-
Der Bereich der Technologie
-
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung des Antikörpers IgG gegen RA33, die in den technischen Bereich der biologischen Bestimmungen gehört.
-
Hintergrund
-
Rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste systemische Autoimmunerkrankung, die sich vor allem durch chronische, symmetrische, gemeinsame erosive Synovitis zeigt und sich zum großen Teil progressiv entwickelt. Wenn sie nicht rechtzeitig ärztlich behandelt wird, wird ein Drittel der Kranken deaktiviert. Daher ist die frühe Diagnose und Behandlung der Schlüssel für die Behandlung von rheumatoider Arthritis. Die diagnostischen Kriterien auf klinische Manifestationen, die von American College of Rheumatology (ACR) 1987 neu überarbeitet wurden, nehmen den Rheumafaktor (RF) als das einzige Kriterium, daher ist die Spezifität schlecht. Deshalb setzen sich die Rheumatologen ein, Biomarker für die Früherkennung von RA zu finden, und haben schon einige Erfolge erzielt.
-
1989 berichtete Hassfeld zum ersten Mal über einen Antikörper von RA33. Weil der Antikörper spezifischer Antikörper zur Diagnose RA (rheumatoide Arthritis) ist und mit Nukleinsäure-Protein mit einem Molekulargewicht von 33KD reagieren kann, wurde er als Anti-RA33-Antikörper bezeichnet, dessen Ziel-Antigen Nukleinsäure-bindendes Protein mit einem Molekulargewicht von 33KD ist, das mit dem A2-Protein in hnRNP übereinstimmt. Das Antigen ist aus HaLa-Zellen oder Ehrlich-Zellen abgeleitet. Das Nachweisverfahren ist Western-Blot-Nachweisverfahren (IBT (IMUNOBLOTTING TEST)). 1992 hatte Hassfeld beim Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers gefunden, dass in einigen RA-Kranken auch der Antikörper gegen 36KD-Nukleinsäure-Protein existiert. Und die letztere hat mit dem gleichen Molekulargewicht 36KD Antigen anti-proliferative cell nuclear antigen-Antikörper (anti-PCNA Antikörper) nichts zu tun. Der Anti-RA33-Antikörper und Anti-RA36-Antikörper treten oft zur gleichen Zeit auf. Wenn zwei charakteristische Bänder auf 33KD, 36KD beim Western-Blot-Nachweisverfahren (IBT (IMUNOBLOTTING TEST)) vorkommen, ist es spezifisch für die Diagnose von RA. In den frühen Diagnosenkriterien der RA war die Spezifität des Anti-RA33-Antikörpers am höchsten, die positive Rate in RA 35,8%, vor allem in der frühen Phase der RA. Wachstum und Rückgang des Anti-RA-Antikörpers ist unabhängig von Zustand der Krankheit und der Einnahme von Medikamenten.
-
Außerdem zeigen sich die Anti-RA33-Antikörper nicht nur bei einigen Patienten mit RA, auch bei etwa 20% der Kranken mit systemischen Lupus erythematodes (SLE) und 40%–60% der Kranken mit gemischten Bindegewebserkrankungen (MCTD). Doch wurde in der Literatur mehrmals berichtet, dass die Anti-RA33-Antikörper in den Kranken mit SLE und MCTD oft mit zwei anderen Anti-U1-RNP-Autoantikörpern und Anti-Sm-Antikörpern gleichzeitig auftreten. Man braucht nur die Antikörper gegen U1-RNP und Sm zu überprüfen, um SLE und MCTD auszuschließen.
-
Das früheste und häufigste Nachweisverfahren des Anti-R33-Antikörpers ist IBT (IMUNOBLOTTING TEST). Außerdem kann man auch Enzym-Immunoassay-Nachweisverfahren benutzen. Aber diese Methoden haben erhebliche Mängel.
-
I. IBT (Imunoblotting Test)
-
1989 berichtete Hassfeld als Erster, mit dem Verfahren IBT (IMUNOBLOTTING TEST) den Anti-RA33-Antikörper im Serum der RA-Patienten nachzuweisen. Diese Methode ist die Hybridisierungstechnik von hochauflösender Gelelektrophorese und immunchemischer Analyse. Die Western-Blot-Analyse mit einer großen Kapazität, hohen Empfindlichkeit, hohen Spezifität, usw. gilt als die am häufigsten verwendete Methode zur Prüfung von Charakter, Ausdruck und Verteilung von Proteinen, wie zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Gewebe-Antigenen, zur Bestimmung der Masse von Peptidemolekülen und zur Erkennung von Viren-Antikörpern oder Antigenen. Seine Mängel sind folgende:
- (1) Das Verfahren kann nur zur qualitativen und semiquantitativen Analyse benutzt werden, kann aber die konkrete Menge der Testsubstanz nicht zeigen;
- (2) Das Verfahren ist umständlich und mit einer längeren Testdauer. Deshalb ist es schwierig an der Basis diesen Test durchzuführen;
- (3) Die Sensitivität und Spezifität des Nachweises sind zu verbessern;
- (4) Auch ist es nicht geeignet für die Verbreitung in der klinischen Anwendung, wegen des komplizierten Gewinnungsprozesses von Antigenen, der langen Dauer und der hohen Anforderung an die Ausrüstung.
