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Verfahren und Vorrichtung.
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zum Hervorrufen und zur Beeinflussung des Wachstums von Mikroorganismen,
insbesondere von Bakterien od. dgl. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
und eine Vorrichtung zur Förderung oder Hemmung des Wachstums von Organismen, insbesondere
niederer Formen, wie Bakterien, Hefen, Pilzen od. dgl., die auf künstlichen Böden
in verhältnismäßig kurzer Zeit wachsen. Vorwiegend werden derart gezüchtete Bakterien
für die hygienische Überprüfung von Abwässern in der Nähe menschlicher Siedlungen
oder von Flüssen oder Seen zur Bekämpfung von Seuchen od. dgl. benötigt.
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Die Erfindung geht von der bekannten Tatsache aus, daß mit Hilfe einer
hochporösen und als Sieb wirkenden Membran, beispielsweise auf der Basis von Trockengelen,
aus einer großen Flüssigkeitsmenge die Bakterien abgetrennt werden können. Diese
Bakterien sammeln sich nämlich beim Durchfließen der Flüssigkeit auf der Membranoberfläche
und können so von der Flüssigkeit getrennt werden. Derartige Membranen mit gesammelten
Bakterien hat man bisher auf einen künstlichen, frischen, sogenannten Nährboden,
z. B. Agar-Agar- oder Bouillon-Boden, gesetzt, aus dem den Bakterien die notwendige
Nähr- und Hemmsubstanz zugeführt werden konnte. Dabei zieht im allgemeinen die Membran
auf Grund ihrer außerordentlich feinen und gleichmäßig verteilten Kapillaren die
Flüssigkeit aus dem frischen Nährboden und bringt diese mit den Bakterienkolonien
in Berührung.
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Diese frischen Nährböden haben den Nachteil, daß sie sehr kurzlebig
in ihrer Nährwirkung sind und daher immer neu in einem Laboratorium wieder angesetzt
werden müssen. Außerdem gibt jeder künstliche Boden nur eine bestimmte Nähr- oder
Hemmsubstanz an die Membran ab. Sollen nun in kurzen Zeitabständen verschiedene
Substanzen abwechselnd der Membranoberfläche und damit den Bakterien zugeführt werden,
beispielsweise dem einen Teil der Bakterien ihr Wachstum fördernde Nährsubstanzen
und dem anderen Teil der Bakterien ihr Wachstum hemmende Substanzen (Inhibitoren),
so muß der Nährboden schnell ausgewechselt werden. Es muß also ständig für derartige
Versuchsreihen ein Laboratorium zur Verfügung stehen, in dem die entsprechenden
Nährböden hergestellt werden können.
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Weiterhin ist es bereits beschrieben worden, unterhalb einer als Filter
wirkenden Membran, auf welcher die Mikroorganismen angesammelt werden, eine hochporöse
Kartonscheibe anzuordnen, die nach Berührung einer Flüssigkeit die in ihr gelösten
Nährbodenkomponenten an die Membran mit den Mikroorganismen abgibt. Aus einer weiteren
Druckschrift ist es bekannt, die hochporöse Membran zwischen einem Träger mit einer
zunächst getrockneten und dann rehydrierten Nährsubstanz bzw. der Hemmsubstanz und
einer als Sieb wirkenden und die Mikroorganismen tragenden Membran anzuordnen. Eine
zeitliche Regulierung der Zugabe der Nährbodensubstanz ist bei derartigen Anordnungen
nicht möglich.
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Gemäß der Erfindung werden zum Hervorrufen und zur Beeinflussung des
Wachstums von Mikroorganismen, bei dem wachstumsfördernde und/oder wachstumshemmende,
auf mehreren neutralen Trägern aufgebrachte Nährbodensubstanzen zunächst getrocknet
und unmittelbar vor der Benutzung in den ursprünglich gelösten Zustand unter Einhaltung
einer gewissen Konzentration unter sterilen Bedingungen übergeführt werden, wobei
die neutralen Träger unterhalb einer als Sieb wirkenden und die Mikroorganismen
tragende Membran in unmittelbarer Berührung mit dieser angeordnet sind, die Nährbodenkomponenten
aus den untergelegten neutralen Trägern staffel- oder stufenweise kontinuierlich
der Membranoberfläche zugeführt werden.
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Als Träger kann man vorzugsweise chemisch neutrale, hydrophile Filze,
insbesondere aus Pflanzenfasern, wie Zellulosefasern, verwenden. Hier hat sich insbesondere
füll- und leimstofffreies Filterpapier bewährt, das bei der Herstellung mit einer
Nähr- und/ oder Hemmsubstanz getränkt oder bedruckt und unmittelbar danach getrocknet
worden ist.
