-
Technisches Gebiet
-
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur elektronenmikroskopischen Betrachtung von auf einer ionischen Flüssigkeit schwimmenden Mikroproben, insbesondere zur elektronenmikroskopischen Betrachtung von Aggregation und Dispersion, Orientierung einzelner Proben und dergleichen.
-
Stand der Technik
-
Eine auf einer Flüssigkeitsoberfläche schwimmende Mikroprobe aggregiert, dispergiert und richtet sich je nach Hydrophobizität und Hydrophilizität in unterschiedlicher Art und Weise aus. Es tritt auch ein Phänomen auf, bei dem sich einzelne Teilchen je nach den physikalischen Bedingungen, wie einem Magnetfeld, einem elektrischen Feld, Druck und Temperatur, ausrichten. Ferner gibt es eine Technik, die es sich zu Nutze macht, dass eine Mikroprobe auf einer Flüssigkeitsoberfläche nicht fixiert ist, und die Orientierung der Mikroprobe uneingeschränkt eingestellt werden kann, indem die physikalischen Bedingungen wie Magnetfeld, elektrisches Feld, Druck und Temperatur gesteuert werden. Die Betrachtung solcher schwimmenden Formen unter einem Elektronenmikroskop ist für die Analyse der physikalischen Eigenschaften von funktionellen Substanzen, wie Katalysatoren, Arzneistoffen und Kosmetika, und feinkristallinen Stoffen und organischen pulverförmigen Stoffen und für die Analyse der Biologie von kleinen biologischen Materialien wichtig. Mit herkömmlichen Verfahren ist jedoch eine Betrachtung einer auf einer Flüssigkeitsoberfläche schwimmenden Probe bei hoher Vergrößerung schwierig. Der Grund hierfür ist, dass wässrige Lösungen und organische Lösemittel in der Vakuumumgebung der elektronenmikroskopischen Betrachtung verdampfen.
-
Um dem entgegenzuwirken, wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem eine elektronenmikroskopische Betrachtung nach Einfrieren einer Flüssigkeit unter den Gefrierpunkt unter Verwendung einer Kühlstufe oder Kryostufe durchgeführt wird. Dieses Verfahren ist jedoch problematisch, da das Einfrieren einer Flüssigkeit die Gestalt der Mikroprobe oder die Form der Mikroprobe verändert, und dazu führt, dass die Mikroprobe aggregiert, dispergiert, sich ausrichtet oder sich in einer unterschiedlichen Weise orientiert. Ein weiteres Problem besteht darin, dass die Wasserkomponente, auch wenn die Probe gefroren ist, im Vakuum verdampft. Es könnte in diesem Fall möglich sein, ein Öl als flüssiges Material zu verwenden, das in einer Vakuumumgebung nicht verdampft. Ein Problem eines solchen Verfahrens besteht jedoch darin, dass die auf der Öloberfläche schwimmende Probe bei Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl schnellen fließenden Bewegungen unterworfen wird. Ferner besteht bei diesem Verfahren ein Ladungsproblem. Bei einem anderen vorgeschlagenen Verfahren wird eine Flüssigkeit unter Atmosphärendruck gegeben und ein dünner Film wird verwendet, um die Flüssigkeit im Inneren des Rezipienten des Elektronenmikroskops von der Vakuumumgebung zu trennen. Auch mit diesem Verfahren ist es jedoch nicht möglich, eine auf einer Flüssigkeitsoberfläche schwimmende Mikroprobe zu betrachten.
-
Es gibt ferner ein Verfahren, bei dem eine Mikroprobe über eine Carbonpaste oder ähnliches gestreut wird, um das Schwimmen einer Mikroprobe auf einer Flüssigkeit nachzuahmen. Dieses Verfahren löst das Ladungsproblem, und hat keine Fließfähigkeit zur Folge. Daher wird durch dieses Verfahren die Betrachtung im Elektronenmikroskop in vorteilhafter Weise einfacher. Da sich die Carbonpaste jedoch rasch verfestigt, wird die Mikroprobe schnell fixiert, bevor sie vollständig aggregiert, dispergiert, ausgerichtet oder orientiert ist. Es kann daher nicht festgestellt werden, dass dieses Verfahren die Form einer auf einer Flüssigkeitsoberfläche schwimmenden Probe mit Erfolg reproduziert. Da die Mikroprobe nach dem Aufstreuen auf die Carbonpaste schnell fixiert wird, ist es außerdem nicht möglich, die Ausrichtung der individuellen Teilchen zu steuern.