-
II. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
-
Im Vergleich mit anderen biologischen Nachweisverfahren oder der Anwendung von ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) sind die Methoden, Techniken, Werkzeuge oder Produkte von ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) noch nicht ausreichend. Seine Mängel sind vor allem die folgenden Aspekte:
- (1) Bei diesem Verfahren muss man Mikroplatten von 12 × 8 Typ, 8 × 12 Typ oder einer ganzen 96-Well-Platte als Antigen- oder Antikörperreagens und das Reaktionsgefäß einsetzen. Beim Einsatz kann nur in 12 Lose, 8 Lose oder das gesamte Board zum einen Gebrauch aufgeteilt werden;
- (2) Zur quantitativen Bestimmung braucht man bis zu 11 Reagenzien, jedes davon muss in einem Reagenzglas erhalten werden. Bei der Anwendung müssen die einzelnen Reagenzien mit verschiedenen Saugdüsen in das Loch der Mikrolochplatte gefüllt werden. Es gibt nicht nur viele Arten von Reagenzflaschen, sondern das Bedienungsverfahren des Füllvorgangs ist auch sehr kompliziert. Wenn kein vollautomatisches Enzym-Immunoassay-Analysegerät benutzt wird, müssen alle Operationen manuell durchgeführt werden. Aber das vollautomatische Enzym-Immunoassay-Analysegerät ist sehr teuer und gilt als große Investition.
- (3) Bei jeder Feststellung von Nicht-Detektionsreagenzien kann man die Informationen vom Barcode, die Chargennummer und Verlaufsdatum der Detektionsreagenzien nur aus der äußeren Verpackung gewinnen. Außerdem sind die bekannten Informationen beim Nachweis nicht unter Kontrolle, daher gibt es eine erhebliche Unsicherheit;
- (4) Die Nachweisreagenzien sind in der Detektion offen in der Luft. So kann leicht eine Kreuzkontamination zwischen den verschiedenen Reagenzien entstehen, was das Ergebnis der Prüfung beeinflussen kann;
- (5) Vor dem Einsatz eines vollautomatischen Enzym-Immunoassay-Analysegeräts müssen die Verfahren manuell durchgeführt werden. Daher können die Menge der Reagenzien oder Proben sehr ungenau sein. Der Verfahrensprozess ist sehr umständlich und kompliziert, was leicht zu Verfahrensfehlern führt. Die Genauigkeit und die Präzision der Erfassungsergebnisse sind sehr schlecht.
- (6) Die Anzahl der Prüfungsreagenzien-Kits sind konfiguriert auf ×96 Portionen, z. B. wenn 10 Elemente erfasst werden, muss die Anordnung und Verwendung der Anzahl der erforderlichen Reagenzien 10 × 96 Portionen sein, wenn 10 verschiedene Elemente aus nur einer Probe zu erfassen sind, müssen auch die 10 × 96 Portionen Reagenzien konfigurieren.
-
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
-
Um die Mängel des Verfahrens zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG auszugleichen, bietet die Erfindung eine neue Nachweismethode, die Reagenzienvorrichtung und die entsprechenden Reagenzien an. Diese Nachweismethode basiert auf der Technik des Enzym-Immunoassay-Nachweisverfahrens, strebt nach noch einfacheren, genaueren und effizienteren Methode und Reagenzien zur Rationsbestimmung und zur Erfüllung der Anforderungen in der klinischen Anwendung.
-
Basierend auf dem Prinzip des Enzym-Immunoassay-Nachweisverfahrens erzielt das Verfahren den immunologischen Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG, präsentiert eine unabhängige Einwegmethode, Reagenzienvorrichtung und entsprechende Reagenzien zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG im Enzym-Immunoassay-Analyseverfahren. Mit diesem Verfahren kann man die benötigten Reagenzien in ein Analysegerät füllen, wodurch es viel günstiger ist für den einschlägigen Immunologischen Nachweis nach dem Prüfungsprogramm, um einen besseren Anhaltspunkt für die klinische Anwendung zu finden.
-
Diese Erfindung bietet ein Verfahren zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG, das durch die Analysereagenzienvorrichtungen und die entsprechenden Reagenzien von Enzym-Immunoassay zu erreichen ist. Die Analysereagenzienvorrichtung besteht aus einem Substrat mit acht Löchern und einem Griff zusammengesetzt mit dem Substrat. Durch die spezifische Analysegeräte werden die spezifischen Reagenzienlösungen in die Löcher gefüllt und absorbiert, was die Reaktion von Proben und Reagenzien möglich macht. Dann wird der Farbenwert der Reaktionslösung gemessen. Schließlich sind die Erfassungsergebnisse durch die Verarbeitung der gemessenen Werte zu ermitteln.
-
Die vorliegen vorgestellte Methode wird so durchgeführt, dass der in der Probe beschriebene zu testende Anti-RA33-Antikörper IgG mit RA33, dem rekombinaten Antigen, kombiniert wird, um einen Immunkomplex zu gewinnen. Und dann kombiniert man den ersten Immunkomplex mit dem Enzymmarkierten zweiten Antikörper, was zum zweiten Immunkomplex führen kann, der mit einem chromogenen Substrat für Farbe zu vergleichen ist, wodurch der Inhalt des Anti-RA33-Antikörpers IgG festgestellt werden kann.
