Verfahren zur Beeinflussung des Wachstums von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien oder dergleichen Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Behandlung von Mikro organismen, insbesondere Bakterien, Hefen, Pilzen oder dergleichen, die auf künstlichen Böden in ver- hältnismässig kurzer Zeit wachsen, mit wachstums fördernden und/oder wachstumshemmenden Stoffen. Vorwiegend werden derart gezüchtete Bakterien für die hygienische Überprüfung von Abwässern in der Nähe menschlicher Siedlungen oder von Flüssen oder Seen zur Bekämpfung von Seuchen oder der gleichen benötigt.
Es ist bekannt, mit Hilfe einer hochporösen und als Sieb wirkenden Membran, beispielsweise auf der Basis von Trockengelen, aus einer grossen Flüssig keitsmenge Bakterien abzutrennen ; diese Bakterien sammeln sich beim Durchfliessen der Flüssigkeit auf der Membranoberfläche und können so von der Flüssigkeit getrennt werden. Derartige Membranen mit den angesammelten Bakterien hat man bisher auf einen künstlichen Nährboden, z. B. Agar-Agar- oder Bouillon-Boden gesetzt, aus dem den Bakterien die notwendige Nähr- oder Hemmsubstanz zugeführt werden konnte.
Dabei zieht im allgemeinen die Membran auf Grund ihrer ausserordentlich feinen und gleichmässig verteilten Kapillaren die Flüssig keit aus dem frischen Nährboden und bringt diese mit den Bakterienkolonien in Berührung.
Diese frischen Nährböden haben den Nachteil, dass sie sehr kurzlebig in ihrer Nährwirkung sind und daher immer neu in einem Laboratorium wieder angesetzt werden müssen. Ausserdem gibt jeder künstliche Boden nur eine bestimmte Nähr- oder Hemmsubstanz an die Membran ab. Sollen nun in kurzen Zeitabständen verschiedene Substanzen ab wechselnd der Membranoberfläche und damit den Bakterien zugeführt werden, beispielsweise dem einen Teil der Bakterien ihr Wachstum fördernde Nährsubstanzen und dem anderen Teil der Bakterien ihr Wachstum hemmende Substanzen (Inhibitoren), so muss der Nährboden schnell ausgewechselt wer den.
Es muss also ständig für derartige Versuchs reihen ein Laboratorium zur Verfügung stehen, in dem die entsprechenden Nährböden hergestellt wer den können.
Weiterhin ist es bekannt, unterhalb einer als Fil ter wirkenden Membran, auf welcher die Mikro organismen angesammelt werden, eine hochporöse Kartonscheibe anzuordnen, die nach Berührung einer Flüssigkeit die in ihr gelösten Nährbodenkomponen- ten an die Membran mit den Mikroorganismen ab gibt. Weiterhin ist es bekannt, die hochporöse Mem bran zwischen einem Träger mit einer zunächst ge trockneten und dann rehydratisierten Nährsubstanz bzw. der Hemmsubstanz und einer als Sieb wirken den und die Mikroorganismen tragenden Membran anzuordnen. Eine zeitliche Regulierung der Zugabe der Nährbodensubstanz ist bei derartigen Anordnun gen nicht möglich.
Das Patent betrifft nun ein Verfahren zur Be handlung von Mikroorganismen, insbesondere Bak terien, Hefen, Pilze, mit wachstumsfördernden und/ oder wachstumshemmenden Stoffen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die auf mehreren unterhalb einer als Sieb wirkenden und die Mikroorganismen tragenden Membran in unmittelbarer Berührung mit dieser angeordneten neutralen Trägern aufgebrachten wachstumsfördernden bzw. -hemmenden Nährboden substanzen nacheinander zunächst getrocknet, dann unter sterilen Bedingungen in Lösung gebracht und alsdann die in den untergelegten neutralen Trägern enthaltenen gelösten wachstumsfördernden bzw. -hemmenden Stoffe der Membranoberfläche zuge führt werden.
Als Träger kann man vorzugsweise chemisch neutrale, hydrophile Filze, insbesondere aus Pflan zenfasern, wie Zellulosefasern, verwenden. Hier hat sich insbesondere füll- und leimstoffreies Filterpapier bewährt, das bei der Herstellung mit einer Nähr- und/oder Hemmsubstanz getränkt oder bedruckt und unmittelbar danach getrocknet worden ist.