-
Um dem entgegenzutreten wurde ein Verfahren entwickelt, bei dem eine ionische Flüssigkeit zur Betrachtung und zum Steuern einer Mikroprobe in einer Flüssigkeit in einem Elektronenmikroskop verwendet wird. Beispielsweise löst PTL 1 (
WO2007/083756 ) das Ladungsproblem, indem eine ionische Flüssigkeit auf eine Probenoberfläche aufgebracht wird, wodurch die tatsächliche Form einer Probe in einem Rasterelektronenmikroskop und einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet werden kann.
-
PTL 2 (
JP-A-2009-266741 ) ermöglicht die Betrachtung einer auf einer ionischen Flüssigkeit schwimmenden Probe, nachdem die Probe in die in einem Mikrogitter, Geflecht oder dergleichen befindliche ionische Flüssigkeit eingebracht wurde.
-
PTL 3 (
JP-A-2010-25656 ) gibt eine ionische Flüssigkeit auf eine Probe, um zu verhindern, dass eine Probenoberfläche der Atmosphäre ausgesetzt wird.
-
Liste der Literaturstellen
-
Patentliteratur
-
- PTL 1: WO2007/083756
- PTL 2: JP-A-2009-266741
- PTL 3: JP-A-2010-25656
-
Kurzbeschreibung der Erfindung
-
Problemstellung
-
Bei den Verfahren des Standes der Technik treten die folgenden Probleme auf. Bei der in PTL 1 beschriebenen Erfindung wird die ursprüngliche Feinstruktur der Probe oder die Mikroprobe selbst in einer ionischen Flüssigkeit vergraben, da die ionische Flüssigkeit auf eine Probenoberfläche aufgebracht wird. Durch die in PTL 2 beschriebene Erfindung kann eine Probe in einer ionischen Flüssigkeit in einem Transmissionselekronenmikroskop betrachtet werden. Mit diesem Verfahren kann jedoch die Probe nicht in einem Rasterelektronenmikroskop betrachtet werden, es sei denn, die Probe ist der Oberfläche der ionischen Flüssigkeit ausgesetzt, und es ist zur Einstellung der Orientierung der Probe erforderlich, dass ein Probenhalter bewegt wird. PTL 3 bringt eine ionische Flüssigkeit auf eine Probenoberfläche auf, wobei die ursprüngliche Feinstruktur der Probe oder die Mikroprobe selbst in der ionischen Flüssigkeit vergraben werden.
-
Eine Aufgabe einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine Technik zu entwickeln, bei der eine Probe, die auf der Oberfläche einer ionischen Flüssigkeit schwimmt, im Rasterelektronenmikroskop betrachtet werden kann, ohne dass sie von der ionischen Flüssigkeit (auch als Ionenflüssigkeit bezeichnet) bedeckt ist, bei der die Form der auf einer Flüssigkeitsoberfläche aggregierenden, dispergierenden und sich ausrichtenden Mikroprobe in natürlicher Weise, so wie sie auftritt, beibehalten werden kann, und bei der die Orientierung oder Richtung von einzelnen Mikroproben gesteuert werden kann.
-
Lösung der Problemstellung
-
Eine schwimmende oder hydrophobe Probe wird auf einer Oberfläche einer hydrophilen wässrigen Ionenflüssigkeitslösung schwimmen gelassen, um zu verhindern, dass die Mikroprobe von der ionischen Flüssigkeit bedeckt wird. Für hydrophile Proben wird eine hydrophobe ionische Flüssigkeit verwendet. Durch die Verwendung einer wässrigen Ionenflüssigkeitslösung geringer Viskosität und großer Fließfähigkeit kann die Probe frei aggregieren, dispergieren und sich an der Oberfläche der Ionenflüssigkeit ausrichten und auch nach Eintauchen in die Ionenflüssigkeit wieder schwimmen. Für die einfache Betrachtung im Rasterelektronenmikroskop wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung nach Stabilisierung der Form der Mikroprobe und vor der Betrachtung im Elektronenmikroskop getrocknet, um die Fließfähigkeit der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung zu erniedrigen.
-
Die herkömmlichen Probleme werden gelöst, indem die Mikroprobe nach diesen Vorbehandlungen im Rasterelektronenmikroskop betrachtet wird. Ferner wird die Richtung und Orientierung der einzelnen Mikroproben mit Hilfe von hydrophoben ionischen Flüssigkeiten und hydrophilen ionischen Flüssigkeiten, die für unterschiedliche Zwecke eingesetzt werden, eingestellt.
