert. Dann wurden die Latexteilchen nochmals^ait 20 ml der Pufferlösung gewaschen

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•und in 10 ml des gleichen Puffers, dem Je ml 100 I.U. HCG zugefügt worden waren, resuspendiert. Das Gemisch wurde nun nochmals 90 Minuten bei 20° inkubiert, worauf die Teilchen aufä Neue zentrifugiert und zweimal mit je 20 ml der Pufferlösung gewaschen wurden. Der auf diese Weise erst vorsensibilisierte und dann endgültig sensibilisierte Latex wurde nun in 6,7 ml einer 0,07-molaren Boratpufferlösung vom pH 8,3, der 4> Sucrose und 0,01 f> Merthiolat zugefügt worden waren, suspendiert. Die sensibilisierten Teilchen können mit Antiserum gegen HGG agglutiniert werden.

Im Nachfolgenden seien einige Methoden beschrieben, die sich für die Durchführung von Reaktionen eignen, die zur Agglutinierung bzw. zur Verhinderung der Agglutinierung führen:

a) 2 Tropfen einer physiologischen Kochsalzlösung, 1 Tropfen des Antißerums gegen HCG, verdünnt auf die gewünschte Stärke mit 0,15-molarem Imidazolpuffer vom pH 7|8 und mit einem Gehalt an 3 # Rinderserumalbumin, und 1 Tropfen der erfindungsgemäß behandelten Latexsuspension werden auf einer Glasplatte mit dem Spatel vermischt und auf einen runden Fleck von 2,5 bis 3 cm Durchmesser verrieben« Man neigt dann die Glasplatte leicht, indem man sie

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langsam von einer Seite zur anderen hin und her rollt. Nach 1 oder 2 Minuten agglutinieren die Teilchen, was ohne weiteres mit dem bloßen Auge zu sehen ist. Bei der Durchführung der Reaktion zur Verhinderung der Agglutinierung wird die physiologische Kochsalzlösung durch die Antigenlö'sung ersetzt.

Nachdem man die Glasplatte 1 bis 2 Minuten bewegt hat, kann sie auf eine horizontale Fläche aufgelegt werden, so daß das Reaktionsgemisch trocknen kann. Auch nach dem Trocknen kann ohne weiteres noch festgestellt werden, ob eine Agglutinierung stattgefunden hat oder nicht. Auf diese Weise können die Versuchsresultate zum späteren nachweis aufbewahrt werden.

b) Gemäß einer anderen Methode arbeitet man mit Zentrifugieren? sie wird wie folgt durchgeführt:

0,5 ml einer physiologischen Kochsalz- bzw. Antigenlösung werden Termisoht mit 0,5 ml Antiserum in geeigneter Verdünnung in einer 0,15-molaren Imidazolpufferlösung vom pH 7,8, der Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 0,1 56 zugefügt wurde. Hierzu gibt man einen Tropfen der Latexeuepeneion, die verdünnt wurde mit der 5-fachen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung. Dann wird

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das Gemisch 1 Stunde "bei 57° inkubiert und daraufhin 10 Minuten mit 1500 Umdr./Min. zentrifugiert. Eine überstehende klare Lösung deutet auf Agglutinierung, während eine trübe Schicht anzeigt,daß keine Agglutinierung stattgefunden hat.

Verschiedene Methoden, um die Agglutinierung sichtbar zu machen, sind unter anderem beschrieben von K.J.Bloch in Bull.Rheum. Dis. % , 185 (1959) und von L.Fleck et al. in Nature 1^4 , 548 (1962).

Bei dem gemäß diesem Beispiel hergestellten latex tritt die Agglutinierung nur mit spezifischen Antisera ein und sie kann verhindert werden mit HOG- in einer Konzentration von 2 I.U. je ml, was die Sensibilität dieses Eeagens* beweist*

Beispiel 2

In einem Boratpuffer mit 4· $> Sucrose und 0,01 $> Merthiolat wurden gemäß Beispiel 1 zwei Suspensionen bereitet. Eine davon wurde einer 20-stündigen Inkubation bei 56⁰C, die andere einer 1-stündigen bei 100°0 unterworfen. Die erhaltenen Suspensionen agglutinieren nur mit spezifischen Anti-

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sera. Die AggititinierungsreaktiOh kaün verhindert werden mit HCG in einer Konzentration von 1 I.ü. «J^e ml. Die letztgenannte Suspension erwies sich, als am. empfindlichsten·

% Ifta&peiision iron Bäctolatek 0,81 wurde wie in Beispiel 1 vbrtfeiisibilisiert mit Rinderserumalbumin und daraufhin 2 StuÄken bei ÖÖ° inkitibiert. ÜTun wurden die Teilchen mit HOG sensitiilisiert, worauf eine 2-stüiidige Inkubation bei 60° statliltnd. Bei der Prüfung auf Ägglutinierung b2*. VerhihderiÄg %er Aggiutinierung er%ies sich das Reagens als sehr spezifisch uiid a^a&eroirdentlich sensibel.

