DE112015007252T5

DE112015007252T5 - Verfahren zur herstellung eines crassocephalum crepidioides extrakts, damithergestellter extrakt und verwendung des extrakts

Info

Publication number: DE112015007252T5
Application number: DE112015007252.7T
Authority: DE
Inventors: Dai-Hua Tsai; Tzung Hsien Lai; Tsui Hsu Chan; Yuh Shan Chung; Li-Chuan Hsu
Original assignee: Development Center for Biotechnology; DCB USA LLC
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2018-09-27
Also published as: JP6627141B2; US10980853B2; CN108778302A; CN108778302B; SG11201805618UA; JP2019503370A; WO2017116476A1; US20190060382A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Zubereitung eines Crassocephalum crepidioides Extrakts, und den dadurch hergestellten Extrakt. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung/Kombination, welche den Crassocephalum crepidioides Extrakt enthält. Die Verwendung des Extrakts und der Zusammensetzung/Kombination mit dem Extrakt bei der Prävention oder Behandlung von Krebs wird ebenfalls bereitgestellt.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Kräuter-Arzneimittel-Extrakts von Crassocephalum crepidioides, und die Verwendung des Crassocephalum crepidioides Extrakts bei der Behandlung und Prävention von Krebs in einem dieses benötigenden Individuum.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs ist eine Hauptursache von Todesfällen. Das Hauptaugenmerk von Studien in der modernen Medizin, Arzneimitteln und Forschung richtete sich auf eine wirksame Behandlung. Herkömmliche Krebs-Behandlungen beinhalten chirurgische Eingriffe, Chemotherapie und gezielte Therapie. Tumorgewebe wird zuerst mittels eines chirurgischen Eingriffs weggeschnitten. Verbleibende Zellen werden dann mittels Chemotherapie und gezielter Therapie abgetötet. Eine derartige Behandlungsabfolge ist jedoch für Krebs-Patienten im Endstadium bei weitem nicht ausreichend. Die Überlebensraten und die Lebensqualität von Krebs-Patienten im fortgeschrittenen Stadium kann durch herkömmliche Behandlungsmethoden nicht verbessert werden.
Kürzlich wurde bei klinischen Studien beobachtet, dass der Behandlungseffekt bei Krebs-Patienten, welche als Adjuvans-Therapie (unterstützende Therapie) Kräuter-Medizin erhielten, erheblich gesteigert wurde, dass Kräuter-Medizin toxische Nebenwirkungen der Chemotherapie verhindern oder reduzieren kann, um die Auswirkungen der Chemotherapie zu verbessern, und dass Kräuter-Medizin eine Immunantwort der Patienten steigern und die Erholungsphase nach dem chirurgischen Eingriff reduzieren kann. Darüber hinaus wurde gefunden, dass Kräuter-Medizin alleine verwendet werden kann, um Patienten zu behandeln, für die ein chirurgischer Eingriff und/oder Chemotherapie ungeeignet sind.
Crassocephalum crepidioides ist als essbare Pflanze bekannt, die traditionell als eine Kräuter-Medizin zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, Bluthochdruck, Kopfschmerzen, Erbrechen, Ödeme, Verstopfung usw. verwendet wurde.
Lie-fen Shyur et al. ( US 8,048,455 B2 ) offenbart einen Extrakt von Crassocephalum crepidioides und fand, dass der Crassocephalum crepidioides Extrakt einen besseren Effekt bei der Inhibierung des Wachstums von Melanoma-Zellen in C57BL/6J Mäusen aufwies als Cisplatin (als chemotherapeutisches Mittel). Lie-fen Shyur et al. fanden weiter, dass die in dem Crassocephalum crepidioides Extrakt enthaltene aktive Komponente eine Galactolipid-Verbindung mit dem Namen 1,2-Di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) ist, und dass dLGG die Expression und Herstellung von iNOS, COX-2 und PEG2 in einer Makrophagen-Zelllinie inhibieren kann.
Lie-fen Shyur et al. ( US 2014/356301 A1 ) offenbaren weiter einen Galactolipid-angereicherten Pflanzen-Extrakt, der durch Extrahieren einer Pflanzenprobe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gynura divaricata subsp. formosana (Asteraceae), Murdannia bracteata (C. B. Clarke) J. K. Morton ex D. Y. Hong (Commelinaceae), und Crassocephalum rabens S. Moore (Asteraceae) mit einer Anzahl an Lösungsmitteln hergestellt wurde. Diese Anmeldung liefert weiter eine Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung von akuter fulminanter Hepatitis und Sepsis und verwandter Formen davon, und zum Bleichen von Haut, welcher den Pflanzen-Extrakt oder einen gereinigten Inhaltsstoff davon und einen pharmazeutischen, gesunden oder Nahrungsmittel annehmbaren Träger enthält.
Chien-Yung Lee ( US 2004/0013748 A1 ) offenbaren eine Kräuter-Kombination zur Behandlung von Nieren- und Pankreas-Krebs, welcher Jiatonghao (Crassocephalum crepidioides), Fuling, usw. umfasst.
YOKO ANIYA ( WO 2008/105436 A1 ) offenbart einen Extrakt aus einer in Okinawa natürlich gewachsenen Pflanze, d.h. Crassocephalum crepidioides S. Moore. YOKO ANIYA fanden, dass der Extrakt den Tumor-Nekrose-Faktor-a und die Prostaglandin Syntethase-2 inhibieren kann.
Die Identifizierung neuer Kräuter-Extrakte. die zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden können ist erforderlich.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem Gesichtspunkt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts von Crassocephalum crepidioides.
Ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft den Crassocephalum crepidioides Extrakt, erhältlich aus dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung.
Noch ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die den Crassocephalum crepidioides Extrakt enthält.
Noch ein anderer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Kombination, die den Crassocephalum crepidioides Extrakt und ein chemotherapeutisches Mittel umfasst.
Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Krebs eines diese benötigenden Individuums bereitzustellen, welches umfasst, Verabreichen dem Individuum den Crassocephalum crepidioides Extrakt der Erfindung allein oder in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel. Die vorliegende Erfindung liefert weiter die Verwendung des Crassocephalum crepidioides Extrakts oder der Zusammensetzung/Kombination mit dem Extrakt bei der Behandlung und Prävention von Krebs eines diese benötigenden Individuums.
Andere Gesichtspunkte und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den anliegenden Ansprüchen ersichtlich.
Figurenliste

