DE10344545A1

DE10344545A1 - Genetisch modifiziertes Kapsidprotein des Beak and Feather Disease Virus

Info

Publication number: DE10344545A1
Application number: DE10344545A
Authority: DE
Inventors: Reimar Dr.med.vet. Johne; Hermann Prof. Dr.med.vet. Müller; Christian Dr.med.vet. Grund
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2003-09-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2023-09-20
Also published as: DE10344545B9; DE10344545B4

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Impfstoffe und diagnostische Tests für die Beak and Feather Disease Virus (BFDV; auch Psittacine Feather Disease Virus oder Virus der Feder-Schnabelkrankheit) zur Anwendung in der Tiermedizin. DOLLAR A Die Impfstoffe und diagnostischen Tests basieren auf einem genetisch modifizierten Kapsidprotein C1 des BFDV, das gegenüber dem natürlichen Kapsidprotein N-terminal verkürzt ist. Durch diese Modifikation wird u. a. die Expression des Kapsidproteins in Wirtsorganismen erleichtert und die unspezifische Bindung von Antikörpern reduziert.

Description

Die Erfindung betrifft neue Impfstoffe und Diagnostische Tests für das Beak and Feather Disease Virus (BFDV; auch Psittacine Feather Disease Virus oder Virus der Feder-Schnabelkrankheit), zur Anwendung in der Tiermedizin.
Dieses Virus verursacht schwerwiegende Erkrankungen bei Vögeln, insbesondere Papageien und Sittichen (Psittaciden), die durch hohe Todesraten, irreversible Federveränderungen oder Immunsuppression gekennzeichnet sind. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet und führt zu hohen Verlusten bei wertvollen Tieren, die sich entweder direkt durch den Tod der Tiere, oder indirekt durch eine Wertminderung bzw. Unverkäuflichkeit infolge der Federveränderungen ergeben.

Die Verwendung des Vollvirus, welches aus Organen infizierter Vögel gewonnen wurde, als Antigen in Impfstoffpräparationen ist bekannt (Raidal et al., 1993; Ritchie et al., 1992).

WO1999045956 A1 schlägt die Verwendung von viralen Nukleinsäuren und Proteinen als Impstoffe gegen Circovirusinfektionen, insbesondere gegen das „Porcine Circovirus" (Porcine = Schwein) und BDFV vor. Als mögliche Impfstoffe werden auch Varianten des natürlichen Kapsidproteins C1 des BDFV empfohlen. In WO1999045956 A1 wird weder die Herstellung des Kapsidproteins C1 des BDFV in isolierter Form, noch die konkrete Verwendung des Kapsidproteins C1 des BDFV als Impfstoff beschrieben. Bei Verwendung des vollständigen Kapsidproteins C1 als Impfstoff lässt sich anhand einer Serumprobe eines Vogels nicht unterscheiden, ob dieser geimpft worden ist oder mit Feldvirus infiziert war.

Neben den aus WO1999045956 bekannten Sequenzen des Kapsidproteins C1 sind weitere Sequenzen des Proteins bekannt (Genbank, NCBI, Einträge NP 047277/AAC34816.1, AAC69862.1, AF 311295, AF 311296, AF 311297, AF 311298, AF 311299, AF 311300, AF 311301, AF 311302).

Naheliegend für eine virologische Diagnostik ist ein serologischer Tests, der (inaktiviertes) Vollvirus als Antigen benutzt. Ein Hämagglutinations-Hemmtest (HAH) zum Nachweis BFDV-spezifischer Antikörper, der Vollvirus als Antigen benutzt, wurde beschrieben (Raidal, 1993; Sanada und Sanada, 2000). Die Herstellung von Vollvirus als Antigen ist im Falle des BFDV schwierig, da sich der Erreger bisher nicht kultivieren lässt (Ritchie, 1995). Daraus folgt, dass das Virus schwierig und kostenintensiv direkt aus infizierten Vögeln gewonnen werden muss. Neben Problemen, die dabei im Hinblick auf Tierschutz und Standardisierung der Tests entstehen, sind auch die dabei entstehenden Kosten hoch. Zusätzliche Probleme beim HAH ergeben sich aus der unterschiedlichen Brauchbarkeit von für diesen Test benötigten Erythrozyten, die eine Interpretation und Vergleichbarkeit der Resultate erheblich erschweren (Sanada und Sanada, 2000).

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte neue Impfstoffe und Diagnostische Tests für das Beak and Feather Disease Virus und Mittel für solche Tests anzugeben. Die Aufgabe soll insbesondere mit Materialien gelöst werden, die keine ganzen Viren enthalten.

Erste eigene Versuche haben gezeigt, dass das natürliche Kapdsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Virus sich nicht in Wirtsorganismen, wie Eschericha Coli, exprimieren lässt.

Überraschend wurde gefunden, dass eine Verkürzung der natürlichen Proteinsequenz im N-terminalen Bereich eine Expression ermöglicht.

Erfindungsgemäß wir die Aufgabe demnach gelöst durch ein isoliertes genetisch modifziertes Kapdsidprotein C1 (im folgenden C1-Protein genannt) des Beak and Feather Disease Virus, das gegenüber dem natürlichen Kapsidprotein des Virus um mindestens die ersten (N-terminalen) 22 Aminosäuren und maximal die ersten 51 verkürzt ist.

Im Unterschied zu dem vollständigen natürlichen Kapsidprotein des Virus lässt sich das erfindungsgemäß verkürzte Protein überraschend gut in Eschericha coli und anderen Wirtsorganismen, wie Sacharomyces cerervisae oder Baculovirus-infizierte Insektenzellen exprimieren.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen verkürzten Proteins ist, dass es eine geringere unspezifische Bindung von Antikörpern aufweist, als das natürliche Kapsidprotein des Virus.