-
Der zweite Immunkomplex ist ein von HRP(Meerrettich-Peroxidase)markierten Anti-human-IgG-Antikörper.
-
Die Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG besteht aus einem Substrat mit acht Löchern und einem Griff, der mit dem Substrat verbunden ist, und einer zum Verfahren der Analyse des Antikörpers IgG gegen RA33, Enzyme-linked Immunosorbent Assay, dienenden Reagenzienvorrichtung und einer entsprechenden Anzahl von Standardreagenzien, Kontrollmaterial und Komponenten zum Puffern der Waschlösung.
-
Der Griff des Substrats der vorliegenden Reagenzienvorrichtung ist mit dem Reagenzbarcode beklebt, dessen Zahl die entsprechende Testprojektkennziffer, die Produktionschargennummer des Reagenz, das Ablaufdatum, den Korrekturwert der qualitativen Bestimmung, Eichkurvenparameter, Art der Reaktion ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), und Informationen über die Vorrichtungen und Seriennummer der Analysegeräte enthält.
-
Es gibt in der Reagenzienvorrichung zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG ein Reaktionsloch, ein Probeloch, ein Verdünnungsloch und fünf Reagenzienlöcher, wobei gilt:
- 1) Das Probeloch dient zur Aufnahme einer zu testenden Lösung;
- 2) Das Verdünnungsloch wird zum Verdünnen der Probe verwendet;
- 3) Das Reaktionsloch hat einen platten Boden und hohe Permeabilität für Lichtquelle und Lichtweg. Wenn das Loch die farblose Lösung enthält, wird ein Extinktionswert für sichtbares Licht/UV-Licht/Fluoreszenzlicht auf Null genähert. In dem Reaktionsloch wird der zweite Immunkomplex von HRP (Meerrettich-Peroxidase) markierten anti-human IgG-Antikörper festgelegt. Das Loch enthält die zu testenden Proben und Reagenzien, und reagiert auf die Proben und Reagenzien, führt schließlich zu ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Daher ist das Reaktionsloch der Behälter für die Reaktion von ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) sowie Farb-Display und Detektion.
- 4) Jedes Reagenzienloch ist mit einem zum Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) erforderlichen Reagens gefüllt. Nachdem das Reagens eingefüllt ist, soll man mit einer Mikropore entlang dem Öffnungsrand das Loch schließen.
-
Das zum Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) erforderliche Reagens besteht aus dem Reaktionsinhibitor I, Neutralisationsmittel I, Blocker 7, Adsorbentien, Enzymkonjugatlösungen, chromogenen Lösungen, Farbenstopplösungen, Reaktionsbeschleunigern und Probenverdünnungsmitteln.
-
Die Querschnittsformen des Reaktionslochs, des Probelochs, des Verdünnungslochs und der fünf Reagenzienlöcher der Reagenzienvorrichung zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG weisen flache Form, V-Form oder U-Form, oder eine beliebige Kombination zwischen flacher Form, V-Form und U-Form auf.
-
Die entsprechenden Verfahrensschritte zur Bestimmung eines Anti-RA33-Antikörpers IgG sind folgende:
- 1) Inbetriebnahme: Nach der Einschaltung der Vorrichtung läuft vollautomatisch eine Reihe von Untersuchungen zur Vorbereitung der normalen Operation.
- 2) Vorbereitung der Prüfungsprogramme: Konfiguration entsprechender Lösungen, davon: Waschlösungspuffer, Reinigungslösung, Desinfektionsmittel und destilliertes Wasser oder VE-Wasser. Nach der Konfiguration sollen die Lösungen in die entsprechenden Behälter gefüllt werden.
- 3) Spülungsprüfung
- 4) Vorwärmung: Nach der Inbetriebnahme wird sich die Vorrichtung selbst bis zu der zu erfassenden Temperatur vorwärmen.
- 5) Mit dem Host-Gerät anschließen: Das Gerät kann mit dem Host-Gerät über eine serielle RS232-Schnittstelle angeschlossen werden, damit die Weitergabe der Ergebnisse durch normale Operation der Vorrichtung an ein zentrales System für die Verarbeitung erledigt werden kann.
- 6) Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG: Die erforderlichen Schritte sind folgende:
i. Öffnen Sie den Verpackungsbeutel an der Seite mit einer Abdichtung, entnehmen Sie Analysevorrichtungen in der benötigten Anzahl, entlüften Sie den Beutel und dichten ihn ab.
ii. Prüfen Sie das Substrat in dem Reagenzienloch der Analysevorrichtung. Das Substrat soll keine Farbveränderung aufweisen, sonst muss man es wegwerfen.
iii. Geben Sie jeweils 50–100 μl unverdünnte Proben in die Probelöcher jeder Analysevorrichtung. Bei jeder Veränderung der Chargennummer von Reagenzien sollen Sie die Analysevorrichtungen mit Kalibratoren kalibrieren.
iv. Ordnen Sie die Analysevorrichtungen in dem entsprechenden Analysevorrichtungstablett an, kalibrieren und prüfen Sie es bitte nach der Gebrauchsanweisung.