iüAei: iiäch Beispiel 1 wurde,wiö dort beschrieben, vorsensibiliüerl MJi RiMersertimälbOmini worauf er noch 180 Minuten b%i i5° mi* ÄÖG sensibilisieri wurde. Das erhaltene fieagens itggiutiniert nur mit einem spezifischen Antiserum und ist Sehr eipfindlichi

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Beispiel 5

Die Teilchen von IO ml Bactolatex 0,81 wurden durch Zentrifugieren sedimentiert und dann in 5 ml eines 0,14-molaren Boratpuffere vom pH 8,3, worin 4 mg Rinderserumalbumin je ml gelöst waren, suspendiert. Nach. Homogenisieren wurden der Suspension sofort weitere 5 ml des gleichen Puffers zugefügt, worin diesmal 200 I.U. HCG je ml gelöst waren. Nach neuerlichem Homogenisieren wurde die Suspension 90 Minuten bei 20⁰C stehen gelassen. Dann wurden die Teilchen abzentrifugiert und zweimal mit je 20 ml des Puffers gewaschen. Schließlich wurden die gewaschenen Teilchen wieder in 0,07-molarem Boratpuffer vom pH 8,3 mit 4 $> Sucrose und 0,01 ⁰Jo Merthiolat suspendiert und Iu Stunden bei 56⁰C inkubiert.

Beispiel 6

Die Teilchen aus.20 ml Bactolatex wurden durch Zentrifugieren sedimentiert und dann in 20 ml 0,14-molarem Boratpuffer vom pH 8,3, worin 2 mg Rinderserumalbumin je Liter gelöst waren, suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde inkubiert, zentrifugiert und gewaschen wie in Beispiel 1

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und dann in 20 ml Puffer, dem 100 ug menschliches wachstumshormon (HG-H) je ml zugefügt worden waren, suspendiert. Fun ließ man die Suspension 2 Stunden bei 2ü stehen, worauf die i'eilchen wieder abzentrifugiert und zweimal mit je 3ü ml der Pufferlösung gewaschen wurden. Der so behandelte Latex wurde in 14 ml 0,07-molarem Boratpuffer vom pH 8,3 mit 4 5& Sucrose und 0,01 $ Merthiolat suspendiert.

Die·sensibilisierten Teilchen können nur mit spezifischem Antiserum agglutiniert werden. Diese Agglutinierung kann verhindert werden mit HGH in einer Konzentration von Of5 ug je ml.

Beispiel 7

Mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Methode wurde Bactolatex einer Vorsensibilisierung mit Eialbumin unterworfen, wobei das Albumin in einer Konzentration von 6 mg je ml zur Anwendung kam. Die so erhaltene Suspension wurde dann mit HCG- gndgültig sensMHeiert, wie oben beschrieben, und ergab ein Reagens, das mit spezifischem Antiserum agglutiniert werden kann. Diese Agglutinierung kann bereits verhindert werden mit HOG- in Konzentrationen von 1-3 I.U. je ml.

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Beispiel 8

Mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens wurde Bactolatex vorsensibilisiert, und zwar diesmal mit
Lactalbumin in einer Konzentration von 2 mg je ml anstelle des Rinderalbumins. Die so erhaltene Suspension wurde sensibilisiert mit HCG in einer Konzentration von 100 I.TJ. je ml. Dieses Reagens agglutiniert ebenfalls nur mit spezifischem Antiserum, während eine Verhinderung der Agglutinierung bereits stattfindet mit HCG-Konzent rat ionen von wenigen I.U. je ml.

Beispiel 9

Analog Beispiel 1 wurden Latexteilchen vorsensibilisiert mit Eialbumin in einer Konzentration von 6 mg je ml und daraufhin endgültig sensibilisiert mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 300 ug je ml. Dieses Reagens kann mit Antiserum gegen Rinderserumalbumin agglutinieren. !Für die Agglutinierungsreaktion wird das Antiserum verdünnt mit einem Puffer f dem 3 % Bialbumin zugesetet sind. Die Agglutinierung wird bei einer gewissen Antiserumverdünnung verhindert durch Konzentrationen von 0,3 jig Rinderserumalbumin je ml.

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Beispiel 10

Eine Suspension von Latexteilchen (Hersteller Dow Chemical Company, Midland, Michigan) mit 0,56 μ Durchmesser und in einer Konzentration von 1,25 $> wurden vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin und dann gemäß Beispiel 1 endgültig sensibilisiert mit HCG. Auf gleiche Weise wurden Latexteilchen von 0,80 li Durchmesser (Hersteller wie oben) vorsensibilisiert und endgültig sensibilisiert.

Auf die gleiche Weise wurde ein Latex mit Teilchen von 1,3 u. Durchmesser (Hersteller wie oben) mit Hinderserumalbumin und HCG behandelt. Die Reagentien waren äußerst empfindlich und voll spezifisch.