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Zum staffelweisen Behandeln eines Bakterienrasens werden zweckmäßigerweise
zwei oder mehr Träger für die Nähr- und Hemmsubstanzen derart übereinander
angeordnet,
und die Trägersubstanz des die Membran berührenden Trägers wird derart abggstimmt,
daß die Hemmsubstanz des darunter angeordneten Trägers beim Aufsteigen durch den
die Membran berührenden Träger von den gleichzeitig mitaufsteigenden Nährsubstanzen
chromatographisch getrennt werden und die Membran nicht erreichen, bevor die Sorptionskapazität
des die Membran berührenden Trägers gesättigt ist. Dabei läßt sich durch geeignete
Dimensionierung der Flüssigkeits- und Sorptionskapazität der übereinander angeordneten
Träger der Zeitpunkt genau bestimmen, an dem die Bakterienkultur mit der Hemmsubstanz
in Berührung kommt. Es wird dadurch erreicht, daß wachstumsgehemmte Bakterien ohne
Hemmsubstanz sich innerhalb der ersten Stunden der Bebrütung entwickeln können,
d. h. in die sogenannte logarithmische Wachstumsphase eintreten können. Wird die
Zeitdauer der Zufuhr der hemmsubstanzfreien Nährsubstanz darin beschränkt, daß die
Kolonien noch nicht sichtbar werden, so bleiben sie auch noch unsichtbar beim Abschluß
der Bebrütungsdauer, da ihr weiteres Wachstum in den sichtbaren Bereich durch die
Hemmsubstanz verhindert wird.
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Es ist auf diese Weise möglich, den Bakterien außerordentlich günstige,
anfängliche Wachstumsbedingungen zu bieten. Damit läßt sich die Zeitdauer der Bebrütung
sehr erheblich verkürzen, die erforderlich ist, um deutlich auszahlbare Kolonien
zu erhalten, so daß beispielsweise im Falle von Colibakterien eindeutig auszahlbare
Kolonien bereits nach 14 bis 16 Stunden erreicht werden können im Gegensatz zu einer
bisher erreichbaren niedrigsten Zeitdauer von 36 Stunden. Diese Zeitverkürzung ist
insbesondere bei Seuchengefahr von wesentlicher Bedeutung, um die Vorwarnung möglichst
frühzeitig geben zu können.
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Als wachstumssteigernde Substanz kann auf das Filterpapier eine Lösung
von Traubenzucker, Peptonen, Hefeautolysaten durchTränken oder Bedrucken aufgebracht
werden; das so behandelte Filterpapier wird mit der Nährsubstanz getrocknet, und
die Nährsubstanzen werden unmittelbar vor der Benutzung wieder in den ursprünglichen,
gelösten Zustand, unter Einhaltung einer bestimmten Konzentration, unter sterilen
Bedingungen übergeführt. Als wachstumsfördernde Substanz einerseits kann auf einem
anderen Träger eine Lösung von Milchzucker und Peptonen und als selektiv wachstumshemmende
Substanz Fuchsin und Natriumsulfit aufgegeben werden.
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Um die Entwicklungsbedingungen bestimmter Organismen zu förden, wird
zweckmäßig zur Einhaltung eines dementsprechenden pff-Wertes der zum Wachstum der
lllikroorganismen erforderlichen Nährlösung vor dem Aufbringen auf den Träger und/oder-
der un> mittelbar vor der Benutzung zugeführten wäßrigen Lösung oder Wasser eine
Puffersubstanz, vorzugsweise ein Phosphatpuffer, zugegeben.
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Träger, die mit den vorstehend genannten Nähr- und Hemmsubstanzen
versehen sind, können unterhalb der die Bakterien tragenden Membran derart angeordnet
werden, daß das Füchsin im unteren Träger als Hemmsubstanz bei seinem Aufsteigen
durch die Hohlraumstruktur des der Membran benachbarten Trägers chromatographisch
so lange, wie dessen Trägersubstanz nicht gesättigt ist, sortiert und nach dessen
Sättigung an die Membranoberfläche geführt :--ird. Die Träger werden dabei mit der
Membran in einen Behälter eingeschlossen und bei Temperaturen, vorzugsweise zwischen
30 und 37° C, bebrütet.