1 zeigt das HPLC Muster des Crassocephalum crepidioides Extrakts der vorliegenden Erfindung.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung, den Beispielen, und den Tabellen mit deren jeweiliger Beschreibung besser verständlich. Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten Begriffe (einschließlich technischer und wissenschaftlicher Begriffe) die gleiche Bedeutung, wie sie vom Durchschnittfachmann, an den sich die Erfindung richtet, normalerweise verstanden werden. Es wird weiter klar sein, dass Begriffe, wie jene in herkömmlich verwendeten Lexika definierte, gleich mit deren Bedeutung im Zusammenhang mit der jeweiligen Technik definiert werden und nicht in einer idealisierten oder übermäßig formalen Weise interpretiert werden, außer dies ist hier explizit angegeben. Es sollte auch klar sein, dass die hier verwendete Terminologie lediglich zum Zwecke der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und keine Einschränkung darstellen soll.
Es ist anzumerken, dass wie in der Beschreibung und den anliegenden Ansprüchen verwendet, die Singular-Formen „ein,“ „eine“ und „der/die/das“ die Pluralfomen mit umfassen, außer im Zusammenhang ist explizit etwas anderes angegeben. D.h., außer wenn im Zusammenhang etwas anderes gefordert wird, sollen Singular-Formen den Plural und die Plural-Begriffe sollen den Singular mit umfassen.
Häufig werden Bereich hier ausgedrückt als von „etwa“ einem bestimmten Wert und/oder bis „etwa“ einem anderen bestimmten Wert. Wird ein derartiger Bereich ausgedrückt, dann beinhaltet eine Ausführungsform den Bereich von dem einen bestimmten Wert und/oder zu dem anderen bestimmten Wert. In vergleichbarer Art und Weise, ist klar, dass wenn Werte durch Verwendung des Worts „etwa“ als Annäherungen ausgedrückt werden, der bestimmte Wert eine andere Ausführungsform bildet. Es wird weiter klar sein, dass die Endpunkte eines jeden der Bereiche wesentlich sind in Bezug zu und unabhängig von dem anderen Endpunkt. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „etwa“ ± 20%, vorzugsweise ± 10%, mehr bevorzugt ± 5%, und noch mehr bevorzugt ± 1%.
Die Herstellungsverfahren
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts von Crassocephalum crepidioides, welches die Schritte umfasst:

(a) Inkontakbringen der Crassocephalum crepidioides Pflanze mit 70% Ethanol, um eine Suspension zu erhalten;
(b) Abtrennen des festen Teils in der Suspension von dem flüssigen Teil, und dann Gewinnen des flüssigen Teils, um einen Roh-Extrakt zu erhalten;
(c) Verdünnen des Roh-Extrakts auf einen 60 % Ethanol-Extrakt;
(d) Vermischen den 60 %-igen Ethanolextrakts mit makroporösem Styrol-Divinyl-Benzolharz;
(e) Gießen des Gemisches von 60 %-igem Ethanol-Extrakts und makroporösem Harz in eine Säule;
(d) Waschen der Säule mit Ethanol in einem Volumen von etwa 2- bis 10-fach des Säulen-Volumens;
(e) Eluieren der Säule mit einem Lösungsmittel von Ethanol/Ethylacetat oder Ethylacetat und Gewinnen der eluierten Fraktionen zu unterschiedlichen Zeitintervallen; und
(f) Analysieren jeder eluierten Fraktion und Bestimmen, welche angereichert ist an 1,2-Di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) und Phytol, als den Crassocephalum crepidioides Extrakt.