Bei der Verwendung eines verkürzten Proteins als Impfstoff ergibt sich eine Markerfähigkeit, die eine Unterscheidung zwischen geimpften und natürlich infizierten Tieren ermöglicht. Bei der natürlichen Infektion werden Antikörper gegen das gesamte C1 Protein gebildet, nach der Impfung fehlen allerdings solche, die gegen den Bereich des C1 Proteins gebildet werden, der deletiert worden ist (N-Terminus). Ein Test, der solche Antikörper nachweist, kann also zwischen geimpften und infizierten Tieren unterscheiden. Dies ist für eine effiziente Bekämpfung der weit verbreiteten Erkrankung wichtig. Bevorzugt ist das C1-Protein, um einen möglichst großen Teil des Proteins als Antigen zu erhalten, nur um die ersten 32 bis 43, besonders bevorzugt um die ersten 38 Aminosäuren, verkürzt.

Bevorzugt wird in der Sequenz des modifizierten C1-Proteins als erste (N-terminale) Aminosäure ein Methionin gewählt, um die Expression in Bakterien zu vereinfachen.

Eine bevorzugte C1 Proteinsequenz lautet wie folgt:

Dabei steht in Formel 1:
X für eine beliebige Aminosäure,
(X)_0–10 für 0 bis 10 beliebige Aminosäuren,
/ für oder (Ile/Val steht z. B. für Ile oder Valin).

In der oben aufgelisteten Sequenz (Formel 1) ist das natürliche Kapsidprotein um die ersten 35 (im Falle von GenBank Accession Nummer AF311301) bis 39 (im Falle von GenBank Accession Nummer AF311295) Aminosäuren verkürzt und als erste Aminosäure ein Methionin angefügt. Zusätzlich enthält es N-Terminal im Anschluss an das Methionin sowie am C-Terminus jeweils 0 bis 10 beliebige Aminosäuren.

Diese Sequenz erlaubt an mehreren Positionen verschiedene Aminosäuren. Diese nicht konservierten Positionen spiegeln die bekannte natürliche antigene Variation des C1 Proteins des BFD-Virus wieder (s. auch 1).

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird zur Synthese des Proteins an diesen Stellen ein Gemisch mehrerer oder aller möglichen Aminosäuren eingesetzt. Dadurch erhält man ein Proteingemisch, das der natürlichen antigenen Variation des BFDV entspricht. Dieses stellt vorteilhaft einen universellen Impfstoff gegen eine Vielzahl von Varianten des BFDV dar. Gleichermaßen kann ein solches Proteingemisch als Antigen in diagnostischen Tests zur gleichzeitigen Erkennung von Antikörpern, die gegen eine Vielzahl von Varianten des BFDV gerichtet sind, verwendet werden.

Weitere bevorzugte Sequenzen sind in den SEQ_ID. No. 1 und SEQ_ID. No. 2 angegeben.

Die Verkürzung des Proteins beeinträchtigt die antigenen Eigenschaften des Proteins nicht, da keine Epitope deletiert werden, die für seine Wirkung als Impstoff wichtig wären.

In einer bevorzugten Ausführungsform trägt das modifizierte C1-Protein an seinem C-Terminus eine Sequenz, welche die Aufreinigung des Proteins nach der Expression in einem Wirtsorganismus erleichtert. Bevorzugt ist diese Sequenz ein sogenannter Histidin-Marker, bestehend aus einer Sequenz von 6 aufeinanderfolgenden Histidinen (His oder H). Ein solcher Histidin-Marker ermöglicht in bekannter Weise die Aufreinigung des Proteins affinitätschromatographisch auf einer Nickel- oder Kobalt-Säule. Eine derart bevorzugte Sequenz ist in der SEQ_ID. No. 3 angegeben.

In alternativen Ausführungsformen besteht die Sequenz, welche die Aufreinigung des Proteins nach der Expression in einem Wirtsorganismus erleichtert, aus Gluthathion-S-Transferase (GST) oder Maltose-bindendem Proteine (MBP). In diesen Fällen ist allerdings eine nachträgliche Entfernung des Fusionsprotein-Anteils mittels Protease-Spaltungen empfehlenswert, um ein reines C1-Protein zu erhalten.

Die Erfindung umfasst auch isolierte Gensequenzen, die für das modifizierte C1 Protein codieren und Expressionsvektoren, die eine solche Gensequenz enthalten. Bevorzugt sind eine Gensequenz gemäß SEQ_ID No. 4 und ein Expressionsvektor gemäß SEQ_ID No. 5.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Wirtsorganismus zur Expression des erfindungsgemäßen modifizierten C1 Proteins. Dieser Wirtsorganismus enthält mindestens einen Expressionsvektor mit einer Gensequenz die für das modifizierte C1 Protein codiert und/oder eine Gensequenz die für das modifizierte C1 Protein codiert in sein Genom integriert. Der Wirtsorganismus wird bevorzugt aus den üblicherweise für die Proteinexpression verwendeten prokaryotischen, bevorzugt Eschericha coli, oder eukaryotischen einzelligen Wirtsorganismen, bevorzugt Sacharomyces cerevisae oder Insektenzellen (bevorzugt Sf9-Zellen), die mit rekombinanten Baculoviren infiziert worden sind, gewählt.

Das erfindungsgemäße modifizierte C1 Protein wird bevorzugt in einer Impfstoffpräparation in der präventiven Tiermedizin verwendet. Die Verabreichung einer solchen Impfstoffpräparation induziert in den geimpften Vögel Antikörper und andere Immunabwehrmechanismen, welche die geimpften Vögel effektiv vor einer Infektion mit dem Beak and Feather Disease Virus (BFDV) schützen. Durch die Impfung wird eine Erkrankung, die durch BFDV hervorgerufen wird verhindert. Die Impfung erfolgt vorzugsweise intramuskulär oder subcutan.