v. Ordnen Sie bitte die erforderliche Menge der Analysevorrichtungen auf das entsprechende Tablett, und füllen Sie bitte die Vorrichtungen mit Kalibratoren und Materialien für die Qualitätskontrolle vor der Erfassungsposition. Das Gerät kann vollautomatisch die Barcodes der Analysevorrichtungen, der Materialien für die Qualitätskontrolle und der Kalibratoren ablesen. Die Auswahllinie kann sich in der Probe- oder Prüfungsspalte befinden.
vi. Klicken Sie auf die Taste der Inbetriebnahme, nehmen Sie die Projektliste in Betrieb, scannen Sie die Barcodes jeder Analysevorrichtung, nummerieren Sie die Materialien für die Qualitätskontrolle, die Kalibratoren und die zu testenden Proben.
vii. Nehmen Sie die Prüfungsliste. Das Gerät kann vollautomatisch nach den Informationen der Barcodes operieren. In Übereinstimmung mit den Barcodes kann das Gerät entsprechend gesetzte Standardkurven wählen. Das Programm prüft zuerst die Kalibratoren. Nach dieser Kurve kalibriert das Gerät die voreingestellten Kurven. Dann prüft das Gerät die Materialien zur Qualitätskontrolle. Wenn das Ergebnis im Rahmen des Standards ist, ist die voreingestellte Kurve geeignet für die Prüfung der Proben. Schließlich startet das Programm die Prüfung der Proben.
viii. Verdünnung: Die Füllnadel kann vollautomatisch die Proben aus den Probelöchern absorbieren. Die Versiegelungsmikroporen können vollautomatisch die Verdünnungslösung absorbieren. Die Verdünnung soll im Verdünnungsloch erledigt werden. Danach soll die verdünnte Probe durch die Füllnadel in das Reagensloch gesetzt werden, und nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt werden.
ix. Waschen: Sorbieren Sie mit der Füllnadel eine bestimmte Menge Waschmittel ab, und waschen das Reagensloch damit drei- bis fünfmal. Dann wird die Lösung entfernt.
x. Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von dem zweiten Immunkomplex von HRP (Meerrettich-Peroxidase) markiertem Anti-human-IgG-Antikörper ab, und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wird die Lösung wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt.
xi. Wiederholen Sie den Schritt ix
xii. Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von dem Substrat der Reaktion ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ab, und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wird die Lösung wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt.
xiii. Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von der Stopplösung ab und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach zehn Minuten lesen Sie auf 450 nm den OD-Wert. Wenn Sie ein Verfahren der dualen Wellenlänge zur Bestimmung auswählen, dann ist eine Referenz-Wellenlänge 620 nm bis 690 nm.
- 7) Das Erfassungsergebnis: Wenn das Prüfungsprogramm komplett erledigt ist, klicken Sie auf die Datenübertragung mit dem Host-Rechner. Das Gerät sendet vollautomatisch das durch die normale Operation erzielte Ergebnis zum Host-Rechner und an eine externe Datenverarbeitungs-Software zur Analyse. Schließlich ist ein Bericht zur Beratung zu erstellen.
- 8) Abschaltung: Nach der Prüfung und vor der Abschaltung müssen Sie den Kreislauf zum Waschen starten, damit das Auskristallisieren von Kochsalzlösung im Lösungspfad und die Beschädigung der Geräte vermieden werden können, was zu einem ungültigen Ergebnis führen kann. Nach dem Waschen schaltet sich die Stromquelle des Geräts vollautomatisch ab.
-
Die vorliegende Reagenzienvorrichtung ist eine unabhängige, nur für eine Person bestimmte Einweganalysen reagenzienvorrichtung zum Enzym-Immunoassay-Analyseverfahren in einer bestimmten Analysevorrichtung.
-
Die Analysevorrichtung in dem vorliegenden Nachweisverfahren und den entsprechenden Reagenzienvorrichtungen ist eine unabhängige, nur für eine Person bestimmte Einwegmethode, Reagenzienvorrichtung und entsprechende Reagenzien zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG im Enzym-Immunoassay-Analyseverfahren.
-
Das in der Erfindungsbewerbung vorgestellte Verfahren zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG und die entsprechenden Vorrichtungen erben Eigenschaften wie die hohe Spezifität, hohe Empfindlichkeit, hohe Genauigkeit, niedrige Kosten, geringe Anforderungen bei der Verwendung, die einfache Bedienung, kurze Dauer für die Erstellung der Ergebnisse und weite Verbreitung usw., die die anderen Verfahren auch haben, und haben deren Mängel ausgeglichen, wie im Folgenden gezeigt:
- 1. Dieses Verfahren benutzt das Prinzip des Enzym-Immunoassay-Analyseverfahrens mit dem Einsatz von spezifischen analytischen Geräten, den entsprechenden speziellen Detektionsreagens- und Analysen-Kits, erreicht vollautomatisch die qualitative und quantitative Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG und gilt als eine neue, anwendbare, praktische, effiziente, schnelle Methode zum Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG.