Wie hier verwendet betrifft der Begriff „Extrakt“ eine konzentrierte Zubereitung der essentiellen Komponenten der Crassocephalum crepidioides Pflanze. Der Extrakt kann in Form einer Flüssigkeit sein, Extraktum spissum, Feststoff oder Pulver.
Wie hier verwendet kann die Crassocephalum crepidioides Pflanze die gesamte Pflanze sein oder ein oder mehrere Teile davon, einschließlich, ohne darauf begrenzt zu sein, Samen, Blüten, Blätter, Stämme und Wurzeln. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Crassocephalum crepidioides Pflanze die gesamte Pflanze. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Crassocephalum crepidioides Pflanze der Samen, die Blüten, Blätter oder jede Kombination davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Crassocephalum crepidioides Pflanze getrocknet und pulvrig.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist in Schritt (a), das Verhältnis des Gewichts der getrockneten Pflanze zu dem Volumen des 70 %-igen Ethanol-Lösungsmittels im Bereich von etwa 1:1 bis etwa 1:50, wie etwa 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40, 1:41, 1:42, 1:43, 1:44, 1:45, 1:46, 1:47, 1:48, 1:49 oder 1:50. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verhältnis etwa 1:1 bis etwa 1:20. In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Verhältnis etwa 1:10. Darüber hinaus kann der feste Anteil aus Schritt (b) den Kontakt-Bedingungen von (a) unterworfen werden, um eine weitere Suspension zu erhalten. Derartige Wiederholungsschritte können ein oder mehrere Male durchgeführt werden, und all die daraus erhaltenen Roh-Extrakte werden vor Durchführung von Schritt (c) miteinander vermischt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, kann der aus Schritt (b) erhaltene Roh-Extrakt durch jedes herkömmliche Konzentrierungsverfahren für Lösungen zu einem Extraktum spissum oder zu einem Pulver konzentriert werden, wie durch Verwendung eines Rotationsverdampfers bei vermindertem Druck.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der 60 %-ige Ethanol- Extrakt von Schritt (c) durch direktes Verdünnen des Roh-Extrakts mit Wasser erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der aus Schritt (b) erhaltene Roh-Extrakt auf ein Extraktum spissum konzentriert, und der Extraktum spissum wird dann in 60 %-igem Ethanol verdünnt, um den 60 %-igen Ethanol-Extrakt von Schritt (c) herzustellen.
Erfindungsgemäß ist das hier verwendete makroporöse Styrol-Divinylbenzol-Harz ein Styrol-Divinylbenzol basiertes Harz, welches Poren mit einem durchschnittlichen Porenradius im Bereich von etwa 45 Å bis etwa 290 Å aufweist. Das Volumen der Poren des makroporösen Harzes beträgt etwa 1,5 ml/g, und die Oberfläche des makroporösen Harz ist eine aromatische, unpolare Oberfläche, und die Oberfläche ist daher hydrophob. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das makroporöse Harz Sepabeads Harz oder Dialon Harz. In einer bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das makroporöse Harz, ohne darauf beschränkt zu sein, ausgewählt unter Sepabeads SP70 (Mitsubishi), Sepabeads SP710 (Mitsubishi), Sepabeads SP825 (Mitsubishi), Sepabeads SP850 (Mitsubishi), Sepabeads SP207(Mitsubishi), Sepabeads SP700 (Mitsubishi), Dialon HP20 (Mitsubishi), MCI Gel CHP20P (Sigma-Aldrich), Amberlite^® XAD^®-2 (Sigma-Aldrich), und Amberlite^® XAD^®-4 (Sigma-Aldrich). In einer noch bevorzugteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das makroporöse Harz Sepabeads SP70, und das Harz ist mit 10% Ethanol vorbehandelt.
In Schritt (d) des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung kann ein Konzentrationsverhältnis des verwendeten Ethanols von etwa 50%-90%, vorzugsweise etwa 70%-90%, und mehr bevorzugt etwa 80% verwendet werden. Das Volumen an Ethanol zum Waschen der Säule ist etwa 2- bis 10-fach des Säulenvolumens, vorzugsweise etwa 4- bis 8-fach, und mehr bevorzugt etwa 4-fach.
In einer Ausführungsform des Herstellungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt (e) verwendete Lösungsmittel Ethanol/Ethylacetat, worin das Volumen-Verhältnis von Ethanol zu Ethylacetat von etwa 1:1 bis 1:50 reicht, vorzugsweise von etwa 1:1 bis 1:30, mehr bevorzugt von etwa 1:1 bis 1:10, und noch mehr bevorzugt etwa 1:1 ist. In einer anderen Ausführungsform der Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist das in Schritt (e) verwendete Lösungsmittel Ethylacetat.
In Schritt (f) der Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann das Analyseverfahren jedes zur Identifizierung von dLGG bekannte Verfahren sein. Beispielsweise HPLC und HPLC-MS.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Crassocephalum crepidioides Extrakt 7 Haupt-Peaks zu Retentionszeiten von 12,59 min, 12,893 min, 13,828 min, 14,158 min, 14,922 min, 15,455 min bzw. 16,478 min auf, dies bei Bestimmung durch HPLC bei den folgenden Bedingungen:

Säule: Symmetry Shield C18, 15 µm, 4.6 × 150 mm
Temperatur: Umgebung
Elution: H₂O/CH₃CN Gradient
Erfassung: UV 210 nm

Zeit (min)	Mobile Phase (%)
Zeit (min)	H₂O	CH₃CN
0	35	65
10	3.5	96.5
20	3	97
22	0	100
27	0	100
28	35	65
35	35	65

Pharmazeutische Zusammensetzung/Kombination
Die vorliegende Erfindung liefert eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Crassocephalum crepidioides Extrakts umfasst, der durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde. Die vorliegende Erfindung liefert weiter eine pharmazeutische Kombination, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines Crassocephalum crepidioides Extrakts umfasst, der durch das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, und eine therapeutisch wirksame Menge eines chemotherapeutischen Mittels. Die pharmazeutische Zusammensetzung/Kombination kann einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Vehikel umfassen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „therapeutisch wirksame Menge“ eine ausreichende Menge eines Kräuter-Extrakts oder einer Verbindung, die bei Verabreichung zu einem gewissen Maße ein oder mehrere der Symptome der Erkrankung oder des zu behandelnden Zustandes lindert. Das Ergebnis kann eine Reduzierung und/oder Erleichterung der Zeichen, Symptome oder Ursachen einer Erkrankung sein, oder jede andere gewünschte Veränderung eines biologischen Systems.
Der Begriff „chemotherapeutisches Mittel“ wird hier verwendet, um Mittel zu bezeichnen, die die funktionale Eigenschaft aufweisen, die Entwicklung oder das Fortschreiten eines Neoplasmas in einem Menschen zu inhibieren, insbesondere eine maligne (Krebs) Verletzung, wie ein Karzinom, Sarkom, Lymphom, oder Leukämie. Eine Inhibierung der Metastasierung oder Angiogenese ist häufig eine Eigenschaft chemotherapeutischer Mittels. Ein chemotherapeutisches Mittel kann ein zytotoxisches oder zytostatisches Mittel sein. Der Begriff „zytostatisches Mittel“ bezeichnet ein Mittel, das Zellwachstum und/oder Vervielfachung von Zellen inhibiert und/oder supprimiert.
Nicht-beschränkende Beispiele chemotherapeutischer Mittels umfassen Antimetaboliten (z.B. Azathioprin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Fludarabin, Pentostatin, Cladribin, 5-Fluoruracil (5FU), Floxuridin (FUDR), Cytosinarabinosid (Cytarabin), Methotrexat, Trimethoprim, Pyrimethamin, und Pemetrexed); alkylierende Mittel (z.B. Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Uramustin, Melphalan, Chlorambucil, Thiotepa/Chlorambucil, Ifosfamid, Carmustin, Lomustin, Streptozocin, Busulfan, Dibromomannitol, Cisplatin, Carboplatin, Nedaplatin, Oxaliplatin, Satraplatin, Triplatin Tetranitrat, Procarbazin, Altretamin, Dacarbazin, Mitozolomid und Temozolomid); Anthracycline (z.B. Daunorubicin, Doxorubicin, Epirubicin, Idarubicin und Valrubicin); Antibiotika (z.B. Dactinomycin, Bleomycin, Mithramycin, Anthramycin, Streptozotocin, Gramicidin D, Mitomycin (z.B. Mitomycin C), Duocarmycin (z.B., CC-1065), und Calicheamicin); Antimitotische Mittel (einschließlich z.B. Maytansinoid, Auristatin, Dolastatin, Cryptophycin, Vinca Alkaloide (z.B. Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Vinorelbin), und Taxane (z.B. Paclitaxel und Docetaxel), und Colchicine; Topoisomerase-Inhibitoren (z.B. Irinotecan, Topotecan, Amsacrin, Etoposid, Teniposid und Mitoxantron); und Proteasominhibitoren (z.B. Peptidylborsäuren).