Eine derartige Impfstoffpräpäration enthält neben dem erfindungsgemäßen modifizierten C1 Protein vorzugsweise Adjuvantien, wie Specol (ID-DLO, Lelystad, The Netherlands) oder komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvanz.

Pro Impfdosis und Tier werden vorzugsweise 10 μg bis 25 μg C1 Protein in 100 bis 250 μl Adjuvantslösung pro kg Körpergewicht verwendet.

Nach einer ersten Impfung erfolgt vorzugsweise nach 12 bis 100 Tagen eine zweite Impfung.

Das modifizierte C1 Protein lässt sich – im Gegensatz zu dem nach dem Stand der Technik als Impfstoff verwendeten Vollvirus – leicht und kostengünstig in ausreichenden Mengen in Kulturen von E. coli oder anderen Wirtsorganismen herstellen. Die erfindungsgemäße Impfstoffpräparation enthält das Kapsidprotein C1 als gereinigtes Antigen und kein vermehrungsfähiges Antigen. Vorteilhaft ist die erfindungsgemäße Impfstoffpräparation damit erheblich sicherer als die bisher bekannten Impfstoffe, die auf Vollvirus-Präparationen beruhen.

Die Unterschiede des erfindungsgemäßen modifizierten C1 Proteins in seiner Proteinsequenz von dem natürlichen Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Virus ermöglichen die spätere diagnostische Unterscheidung von mit dem modifizierten C1 Protein geimpften Tieren und mit dem Beak and Feather Disease Virus infizierten Tieren. Eine solche Unterscheidung ist bei der Sanierung von Beständen sehr nützlich.

Es hat sich herausgestellt, dass der Impfschutz auf Antikörpern beruht (vergleiche Ausführungsbeispiele). Vorteilhaft wird ein aktiver auf Antikörpern beruhende Impfschutz von Elterntieren über das Ei als passiver Impfschutz an die Jungtiere weitergegeben (Ritchie et al., 1992).

Eine weitere bevorzugte Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins ist die Verwendung in einem Diagnostischen Test zur Detektion von Anti-Beak and Feather Disease Virus-Antikörpern in Körperflüssigkeiten, z. B. Serum, Eiern oder Gewebeextrakten von Psittaziden.

Mit einem solchen Test, vorzugsweise ein ELISA oder Dotblotassay oder Western Blot oder Proteinmikrochipassay, können – entweder am Einzeltier oder im Rahmen einer Bestandsuntersuchung – BFDV-Infektionen nachgewiesen werden. Die Erfindung eignet sich auch zur Testung des Impferfolges bei Vögeln, die gegen BFDV geimpft worden sind.

Bevorzugt ist in dem diagnostischen Kit das Protein an einen festen Träger gebunden. Ein solcher fester Träger ist z. B. eine ELISA- Platte, bevorzugt aus Polycarbonat, oder im Falle des Dotblot- oder Western blot-Assays eine Folie, bevorzugt aus Nitrozellulose. Im Falle des Proteinmikrochipassay ist das Protein vorzugsweise an einen Glaschip gebunden.

Die Bindung des C1 Proteins an den festen Träger wird bevorzugt durch Inkubieren des festen Trägers mit einer Proteinlösung in 50 mmol/Liter Carbonat bei einem pH-Wert von pH 8 bis pH 9 für mindestens eine Stunde und anschließendes Trocknen erreicht.

Ein solcher Diagnostischer Kit enthält neben dem festen Träger, an den das erfindungsgemäße C1 Protein gebunden ist, vorzugsweise folgende weitere Komponenten:

a.) Eine Proteinlösung zum Blockieren freier Bindungsstellen auf dem festen Träger, vorzugsweise Magermilchpulver oder bovines Serumalbumin (BSA)
b.) einen sekundären Antikörper, der spezifisch für Psittaziden-Immunglobuline ist.

Dieser sekundäre Antikörper ist einer Variante des erfindungsgemäßen Kits direkt mit einem detektierbaren Marker verbunden.

In einer besonders bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Kits erfolgt der Nachweis der Bindung des sekundären Antikörpers indirekt mit einem tertiären Antikörper, der spezifisch für den sekundären Antikörper ist und der mit einem Marker verbunden ist. Da in diesem zusätzlichen Schritt mehrere tertiäre Antikörper an einen sekundären Antikörper binden, wird das Signal vorteilhaft verstärkt.

In einer bevorzugten Variante ist der Marker ein Enzym, besonders vorzugsweise eine Peroxidase, wie z. B. die Peroxidase aus Meerrettich (horse-radish), oder eine alkalische Phosphatase. Peroxidasen und Phosphatasen ermöglichen in bekannter Weise chromogene oder fluorogene Substrate zu Farbstoffen bzw. Fluoreszenzfarbstoffen umzusetzen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine Detektion mit bekannten photometrischen Methoden, z. B. ein einem ELISA-Platten Lesegerät. Alternativ ist das Enzym Luziferase, welches die Detektion durch eine Lichtreaktion ermöglicht.

In einer alternativen Variante ist der Marker ein im Mikroskop detektierbarer Fluoreszenzfarbstoff wie z. B. Fluorescein, oder auch ein fluoreszierendes Protein, wie z. B. das „Green Fluorescent Protein" (GFP).

In einer weiteren Variante ist anstelle des Markers Biotin an den Antikörper gebunden. Die Detektion des Botin erfolgt mittels Streptavidin oder Avidin, an das der detektierbare Marker gebunden ist.

Zur diagnostischen Unterscheidung von mit dem modifizierten C1 Protein geimpften Tieren und mit dem Beak and Feather Disease Virus infizierten Tieren werden in einem solchen Diagnostischen Test, die Reaktion gegenüber dem Vollvirus oder dem kompletten natürlichen Kapsidprotein als Antigen, und dem modifizierten C1 Protein verglichen.

