DE1543431A1 - Verfahren zur Herstellung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion - Google Patents

Description

Patentanmeldung betreffend

VERFAHREN ZUH HERSTELLUNG VON ANDROSTA-1,4-DIEi:~3,17-

der Firma

Richter Gedeon Vegyeazeti Gyar R.T., Budapest X, Cserkesz utca

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Androsta-l_l4-dien-3,17-dion auf mikrobiologischem Wege·

Ee ist bekanntlich ein wichtiges Problem der pharmexeutisehen Industrie, Rohmaterial für die Herstellung von Steroiden zu sichern. Im tier !gehen Organismus entstehen Steroidverbindungen hauptsächlich aus Cholesterin. Das Cholesterin steht bei einem relativ niedrigen Preis in grossen Mengen zur Verfügung. Es kann dadurch erklärt werden, dass die mikrobiologische Umsetzung des Cholesterins durch Abbau der Seitenkette zwecks Herstellung der entsprechenden Steroid-

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Grundverbindung sohon seife langem angestrebt wurde. (G, Arnaudi, Ixperientia Z, ⁸¹ /1951/)· All diese Versuche haben . aber versagt, und zwar wahrscheinlich darum, weil eich der Ring A viermal schneller abbaut und zu COg abbrennt, als die Seitenkette (Th. C. Stadtman, A. Oherkes, Ch. E. Anfinseni J. Biol, Chem. 206. 511 /1954/). Das Problem ist auch dadurch kompliziert, dass das Cholesterin in der Anwesenheit von Sauerstoff in wässrigen Suspensionen verschiedenen Umsetzungen auegesetzt ist, und die auf diese V/eise gebildeten Produkte unter dem Einfluss der Ensyme des Mikroorganismus durch verschiedene weitere Umsetzungen vielerlei und nur in Spuren anwesende Produkte liefern, währenddem das Molekül vollständig metabolysiert wird (F· J. Loomeiyers Biochim. Biophye. Acta 29« 168 /1958/)· Es wurde bewiesen, dass in diesen Abbaustufen Androsta-l,4-dicn-3,17-dion und 9_f10-seco-östra-l,3»5(10)- -trien-3-el-9,17-dion entstehen (K. Schubert, K,H. Böhme, C. Hörhold: Naturwissenschaften £2, 20 /1965/). Falls 8-Oxychin öl in als Inhibitor gegen Üboroa^dation verv/endet wird (Britische Patentschrift Nr. 918 960), können Abbauprodukte mit einem intakten Steranskelett, so z.B. 3-Keto-bisnorchol« -4-en-säure, jJ-Keto-bisnorchola-lj^dien-säure, Androst-4- ~en-3,17-dion und Androsta-1,4—dien-3_f17-dion durch Papierehromatographie in kleinen Mengen nachgewiesen v/erden (J.M. Whittmarsh: Bioehem. J. %&, 232. /1964/).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden· dass mit Hilfe von Myeobacterium smegmatis als Mikroorganismus und Cliolest-4-on->-Gn als Substrat, unter bestimmten Fermente·· tionsbedingungen Androsta-1,4—dien-3#17-dicai oii* einer Aue-

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¥©a:% aw. % intfctifctf* Anderseits überschreitet die

wohl nicht 1 bis 2 %, falls als Substrat Cholesterin verwendet wird.

Erfindungsgemäss erhält man Androsta~l,4~dien-3>,17- -dion, wenn man

Cholest-4-en-3-on unter aeroben Fermentationsbedingungen mit Kulturen von auf einem halbsynthetischen Nährboden gezüchteten Mycobaoterium smegmatis (deponiert am 5» März 1965 beim Institut für Gesundheitswesen zu Budapest unter der Kummer 27) in der Anwesenheit von Chinolinderivaten behandelt.