- 2. Es ist eine unabhängige, nur für eine Person bestimmte Einwegmethode und Reagenzienvorrichtung. Mit diesem Verfahren braucht man nicht wie bei dem Verfahren ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) die Mikrolochplatte vom Typ 12 × 8 oder 8 × 12 oder eine ganze 96-Well-Platte als Antigen- oder Antikörperreagens und das Reaktionsgefäß zu verwenden. Bei der Verwendung muss nur eine Probe zum Nachweis der einschlägigen Projekte zum Einsatz kommen, womit die Verschwendung der Reagenzien vermieden werden kann. Wenn die benötigte Probe mehr als ein Exemplar ist, soll man die tatsächliche Menge der Reagenzien und der Analysegeräte verwenden.
- 3. Sowohl für den qualitativen als auch den quantitativen Nachweis werden die zu jedem Nachweis benötigten Reagenzien in den Löchern der Analysenreagenzienvorrichtung gehalten, man braucht kein separates Reagenzglas dafür. Die Operation ist ganz einfach und führt kaum zu Operationsfehlern, kann somit die Korrektheit der Erfassungsergebnisse garantieren.
- 4. Es gibt in jeder Analysenreagenzienvorrichtung einen Barcode, dessen Wert die entsprechende Testprojektkennziffer, die Produktionschargennummer des Reagenzes, das Ablaufdatum, den Korrekturwert der qualitativen Bestimmung, Eichkurvenparameter, Art der Reaktion ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), und Informationen über die Vorrichtungen und Seriennummer der Analysegeräte enthält. Er kann nicht leicht verändert werden, ist bei der Verwendung streng kontrolliert. Besonders kann die Verwendung der Reagenzien, die über das Ablaufdatum hinaus sind, erkannt werden, worüber auch ein Prüfungsbericht geschickt wird, wodurch die Korrektheit der Prüfung garantiert werden kann.
- 5. Jedes zum Nachweis benötigte Reagens wird effektiv abgetrennt und abgedichtet, was keine Kreuzkontamination zwischen den verschiedenen Reagenzien, die sich auf die Testergebnisse auswirken können, verursachen kann.
- 6. Es ist eine spezifische Analysenreagenzienvorrichtung des Analysegerätes, die bei dem Nachweis die vollautomatische Präzisionsdosierung zur Befüllung der Reagenzien oder Proben benutzt wird. Die Operation ist vollautomatisch und die Erfassungsergebnisse haben hohe Korrektheit und Präzision.
- 7. Die Zahl der Prüfungsreagenzien-Kits und die Verwendung sollen je nach dem praktischen Bedarf konfiguriert werden. Besonders beim Fall mehrerer Projekte ist die Konfiguration geeigneter, wobei die Superkonfiguration und -verwendung nicht existieren können.
-
Beschreibung der Schaubilder
-
1 ist eine Schnittansicht eines Ausführungsbeispiels der in der Erfindung beschriebenen Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung von Anti-RA33-Antikörper IgG;
-
2 ist eine Draufsicht eines Ausführungsbeispiels der in der Erfindung beschriebenen Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung von Anti-RA33-Antikörper IgG;
-
3 ist eine andere Schnittansicht eines Ausführungsbeispiels der in der Erfindung beschriebenen Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung von Anti-RA33-Antikörper IgG;
-
4 ist eine andere Draufsicht eines Ausführungsbeispiels der in der Erfindung beschriebenen Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung von Anti-RA33-Antikörper IgG;
-
5 und 6 zeigen eine Schnittansicht eines anderen Ausführungsbeispiels einer Reagenzienvorrichtung zur Bestimmung von Anti-RA33-Antikörper IgG gemäß der vorliegenden Erfindung;
-
Dabei ist 1 das Probenloch, 2, 3, 4, 5, 6 die Reagenzienlöcher, 7 das Reaktionsloch, 8 das Verdünnungsloch, 9 der Griff, 10 die Versiegelungsmikropore, 11 der Substrat, 90 das Etikett.
-
Konkretes Durchführungsverfahren
-
Im Folgenden wird der Versuch unternommen, in der Verbindung mit einer speziellen Vorrichtung und den Durchführungsschritten das Nachweisverfahren und die Reagenzienvorrichtung weiter bis in die Details zu erklären, dessen Ziel nicht ist, das Verfahren zu beschränken, sondern nur, dass die Öffentlichkeit mehr über das Verfahren weiß. In der Tat zum Geist der Erfindung gehören die Verbesserung der beschriebenen Schritte, die Substitutionen und Modifikationen der entsprechenden Reagenzienvorrichtungen, deren Veränderungen und Wechsel zu den in der Erfindung zu schützenden Technikprogrammen.