Zu dieser diagnostischen Unterscheidung wird vorzugsweise das Serum der Tiere in 2 parallel durchgeführten Tests auf die Spezifität der gebildeten Antikörper analysiert. Im ersten Test wird wie oben beschrieben untersucht, ob die Tiere Antikörper gegen das erfindungsgemäße modifizierte C1 Protein gebildet haben.

In dem zweiten Test wird in einer analogen Vorgehensweise untersucht, ob die Tiere Antikörper gegen den N-terminalen Bereich des natürlichen Kapsidproteins gebildet haben, welcher im erfindungsgemäßen modifizierten C1 Protein deletiert ist.

Für den zweiten Test wird vorzugsweise ein chemisch Synthetisiertes N-terminales Peptid des Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Virus (Virus der Feder-Schnabelkrankheit) verwendet, dass aus mindestens den ersten 22 und maximal den ersten 51 Aminosäuren, vorzugsweise aus den ersten 37 Aminosäuren des natürlichen Kapsidproteins, besteht. Ein Beispiel für ein solches Peptid ist in SEQ_ID No. 6 angegeben.

Ein weiterer Bestandteil der Erfindung sind auch Antikörper, die spezifisch mit dem Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Virus reagieren. Die Antikörper werden durch zweimalige Impfung von Tieren, vorzugsweise Vögel, besonders vorzugsweise Hühnern, mit dem erfindungsgemäßen C1 Protein wie zu vor beschrieben induziert. In alternativen Ausführungsformen der Erfindung werden anstelle als Tiere für die Produktion der Antikörper Kaninchen oder Ziegen verwendet. Isoliert werden die Antikörper entweder aus dem Serum der Tiere oder dem Ei der Vögel. Die Isolierung erfolgt vorzugsweise zwischen dem 7. und dem 28. Tag nach der zweiten Impfung. Die isolierten Antikörper sind polyklonale Antikörper des IgG-Typs (Imunglobulin Gamma, wird bei Vögeln z. T. auch IgY genannt) welche Epitope des erfindungsgemäßen C1 Proteins spezifisch erkennen.

Diese Antikörper eignen sich zum direkten Nachweis des Virus in einem diagnostischen Test und als Kontrollserum für die beschriebenen diagnostischen Tests zum Antikörper-Nachweis.

Anhand nachfolgender Figuren, Sequenzen, und Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:

1 zeigt ein Sequenzalignment von natürlichen Sequenzen des Kapsidproteines C1 des BFDV. In diesem Alignment ist eine Sequenz als Konsensussequenz als Referenzsequenz im Einbuchstabencode vollständig wiedergegeben. Bei den weiteren Sequenzen sind nur die abweichenden Aminosäuren dargestellt, die restlichen Aminosäuren sind durch Punkte ersetzt. Die jeweils zugehörigen Accession-Nummern der Gen-Bank Datenbank sind am Ende jeder Sequenz aufgeführt. Die natürliche Sequenz mit der zukünftigen GenBank-Accession-Nummer AY345131 wurde im Rahmen der Erfindung neu identifiziert und entspricht SEQ ID. No. 7. Die Konsensussequenz wurde mit dem Computerprogramm MegAlign des Softwarepakets Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA) ermittelt.

Die folgenden gesondert beiliegenden Sequenzprotokolle sind Teil der Offenbarung der Erfindung:

SEQ_ID. No. 1 zeigt eine modifizierte Proteinsequenz des C1 Proteins. Gegenüber der in 1 ermittelten Konsensussequenz des Kapsidproteines des BFDV ist diese Sequenz um 37 Aminosäuren verkürzt und als erste Aminosäure ein Methionin angefügt.

SEQ_ID. No. 2 zeigt ein Beispiel für eine modifizierte Proteinsequenz des C1 Proteins. Gegenüber der neu ermittelten natürlichen Sequenz des Kapsidproteines des BFDV aus SEQ_ID. No. 7 ist diese Sequenz um 38 Aminosäuren verkürzt und die erste Aminosäure durch ein Methionin ersetzt.

SEQ_ID. No. 3 zeigt ein Beispiel für eine modifizierte Proteinsequenz des C1 Proteins, an die C-terminal die Sequenz Arg-Ser-His-His-His-His-His-His angehängt ist, welche die Aufreinigung des Proteins erleichtert. Diese Sequenz ist bis auf die Sequenz Arg-Ser-His-His-His-His-His-His identisch mit SEQ_ID. No. 2.

SEQ_ID. No. 4 zeigt ein Beispiel für eine isolierte Gensequenz, die für die Proteinsequenz aus SEQ_ID. No 3 codiert.

SEQ_ID. No. 5 zeigt ein Beispiel für eine Sequenz eines Expressionsvektors der eine Expression des modifizierten C1 Proteins gemäß Proteinsequenz aus SEQ_ID. No 3 in E. coli oder anderen Wirtsorganismen ermöglicht.

SEQ_ID. No. 6 zeigt ein Isoliertes N-terminales Peptid des Kapsidprotein C1 des BDFV.