Es wurde schon friuiar bewiesen, dass der mikrobiologische Abbau des Steranskeletts durch verschiedene bi- und .trizyklische Verbindungen verhindert wird (Britische Patentschrift Kr. 918 960), Im Falle der erfindungsgemassen Umsetzung hat sich von diesem Gesichtpunkt aus das 8-Oxychinolin als das vorteilhafteste bewiesen. Für ähnlichen Zweck können aber auch andere Chinolinderivate, wie z.B. J-läethyl-e-oxychinolin, 7-Methyl-8~oxychinolin, 8-Oxychinolin-7-karbonsäure, 5-Aceto- -8-oxychinolir, 5-Butyro-S-oxych.inolin, ^-Isovalero-e-o^chinolin, ^Chloro^-jodo-S-oxychinolin (Vioform), 8-0xychinolin- -echtblau-asoderivat usw. verwendet werden.

Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens geht man zweckmilssig derart vor, dass das Fermentationsmedium nach der Züchtungsperiode, doch vor der Umsetzungsperiode ausgetauscht wird. Nämlich falls die Zellen in dem ursprünglichen Nährboden bleiben wurden, dann würden sich
verschiedene Oxydationsprodukte auch in der Anwesenheit von

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inhibierenden Verbindungen anhäufen, und so würde die Konzentration des Androsta-l|4-dien-3»17*-dione den erwünsohten hohen Wert nicht erreichen. Wenn aber die Zellen nach der Inkubierungsperiode Ia sterilem Wasser suspendiert werden, dann werden die Neben-· _% reaktionen zurückgedrängt, und neben wenigen Androst-4-en-3,17- -dion wird das Androsta-l,4-dien-3_f17-dlon in einer verhältnisaäseig hohen Konzentration erhalten. Anstatt Wassers kann eine 0,4 - 0,9 £ige NaCl-Lösung als ßuspendierungsmedlum noch vorteilhafter verwendet werden.

Die Wirksamkeit der Umsetzung wird stark erhöht, wenn das Nährboden PolyäthylensorMtan-monooleat oder Polyäthylenaorbitan-trioleat, d.h. eine Tween 80, 81, 85 uev7. -lösung enthält, sweekmässig in einer Menge von 0,1 - 0,2 %. Duroh die auf diese Weise gezüchtete Kultur wird das 0holest-4-en-3~on sohneller Betabolyeiert, wodurch die Menge des nützlichen Produktes

sunlmmt.

Es ist zweckmässig, das Oholest-4-en-3~an in einer Konzentration von 20-100 mg/100 ml zu verwenden· Me industrielle Verwendbarkeit des erfindungsgemässen Verfahrene ist duroh den Umstand, dass die für eine Umsetzung einmal sohon verwendete Kultur, nach Trennung von der als Produkt erhaltenen, Androsta- -l,4-dien-3,17-dion enthaltenden Fermentlösung und Suspendieren in einer neuen Salzlösung für Abbau von Cholest-4-en-3-an wieder verwendet werden kann, vorteilhaft erhöht.

He es schon oben erwähnt wurde, ist die Anwesenheit . einer Tween-Sorte in der Züchtungephase vom Gesichtspunkt der Umsetzung «us sehr vorteilhaft. Falls Luft durch die tweenhaltlge wässrige Lösung geblasen wird, kann eine starke Schaumbildung

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b«obf*ht·* wevden, Deafcalb let ·β b«i Züchtung in ein·* Ή» vorteilhaft, wann auf dit Oberfläche dtr gerührten Kultur luft geblasen VlVd₉ weil auf ditae Wtlae tint genügende liens« all ßaueretoff für Waahatua dta Ityeobaoterium aaegiiatia gelie·

JbMl die ZuaasMnaetaung der Hährlöaung let bei indu-

•tffUHen fermentationan waa«ntllah· Tür Züohtung dea Organia« ■tta b*wlaa#n aiah dl· folgenden Hährlöauneen «la aahr vorteil*

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Die Nährlösung wurde in Ertenmeyer-Iolben voa 4· 900 al aufgeteilt, bei Ia⁰O 20 Miauten lang in einem Autoklav eteri-1 leiert, oder 5 Liter NährHJeung wurden in einen <Ua*ferm«ntor alt einem Hauminhalt von 10 Uter gefüllt und bfi IU⁰O 45 Minuten lane etejffUifliert· Di« geimpften lolbea wurdea tai 2B⁰O