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Eine besondere Schwierigkeit breitet die sterile 'L_rrhetvahrung derartiger
mit Nähr- oder Hemmsubstanzen versehener Träger und Membranen. Gemäß der Erfindung
werden die Träger und die Membranen in einem luft-, wasser- und bakteriendichten
Behälter aufbewahrt, dessen Wandung ganz oder teilweise aus Kunststoffolie, vorzugsweise
Polyäthylen, besteht. Ein derartiger Behälter mit eingeschlossenen und getrockneten
Trägern sowie der oder den Membranen wird einem sterilisierenden Gas ausgesetzt,
das durch die Kunststoffolie diffundiert. Besteht der Behälter ganz oder teilweise
aus einer Kunststofffolie auf der Basis von Polyäthylen, so wird zweckmäßig zum
Sterilisieren der Behälter einem Luftstrom mit geringen Mengen gasförmigen Äthylenoxyds
ausgesetzt, wobei der Partialdruck dieses Gases auf der Außenseite der Polyäthylenfolie
größer sein muß als auf deren Innenseite. Setzt man anschließend den so behandelten
Behälter einem äthylenoxydfreien Luftstrom aus und erniedrigt damit den Partialdruck
des Äthylenoxyds auf der Außenseite gegenüber der Innenseite der Polyäthylenfolie,
so diffundiert das eingedrungene Äthylenoxyd wieder nach außen. nachdem es die in
der Folie eingeschlossenen Träger und Membranen keimfrei gemacht hat.
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Zur Erläuterung der Erfindung soll im folgenden ein Ausführungsbeispiel
beschrieben werden, bei dem ein Bakterienrasen, der aus verschiedenartigen Bakterien
besteht, nacheinander (stufen- oder staffelweise) sowohl mit wachstumsfördernden
als auch mit wachstumshemmenden Substanzen behandelt wird. Beispielsweise sollen
zur Überprüfung von Abwässern auf Colibakterien einem auf einer Membranoberfläche
gesammelten Bakterienrasen zunächst ein für alle Bakterien wachstumsanregender Stoff
zugeführt und nach einer bestimmten Zeit, beispielsweise nach 3 bis 6 Stunden, neben
derselben oder einer anderen wachstumsfördernden Substanz eine selektiv wachstumshemmende
Substanz zugeführt werden, die einen Teil der Bakterien in ihrem Wachstum beeinträchtigt;
so daß sie späterhin, beispielsweise nach 16 Stunden, seit Beginn des Wachstums
ausgezählt werden können. Die zu einer solchen Untersuchung gemäß der Erfindung
gewählte Vorrichtung oder Anordnung ist aus der Zeichnung zu ersehen. Es zeigt Fig.
1 einen Längsschnitt durch übereinandergelegte Filter mit darüber angeordneter Membran,
Fig. 2 einen Schnitt durch dieselben Träger und dieselbe Membran mit Bakterienrasen
in einem Glasgefäß, Fig. 3 eine -Draufsicht auf einen Kunststoffolienbeutel mit
eingelegten getrockneten Trägern und Membran.
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Mit 10 ist die aus einem Trockengel bestehende Membran bezeichnet.
Das Trockengel besteht beispielsweise aus einer Mischung von Zelluloseestern (Nitraten,
Acetaten) und weist einen Porositätsgrad von 75 bis 80% auf. Seine Oberfläche ist
hydrophil, und die Gesamtzahl der Porenöffnungen an dieser Oberfläche beträgt etwa
10 000 000 bis 500 000 000 pro-cm2. Der maximale, effektive Porendurchmesser ist
etwa 0,5 l,. Die Membran ist rund bei einem Durchmesser von etwa 5 cm und einer
Dicke von 120 bis 150 [,. Der Strömungswiderstand dieser Membran ist derart, daß
1 bis 2 cm3 Wasser pro cm2 Membranoberfläche pro Sekunde bei einer Druckdifferenz
von etwa 1 atü durchlaufen kann.
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Unterhalb dieser Membran befindet sich in unmittelbarer Berührung
mit dieser der mit 11 bezeichnete, ebenfalls kreisrunde Träger aus Filterpapier
gleichen Durchmessers. Dieser Träger ist 0,3 bis 0,8 mm dick. Seine Hohlraumstruktür
ist mit einer Nährsubstanz, und zwar einer Lösung von Traubenzucker,
Peptonen
und Hefeautolysaten, bedruckt und unmittelbar nach dem Bedrucken an der Luft getrocknet.