Ausführungsbeispiel 1: Herstellung einer DNA-Sequenz, die für das genetisch modifizierte Kapsidprotein C1 codiert
Aus der Feder eines BFDV-infizierten Kakadus wird Gesamt-DNA mit Hilfe des DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Diese DNA wird als Template in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet.
Als Primer werden folgende Oligonukleotide verwendet:
5'-AGACACATGTTCACAACCAATAG-3'
5'-GAGTCTAGATCTAGTACTGGGATT-3'
Durch diese Primer wird spezifisch die Gensequenz amplifiziert, die für die Aminosäuren 38 bis 244 des BFDV C1 Proteins codiert.
Die Amplifikation erfolgt in einem Total-Volumen von 100 μl mit Hilfe des Expand High Fidelity PCR Kits (Boehringer, Mannhein, Deutschland) in einem Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research, USA). Es erfolgt eine initiale Deanturierung für 5 min bei 95 °C, anschließend 40 Zyklen mit jeweils 30 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 56 °C und 1 min bei 72 °C, und am Ende eine Inkubation bei 72 °C für 5 min.
Das PCR-Produkt wird anschließend mit den Restriktionsenzymen AflIII und BglII (beide NEB, UK) geschnitten und nach einer Agarosegelelektrophorese mit Hilfe des Qiaquick DNA purification Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) gereinigt.
Ausführungsbeispiel 2: Expressionsvektor pQE-60 C1, in den eine für das modifizierte Kapsidproteins C1 codierende Gensequenz inseriert ist.
Der Vektor pQE-60 (Qiagen, Hilden, Deutschland) wird mit den Restriktionsenzymen NcoI und BglII (NEB, UK) geschnitten und wie das PCR-Produkt in Ausführungsbeispiel 1 in einem Agarosegel gereinigt.
Das geschnittene und gereinigte PCR-Produkt wird mit dem geschnittenen und gereinigten Vektor mit Hilfe von T4-DNA-Ligase (NEB, UK) über Nacht bei 16°C nach den Angaben des Herstellers (NEB, UK) verbunden.
2 zeigt eine Karte des resultierenden Plasmides zur Herstellung des modifizierten Proteins, bezeichnet mit Met-C1(aa38-244)-6xHis, in E. coli. PT5: T5-Promotor. amp: Ampicillin-Resistenz-Gen. ColE1: Replikationsursprung. Die Zahlen innerhalb des Kreises geben die Nukleotid-Positionen wieder. Die Sequenz des +–Strang des Vektors ist in SEQ_ID. No. 5 wiedergegeben.
Durch die Insertation des geschnittenen PCR-Produkts in den geschnittenen Vektor wird die kodierende Sequenz für die Aminosäuren 39 bis 244 des BFDV C1 Proteins unmittelbar hinter ein Startkodon (ATG, kodierend für Met) und unmittelbar vor eine Sequenz, kodierend für Arg-Ser-His-His-His-His-His-His, gefolgt von einem Stopkodon plaziert. Die gesamte kodierende Region steht unter der Kontrolle des bakteriellen T5 Promotors, der durch IPTG reguliert werden kann. Weiterhin sind auf dem Plasmid ein Ampicillin-Resistenzgen sowie ein Replikationsursprung vorhanden.
Ausführungsbeispiel 3: Expression des genetisch modifizierten Kapsidproteins C1 in E. Coli
Das in Ausführungsbeispiel 2 erhaltene Plasmid, in dem das PCR Produkt inseriert ist, wird wie folgt in E. coli zur Proteinexpression verwendet:
Zunächst wurden E. coli wie folgt mit dem Plasmid transformiert:
Eine Kolonie E. coli vom Stamm XL-1 blue MRF' (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) wird für 10 Stunden in 10 ml LB-Medium bei 37 °C vermehrt. Die Bakterien werdenanschließend für 1 min bei 6000 rpm zentrifugiert, das Bakterienpellet in 0.1 Mol/Liter CaCl₂-Lösung gelöst und für 20 Minuten auf Eis inkubiert. Die Zellen werden danach pelletiert und erneut in 0.1 Mol/Liter CaCl₂-Lösung für 20 min inkubiert. Nach Zugabevon 1 μg der Plasmid-DNA werden die Bakterien für 30 Minuten auf Eis inkubiert, danach für 30 Sekunden bei 42 °C inkubiert und sofort wieder für 5 Minuten auf Eis gestellt. Es erfolgt die Zugabe von LB-Medium und Inkubation bei 37°C für 1 Stunde. Die Bakterien werden auf Platten mit LB-Agar (mit 100 μg/ml Ampicillin) ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Eine Kolonie wird in LB-Medium (mit 100 μg/ml Ampicillin) angezüchtet.
Gesättigte Kulturen von den so erhaltenen E. coli, die ein Plasmid mit einer kodierende Sequenz für dieses Protein im Expressionsvektor pQE-60 (Qiagen) besitzen, werden 1:100 in 1 l Luria-Bertani (LB)-Medium (mit 100 μg/ml Ampicillin) verdünnt und bei 37 °C in einem Orbital-Schüttler inkuziert. Nachdem die optische Dichte der Kulturen bei 600 nm den Wert von 0,8 erreicht hatte, wurde die Expression mittels 1mmol/Liter IPTG induziert. Nach 5 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugation pelletiert, resuspendiert in Ultraschall-Puffer (10 mmol/Liter Tris-HCl pH 7,8, 50 mmol/Liter KH₂PO₄, 300 mmol/Liter NaCl, 10 mmol/Liter beta-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung lysiert (6 × 30 sec.). Das Lysat wurde für 20 min bei 10000 rpm zentrifugiert und der Überstand gewonnen.