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oder bei 37$ 2»} Tage lang auf einer BohfittelaaeeMÄ· inkobiert· Whrend der Inkubation wur4e» die Kolben aa eine» Knlebahm mit einer ftwentri.ität ym Z cm, alt ti*·* öreliaaia τοη JOOAUAVt· geeahüttelt. de Kulturen wurden In eine« faraaato* bei äballehav temperet» mit einer irmdrehungifhl toa 300-400

4nanb4a»t, md 0,2 m i,o YoluaeatfU

UtW ntel0m«i wurd· «ut die Oberfläane der Kul

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Dar Vorteil de« erfiiidungegemaeeen Verfahrene ist, dass os ermöglioht, «na 0holeet-4-en-5-on das (!rundmaterial der östron- * fabrikction, das leicht In östron umsetsbsre Androsta-1,4- *dien-5,17-dion hersustellen· Bis jetst wurde das Androsta-•l₉4-dien-5|17*dion aus Progesteron, bsw· aus Androst-4-en- -3,17-dlon hergestellt, also war schon das Ausgangsmaterial •ta relativ kostbares Steroid, welches durch einen mehrstufigen qynthesenproseas aus Ergosterin oder Steroidsapogenin oder aus Steroid-Alkaloiden (Diosgenin, SolasodIn, Tomatidln, etc·) gewonnen wurde. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren 1st dieser kostspielige ßjntheeenproze3B su vermeiden und es wird ermöglicht, das überall in grossen Mengen sur Verfügung stehende Cholesterin In ein billiges Steroid-Grundmaterlal su verwandeln. Die Bedeutung des entstehenden Androata-l,4-dien-3,17- -diona besteht nicht nur darin, dass man durch diese Verbindung su östron* bsw« su dessen Derivaten gelangen kann, sondem wird auch die Herstellung von Antlkonslpienten und anabolieohe&Mitteli bedeutend vereinfacht· Diese Verbindungen ge-

hören ««Η^^ΐι grösetenteile su den 19-nor-Steroiden. Die letstgensnnten Verbindungen sind aber aucii von östron vorteilhaft hersustellen·'

Die nachstehenden Beispiele erläutern das erfindungsgemasse Verfahren:

Beispiel 1

In swel Erlenmeyer Kolben von 500 ml wurden vor Impfen su je 100 ml steril Nährlösung III, je 200 mg Tween 80 zugegeben und dieselbe mit je 1 ml einer 5>tägigen Schrägagar-Kultur mit 10 ml Bouillon suberelteten Hycobacterium snegmatls-Sus-

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pension geimpft. Gezüchtet wird 3 Tage lang bei 2.8⁰O, geschüt- \ teltj Die gewachsenen Kulturen wurden sedimentiert und nachher die Hährlöoung mit steriler 0,4%iger NaCl-Lösung gleicher Ilen- ' ge ausgetauscht. Zu dem einen Kolben wurde 20 rag, zu dtn ende-· ren 60 mg Cholest-4-en-3-on, in 1 ml Äthanol gelöst* und zu * beiden 7,2 - 7»2 mg Oxyohinolin in 0,5 ml Azeton gelöst zug·* geben. Die Kolben wurden bei 37⁰O geschüttelt undzwar der erste 48 Stunden lang, und der andere 72 Stunden lang inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen zweimal mit 25 al Diehloräthan extrahiert, das Extraktum mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert, von dem Extraktum des ersten Kolben 12,5 ml» von zweiten 3 ml eingedampft· Die eingedampften Reste wurden in 2 al Azeton aufgenommen und von dieser Lösung 100 /Ul auf Maoherey-Nagel 214 Papier zur quantitativen Papierchromatographie auf getropft* Es wurde in dem ersten Kolben 6,8 ag> in dem zweiten 21 mg AndroBta-l_f4-dien-3,17-<iion gemessen« Dies enteprloht einer Ausbeute von 46, bzw· 35»5 %*