-
Ausführungsbeispiel 1: Nachweis des indirekten Enzym-Immunoassayverfahrens, der Reagenzien-Kits und -vorrichtungen
-
Die Erfindung basiert auf der Enzym-Immunoassayverfahrenstechnik und gilt als eine noch einfachere, genauere und effektivere Methode, deren Prinzip das indirekte Enzym-Immunoassayverfahren ist. Man sorbiert das rekombinante Antigen von RA33 auf einer festen Phase ab, setzt den spezifischen Antikörper und Antigen durch Inkubation des verdünnten Humanserums zusammen, entfernt durch das Waschen das nicht mit der festen Phase verbundene Antigen, fügt eine Meerrettich-Peroxidase-markierte anti-human Enzymkonjugats-Immunglobulin hinzu und bebrütet, entfernt ungebundene Enzymsubstanzen und fügt das Enzym-Substrat-Chromogen hinzu. Die entstehende Farbe steht mit der Konzentration des spezifischen Antikörpers in der Nachweisprobe in der richtigen Proportion. Es ist vor allem durch die Reagenzienvorrichtungen und -kits des Enzym-Immunoassayverfahrens der immunologische Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers zu erreichen. Durch dieses Verfahren und die Benutzung der spezifischen Reagenzienvorrichtung und Reagenzien des bestimmten Analysegerätes kann die Diagnose ganz schnell und genau erreicht werden, was die Forderungen der klinischen Diagnose erfüllen kann. Die konkrete Struktur der Analysevorrichtung ist wie im Folgenden:
Was im Schaubild 1–6 gezeigt ist, ist die Reagenzienvorrichtung des Enzym-Immunoassayverfahrens zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers, die aus einem Substrat 11, auf dem sich 1–8 Löcher (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) befinden, wovon Loch 1 ein Loch zur Erhaltung der zu testenden Proben ist, dessen Boden eine V-Form hat, die anderen Löcher das Reaktionsloch 7, das Verdünnungsloch 8, und die Reagenzienlöcher (2, 3, 4, 5, 6) sind. Das Reaktionsloch wird benutzt, die zu testenden Proben zu erhalten und zu prüfen, und als das Reaktionsgefäß für Enzym-Immunoassayverfahren und Farbenvergleich zu dienen. Das Loch ist für die Lichtquelle und den Lichtweg durchsichtig. Am Ende des Substrats gibt es einen Griff 9, auf dem ein Informationsbarcode des Reagenzes vom Anti-RA33-Antikörper IgG 90 steht. Im Ausführungsbeispiel gehören die Löcher mit den Nummern 2, 3, 4, 5, 6 zu den Reagenzienlöchern, in die bei der Verwendung die erforderlichen Reagenzien gefüllt werden. Der Öffnungsrand kann quadratisch oder rund sein. Diese Löcher haben auch einen Nutgrund. Nachdem die Reagenzien in die Löcher gefüllt werden oder die Löcher leer sind, muss man die Löcher mit Mikroporen 10 abdichten. Das Verdünnungsloch 8 dient zur Verdünnung der Proben, auf dem es keine Versiegelungsporen gibt.
-
In dem Kit gibt es außer der Analysenreagenzienvorrichtung auch andere Reagenzien: Kalibrator, Kontrolle Material, Puffer Waschlösung, Spülmittel, Desinfektionsmittel und destilliertes oder deionisiertes Wasser.
-
Ausführungsbeispiel 2: Herstellung von Reagenzienkits und -vorrichtungen. – Indirekter Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG
-
Das Loch 1 dient als das Gefäß für die zu testenden Proben. Bei der Verwendung wird die Lösung in das Loch zur Benutzung beim Nachweis gefüllt;
-
Das Loch 2 dient als ein freies Loch, das mit den Mikroporen abgedichtet ist, und wird als Ersatz zum Testen verwendet;
-
Das Loch 3 dient als das Reagenziengefäß, in das das Verdünnungsreagens gefüllt wird und das mit den Mikroporen abgedichtet wird, zur Benutzung beim Nachweis.
-
Das Loch 4 dient als das Reagenziengefäß, in das das Stoppreagens gefüllt wird, und das mit den Mikroporen abgedichtet wird, zur Benutzung beim Nachweis.
-
Das Loch 5 dient als das Reagenziengefäß, in das von HRP (Meerrettich-Peroxidase) markierte Anti-human-IgG-Antikörper gefüllt wird, und mit den Mikroporen abgedichtet wird, zur Benutzung beim Nachweis.
-
Das Loch 6 dient als das Reagenziengefäß, in das das Substrat von ELISA gefüllt wird, und mit den Mikroporen abgedichtet wird, zur Benutzung beim Nachweis.
-
Das Loch 7 dient als das Erhaltungsloch, Reaktionsloch und Farbenvergleichsloch und hat schon das rekombinante Antigen gegen RA33. In das Reaktionsloch werden die zu testenden Probenlösungen, die Nachweisreagenzien und Waschmittel gefüllt, schließlich wird das Substrat von ELISA hinzugefügt, bebrütet zur Absorptionsmessung nach der Inkubation.
-
Das Loch 8 dient als das Verdünnungsgefäß zur Verdünnung der Proben.
-
Auf dem Griff 9 werden Reagenzbarcodes geklebt, dessen Zahl die entsprechende Testprojektkennziffer, die Produktionschargennummer des Reagenses, das Ablaufdatum, den Korrekturwert der qualitativen Bestimmung, Eichkurvenparameter, Art der Reaktion ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), und Informationen über die Vorrichtungen und Seriennummer der Analysegeräte enthält.
-
Nach den vorgestellten Methoden werden einige Analysevorrichtungen zusammengesetzt, außerdem werden auch Standardreagenzien, Kontrollmaterial und Komponenten zum Puffern der Waschlösung, Desinfektionsmittel und destilliertes oder entionisiertes Wasser hergestellt, die eine komplette Testkit-Komponente vom Anti-RA33-Antikörper IgG bilden. Die Reagenzienvorrichtungen und die Verpackungen der entsprechenden Reagenzienkits zum Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG bilden gemeinsam das Reagenzienkit des Anti-RA33-Antikörpers IgG.