Zum staffelweisen Behandeln eines Bakterien rasens mit den wachstumsfördernden bzw. -hemmen den Stoffen werden zweckmässigerweise zwei oder mehr Träger für die Nähr- und Hemmsubstanzen übereinander angeordnet, und die betreffende Nähr- bzw. Hemmsubstanz des die Membran berührenden Trägers wird derart abgestimmt, dass die Nähr- bzw.
Hemmsubstanz des darunter angeordneten Trägers beim Aufsteigen durch den die Membran berühren den Träger von den gleichzeitig mitaufsteigenden Nährsubstanzen chromatographisch getrennt werden und die Membran nicht erreichen, bevor die Sorp- tionskapazität des die Membran berührenden Trä gers gesättigt ist. Dabei lässt sich durch geeignete Dimensionierung der Flüssigkeits- und Sorptions- kapazität der übereinander angeordneten Träger der Zeitpunkt genau bestimmen, an dem die Bakterien kultur mit der Nähr- bzw. Hemmsubstanz in Berüh rung kommt.
Es wird dadurch erreicht, dass z. B. wachstumsgehemmte Bakterien sich innerhalb der ersten Stunden der Bebrütung entwickeln können, d. h. in die sogenannte logarythmische Wachstums phase entreten können. Wird die Zeitdauer der Zu fuhr der wachstumsfördernden Nährsubstanz dahin beschränkt, dass die Kolonien noch nicht sicht bar werden, so bleiben sie auch noch unsichtbar beim Abschluss der Bebrütungsdauer, da ihr weite res Wachstum in den sichtbaren Bereich durch die Hemmsubstanz verhindert wird.
Es ist auf diese Weise möglich, den Bakterien ausserordentlich günstige, anfängliche Wachstums bedingungen zu bieten. Damit lässt sich die Zeit dauer der Bebrütung sehr erheblich verkürzen, die erforderlich ist, umdeutlich auszählbare Kolonien zu erhalten, so dass beispielsweise im Falle von Coli- bakterien eindeutig auszählbare Kolonien bereits nach 14-l6 Stunden erreicht werden können,
im Gegensatz zu einer bisher erreichbaren niedrigsten Zeitdauer von 36 Stunden. Diese Zeitverkürzung ist insbesondere bei Seuchengefahr von wesentlicher Bedeutung, um die Vorwarnung möglichst frühzeitig geben zu können.
Als wachstumssteigernde Substanz kann auf das Filterpapier eine Lösung von Traubenzucker, Pep tonen, Hefeautolysaten durch Tränken oder Be drucken aufgebracht werden. Das so behandelte Fil terpapier wird zweckmässig mit der Nährsubstanz getrocknet, und die Nährsubstanzen werden sodann unmittelbar vor der Benutzung in Lösung gebracht.
Als wachstumsfördernde Substanz einerseits kann auf einem anderen Träger eine Lösung von Milchzucker und Peptonen und als selektiv wachstumshemmende Substanz Fuchsin und Natriumsulfit aufgegeben wer den.
Um die Entwicklungsbedingungen bestimmter Organismen zu fördern, wird zweckmässig zur Ein haltung eines dementsprechenden pH-Wertes der zum Wachstum der Mikroorganismen erforderlichen Nährlösung vor dem Aufbringen auf den Träger und/oder der unmittelbar vor der Benutzung zuge führten wässerigen Lösung oder Wasser eine Puffer substanz, vorzugsweise ein Phosphatpuffer, zugege ben.
Träger, die mit den Nähr- und Hemmsubstanzen versehen sind, können unterhalb der die Bakterien tragenden Membran derart angeordnet werden, dass die Hemmsubstanz, z. B. das Fuchsin, im unteren Träger bei seinem Aufsteigen durch die Hohlraum- struktur des der Membran benachbarten Trägers chromatographisch solange, wie dessen Trägersub stanz nicht gesättigt ist, sorbiert und nach dessen Sättigung an die Membranoberfläche geführt wird.
Die Träger werden dabei zweckmässig mit der Membran in einen Behälter eingeschlossen und bei Temperaturen, vorzugsweise zwischen 3011 und 37 , bebrütet.