Mittels Nickel-NTA-Agarose (Qiagen) wurde das Protein affinitätschromatographisch gereinigt. Hierzu wurden 4ml der Nickel-NTA-Agarose auf eine Säule (20 ml, Qiagen) gegeben und anschließend mit 20 ml Ultraschall-Puffer equilibriert. Das Lysat wurde auf die Säule gegeben und lief hindurch. Danach wurden 20 ml Waschpuffer (40 mmol/Liter Tris-HCl pH 7,5, 20 % Glycerol, 100 mmol/Liter KCl, 1 mmol/Liter beta-Mercaptoethanol), mit dem Zusatz von 20 mmol/Liter Imidazol auf die Säule gegeben. Es folgten Zugaben von jeweils 4 ml Waschpuffer mit 50 mm, 80 mmol/Liter, 120 mmol/Liter, 200 mmol/Liter, 300 mmol/Liter und 500 mmol/Liter Imidazol, wobei der Durchfluss jeweils separat aufgefangen wurde. Die aufgefangenen Fraktionen nach Zugabe von 120 mmol/Liter, 200 mmol/Liter und 300 mmol/Liter Imidazol in Waschpuffer wurden danach vermischt und Proteinkonzentration und Reinheit des darin enthaltenen modifizierten C1 ermittelt. Das Protein hatte eine apparentes Molekulargewicht von 24 kDa nach Auftrennung im SDS-PAGE, eine Reinheit >95 % bei einer Ausbeute von 0,1 mg/ml.
Ausführungsbeispiel 4: Verwendung des modifizierten C1 als Impfstoff
Das gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene Protein wurde in einem Immunisierungsversuch in Hühnern eingesetzt. Hierzu wurden drei 12 Wochen alten Hühnern (White Leghorn) verschiedene Lösungen mit einem Gesamtvolumen von jeweils 500 μl intramuskulär injiziert. Huhn #1 erhielt 50 μg gereinigtes Protein in Waschpuffer, Huhn #2 erhielt 50 μg Protein in Waschpuffer zusammen mit dem Adjuvanz Specol (ID-DLO, Lelystad) und Huhn #3 erhielt reinen Waschpuffer. 100 Tage später wurde die Injektion mit jeweils der gleichen Lösung intramuskulär wiederholt (Boosterung). Allen Hühnern wurden am Tag der ersten Impfung sowie 7, 14, 28, 35, 100, 114 und 135 Tage später Blutproben entnommen, von denen das Serum gewonnen wurde. Die Seren wurden mittels Immunoblotting auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper gegen das modifizierte Kapsidprotein untersucht. Hierbei konnten solche Antikörper nur bei Huhn #1 und Huhn #2 bei den Seren, die ab dem 7. Tag nach Injektion gewonnen worden waren, nicht jedoch bei den Seren vom Tag der Injektion sowie bei keinem Serum von Huhn #1 detektiert werden. Die größte Menge spezifischer Antikörper wurde bei dem Serum gefunden, das am 114. Tag nach der ersten Injektion (entspricht 14 Tage nach der Boosterung) bei Huhn #2 gewonnen worden war. Dieses Serum detektierte auch in einem Immunoblot das C1 Protein von BFDV in einer Organsuspension eines BFDVinfizierten Rüppel-Papageis. Diese Versuche demonstrieren, das der Impfstoff, der das gentechnologisch hergestellte modifiziere Kapsidprotein enthält, in der Lage ist, spezifische Antikörper gegen BFDV in Vögeln zu induzieren.
Ausführungsbeispiel 5: Verwendung des modifizierten C1 als Antigen in einem Diagnostischen Test
Das gemäß Ausführungsbeispiel 3 erhaltene Protein wurde als Antigen in einem ELISA eingesetzt, mit dessen Hilfe 11 Seren von verschiedenen Papageienarten auf das Vorhandensein von BFDV-spezifischen Antikörpern getestet wurden. Hierzu wurde das gereinigte modifizierte C1 auf eine Konzentration von 10 μg/ml in einem Beschichtungspuffer (0,1 mol/Liter Natriumcarbonat/Bicarbonat, pH 9,6) eingestellt. Jeweils 50 μl/Vertiefung dieser Lösung wurden auf eine MaxiSorp ELISA-Platte (Nunc) aufgebracht und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Parallel dazu wurde eine Platte (=Negativ-Kontroll-Platte) nur mit Beschichtungspuffer beschichtet, die ansonsten identisch zur ersten Platte behandelt wurde. Die Vertiefungen wurden anschließend fünfmal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 136,9 mMol/Liter NaCl, 8,1 mMol/Liter Na₂HPO₄, 2,7 mMol/Liter KCl, 1,5 mMol/Liter KH₂PO₄, pH 7,2) mit Zusatz von 0,1 Tween 20 (PBS-T) gewaschen. Dann wurden jeweils 200 μl einer 10%-igen Milchpulver-Lösung in PBS-T zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Nach einmaliger Wa schung mit PBS-T wurden 100 μl der Seren der Papageien, die vorher für 30 min bei 56 °C inkubiert worden waren, in einer Verdünnung von 1:10 in PBS-T in die oberste Reihe der ELISA-Platte gegeben. Serielle 2-fache Verdünnungen in PBS-T wurden anschießend in die unten anschließenden Reihen der ELISA-Platte gegeben. Die Platte wurde nun für 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach drei Waschungen mit PBS-T wurde eine 1:100 Verdünnung eines Anti-Psittaziden-IgG-Serums (Grund et al., 2001) in PBS-T (100 μl) zugegeben und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Nach nochmaligen drei Waschungen mit PBS-T wurden 100 μl einer 1:1000 Verdünnung des biotinylierten anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers (Sigma) in PBS-T zugegeben. Anschließend wurden die Platten dreimal mit PBS-T gewaschen und 100 μl einer 1:2000 Verdünnung eines Streptavidin-Peroxidase-Konjugats (Sigma) in PBS-T zugegeben. Nach 30 minütiger Inkubation bei 37 °C wurde die Platte zweimal mit PBS-T und einmal mit PBS gewaschen und ein Substrat (100 μl), das o-Phenyldiaminhyhrochlorid enthielt, zugegeben. Die gelbbraune Farbentwicklung wurde nach 5 Minuten durch Zugabe von 50 μl 2M H₂SO₄ gestoppt und die optische Dichte wurde bei einer Wellenlänge von 490 nm (Referenz-Wellenlänge: 650 nm) bestimmt. Der Titer wurde definiert als die höchste Serum-Verdünnung, die eine zweifach höhere optische Dichte auf der Platte, die mit Antigen beschichtet wurde, aufwies als dieselbe Verdünnung auf der Negativ-Kontroll-Platte.