-
Ausführungsbeispiel 3: Der Verfahrensprozess zur Analyse der Probe vom Anti-RA33-Antikörper IgG durch den vollautomatischen Analysator
-
Der vollautomatische Analysator besteht aus einem Analyselaufwerk, dessen Form der Form von Analysegeräten entspricht, und 30 Plätze für Analysegeräte zu Nachweis und Analyse hat, und einer modularen integrierten mechanischen und elektronischen Struktur, die den Prozess von vollvollautomatischen Probengewinnungen, Verdünnung, Inkubation, Waschen, und Ablesen erledigen kann, in der es auch mehr als 200 elektronische Sensoren zur Überwachung der Operation gibt, die die Genauigkeit der Ergebnisse garantieren können. Nach der Inbetriebnahme des Gerätes dreht das Analyselaufwerk vollautomatisch an verschiedene Stellen zur Gewinnung der Probe, Verdünnung, Inkubation, Waschen, und Ablesen.
- (1) Inbetriebnahme: Nach der Einschaltung der Vorrichtung läuft vollautomatisch eine Reihe von Untersuchungen zur Vorbereitung der normalen Operation ab.
- (2) Vorbereitung der Prüfungsprogramme: Konfiguration entsprechender Lösungen, darunter: Waschlösungspuffer, Reinigungslösung, Desinfektionsmittel und destilliertes Wasser oder VE-Wasser. Nach der Konfiguration sollen die Lösungen in die entsprechenden Behälter gefüllt werden.
- (3) Spülungsprüfung
- (4) Vorwärmung: Nach der Inbetriebnahme wird sich die Vorrichtung selbst bis zu der zu erfassenden Temperatur vorwärmen.
- (5) Mit dem Host-Gerät anschließen: Das Gerät kann mit dem Host-Gerät über eine serielle RS232-Schnittstelle angeschlossen werden, damit die Weitergabe der Ergebnisse durch normale Operation der Vorrichtung an ein zentrales System für die Verarbeitung erledigt werden kann.
- (6) Nachweis des Anti-RA33-Antikörpers IgG:
1) Öffnen Sie den Verpackungsbeutel an der Seite mit einer Abdichtung, entnehmen Sie die Analysevorrichtungen in der benötigten Anzahl, entlüften Sie den Beutel und dichten ihn ab.
2) Prüfen Sie das Substrat in dem Reagenzienloch der Analysevorrichtung. Das Substrat soll keine Farbänderung aufweisen, sonst muss man es wegwerfen.
3) Geben Sie jeweils 50–100 μl unverdünnte Proben in die Probelöcher jeder Analysevorrichtung. Bei jeder Veränderung der Chargennummer von Reagenzien sollen Sie die Analysevorrichtungen mit Kalibratoren kalibrieren.
4) Ordnen Sie die Analysevorrichtungen in dem entsprechenden Analysevorrichtungstablett an, kalibrieren und prüfen Sie es bitte nach der Gebrauchsanweisung.
5) Ordnen Sie bitte die erforderliche Menge der Analysevorrichtungen auf das entsprechende Tablett, und füllen Sie bitte die Vorrichtungen mit Kalibratoren und Materialien für die Qualitätskontrolle vor der Erfassungsposition. Das Gerät kann vollautomatisch die Barcodes der Analysevorrichtungen, der Materialien für die Qualitätskontrolle und der Kalibratoren ablesen. Die Auswahllinie kann sich in der Probe- oder Prüfungsspalte befinden.
6) Klicken Sie auf die Taste der Inbetriebnahme, nehmen Sie die Projektliste in Betrieb, scannen Sie die Barcodes jeder Analysevorrichtung, nummerieren Sie die Materialien für die Qualitätskontrolle, die Kalibratoren und die zu testenden Proben.
7) Nehmen Sie die Prüfungsliste. Das Gerät kann vollautomatisch nach den Informationen der Barcodes operieren. In Übereinstimmung mit den Barcodes kann das Gerät entsprechend gesetzte Standardkurven wählen. Das Programm prüft zuerst die Kalibratoren. Nach dieser Kurve kalibriert das Gerät die voreingestellten Kurven. Dann prüft das Gerät die Materialien zur Qualitätskontrolle. Wenn das Ergebnis im Rahmen des Standards ist, ist die voreingestellte Kurve geeignet für die Prüfung der Proben. Schließlich startet das Programm die Prüfung der Proben.
8) Verdünnung: Die Füllnadel kann vollautomatisch die Proben aus den Probelöchern absorbieren. Die Versiegelungsmikroporen können vollautomatisch die Verdünnungslösung absorbieren. Die Verdünnung soll im Verdünnungsloch erledigt werden. Danach soll die verdünnte Probe durch die Füllnadel in das Reagensloch gesetzt werden, und nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt werden.
9) Waschen: Sorbieren Sie mit der Füllnadel eine bestimmte Menge von Waschmittel ab, und waschen Sie das Reagensloch damit drei- bis fünfmal. Dann wird die Lösung entfernt.
10) Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von dem zweiten Immunkomplex von HRP (Meerrettich-Peroxidase) markiertem Anti-human-IgG-Antikörper ab, und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wird die Lösung wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt.