-
Vorteilhafte Wirkungen
-
Das Verfahren einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der eine schwimmende oder hydrophobe Probe betrachtet wird, wie sie an der Oberfläche einer hydrophilen wässrigen Ionenflüssigkeitslösung schwimmt, ist vorteilhaft, da es durch das Verfahren möglich ist, die Aggregation, Dispersion oder den Ausrichtungszustand der Mikroprobe auf der Flüssigkeitsoberfläche im Elektronenmikroskop zu betrachten, so wie sie in natürlicher Weise auftritt. Da hydrophile ionische Flüssigkeiten bzw. hydrophobe ionische Flüssigkeiten für hydrophobe bzw. hydrophile Proben verwendet werden, kann verhindert werden, dass die ionische Flüssigkeit an der Probenoberfläche anhaftet, sodass die Mikroprobe oder die Feinstruktur einer Probenoberfläche betrachtet werden kann. Da ferner nicht interessierende Komponenten in der ionischen Flüssigkeit ausgefällt werden, können die schwimmende oder hydrophobe Probe im Elektronenmikroskop in einfacher Weise beobachtet werden.
-
Im Falle einer zum Teil hydrophilen Probe ist nur der hydrophile Bereich mit der ionischen Flüssigkeit in Kontakt, wodurch es möglich ist, den hydrophoben Bereich in Richtung des Detektors eines Elektronenmikroskops auszurichten. Da die Probe in einer hydrophoben ionischen Flüssigkeit in der umgekehrten Richtung ausgerichtet wird, kann auch der hydrophile Bereich in Richtung des Detektors eines Elektronenmikroskops gelenkt werden. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es daher in vorteilhafter Weise möglich, die Probenorientierung mit der für unterschiedliche Zwecke verwendeten hydrophilen oder hydrophoben ionischen Flüssigkeit zu steuern.
-
Die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist für die Betrachtung von kleinen biologischen Materialien (wie kultivierte Zellen, schwimmendes Plankton und Pollen), funktionellen Substanzen (wie Katalysatoren, Arzneistoffe und Kosmetika), hydrophoben oder hydrophilen Harzen und amphiphilen Substanzen im Rasterelektronenmikroskop besonders effektiv.
-
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 ist eine Seitenansicht einer Probenkammer eines Elektronenmikroskops gemäß Beispiel 1.
-
2 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die eine Probe veranschaulicht, die in Bezug auf die Seitenansicht der Probenkammer des Elektronenmikroskops gemäß Beispiel 1 um 90° geneigt ist.
-
3 ist eine schematische Darstellung von Chromophyton rosanoffii des Beispiels 1.
-
4 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die die Vorgehensweise zum Erhalt einer elektronenmikroskopischen Aufnahme von Chromophyton rosanoffii nach dem Verfahren des Beispiels 1 darstellt.
-
5 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die zeigt, wie ein Chromophyton rosanoffii enthaltendes Kulturmedium in Beispiel 1 auf eine Siliciumscheibe getropft wird.
-
6 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die zeigt, wie ein Chromophyton rosanoffii enthaltendes Kulturmedium in Beispiel 1 zu einer wässrigen Ionenflüssigkeitslösung gegeben wird, um ein Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit zu bilden.
-
7 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die einen Zustand zumindest 3 Stunden nach der Zugabe der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung zu dem Chromophyton rosanoffii enthaltenden Kulturmedium in Beispiel 1 darstellt.
-
8 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die eine elektronenmikroskopische Aufnahme von unter einem Elektronenmikroskop unter Anwendung des Verfahrens gemäß Beispiel 1 betrachteten Chromophyton rosanoffii zeigt, aus der hervorgeht, dass das Betrachten von Chromophyton rosanoffii nach dem Verfahren des Beispiels 1 wirklich möglich ist.
-
9 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die eine elektronenmikroskopische Aufnahme von unter einem Elektronenmikroskop ohne Verwendung einer Ionenlösung betrachteten Chromophyton rosanoffii zeigt, aus der hervorgeht, dass lediglich Salzkristalle, die aus dem Kulturmedium stammen, betrachtet werden können und dass Chromophyton rosanoffii nicht zu sehen ist.
-
10 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die zeigt, wie in Beispiel 2 eine wässrige Ionenflüssigkeitslösung auf eine Siliciumscheibe gegeben wird.
-
11 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die zeigt, wie in Beispiel 2 Pollen über eine wässrige Ionenflüssigkeitslösung gestreut werden.