In unmittelbarer Berührung mit diesem Filterpapier 11 ist ein weiteres Filterpapier
12 als Träger für eine wachstumssteigernde und selektiv wachstumshemmende Substanz
angeordnet. Die Dicke dieses Trägers beträgt 1 bis 2 mm bei einem Durchmesser von
5 cm. Dieser Träger ist bedruckt oder imprägniert mit einer Nährsubstanz, und zwar
einer Lösung von Milchzucker und Peptonen einerseits und einer wachstumshemmenden
Substanz, und zwar einer Lösung von Fuchsin und Natriumsulfit, wobei dieser letzten
Lösung zur Einhaltung eines pH-Wertes von etwa 7,2 ein Phosphatpuffer beigegeben
ist.
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Fig. 3 zeigt die so behandelten Träger und ein oder mehrere Membranen
übereinander angeordnet in einem ausschließlich aus Kunststoffolie auf der Basis
von Polyäthylen bestehenden Tasche. Diese Tasche ist aus einem Schlauch durch Verschweißen
des oberen und unteren Randes hergestellt und schließt den Inhalt luft-, Wasser-
und bakteriendicht ab. Diese Tasche wird zum Sterilisieren einem Luftstrom mit Äthylenoxyd
ausgesetzt, wobei das Äthylenoxyd nur in Spuren vorhanden ist, beispielsweise in
einer Menge von 1/z o/oo. Auf Grund des außerhalb der Tasche herrschenden höheren
Partialdruckes des Äthvlenoxvds diffundiert dieses Gas selektiv durch die yPolyäthylenfolie
in den Behälter und sterilisiert die getrockneten Träger und Membranen. Wird der
Behälter daraufhin in einen anderen Raum gebracht, in dem von Äthylenoxyd freie
Luft kreist, dann diffundiert infolge des höheren Partialdruckes des Äthylenoxyds
dieses aus der Folie hinaus, bis die Partialdruckdifferenz dieses Gases auf beiden
Seiten gleich groß ist.
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Verwendet man eine andere Kunststoffolie, so gibt es hierfür sterilisierende
Gase, die auf Grund ihrer selektiven Diffusion in das Innere eindringen und nach
Umkehrung des Partialdruckes aus diesem wieder hinausdiffundieren können. Derartig
sterilisierte und in einer Kunststoffolie eingeschlossenen Vorrichtungen mit ausgetrockneten
Trägern und Membranen sind über Monate und Jahre haltbar.
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LTnmittelbar vor der Benutzung schneidet man den Plastikbehälter auf,
entnimmt diesem die für die Untersuchung gewünschten Membranen 10 und sarninelt
auf deren Oberfläche den zu überprüfenden Bakterienrasen 14. Dieser wird dann auf
die übereinandergeschichteten, die Nähr- und Hemmsubstanzen in trockenem Zustande
enthaltenden Filterpapierscheiben 11 und 12 (vgl. Fig. 2) aufgelegt. Die Unterseite
des unteren Trägers 12 wird dann mit einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise Wasser,
in Berührung gebracht. Die gesamte Flüssigkeitskapazität der Trägerscheiben beträgt
dabei 2,2 bis 2,5 cm3. Gibt man dementsprechend eine Wassermenge in einen Behälter,
legt darauf die Scheiben 12, 11 mit der Membran 10, so saugt sich die Hohlraumstruktur
der Filterscheiben 12, 11 voll und löst die darin enthaltenen Nähr- und Hemmsubstanzen.
Durch die Kapillarwirkung der Membran und der Träger steigen die Nähr- und Hemmsubstanzen
durch die ?Membran an deren Oberfläche und kommen damit mit den Zellen des Bakterienrasens
in Berührung. Die Hohlraumstruktur der Träger ist dabei so festgelegt und abgestimmt,
daß zunächst nur die Nährsubstanz aus dem oberen Träger der Membran zugeführt wird,
während die aus dem unteren Träger aufsteigende Hemmsubstanz so lange vor der Berührung
mit der Membran zurückgehalten wird, bis die Sorptionskapazität des oberen Trägers
gesättigt ist. Die Nähr- und Hemmsubstanzen werden dadurch chromatographisch getrennt
und der Membranoberfläche in verschiedenen Zeitabständen kontinuierlich zugeführt.
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Die übereinandergelegten Filterpapierscheiben mit der darüber befindlichen
Membran und dem Bakterienrasen werden nach Zugabe des Wassers in einen Behälter
eingeschlossen und unter einer Temperatur von 30 bis 37-- C bebrütet.
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Die Colibakterien wachsen, so daß sie allein ausgezählt werden können,
während die nicht erwünschten Bakterien gehemmt werden. Die gelösten Nähr-und Hemmsubstanzen
haben dabei eine Konzentration, die optimal auf die osinotischen Verhältnisse der
Bakterienzelloberflächen abgestimmt ist.