Eine besondere Schwierigkeit bereitet die sterile Aufbewahrung derartiger mit Nähr- oder Hemmsub stanz versehener Träger und Membranen. Die Trä ger und die Membranen werden am besten in einem möglichst luft-, wasser- und bakteriendichten Kunst stoffbehälter aufbewahrt, der ganz oder teilweise aus Polyäthylen besteht. Zweckmässig erfolgt die Sterili sation der genannten Stoffe in einem derartigen Be hälter mit eingeschlossenen und getrockneten Trä gern sowie der oder den Membranen, indem der Be hälter einem sterilisierenden Gas ausgesetzt wird, das durch die Kunststoffolie diffundiert.
Besteht der Be hälter ganz oder teilweise aus einer Kunststoffolie auf der Basis von Polyäthylen, so wird zweckmässig zum Sterilisieren der Behälter einem Luftstrom mit geringen Mengen gasförmigen Äthylenoxyds ausge setzt, wobei der Partialdruck dieses Gases auf der Aussenseite der Polyäthylenfolie grösser ist als auf deren Innenseite.
Setzt man anschliessend den so behandelten Behälter einem äthylenoxydfreien Luft strom aus und erniedrigt damit den Partialdruck des Äthylenoxyds auf der Aussenseite gegenüber der In nenseite der Polyäthylenfolie, so diffundiert das ein gedrungene Äthylenoxyd wieder nach aussen, nach dem es die in der Folie eingeschlossenen Träger und Membranen keimfrei gemacht hat.
<I>Beispiel</I> Ein Bakterienrasen, der aus verschiedenartigen Bakterien besteht, wird nacheinander (stufen- oder staffelweise) sowohl mit wachstumsfördernden als auch mit wachstumshemmenden Substanzen behan delt. Beispielsweise sollen zur Überprüfung von Ab wässern auf Colibakterien einem auf einer Membran oberfläche gesammelten Bakterienrasen zunächst ein für alle Bakterien wachstumsanregender Stoff zuge- führt und nach einer bestimmten Zeit, beispielsweise nach 3-6 Stunden, neben derselben oder einer an deren wachstumsfördernden Substanz eine selektiv wachstumshemmende Substanz zugeführt werden, die einen Teil der Bakterien in ihrem Wachstum be einträchtigt, so dass sie späterhin, beispielsweise nach 16 Stunden, seit Beginn des Wachstums ausge zählt werden können.
Im weiteren wird folgende ge eignete Vorrichtung oder Anordnung, welche aus der Zeichnung zu ersehen ist, verwendet Es zeigen Fig. 1 einen Längsschnitt durch übereinander gelegte Filter mit darüber angeordneter Membran, Fig. 2 einen Querschnitt durch die Träger für die wachstumsfördernden bzw. -hemmenden Stoffe und Membran mit Bakterienrasen in einem Glasgefäss, Fig. 3 den Grundriss eines Kunststoffolienbehäl- ters mit eingelegten getrockneten Trägern und Mem bran.
10 ist die aus einem Trockengel bestehende Membran. Das Trockengel besteht beispielsweise aus einer Mischung von Zelluloseestern (Nitraten, Acetaten) und weist einen Porositätsgrad von 75- 80% auf. Seine Oberfläche ist hydrophil, und die Gesamtzahl der Porenöffnungen an dieser Ober fläche beträgt etwa<B>10000000-500000000</B> pro cm . Der maximale, effektive Porendurchmesser ist etwa 0,
5 ii. Die Membran ist rund bei einem Durch messer von etwa 5 cm und einer Dicke von 120 150 g. Der Strömungswiderstand dieser Membran ist derart, dass 1-2 cm3 Wasser pro cm-' Membran oberfläche pro Sekunde bei einer Druckdifferenz von etwa einem atü durchlaufen kann. Unterhalb dieser Membran befindet sich in unmittelbarer Berührung mit dieser der ebenfalls kreisrunde Träger 11 aus Filterpapier gleichen Durchmessers. Dieser Träger 11 ist 0,3-0,8 mm dick.
Seine Hohlraumstruktur ist mit einer Nährsubstanz, und zwar einer Lösung von Traubenzucker, Peptonen und Hefeautolysaten, bedruckt und unmittelbar nach dem Bedrucken an der Luft getrocknet. In unmittelbarer Berührung mit diesem Filterpapier 11 ist ein weiteres Filterpapier 12 als Träger für eine wachstumssteigernde und se lektiv wachstumshemmende Substanz angeordnet. Die Dicke dieses Trägers beträgt 1-2 mm bei einem Durchmesser von 5 cm.