-
12 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die eine elektronenmikroskopische Aufnahme von unter einem Elektronenmikroskop unter Anwendung des Verfahrens gemäß Beispiel 2 betrachteten Pollen zeigt, aus der hervorgeht, dass das Betrachten von Pollen nach dem Verfahren des Beispiels 2 wirklich möglich ist.
-
13 ist ein erläuterndes Schaubild, in dem schematisch eine Probe des Beispiels 3 dargestellt ist, die zum Teil hydrophil und zum Teil hydrophob ist.
-
14 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die das Verfahren zum Aufbringen einer teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe nach dem Auftropfen einer hydrophilen wässrigen Ionenflüssigkeitslösung auf eine Siliciumscheibe in Beispiel 3 zeigt.
-
15 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die einen Zustand veranschaulicht, nachdem eine auf wässrige Ionenflüssigkeitslösung aufgebrachte teils hydrophile, teils hydrophobe Probe in Beispiel 3 für einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen wurde, wobei zu sehen ist, dass sich der hydrophobe Bereich in Richtung nach oben ausgerichtet hat.
-
16 ist eine erläuternde schematische Darstellung, die einen Zustand veranschaulicht, nachdem eine auf eine hydrophobe wässrige Ionenflüssigkeitslösung aufgebrachte teils hydrophile, teils hydrophobe Probe in Beispiel 3 für einen bestimmten Zeitraum stehen gelassen wurde, wobei zu sehen ist, dass sich der hydrophile Bereich in Richtung nach oben ausgerichtet hat.
-
Beschreibung von Ausführungsformen
-
Im Folgenden werden Beispiele der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die Zeichnungen beschrieben.
-
Beispiel 1
-
1 ist eine Seitenansicht einer Probenkammer eines Elektronenmikroskops des vorliegenden Beispiels. Das Elektronenmikroskop des vorliegenden Beispiels ist ein Rasterelektronenmikroskop, wobei sich im Innern der Probenkammer die Objektivlinse 1 des Elektronenmikroskops, ein Elektronenstrahl 3, der die Probe 2 durch die Objektivlinse 1 des Elektronenmikroskops bestrahlt, ein Detektor 5 für reflektierte Elektronen, der das Signal 4 der von der Probe 2 reflektierten Elektronen erfasst, und ein Sekundärelektronendetektor 7 befinden, der das Signal 6 der von der Probe 2 stammenden Sekundärelektronen erfasst. Die Probe 2 schwimmt auf der Oberfläche einer auf eine Siliciumscheibe 8 aufgetropften ionischen Flüssigkeit 9. In dem vorliegenden Beispiel wird die Ionenflüssigkeit 9 auf eine Siliciumscheibe 8 aufgetropft, die an einem Probentisch 10 des Elektronenmikroskops befestigt ist. Die Ionenflüssigkeit 9 kann jedoch auch direkt auf den Probentisch 10 des Elektronenmikroskops aufgetropft werden. In der Probe enthaltene Verunreinigungen 11 setzen sich am Boden der Tropfen der Ionenflüssigkeit 9 ab. Da die Ionenflüssigkeit 9 jedoch unter dem Elektronenmikroskop undurchsichtig ist, sind die Verunreinigungen 11 im Elektronenmikroskop nicht zu sehen. In dem vorliegenden Beispiel kann die Probe 2 auf der Oberfläche der Ionenflüssigkeit 9 fixiert werden und demnach auch durch Neigen des Probentisches des Elektronenmikroskops im rechten Winkel wie in 2 dargestellt auch von der Seite betrachtet werden.
-
Das vorliegende Beispiel beschreibt eine Technik, bei der ein kleines biologisches Material auf der ionischen Flüssigkeit betrachtet wird, wobei als Probe das Phytoplankton Chromophyton rosanoffii verwendet wird, das die Eigenschaft hat, in einer Flüssigkeit zu schwimmen. Das hier beschriebene Beispiel ist nicht auf Chromophyton rosanoffii beschränkt, sondern ist auch auf die Betrachtung von anderen kleinen biologischen Molekülen anwendbar, wie Arthropoden, Plankton und kultivierte Zellen, sowie anderen Materialien, die niedrigere Dichten aufweisen als die Ionenflüssigkeit oder Ionenflüssigkeitslösung, wobei schwimmende Proben, funktionelle Substanzen wie Arzneistoffe und Kosmetika, feinkristalline Stoffe und pulverförmige organische Materialien eingeschlossen sind.