Die Ergebnisse des ELISA wurden mit Ergebnissen verglichen, die nach Durchführung eines HAH (Raidal et al., 1993) mit denselben Seren erhalten worden waren. Es konnte ein hoher Grad an Korrelation festgestellt werden.
Ausführungsbeispiel 6: Diagnostischer Test zur Unterscheidung von geimpften und infizierten Tieren
Der Test verwendet zwei ELISA-Platten (MaxiSorp ELISA-Platte, Nunc), die mit unterschiedlichen Substanzen inkubiert werden. Die erste Platte wird mit dem Protein gemäß Ausführungsbeispiel 3 beschichtet, wobei wie bei Ausführungsbeispiel 5 vorgegangen wird. Die zweite Platte wird mit einem Polypeptid beschichtet, das folgende Aminosäure-Sequenzen gemäß SEQ_ID No. 6 besitzt:
Das Peptid wird mit konventioneller Festphasenpeptidchemie synthetisiert und 50 μl/Vertiefung in einer Konzentration von 1 μg/ml, verdünnt in Beschichtungspuffer (s. Ausführungsbeispiel 5) aufgebracht und für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die weitere Behandlung der beiden Platten entspricht derjenigen, wie sie in Ausführungsbeispiel 5, beginnend mit der fünfmaligen Waschung in PBS-T und der Inkubation mit Milchpulverlösung beschrieben sind. Die zu untersuchenden Seren werden parallel auf beide Platten aufgetragen. Die Auswertung erfolgt wie in Ausführungsbeispiel 5 durch Messung der optischen Dichten und Ermittlung des Titers. Seren, die auf beiden Platten einen signifikanten Titer aufweisen, gelten als Seren von Tieren, die mit Feldvirus infiziert sind oder dies waren. Seren, die nur auf der Platte reagieren, die mit dem Protein aus Ausführungsbeispiel 3 beschichtet war, jedoch keinen Titer auf der mit dem Peptid beschichteten Platte zeigen, gelten als Seren von geimpften Tieren. Seren, die auf keiner der Platten einen signifikanten Titer zeigen, stammen von Tieren, die weder geimpft noch infiziert waren.
Ausführungsbeispiel 7: Herstellung von Antikörpern, die spezifisch das genetisch modifizierte C1-Protein erkennen
Zur Herstellung von Antikörpern wurden Hühner, wie in Ausführungsbeispiel 4 beschrieben, geimpft und Serum isoliert.
Zur immunaffinitätschromatographischen Aufreinigung der Antikörper aus dem Serum wird das genetisch modifizierte Kapdsidprotein C1 als Antigen wie folgt hergestellt:
Gesättigte Kulturen von E.coli, die ein Plasmid mit einer kodierende Sequenz für dieses Protein (modifiziertes Kapsidprotein C1) im Expressionsvektor pQE-60 (Qiagen) besaßen, wurden 1:100 in 1 l Luria-Bertani-Medium (mit 100 μl/ml Ampicillin) verdünnt und bei 37 °C in einem Orbital-Schüttler inkubiert. Nachdem die optische Dichte der Kulturen bei 600 nm den Wert von 0,8 erreicht hatte, wurde die Expression mittels 1mM IPTG induziert. Nach 5 Stunden wurden die Bakterien durch Zentrifugation pelletiert, resuspendiert in Ultraschall-Puffer (10 mMol/Liter Tris-HCl pH 7,8, 50 mMol/Liter KH₂PO₄, 300 mMol/Liter NaCl, 10 mMol/Liter beta-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung lysiert (6 × 30 sec.). Das Lysat wurde für 20 min bei 10000 rpm zentrifugiert und der Überstand gewonnen.
Das Protein wurde affinitätschromatographisch an Nickel-NTA-Agarose (Qiagen) immobilisiert, wobei es durch Waschungen gereinigt wurde. Hierzu wurden 4ml der Nickel-NTA-Agarose auf eine Säule (20 ml, Qiagen) gegeben und anschließend mit 20 ml Ultraschall-Puffer equilibriert. Das oben beschriebene Lysat wurde auf die Säule gegeben und lief hindurch. Danach wurden Waschungen mit 20 ml Waschpuffer (40 mMol/Liter Tris-HCl pH 7,5, 20 % Glycerol, 100 mMol/Liter KCl, 1 mMol/Liter beta-Mercaptoethanol), mit dem Zusatz von 20 mMol/Liter Imidazol, sowie mit 20 ml Waschpuffer mit 50 mMol/Liter Imidazol durchgeführt. Anschließend wurde die Säule mit 20 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) equilibriert.
Das Serum, aus dem die spezifischen Antikörper gereinigt werden sollten, wurde zur Inaktivierung für 30 Minuten bei 56 °C inkubiert. Danach wurde es auf die Säule gegeben und lief hindurch. Anschließend wurde die Säule mit 20 ml PBS und mit 10 ml einer 0.5 Mol/Liter MgCl₂-Lösung gewaschen. Die Elution der spezifisch gebundenen Antikörper erfolgte durch Zugabe von 3 ml 3 Mol/Liter MgCl₂, gefolgt von 3 ml 4 Mol/Liter MgCl₂. Die Eluate wurden in Dialyse-Schläuche (Pierce) gegeben und über Nacht bei 4 °C gegen 1 Liter PBS dialysiert. Anschließend wurde der Proteingehalt der dialysierten Präparationen mittels des BCA-Protein-Kits (Pierce) bestimmt, die Reinheit durch SDS-PAGE und Coomassie-blue-Färbung sowie die Spezifität der Antikörper-Präparationen mittels ELISA und Immunoblot nachgewiesen.
Abkürzungsverzeichnis:
In der Erfindungsbeschreibung werden folgende Abkürzungen verwendet:

amp: Ampicillin-Resistenz-Gen.
BFDV: Beak and Feather Disease Virus
C1: Kapsidprotein C1 des BFDV
ColE1: Replikationsursprung des Plasmides in E. Coli
E. coli: Eschericha Coli
ELISA: Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
HAH: Hämagglutinations-Hemm-Test
IgG: Immunglobulin Gamma
IPTG: Isopropyl-beta-D-Thiogalacto-Pyranosid
Da: Dalton (Molekulargewicht)
LB: Luria-Bertani
min: Minuten
PBS-T: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Zusatz von 0,1 % Tween 20
PT5: T5-Promotor.
rpm: revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
SDS-PAGE: Natrium(Sodium)-dodecylsulfat-Polyacrylamid Gelelektrophorese

Prozentangaben sind, wenn nicht anders angegeben, Gewichtsprozentangaben.
Literaturverzeichnis:

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SEQUENZPROTOKOLL-SEQUENCE LISTING

Claims

Isoliertes modifiziertes Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Viruses (Virus der Feder-Schnabelkrankheit), dadurch gekennzeichnet, dass das Protein gegenüber dem natürlichen Kapsidprotein des Virus um mindestens die ersten (N-terminalen) 22 Aminosäuren und maximal die ersten 51 Aminosäuren verkürzt ist.
Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein gegenüber dem natürlichen Kapsidprotein des Virus um mindestens die ersten 32 Aminosäuren und maximal die ersten 43 Aminosäuren verkürzt ist.
Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein gegenüber dem natürlichen Kapsidprotein des Virus um die ersten 38 Aminosäuren verkürzt ist.
Protein nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgende Sequenz:
wobei X für eine oder ein Gemisch beliebiger Aminosäuren, (X)_0–10 für 0 bis 10 beliebige Aminosäuren und/für und/oder steht.
Protein nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß SEQ_ID. No. 1 oder SEQ_ID. No. 2.
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der modifizierten Sequenz des Kapsidproteins C-terminal eine Sequenz angehängt ist, die eine Aufreinigung des Proteins in einer Affinitätschromatographie ermöglicht.
Protein nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinsequenz am C-Terminus die Sequenz (X)_0–5-His-His-His-His-His-His angehängt ist.
Protein nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß SEQ_ID. No. 3.
Eine isolierte Gensequenz codierend für ein Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 8.
Eine isolierte Gensequenz nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß SEQ_ID. No. 4.
Expressionsvektor, der eine Gensequenz nach Anspruch 9 oder 10 enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß SEQ_ID. No. 5.
Prokaryotischer oder eukaryotischer einzelliger Wirtsorganismus zur Expression eines modifizierten Kapsidproteins des Beak and Feather Disease Viruses, der eine Gensequenz nach Anspruch 9 oder 10 enthält.
Wirtsorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass er von der Art Eschericha coli ist.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Impfstoffpräparation.
Impfstoffpräparation bestehend aus: a.) einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und b.) einem üblich verwendeten Adjuvans.
Verwendung eines Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als Antigen in diagnostischen Tests zur Detektion von Anti-Beak and Feather Disease Virus-Antikörpern.
Diagnostischer Kit zum Nachweis von Anti-BFDV-Antikörpern in Körperflüssigkeiten oder Eiern oder Gewebeextrakten von Psittaciden, bestehend aus mindestens a.) einem festen Träger, an den ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 gebunden ist, b.) einem sekundären Antikörper, der spezifisch für Psittaciden-Immunglobuline ist.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass er folgende weitere Komponenten enthält: a.) eine Proteinlösung zum Blockieren freier Bindungsstellen auf dem festen Träger, vorzugsweise Magermilchpulver oder bovines Serumalbumin (BSA); b.) ein Antikörper, der spezifisch für den sekundären Antikörper ist und der mit einem Enzym verbunden ist, vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase oder Luziferase; c.) einer Substratlösung, die nach Einwirkung des jeweils verwendeten Enzyms einen Farbumschlag oder eine Fluoreszenzreaktion oder eine Lichtreaktion zeigt.
Isoliertes N-terminales Peptid des Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Viruses (Virus der Feder-Schnabelkrankheit) bestehend aus mindestens den ersten 22 und maximal den ersten 51 Aminosäuren der natürlichen Kapsidprotein C1-Sequenz, vorzugsweise aus maximal den ersten 37 Aminosäuren.
Peptid nach Anspruch 20, gekennzeichnet durch die Sequenz gemäß SEQ_ID. No. 6.
Kit zur diagnostischen Unterscheidung von Psittaciden, die mit einem Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Impfstoffpräparation gemäß Anspruch 16 geimpft sind von Psittaciden, die mit dem BFDV infiziert sind oder infiziert waren, in Körperflüssigkeiten oder Eiern oder Gewebeextrakten von Psittaciden bestehend aus: a.) den Komponenten des Kits nach einem der Ansprüche 18 oder 19 und b.) einem festen Träger, an den ein Peptid gemäß Anspruch 20 oder 21 gebunden ist.
Antikörper, die spezifisch mit dem Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Viruses reagieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Proteinsequenz nach Anspruch 1 bis 8 spezifisch erkennen.
Antikörper, die spezifisch mit dem Kapsidprotein C1 des Beak and Feather Disease Viruses reagieren, dadurch erhältlich, dass ein Tier, vorzugsweise ein Vogel oder ein Kaninchen oder eine Ziege, mit einer Proteinsequenz nach Anspruch 1 bis 8 oder einer Impfstoffpräparation gemäß Anspruch 16 mindestens zweimal nacheinanderfolgend geimpft wird und der Antikörper im Anschluss an die zweite Impfung aus dem Serum des Tiers oder den Eiern des Vogels isoliert wird.