11) Wiederholen Sie den Schritt 9
12) Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von dem Substrat der Reaktion ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ab, und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach einer durch das Programm vorgegebenen Zeit wird die Lösung wieder durch die Füllnadel aus dem Reagensloch entfernt.
13) Sorbieren Sie mit der Füllnadel durch die Versiegelungsmikroporen eine bestimmte Menge von der Stopplösung ab und füllen Sie den Immunkomplex in das Reagensloch. Nach zehn Minuten lesen Sie auf 450 nm den OD-Wert. Wenn Sie ein Verfahren der dualen Wellenlänge zur Bestimmung auswählen, dann ist eine Referenz-Wellenlänge 620 nm bis 690 nm.
- (7) Das Erfassungsergebnis: Wenn das Prüfungsprogramm komplett erledigt ist, klicken Sie auf die Datenübertragung mit dem Host-Rechner. Das Gerät sendet vollautomatisch das durch die normale Operation erzielte Ergebnis zum Host-Rechner und an eine externe Datenverarbeitungs-Software zur Analyse. Schließlich ist ein Bericht zur Beratung zu erstellen.
- (8) Abschaltung: Nach der Prüfung und vor der Abschaltung müssen Sie den Kreislauf zum Waschen starten, damit das Auskristallisieren von Kochsalzlösung im Lösungspfad und die Beschädigung der Geräte vermieden werden können, was zu einem ungültigen Ergebnis führen kann. Nach dem Waschen schaltet sich die Stromquelle des Geräts vollautomatisch ab.
-
Ausführungsbeispiel 4: Patientenproben zur Erkennung von Anwendungen, Ergebnisanalyse und Qualitätskontrolle
-
Nach Verfahren und Methoden aus Beispiel 3 benutzt man das Kit vom Beispiel 2 zur quantitativen Bestimmung vom Anti-RA33-Antikörper IgG im Serum.
-
Der allein erscheinende Anti-RA33-Antikörper wird als das Symbol der RA erkannt. Die Sensitivität seiner Diagnose hängt aber von der Testgruppe ab. Der Anti-RA33-Antikörper ist unabhängig von dem Rheumafaktor (RF) und erscheint allein. Die Häufigkeit des Auftretens in der negativen rheumatoiden Arthritis vom Anti-RA33-Antikörper beträgt ungefähr 45%, was eine große Bedeutung für die frühe Diagnose der RA hat. Bei 70% der Kranken mit SLE, verbunden mit erosiver Arthritis tritt der Anti-RA33-Antikörper auf, weshalb der Anti-RA33-Antikörper auch ein Kriterium für die Prognose der Entwicklung von SLE sein kann. Deshalb kann man nach den Erfassungsergebnissen die klinische Diagnose machen, vorläufig den Zustand der Kranken beurteilen. Aber zur Manifestation der endgültigen Diagnose muss man noch das klinische Phänomen und andere diagnostische Methoden oder Indikatoren kombiniert in Betracht ziehen.
-
Es folgen die Testergebnisse:
-
(1) Referenzwert (Referenzbereich)
-
Normale Referenzwerte: 0–25 AU/mL; die dreifache Standardabweichung der Ergebnisse (x - → 3SD) zum Nachweis einer bestimmten Anzahl (statistisch signifikant) von negativen Proben ist die obere Grenze der normalen Referenzwerte. Es wird empfohlen, dass jedes Labor je nach der aktuellen Situation die eigenen Referenzwerte bilden soll.
-
Für eine taugliche klinische Anwendung empfehlen wir:
- Probenwert < 20 AU/mL Negativ
- 20 AU/mL ≤ Probenwert ≤ 30 AU/mL Verdächtig
- Probenwert > 30 AU/mL Positiv
-
(2) Erklärung der Erfassungsergebnisse
-
Erklärung der Erfassungsergebnisse: Im Fall dass der Probenwert > 30 AU/mL ist eine deutliche Erhöhung der Antikörper-Konzentrationen zu erwarten, wobei in der Verbindung mit dem klinischen Phänomen und anderen diagnostischen Methoden oder Indikatoren die RA oder erosive Arthritis festzustellen ist. Im Fall dass der Probenwert < 20 AU/mL zeigt sich keine deutliche Erhöhung der Antikörper-Konzentrationen im Substrat. Im Fall von 20 AU/mL ≤ Probenwert ≤ 30 AU/mL soll das Nachweisverfahren wiederholt werden, wenn es nochmals verdächtig ist, müssen in zwei bis drei Wochen die Proben wieder gesammelt und getestet werden.
-
Das Folgende betrifft die Wiederholungsmöglichkeit der Ergebnisse von negativen und positiven Qualitätskontrollmaterialien, die in den Tabellen gezeigt werden:
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch den gleichen Prozess der Analyse gleichzeitig der vollautomatische Prozess zur Bestimmung des Anti-RA33-Antikörpers IgG ausgeführt, was den Nachweis viel einfacher, kostengünstiger macht und die Dauer verkürzt. Außerdem gibt es kaum Zwischenkontamination. Das Nachweisverfahren ist leicht durchzuführen. Es gibt auch hohe Spezifität, Empfindlichkeit und Genauigkeit.