-
3 ist eine schematische Ansicht von Chromophyton rosanoffii. Wie in 3 dargestellt ist, setzt sich Chromophyton rosanoffii aus einem Zellkörper 12 und einem Stielchenbereich 13 zusammen und es schwimmt auf einem Kulturmedium 14, wobei der Stielchenbereich mit der Flüssigkeitsoberfläche in Kontakt ist. 4 ist eine erläuterndes Diagramm, das die Vorgehensweise zum Erhalt einer elektronenmikroskopischen Aufnahme von Chromophyton rosanoffii nach dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt. Zunächst wird das Kulturmedium, das Chromophyton rosanoffii enthält, auf die Siliciumscheibe getropft. Dieser Zustand ist in dem erläuternden Schaubild von 5 gezeigt. Anstelle der Siliciumscheibe kann auch ein metallischer Probentisch für ein Elektronenmikroskop verwendet werden. In diesem Fall sollte der Probentisch vorzugsweise eine flache Oberfläche aufweisen. Bezugnehmend auf 5 wird in dem Chromophyton rosanoffii enthaltenden Kulturmedium das Wasser des Habitats von Chromophyton rosanoffii verwendet, wobei es sich um eine wässrige Lösung handelt, die Salze enthält. Bezugnehmend auf 5 wird als Vorrichtung 15, die zum Auftropfen des Chromophyton rosanoffii-haltigen Kulturmediums verwendet wird, möglichst eine Meßmikropipette verwendet. Es kann jedoch auch eine nicht unterteilte Mikropipette verwendet werden, wenn es nicht erforderlich ist, die aufgetropfte Menge des Kulturmediums festzulegen. Die optimale Tropfenmenge des Kulturmediums hängt von der Siliciumscheibe oder dem Probentisch ab. Eine geeignete Menge ist etwa 20 μl für eine Größe von etwa 1 cm2.
-
Wie in dem erläuternden Diagramm von 6 dargestellt ist, wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung zu dem Chromophyton rosanoffii-haltigen Kulturmedium gegeben, um ein Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit herzustellen. Die wässrige Ionenflüssigkeitslösung wird hergestellt, indem die ionische Flüssigkeit mit destilliertem Wasser verdünnt wird, wobei sie vorzugsweise eine Konzentration von 20% oder darunter aufweist. Höhere Ionenflüssigkeitskonzentrationen können zu einer unzureichenden Trocknung führen und die ionische Flüssigkeit fluidisieren. Dies kann zu Problemen bei der Betrachtung im Elektronenmikroskop führen. Das vorliegende Beispiel verwendet Chromophyton rosanoffii, das hydrophobe Eigenschaften aufweist, und demnach eine hydrophile Ionenflüssigkeit (C8H15N2BF4). Für hydrophile Proben wird vorteilhafterweise eine hydrophobe ionische Flüssigkeit verwendet. Bezugnehmend auf 6 wird als Vorrichtung 17, die zum Auftropfen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung verwendet wird, vorteilhaft eine Meßmikropipette verwendet. Es kann jedoch auch eine nicht unterteilte Pipette verwendet werden, wenn es nicht erforderlich ist, die aufgetropfte Menge der ionischen Flüssigkeit festzulegen. Die optimale Tropfenmenge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung hängt von der Menge des Kulturmediums ab, wobei es günstig ist, die wässrige Ionenflüssigkeitslösung im Vergleich zu der Menge des Kulturmediums in geringeren Mengen aufzutropfen. In dem vorliegenden Beispiel wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung auf das Chromophyton rosanoffii-haltige Kulturmedium getropft. Umgekehrt kann auch das Chromophyton rosanoffii-haltige Kulturmedium auf die wässrige Ionenflüssigkeitslösung getropft werden.
-
7 zeigt einen Zustand zumindest 3 Stunden nach der Zugabe der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung zu dem Kulturmedium. Nach dem Stehenlassen für mindestens 3 Stunden taucht der Zellkörper 11 von Chromophyton rosanoffii auf, wobei der Stielchenbereich 12 mit dem Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit in Kontakt ist, wie in 7 veranschaulicht ist. Es wird hierbei darauf hingewiesen, dass die zum Auftauchen von Chromophyton rosanoffii erforderliche Zeitpanne in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen variiert und die 3-stündige Ruheperiode als Anhaltspunkt aufzufassen ist. Die Wasserkomponente in dem Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit verdampft während der langen Standzeit, wobei das Volumen schrumpft, sodass die Form der Tröpfchen wie bei einem dünnen Film dünner wird. Die Wasserkomponente in dem Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit stammt überwiegend aus dem Kulturmedium. Da das Kulturmedium Salzkomponenten aufweist, kristallisieren die Salzkomponenten mit steigender Salzkonzentration in Folge des Trocknens aus. Bezugnehmend auf 7 verbleiben die kristallisierten Salzkomponenten 18 in dem Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit, wobei sie in einem Lichtmikroskop oder durch visuelle Prüfung zu sehen sind.