Beispiel 2

In 10 parallelen Erlenmeyer Kolben von 500 Bl wurde je 100 ml steriler Nährboden II, laut Beispiel I₉ geiapft und ent* wickelt· Die Nährlösung wurde mit 0,4 % NaCl-Lösung gleicher !!enge ausgetauscht und zu jedem Kolben je 20 mg Choleet-4-βη- -3-on in je 1 ml Äthanol gelöst zugegeben· Zu jedes Kolben wurden gleichzeitig die folgenden Hemmstoffe dosiert· -

• *

1) 7,2 Bg 8-Oxychinolin in 0,5 ^l Azeton gelöst

2) 4 mg 3-Methyl-8-orychinolin in 0,5 ml Azeton gelöst

3) 4 mg 7-Methyl-3-oxychinolin in 0,5 ul Azeton gelöst

4) 3 ag 8-0xychinolin-7-0arbonsäure in 3 ml Wasser gelöst

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5) 4 ag 5-Azeto~t3-oxychinolin in 0,5 ml Azeton gelöst

6) 3 iag 5-Butyro-8-oxychinolin " 0,5 ml " "

7) 4 mg 5-Isovalero-8-oxychinolin in 0,5 ml Azeton gelöst

8) 7,2 mg 5-Chlor-7-jod-8-oxychinolin (Vioform) in 3 ml Wasser

gelöst

9) 4 mg e-Oxychinolin-Echtblau-Azo-Verbindung in 0,5 ml

Azeton gelöst

Die Kolben wurden nachher bei 37°0 geschüttelt 48 Stunden lang inkubiert. Das in den Kolben entstanden« Andrpsta-1,4-dien- -3,17-dion wurde laut Beispiel 1, extrahiert und bestimmt.

Die erhaltenen Werte

Kolbens Androsta-l_f4-dien-3,17-dion

Ii 6,6 mg

2; 6,4 mg

3; 6,7 mg

4; 6,5 mg

5ί 6,5 mg

Si 6,7 mg

7i 6,4 mg

8i 6,6 mg

9i 6,7 mg

10* O₁8 mg

Dieser Versuch beweist, dass die Oxychinolin-Derivate die Anhäufung von Androsta-l,4-dien-3_t17~dion bedeutend fördern·

Beispiel 3

Die in 5 parallelen Erlenmeyer Kolben von 500 ml verteilte sterile Nährlösung III wurde mit je 1 ml einer Myeobacterium smegmatis-Suspension geimpft, die dem Beispiel 1 entsprechend zubereitet ist. In die Kolben wurden verschiedene, in 10%iger wässeriger Lösung sterilisierte (121⁰O,

20 Minuten), Tweens zugegeben, in einer Menge von je 100 mg,

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Kolbe Nr; 1. mit Tween 60 ¹¹ Nr; 2 "80

¹¹ Nr. 3 "81

" Nri 4 "85

" Nr. 5 ohne Tween

Die Entwicklung dauerte bei 37⁰O geschüttelt 48 Stunden. Die Nährlösung wurde auf 0,4%ige sterile NaCl-Losung von gleichem Volumen ausgetauscht und mit 20-20 mg Cholest-4— en-3-on in 1 ml Ithanol und 7|2 mg 8-0xychinolin in 0,5 ml Azeton gelöst versetzt» Die Kolben wurden bei 37⁰C geschüttelt 48 Stunden lang weiter inkubiert. Das entstandene Atidrosta-1,4-dien- -3fl7-dion wurde laut Beispiel 1 extrahiert und bestimmt.