Beispiel 11·

Dow-Latexteilchen von 0,8Ou Durchmesser wurden gemäß Beispiel 1 vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 1 mg je ml und daraufhin sensibilisiert mit menschlichem J/ - Globulin in einer Konzentration von 300 Mg je ml. Mit diesem Reagenz kann eine Agglutination erreicht werden mit Pferdeserum gegen menschliche Serumproteine und mit menschlichen Sera, die den HBumafaktor enthalten·

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Beispiel 12

Auf die oben "beschriebene Art wurden Dow-Latexteilchen von 0,80 u Durchmesser vorsensibilisiert mit Rinder serumalbumin in einer Konzentration von 2 mg je ml und dann endgültig sensibilisiert mit Follikelreifungshormon mensohlichen Ursprungs in einer Konisentration von 100nfe ml. Das Agglutinieren kann veranlaßt werden mit einem spezifischen Antiserum und es kann verhindert werden durch das Hormon in einer Konzentration von etwa 1 Ug je ml.

Beispiel 13

Bactolatex wurde vorsensibilisiert mit Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 2 mg je ml und sensibilisiert mit der Euglobulinf rakt ion eines Kaninchenantiserums gegen HCG- in einer Konzentration von 5 Mg je ml.

Beispiel 14

Gemäß der Vorschrift von J. Bozicevich in Immunochemical Methode (Blackwell Scientific Publications, Oxford 1964) wurde eine Bentonitsuspension bereitet. Für dieses Verfahren

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diente der sogenannte Natrium-Bentonit als Ausgangsmaterial. Die Suspension wurde in einer Konzentration von 2 <f» mit Rinderserumalbumin vorsensibilisiert, welch letzteres in einer Konzentration τοη 1 mg je ml verwendet wurdej die endgültige Sensibilisierung erfolgte mit HCGf- in einer Konzentration von 200 jag je ml gemäß Beispiel 1.

Beispiel 15

1 ml einer !Obigen Lösung von Mastix in absolutem Alkohol wurde unter kräftigem Rühren zu 24 ml eines 0,1-molaren Boratpuffers vom pH 8,2 zugegeben (siehe A.A. Pit, Ned. T. Geneesk. 103, 2310 (1959)). 2 ml der so erhaltenen Suspension wurden vermischt mit 0,3 ml 35&igem Rinderserumalbumin und dann mit 0,2 ml HCG- in einer Konzentration von 750 I.TJ. je ml. Nach Inkubation von 20 Stunden bei 20⁰O wurde die so vorbereitete Suspension ohne weitere Behandlung verwendet. Mit Anti-HCG—Sera kann man eine spezifische Agglutinierung hervorbringen* HOU in einer Konsentration von 3 bis 5 I.U. je ml kann das Agglutinieren verhindern, wenn man die korrekte Antiserumverdünnung wählt.

Patentansprüche

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Claims

itOWCHEN 8 rsi/HWEIGERSTRASSE B TILIOHIHMAIIRESHK: I'BOTKCTPATENT 1A-31 482 Patentansprüche

1. Reagens für immunochemisehe Bestimmungen mit fein verteiltem festem Träger, dadurch gekennzeichnet , daß die 'feilchen des Trägers außer einem Antigen oder einem
Antikörper mit einem inerten Protein überzogen sind, das
nicht an der immunochemischen Reaktion teilnimmt.

2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein synthetischerLatex ist.

3» Reagens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der latex ein Polystyrollatex mit einem Teilchendurchmesser von etwa 0,5 bis 1,3 Micron ist.

4* Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Protein ein Serumalbumin, Bialbumin
oder Milchalbumin ist.

5. Reagens nach Anspruch I₉ dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen menschliches Ohoriongonadotropin ist.

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6. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Teilchen des Trägers in einem flüssigen Medium suspendiert sind.

7. Verfahren zur Herstellung eines Reagens-*nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß man einen fein verteilten festen Träger an seiner Oberfläche ein Protein adsorbieren läßt,, das gegenüber der immunochemischen Reaktion inert ist und an dieser nicht teilnimmt, worauf man den so vorbehandelt en Träger ein Antigen oder einen Antikörper adsorbieren läßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in einem flüssigen Medium suspendiert ist»

9« Verfahren naoh Anspruch 7, dadurch gekennzeich net, daß die Adsorption bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 60° C durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß der beladens Träger weiterhin 1-20 Std. lang einer Inkubation bei einer Temperatur von 20 bis 100° unterworfen wird.

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11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß der '!'rager ein synthetischer Latex , insbesondere Polystyrol mit einer Teilchengröße von etwa 0,5 bis 1,3 Micron.ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß das inerte Protein ein Serumalbumin, ein Ei albumin oder ein Milohalbumin ist.

13* Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß das Antigen menschliches Choriongonadotropin ist.

ORIGINAL INSPECTED

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