-
In dem in 7 dargestellten Zustand ist Elektronenmikroskopie mit der Maßgabe möglich, dass das Gemisch 16 aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit ausreichend getrocknet ist. Wenn die Trocknung ungenügend zu sein scheint, kann das Gemisch unter Vakuum getrocknet werden. Eine Vorrichtung zur Vakuumentgasung mit einem Beobachtungsfenster kann letztendlich zur Vorbehandlung oder als Sicherheitsmaßnahme vor dem Einbringen der Probe in die Probenkammer des Elektronenmikroskops verwendet werden, da eine solche Vorrichtung auf das Vorhandensein oder Fehlen von Siedeverzug prüfen kann. Wenn die Trocknungszeit nach Zugabe der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung zu dem Kulturmedium etwa 3 Stunden beträgt, kann das Chromophyton rosanoffii unter dem Elektronenmikroskop infolge der verbliebenen Fließfähigkeit des Gemisches aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit schnell eine Fließbewegung erfahren. Es wird daher vorzugsweise eine möglichst lange Trocknungszeit gewählt. Es ist aber auch möglich, die Trocknungszeit durch die Verwendung eines Trocknungsgeräts zu verkürzen.
-
8 ist eine Beispiel, bei dem das Verfahren dieses Beispiels tatsächlich zur Betrachtung von Chromophyton rosanoffii im Elektronenmikroskop angewandt wurde. 8 zeigt den Zellkörper 11 und den Stielchenbereich 16 von Chromophyton rosanoffii und das Gemisch 16 aus Kulturmedium und Ionenflüssigkeit. In diesem Beispiel wurde die Probe um 70° geneigt. Da jedoch das Fließen des Gemisches aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit minimiert ist, bleibt das Chromophyton rosanoffii aufrecht.
-
Als Referenz zeigt 9 ein Beispiel, bei dem Chromophyton rosanoffii ohne Anwendung des Verfahrens dieses Beispiels betrachtet wurde. Ohne Ionenflüssigkeit kristallisieren die Salze aus dem Chromophyton rosanoffii-Kulturmedium aus und stellen ein Erschwernis bei der Betrachtung von Chromophyton rosanoffii dar. Da das Kulturmedium vollständig trocknet, ist das auf der Flüssigkeit schwimmende Chromophyton rosanoffii nicht zu sehen. Die Salzkristalle sind in 9 mit dem Bezugszeichen 18 versehen.
-
Bezugnehmend auf 8 wird angenommen, dass die Salzkristalle bei dem Verfahren dieses Beispiels entweder ausfallen oder sich in dem Gemisch aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit lösen. Da das Gemisch aus Kulturmedium und ionischer Flüssigkeit unter dem Elektronenmikroskop undurchsichtig ist, sind die in dem Gemisch ausgefallenen Salze nicht zu sehen. Hierdurch wird die Betrachtung von Chromophyton rosanoffii erleichtert.
-
Beispiel 2
-
Das vorliegende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur mühelosen Betrachtung von Pollen im Elektronenmikroskop, wobei Pollen auf der ionischen Flüssigkeit von Sandkörner enthaltenden Pollen getrennt werden. Die Technik ist nicht auf Pollen beschränkt, sie lässt sich ebenso auf die Betrachtung von kleinen biologischen Materialien wie Sporen, Milben und Insekten, und schwimmende Proben oder hydrophobe Proben mit einer Dichte kleiner als Wasser anwenden.