Die Zusammensetzung/Kombination kann einem Patienten in herkömmlichen Zubereitungsformen oral oder parenteral verabreicht werden, wie Kapseln, Mikrokapseln, Tabletten, Granulaten, Pulver, Pastillen, Pillen, Zäpfchen, Injektionen, Suspensionen und Syrupe. Geeignete Formulierungen können mit herkömmlich zum Einsatz kommenden Verfahren hergestellt werden, wobei herkömmliche organische oder anorganische Träger verwendet werden, wie ein Exzipient (z.B. Saccharose, Stärke, Mannitol, Sorbitol, Lactose, Glucose, Cellulose, Talk, Calciumphosphat oder Calciumcarbonat), ein Binder (z.B. Cellulose, Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Polypropylpyrrolidon, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Gum Arabicum, Polyethylenglycol, Saccharose oder Stärke), ein Desintegrationsmittel (z.B. Stärke, Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylstärke, gering substituierte Hydroxypropylcellulose, Natriumbicarbonat, Calciumphosphat oder Calciumzitrat), ein Schmiermittel (z.B. Magnesiumstearat, leicht wasserfreie Kieselsäure, Talkum oder Natriumlaurylsulfat), ein Geschmacksmittel (z.B. Zitronensäure, Menthol, Glycin oder oranges Pulver), ein Konservierungsmittel (z.B. Natriumbenzoat, Natriumbisulfit, Methylparaben oder Propylparaben), ein Stabilisator (z.B. Zitronensäure, Natriumcitrat oder Essigsäure), ein Suspendierungsmittel (z.B. Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Aluminiumstearat), ein Dispersionmittel (z.B. Hydroxypropylmethylcellulose), ein Verdünner (z.B. Wasser), und Basenwachs (z.B. Kakaobutter, weisses Petrolatum oder Polyethylenglycol).
Einsatz
Die pharmazeutische Zusammensetzung/Kombination der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, Krebs in einem dieses benötigenden Individuum zu behandeln oder zu verhindern.
Wie hier verwendet bezeichnen die Begriffe „behandeln,“ „behandelnd,“ und „Behandlung“ die Verabreichung eines therapeutisch aktiven Mittels, einer Zusammensetzung, eines Arzneimittels, oder einer Kombination an ein Individuum, welches eine Erkrankung/ Störung aufweist, oder welches ein Symptom oder eine Prädisposition dafür besitzt, mit dem Ziel, das Risiko der Störung, der Symptome von oder der Prädisposition gegenüber der Störung zu kurieren, zu heilen, zu erleichtern, zu befreien, zu verändern, zu beheben, zu bessern, zu verbessern, zu beeinflussen oder zu reduzieren. So betrifft beispielsweise die Behandlung von Krebs die Behandlungsergebnisse der Inhibierung des Krebswachstums oder des Krebs- Zellwachstums, der Regression beim Krebswachstum (d.h. Reduzierung der Größe eines erfassbaren Krebs), oder des Verschwindens eines Krebs.
Wie hier verwendet soll der Begriff „Individuum“ Säuger einschließen, Primaten, Menschen und nicht-menschliche Tiere. So kann beispielsweise ein Individuum ein Patient sein (z.B. ein menschlicher Patient oder ein Veterinär-Patient) mit einem Krebs. Der Begriff „nicht-menschliche Tiere“ der Erfindung umfasst alle nicht-menschliche Vertebraten, z.B. nicht-menschliche Säuger und nicht-Säuger, wie nicht-menschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Hühner, Amphibien, Reptilien usw., wenn nicht anders angegeben.
Der Begriff „Krebs“ bezeichnet jeden der verschiedenen bösartigen Neoplasmen, die durch die Proliferation von Zellen gekennzeichnet ist, die in umgebendes Gewebe eindringen und an neuen Körperstellen Metastasen bilden. Gutartige und bösartige Tumore werden gemäß dem Gewebetyp klassifiziert, in dem sie aufgefunden werden. So sind beispielsweise Fibrome Neoplasmen des fibrösen Bindegewebes, und Melanom ist abnormales Wachstum von Pigment-(Melanin) Zellen. Bösartige Tumore, die von Epithelgewebe herrühren, z.B. von der Haut, den Bronchien und dem Magen, werden Karzinome genannt. Bösartigkeiten des epithelialen Drüsen-Gewebes, wie sie in der Brust, der Prostata und dem Darm zu finden sind, sind als Adenokarzinome bekannt. Bösartiges Wachstum von Bindegewebe, z.B. dem Muskel, Knorpel, Lymphgewebe und dem Knochen werden Sarkome genannt. Lymphome und Leukämien sind Bösartigkeiten, die bei weißen Blutkörperchen auftreten.