Dieser Träger ist be druckt oder imprägniert mit einer Nährsubstanz, und zwar einer Lösung von Milchzucker und Peptonen einerseits und einer wachstumshemmenden Substanz, und zwar einer Lösung von Fuchsin und Natrium sulfit, wobei dieser letzten Lösung zur Einhaltung eines pH-Wertes von etwa 7,2 ein Phosphatpuffer beigegeben ist. 13 ist ein Glasgefäss und 14 der Bakterienrasen.
Fig. 3 zeigt die so behandelten Träger und eine oder mehrere Membranen übereinander angeordnet in einem ausschliesslich aus Kunststoffolie auf der Basis von Polyäthylen bestehenden Behälter 15. Die ser Behälter 15 ist aus einem Schlauch durch Ver- schweissen des oberen und unteren Randes 16 her- gestellt und schliesst den Inhalt praktisch luft-, Was ser- und bakteriendicht ah.
Der Behälter 15 wird zum Sterilisieren einem Luftstrom mit Äthylenoxyd ausgesetzt, wobei das Äthylenoxyd nur in Spuren vorhanden ist, beispielsweise in einer Menge von 1/2 /00. Auf Grund des ausserhalb des Behälters herrschenden höheren Partialdruckes des Äthylen oxyds diffundiert dieses Gas selektiv durch die Poly- äthylenfolie in den Behälter und sterilisiert die ge trockneten Träger und Membranen.
Wird der Be hälter 15 darauf in einen anderen Raum gebracht, in dem von Äthylenoxyd freie Luft kreist, dann dif fundiert infolge des höheren Partialdruckes des Äthylenoxyds dieses aus der Folie hinaus, bis die Partialdruckdifferenz dieses Gases auf beiden Seiten gleich ist.
Verwendet man eine andere Kunststoffolie, so gibt es hierfür sterilisierende Gase, die auf Grund ihrer selektiven Diffusion in das Innere eindringen und nach Umkehrung des Partialdruckes aus diesem wieder hinausdiffundieren können. Derartig sterill- sierte und in einer Kunststoffolie eingeschlossene ausgetrocknete Träger und Membranen sind über Monate und Jahre haltbar.
Unmittelbar vor der Benutzung schneidet man den Plastikbehälter 15 auf, entnimmt diesem die für die Untersuchung gewünschten Membranen 10 und sammelt auf deren Oberfläche den zu überprüfenden Bakterienrasen 14. Dieser wird dann auf die über einandergeschichteten, die Nähr- und Hemmsub stanzen in trockenem Zustand enthaltenden Filter papierscheiben 11 und 12 (vgl. Fig. 2) aufgelegt. Die Unterseite des unteren Trägers 12 wird dann mit einer wässerigen Lösung, vorzugsweise Wasser, in Berührung gebracht.
Die gesamte Flüssigkeitskapa zität der Trägerscheiben beträgt dabei 2,2-2,5 cm3. Gibt man dementsprechend eine Wassermenge in das Gefäss, legt darauf die Scheiben 12, 11 mit der Membran 10, so saugt sich die Hohlraumstruktur der Filterscheiben 12, 11 voll und löst die darin ent haltenden Nähr- und Hemmsubstanzen.
Durch die Kapillarwirkung der Membran und der Träger stei gen die Nähr- und Hemmsubstanzen durch die Mem bran an deren Oberfläche und kommen damit mit den Zellen des Bakterienrasens in Berührung. Die Hohlraumstruktur der Träger ist dabei so festgelegt und abgestimmt, dass zunächst nur die Nährsubstanz aus dem oberen Träger der Membran zugeführt wird, während die aus dem unteren Träger aufstei gende Hemmsubstanz so lange vor der Berührung mit der Membran zurückgehalten wird bis die Sorp- tionskapazität des oberen Trägers gesättigt ist.
Die Nähr- und Hemmsubstanzen werden dadurch chro- matographisch getrennt und der Membranoberfläche nacheinander in verschiedenen Zeitabständen konti nuierlich zugeführt.
Die übereinandergelegten Filterpapierscheiben mit der darüberbefindlichen Membran und dem Bakterienrasen werden nach Zugabe des Wassers in einen Behälter eingeschlossen und unter einer Tem peratur von 30-37o bebrütet.
Die Colibakterien wachsen, so dass sie allein ausgezählt werden können, während die nicht er wünschten Bakterien zurückgehalten werden. Die gelösten Nähr- und Hemmsubstanzen haben dabei eine Konzentration, die optimal auf die osmotischen Verhältnisse der Bakterienzelloberflächen abge stimmt ist.