-
Zunächst wird eine wässrige Ionenflüssigkeitslösung auf eine Siliciumscheibe getropft. Dieser Zustand ist durch das erläuternde Diagramm von 10 veranschaulicht. Es kann anstelle der Siliciumscheibe auch ein metallischer Probentisch für die Elektronenmikroskopie verwendet werden. In diesem Fall sollte der Probentisch vorzugsweise eine glatte Oberfläche haben. Bezugnehmend auf 10 wird als Vorrichtung 17, die zum Auftropfen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung verwendet wird, möglichst eine Meßmikropipette verwendet. Es kann jedoch auch eine nicht unterteilte Mikropipette verwendet werden, wenn es nicht erforderlich ist, die aufgetropfte Menge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung festzulegen. Die optimale Tropfenmenge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung hängt von der Siliciumscheibe oder dem Probentisch ab. Eine geeignete Menge ist etwa 20 μl für eine Größe von etwa 1 cm2. Bezugnehmend auf 10 wird eine wässrige Ionenflüssigkeitslösung 19 hergestellt, indem die ionische Flüssigkeit mit destilliertem Wasser verdünnt wird, wobei sie vorzugsweise eine Konzentration von 5% oder darunter oder so niedrig wie 1% aufweist. Höhere Ionenflüssigkeitskonzentrationen können zu einer unzureichenden Trocknung führen und die ionische Flüssigkeit fluidisieren. Dies kann zu Problemen bei der Betrachtung im Elektronenmikroskop führen. Die Viskosität der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung nimmt ab, wenn die Konzentration der ionische Flüssigkeit abnimmt. Bei niedrigeren Konzentrationen ist es daher einfacher, die wässrige Ionenflüssigkeitslösung über der Siliciumscheibe zu verteilen. Durch das Entfernen der Wasserkomponente aus der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung in dem nachfolgenden Trocknungsschritt wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung 19 noch dünner (wie ein dünner Film).
-
In diesem Beispiel wird die hydrophile ionische Flüssigkeit (C8H15N2BF4) verwendet. Für Proben mit hydrophilen Eigenschaften wird jedoch vorzugsweise eine hydrophobe ionische Flüssigkeit verwendet.
-
Danach werden wie in 11 dargestellt die Pollen 20 über die wässrige Ionenflüssigkeitslösung 19 gestreut und für einen ganzen Tag stehen gelassen, um die überflüssige Wasserkomponente zu entfernen. In diesem Fall können die Pollen aufgestreut werden, nachdem die wässrige Ionenflüssigkeitslösung zur ausreichenden Trocknung für einen ganzen Tag stehen gelassen wurde. Vorzugsweise wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung für einen ganzen Tag stehen gelassen, um die unnötige Wasserkomponente zu entfernen. Die Ruhezeit kann jedoch verkürzt werden, indem die Tropfenmenge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung vermindert wird, oder durch Verwendung eines Trocknungsgeräts. Wenn die Pollen vor dem Trocknen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung aufgestreut werden, sind sie nach dem Trocknen der Lösung zum Teil auf der Flüssigkeitsoberfläche in der wässrige Ionenflüssigkeitslösung verborgen. Die Pollen werden jedoch auch in diesem Fall vorzugsweise fixiert. Wenn die Pollen andererseits nach dem Trocknen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung aufgestreut werden, werden sie nicht in der Ionenflüssigkeit vergraben und sind wie gewünscht zu betrachten. In beiden Fällen setzten sich Verunreinigungen wie Sandkörner, die eine höher Dichte als die wässrige Ionenflüssigkeitslösung aufweisen, in der Ionenflüssigkeit ab und werden von den Pollen, auf die abgezielt wird, abgetrennt. Die Ionenflüssigkeit ist im Elektronenmikroskop undurchsichtig und Verunreinigungen, wie Sandkörner, sind im Sichtfeld des Rasterelektronenmikroskops nicht zu sehen.
-
Die Pollen können unabhängig davon, ob sie vor oder nach dem Trocknen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung aufgestreut wurden, unter der Voraussetzung, dass die Wasserkomponente in der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung hinreichend verdampft wurde, im Elektronenmikroskop betrachtet werden. Für eine hinreichende Trocknung kann vor der Betrachtung im Elektronenmikroskop unter Vakuum getrocknet werden.
-
12 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines aufgestreuten Pollens nach dem Trocknen der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung. In 12 sind die wässrige Ionenflüssigkeitslösung 19 und der Pollen 20 gezeigt. Der Pollen 20 ist fixiert, ohne dass er in der wässrige Ionenflüssigkeitslösung 19 vergraben ist.
-
Beispiel 3
-
Das vorliegende Beispiel beschreibt eine Methode, bei der eine teils hydrophile, teils hydrophobe Probe in einer bestimmten Probenorientierung fixiert wird. In 13 ist die teils hydrophile, teils hydrophobe Probe schematisch dargestellt. Wie in 13 gezeigt ist, ist die teils hydrophile, teils hydrophobe Probe eine Probe, die sich aus einem hydrophoben Bereich 21 und einem hydrophilen Bereich 22 zusammensetzt.