In dem Zusammenhang mit Neoplasma kann Krebs-, Tumor-Wachstums- oder Tumor-Zellwachstums-Inhibierung unter anderem durch ein verzögertes Erscheinen von primären und sekundären Tumoren, einer verlangsamten Entwicklung von primären und sekundären Tumoren, einem verringerten Auftreten von primären und sekundären Tumoren, einer verlangsamten oder verringerten Schwere von Sekundäreffekten der Erkrankung, einem eingefrorenen Tumorwachstum und einer Regression von Tumoren bewertet werden. Bei der extremen vollständigen Inhibierung wird von Prävention oder Chemoprävention gesprochen. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Prävention“ entweder insgesamt Verhindern des Beginns klinisch offensichtlicher Neoplasien oder Verhindern des Beginns eines präklinisch offensichtlichen Zustandes von Neoplasie in risikobehafteten Individuen. Auch sollen in dieser Definition die Prävention der Transformation zu bösartigen Zellen umfasst sein oder das Einfrieren oder die Umkehr des Fortschreitens prä-maligner Zellen zu bösartigen Zellen. Dies beinhaltet eine prophylaktische Behandlung der Individuen die ggf. Neoplasie entwickeln können.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um den Fachmann bei der Durchführung der Erfindung zu unterstützen. Dennoch sollten die Beispiele nicht dahingehend ausgelegt werden, die vorliegende Erfindung unangemessen zu beschränken, da Modifikationen und Änderungen an den hier erläuterten Ausführungsformen vom Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Geist und dem Bereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Zubereitung eines Crassocephalum crepidioides Extrakts
1,02 kg getrocknete Crassocephalum crepidioides (gesamte Pflanze) wurde gemahlen und in eine 70 %-ige Ethanol-Lösung mit einem Volumen 10-fach des Gesamtgewichts der getrockneten Pflanze für 24 Stunden eingebracht, und der Pflanzen- Extrakt wurde dann durch einen Filter NR. 1 bei vermindertem Druck filtriert, um ein erstes Filtrat zu erhalten. Der feste Rückstand wurde weiter in eine 70 %-ige Ethanol-Lösung mit einem Volumen 5-fach des Gesamtgewichts der getrockneten Pflanze für 24 Stunden eingebracht, und der Pflanzen-Extrakt wurde dann durch einen Filter NR. 1 bei vermindertem Druck filtriert, um ein zweites Filtrat zu erhalten. Das erste und zweite Filtrat wurde vermischt, um einen Crassocephalum crepidioides Roh-Extrakt zu erhalten, und der Roh-Extrakt wurde bei vermindertem Druck konzentriert, um ein 1,05-L Extraktum spissum mit einem Gewicht von 213,69 g, einer Konzentration von 203,51 mg/mL, und einer Ausbeute von 20,95% zu erhalten.
425 g des Extraktum spissum wurden mit 12 L 60 %-igem Ethanol verdünnt, um einen Roh-Extrakt zu erhalten. Der Roh-Extrakt wurde in einen Behälter mit makroporösem Harz SP70 (Mitsubishi) überführt, das vorher mit 10 % Ethanol behandelt wurde. Der Inhalt (einschließlich des Harzes und des verdünnten Extrakts) in dem Behälter wurde gerührt und dann über Nacht stehen gelassen. Der Inhalt wurde auf eine Säule überführt. Die Elutionsrate der Säule wurde auf 1,5- bis 2-fach das Säulenvolumen pro Stunde eingestellt. Die zuerst eluierende Fraktion war nicht-absorbierte Probe. Die Säule wurde dann über einen Gradienten der Lösungsmittel von 80% Ethanol bzw. Ethanol:Ethylacetat (1:1) eluiert. Das Volumen eines jeden Lösungsmittels war 4-fach des Säulenvolumens. Die Fraktion, die bei Ethanol:Ethylacetat (1:1) eluierte und an dLGG angereichert war, wurde gewonnen, und konzentriert und getrocknet, um 45,82 g getrocknetes Produkt (Cr-E03) mit einer Ausbeute von 10,78 % z erhalten.
Beispiel 2: Komponenten-Analyse des Crassocephalum crepidioides Extrakts
Bedingungen der HPLC
Säule: Symmetry Shield C18, 15 µm, 4.6 × 150 mm
Temperatur: Umgebung
Elution: H₂O/CH₃CN Gradient
Erfassung: UV 210 nm