Die erhaltenen Werte:
Nr. des Kolbens . Androsta-l,4-dien-3,17-dion

Ii ' 3,6 mg

2i 6,5 mg

3; 6,3 mg

4; 6,8 mg

5. 1,6 mg

Das Beispiel beweist, dass die Umsetzung in Gegenwart von Tween 80, 81 oder 85 bedeutend günstiger ist·

Beispiel 4 \

5 Liter Nährl ös'.ro.g I wurde in einem Glasferment or von 10 Liter 45 Minuten lang sterilisiert· Es wurde nachher mit 100 ml 3tägiger bei 28⁰O entwickelter Kultur (nährlösung und Impfstoff, wie in Beispiel 1) geimpft und 100 ml lOJ&Lge sterilisierte Tween 80-Lösung zugesetzt· Die Temperatur des Fermtntors wurde auf 37°0 gehalten: die Menge der Luft war 5 Liter/Minute und die Umdrehungszahl des Rührwerkes 300/Minute· Die während zwei Tagen entwickelte Kultur wurde nach Abstellen des Rührens segmentiert und die Nährlösung auf .

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0_t4£ige sterile HaCl-Lösung von gleichem Volumen getauscht· ,Bs

wurde 1 g Chole8t-4-en-3-on und 560 mg '8-Oxychinolin in 50 ml Äthanol gelöftt zugesetzt. Die Fermentation wurde 48 Stunden lang unter den bei der Züchtung beschriebenen Verhältnissen weitergeleitet· Die Fermentationsflüssigkeit wurde zentrifugiert» das FiItrat 3mal Mit 800 Bl Dichloräthan extrahiert, 12,5 ml dieser Löeung wurde eingedampft und laut Beiepiel 1, der indrosta-1,4- -dien-3,17-dion-Inhalt bestimmt· Das !Resultat der Bestimmung

«ar 280 mg«

Die Htuptmenge des Srtraktums wurde in Vacuum eingedampft· Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und die unlösbare Verunreinigung filtriert. Kachher wurden die löslichen Komponenten Ewiechen Methanol (mit 20% Wassergehalt) und Fetroläther verteilt. Mit der Petroläther-Phase wurden die apolaren Verunreinigungen entfernt« Me wässerige Methanol-Phase wurde auf ein kleines Volumen eingedampft, mit Wasser gemischt und nachher mit Diehloräthan Behrmal extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, entwässert und zur Trockne eingedampft. Es wurde 300 mg jp -Naphthol in 6 ml Dichloräthan bei Erwärmen belöst, mit dem vorigen Rückstand gemischt und durch Wärmen gelöst _α Die Lösung wurde 24 Stunden lang bei O⁰C gehalten und die auskristallisierte Androeta-l_t4~dien-3,17-dion- Ä -Naphthol Molekül verbindung filtriert (Fp. 168-170°C) und in 100 ml Dichloräthan gelöst· Die Lösung wurde mit l&Lger wässeriger NaOH-Losung zwecks Entfernung des £ -Naphthols extrahiert« Die Dichloräthan-Lösuag wurde eingedampft und der Rückstand aus geringer Menge Äther kristalli-

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siert» Dae kristallisierte Androsta-l,4-dieii-3|l'7-<iion wurde filtriert und getrocknet·

Fp. 139-142°C; /"»X_7_D : 115 (c = 1 ,Chloroform) MeOH . „_fc«_{m/tt log}^ . _4>21;

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Claims (2)

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Androsta-1,4-dien- -3il7-clion auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, dass Cholest-4~en-3-on unter aeroben Fermentationsbedingungen mit Kulturen von auf einem halbsynthetischen Nährbodeo. gedichteten Mycobacterium smegmatis (deponiert am 5. März beim Institut für Gesundheitswesen zu Budapest unter der Nr. 27) in der Anwesenheit von Ohinolinderivaten behandelt wird·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der zum Züchten des Mycobacterium smegmatis verwendeten halbsynthetischen Nährlösung eine separat sterilisierte Polyosqsräthylensorbitan-uciiooleat- oder Polyoxyäthylensorbitan-trioleat-Lösuns £Uge3eben wird.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung mit in einer 0,4 - 0,9%igen NaCl-Lösung suspendierten Kulturen von Mycobacterlum smegmatis durchgeführt wird·

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