-
Zunächst wird eine hydrophile wässrige Ionenflüssigkeitslösung 3 auf eine Siliciumscheibe aufgetropft, wie in 14 dargestellt ist. Es kann auch ein metallischer Probentisch für die Elektronenmikroskopie anstelle der Siliciumscheibe verwendet werden. In diesem Fall sollte der Probentisch vorzugsweise eine glatte Oberfläche haben. Die optimale Tropfenmenge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung hängt von der Siliciumscheibe oder dem Probentisch ab. Eine geeignete Menge ist etwa 20 μl für eine Größe von etwa 1 cm2. Die wässrige Ionenflüssigkeitslösung wird hergestellt, indem die ionische Flüssigkeit mit destilliertem Wasser verdünnt wird, wobei sie vorzugsweise eine Konzentration von 5% oder darunter oder so niedrig wie 1% aufweist. Danach wird wie in 14 gezeigt eine teils hydrophile, teils hydrophobe Probe über die wässrige Ionenflüssigkeitslösung 23 gestreut und für einen ganzen Tag stehen gelassen. Wenn die teils hydrophile, teils hydrophobe Probe in einer Lösung enthalten ist, wird die die Probe enthaltene Lösung mit einer Pipette oder dergleichen auf die wässrige Ionenflüssigkeitslösung aufgetropft. Umgekehrt kann auch die wässrige Ionenflüssigkeitslösung auf die die Probe enthaltene Lösung aufgetropft werden.
-
Die teils hydrophile, teils hydrophobe Probe wird über die wässrige Ionenflüssigkeitslösung gestreut und für eine bestimmte Zeitspanne stehen gelassen. Dadurch kommt wie in 15 dargestellt der hydrophile Bereich der teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe mit der wässrige Ionenflüssigkeitslösung in Kontakt, wobei die Ausrichtung mit dem hydrophoben Teil 21 nach oben gerichtet erfolgt. Durch Verdampfen der entbehrlichen Wasserkomponente wird die Probe fest auf der Oberfläche der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung fixiert. Die auf diese Weise behandelte Probe kann nun in dem in 15 dargestellten Zustand im Elektronenmikroskop betrachtet werden.
-
Vorzugsweise wird die wässrige Ionenflüssigkeitslösung für einen ganzen Tag stehen gelassen, um die unnötige Wasserkomponente in der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung zu entfernen. Die Ruhezeit kann jedoch verkürzt werden, indem die Tropfenmenge der wässrigen Ionenflüssigkeitslösung vermindert wird, oder durch Verwendung eines Trocknungsgeräts. Mit diesem Verfahren kann nur der hydrophobe Bereich der teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe im Elektronenmikroskop betrachtet werden.
-
Für die Betrachtung des hydrophilen Teils der teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe sollte andererseits der hydrophile Bereich 22 durch Verwendung einer hydrophoben ionischen Flüssigkeit 24 wie in 16 dargestellt nach oben ausgerichtet werden.
-
Bezugszeichenliste
-
- 1
- Objektivlinse des Elektronenmikroskops
- 2
- Probe
- 3
- Elektronenstrahl
- 4
- Signal der reflektierten Elektronen
- 5
- Detektor für reflektierte Elektronen
- 6
- Sekundärelektronensignal
- 7
- Sekundärelektronendetektor
- 8
- Siliciumscheibe
- 9
- Ionenflüssigkeit
- 10
- Probentisch eines Elektronenmikroskops
- 11
- Verunreinigungen
- 12
- Zellkörper von Chromophyton rosanoffii
- 13
- Stielchenbereich von Chromophyton rosanoffii
- 14
- Chromophyton rosanoffii-haltiges Kulturmedium
- 15
- Vorrichtung zum Auftropfen eines Chromophyton rosanoffii-haltigen Kulturmediums
- 16
- Gemisch aus Chromophyton rosanoffii-haltigem Kulturmedium und Ionenflüssigkeit
- 17
- Vorrichtung zum Auftropfen einer wässrigen Ionenflüssigkeitslösung
- 18
- Salzkristalle
- 19
- wässrige Ionenflüssigkeitslösung
- 20
- Pollen
- 21
- hydrophober Bereich einer teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe
- 22
- hydrophiler Bereich einer teils hydrophilen, teils hydrophoben Probe
- 23
- hydrophile wässrige Ionenflüssigkeitslösung
- 24
- hydrophobe wässrige Ionenflüssigkeitslösung
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- WO 2007/083756 [0005]
- JP 2009-266741 A [0006]
- JP 2010-25656 A [0007]