Time (min) Mobile phase (%)

H₂O CH₃CN

0 35 65

10 3.5 96.5

20 3 97

22 0 100

27 0 100

28 35 65

35 35 65
Das Spektrum des Crassocephalum crepidioides Extrakts (Cr-E03) ist in 1 gezeigt. Nach Vergleich von Cr-E03 mit Standards und LCMS-APCI(+), wurde bestätigt, dass Peak (1) dLGG war ([M⁺H]⁺: 613, 595 und 335), und dass Peak (2) Phytol war (M.G. = 296,5).
Beispiel 3: Auswirkungen des Crassocephalum crepidioides Extrakt bei der Inhibierung des Wachstums von MKN45 Krebs-Zellen
MKN45 Zellen wurden in RPMI-1640 Medium (Sigma-Aldrich) inkubiert, das 5% FBS (Gibco^®) enthielt. 6 × 10³ Zellen wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen überführt. Jede Vertiefung enthielt 180 µL des vorstehenden Mediums. Die Platte wurde bei 37°C für 4 Stunden inkubiert, worauf in jede Vertiefung der Platte 20 µL unterschiedliche Konzentrationen eines jeden Roh-Extrakts, Cr-E03 und dLGG zugesetzt wurden. Jede Konzentration wurde mit 3 Replikaten getestet. Nach weiterer Inkubierung bei 37°C für 48 Stunden, wurde das Medium in den Vertiefungen entfernt, und 180 µL 5% FBS Medium mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) wurden in die Vertiefungen gegeben. Nach Reaktion bei 37°C für 1 Stunde wurden die Absorptionswerte der Vertiefungen bei 490 nm mittels ELISA Reader (Model 680 Microplate Reader, Bio-Rad) gelesen. IC₂₅-, IC₅₀- und IC₇₅-Werte des Roh-Extrakts, Cr-E03 bzw. dLGG wurden durch Berechnen unter Verwendung der GraphPad Prism 5 Software (GraphPad Software, Inc) erhalten. IC₂₅-, IC₅₀- und IC₇₅-Werte sind als die Konzentrationen der Testprobe definiert, bei denen 25%, 50% bzw. 75%, der maximalen Inhibierung des Wachstums von MKN45-Zellen erhalten wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Drug IC₂₅(µg/mL) IC₅₀(µg/mL) IC₇₅(µg/mL)

Raw 36.08 58.14 89.00

Cr-E03 21.55 55.36 138.33

dLGG 35.86 47.31 61.96
Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, können der Roh-Extrakt, Cr-E03 und dLGG alle das Wachstum von MKN45 Zellen inhibieren.
Beispiel 4: Effekt der Kombination von Crassocephalum crepidioides Extrakt mit 5-Fluorouracil (5-FU) oder Epirubicin bei der Inhibierung des Wachstums von MKN45 Krebs-Zellen
Kombinationen verschiedener Konzentrationen des Roh-Extrakts, Cr-E03 und dLGG mit verschiedenen Konzentrationen von jeweils 5-Fluorouracil (5-FU) und Epirubicin wurden hergestellt. Die Tests wurden basierend auf der gleichen Vorgehensweise wie in Beispiel 3 durchgeführt, und die Kombinationsindizes (CI) der Kombinationen wurden ebenfalls durch Berechnen mit der GraphPad Prism 5 Software erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Das CI Theorem wurde zuerst von Chou T.C. und Talalay P. 1984 (Advances in Enzyme Regulation, 22:27-55, 1984) bereitgestellt. Gemäß des der CI-Theorems, CI = 1 stellt die Kombination mit einer Addition/Summierung dar; CI < 1 stellt die Kombination mit Synergie dar; und CI > 1 stellt die Kombination mit einem Antagonismus dar. Tabelle 2

Getestete Proben Roh Cr-E03 dLGG

Chemische Therapie-Mittel 5FU Epi 5FU Epi 5FU Epi

CI 0.86 0.46 0.67 0.63 1.58 1.58
Wie in Tabelle 2 gezeigt, können der Roh-Extrakt und Cr-E03 jeweils mit 5-FU oder Epirubicin kombiniert werden und erzielen einen synergistischen Effekt bei der Inhibierung des Wachstums von MKN45 Zellen. Kein synergistischer Effekt wurde jedoch bei den Kombinationen dLGG mit 5-FU bzw. Epirubicin verzeichnet.
Beispiel 5: Auswirkungen von Cr-E03 und der Kombination Cr-E03 mit 5-FU oder Epirubicin bei der Inhibition des Wachstums von A549 Lungen-Krebs-Zellen und Colo205 Darm-Krebs-Zellen
Die Auswirkungen von Cr-E03 und der Kombination Cr-E03 mit 5-FU oder Epirubicin bei der Inhibierung des Wachstums von A549 und Colo205 Krebs-Zelllinien wurden basierend auf Verfahren vergleichbar zu denen der Beispiele 3 und 4 bestimmt.
Es wurde gefunden, dass Cr-E03 allein wirksam das Wachstum der A549 Krebs-Zelllinie mit einem IC₅₀ Wert von 75.6 µg/mL inhibiert.
Die Inhibierungs-Auswirkungen der Kombinationen Cr-E03 mit 5-FU bzw. Epirubicin, auf das Wachstum von A549 und Colo205 Zelllinien sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

Zellinien A549 Colo205

Chemische Therapie Mittel 5FU Epi 5FU Epi

CI 1.07 1.05 1.36 0.49
Die Ergebnisse von Tabelle 3 zeigen, dass die Kombination von Cr-E03 mit 5-FU oder Epirubicin einen additiven Effekt bei der Inhibierung von A549 Zellen aufweisen, und dass die Kombination von Cr-E03 mit Epirubicin einen sehr starken synergistische Effekt bei der Inhibierung von Colo205 Zellen aufweist.
Es sollte klar sein, dass die vorstehende ausführliche Beschreibung und spezifische Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, lediglich zur Erläuterung dienen. Verschiedene Änderungen und Modifikationen im Geiste und Bereich der Erfindung werden dem Fachmann aus der detaillierten Beschreibung ersichtlich. Alle diese Modifikationen, wie sie dem Fachmann offensichtlich sind, sollen im Bereich der folgenden Ansprüche umfasst sein.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 8048455 B2 [0005]
US 2014/356301 A1 [0006]
US 2004/0013748 A1 [0007]
WO 2008/105436 A1 [0008]

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Extrakts of Crassocephalum crepidioides welches die Schritte umfasst von: (a) Inkontakbringen der Crassocephalum crepidioides Pflanze mit 70% Ethanol, um eine Suspension zu erhalten; (b) Abtrennen des festen Teils in der Suspension von dem flüssigen Teil, und dann Gewinnen des flüssigen Teils, um einen Roh-Extrakt zu erhalten; (c) Verdünnen des Roh-Extrakts auf einen 60 % Ethanol-Extrakt; (d) Mischen des 60% Ethanol-Extrakts mit makroporösem Styrol-Divinylbenzol-Harz; (e) Giessen des Gemisches des 60% Ethanol-Extrakts und makroporösem Harz in eine Säule; (d) Waschen der Säule mit Ethanol in einem Volumen von etwa 2- bis 10-fach des Säulenvolumens; (e) Eluieren der Säule mit einem Lösungsmittel von Ethanol/Ethylacetat oder Ethylacetat und Gewinnen der eluierten Fraktionen zu unterschiedlichen Zeitintervallen; und (f) Analysieren jeder eluierten Fraktion und Bestimmen, welcher angereichert ist an 1,2-Di-O-α-linolenoyl-3-O-β-galactopyranosyl-sn-glycerol (dLGG) und Phytol, als der Crassocephalum crepidioides Extrakt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Crassocephalum crepidioides Pflanze die gesamte Pflanze ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Crassocephalum crepidioides Pflanze ausgewählt ist unter Samen, Blüten, Blättern oder jeder Kombination davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Crassocephalum crepidioides Pflanze getrocknet und pulverisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verhältnis des Gewichts der getrockneten Pflanze zu dem Volumen der 70% Ethanol Lösungsmittel in Schritt (a) von etwa 1:1 bis etwa 1:50 reicht.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, worin das Verhältnis des Gewichts der getrockneten Pflanze zu dem Volumen des 70% Ethanol Lösungsmittels in Schritt (a) etwa 1:10 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das makroporöse Harz ausgewählt ist unter Sepabeads SP70 und Sepabeads SP710.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 7, worin das makroporös Harz Sepabeads SP70 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das in Schritt (e) verwendete Lösungsmittel Ethanol/ Ethylacetat ist, und worin das Volumen-Verhältnis von Ethanol zu Ethylacetat etwa 1:1 ist.
Crassocephalum crepidioides Extrakt erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Crassocephalum crepidioides Extrakt nach Anspruch, welcher 7 Haupt-Peaks bei Retentionszeiten von 12,59 min, 12,893 min, 13,828 min, 14,158 min, 14,922 min, 15,455 min bzw. 16,478 min aufweist, bestimmt durch HPLC unter folgenden Bedingungen: Säule: Symmetry Shield C18, 15 µm, 4.6 × 150 mm Temperatur: Umgebung Elution: H₂O/CH₃CN Gradient Erfassung: UV 210 nm Time (min) Mobile phase (%) H₂O CH₃CN 0 35 65 10 3.5 96.5 20 3 97 22 0 100 27 0 100 28 35 65 35 35 65
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine therapeutisch wirksame Menge des Crassocephalum crepidioides Extrakts nach Anspruch 10 oder 11 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Pharmazeutische Kombination, welche eine therapeutisch wirksame Menge des Crassocephalum crepidioides Extrakts nach Anspruch 10 oder 11 und ein chemotherapeutisches Mittel enthält.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 13, worin das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist unter einem Antimetaboliten, einem alkylierenden Mittel, einem Anthrazyklin, einem Antibiotikum einem antimitotischen Mittel und einem Proteasom-Inhibitor.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch Claim 13 oder 14, worin das chemotherapeutische Mittel 5-Fluorouracil (5-FU) oder Epirubicin ist.
Verwendung des Crassocephalum crepidioides Extrakts nach Anspruch 10 oder 11 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs in einem dieses benötigenden Individuum.
Verwendung des Crassocephalum crepidioides Extrakts nach Anspruch 10 oder 11 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von Krebs in einem dieses benötigenden Individuums in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel.
Verwendung nach Anspruch 17, worin das chemotherapeutische Mittel ausgewählt ist unter Antimetaboliten, einem alkylierenden Mittel, einem Anthrazyklin, einem Antibiotikum einem antimitotischen Mittel und einem Proteasom-Inhibitor.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, worin das chemotherapeutische Mittel 5-Fluorouracil (5-FU) oder Epirubicin ist.