DE10326370B3

DE10326370B3 - Gegenstromtischzentrifugenrotor

Info

Publication number: DE10326370B3
Application number: DE2003126370
Authority: DE
Inventors: Johann Bauer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2023-06-13

Abstract

Ein kleiner, in eine Tischzentrifuge passender Gegenstromtischzentrifugenrotor, bestehend aus Rotorwelle und rohrförmigem Rotorkörper, wurde konstruiert, in welchem gleichzeitig zwei Trennkammern rotiert werden. Die Trennkammern sind in zwei modular aufgebauten Rotoreinsätzen enthalten und werden seriell von der Gegenstromflüssigkeit durchquert. Ihre Abstände von der Rotormitte können sich um mindestens eine Trennkammerlänge unterscheiden. Der modulare Aufbau erlaubt eine flexible, dem jeweiligen Trennproblem angepaßte, voneinander unabhängige Einstellung der Abstände der beiden Trennkammern zu der Rotormitte.

Description

Die Erfindung betrifft einen Gegenstromtischzentrifugenrotor mit den Merkmalen des Anspruchs 1.

Gegenstromzentrifugen werden bereits seit über 50 Jahren benutzt um Partikel nach Größen und spezifischen Gewichten zu fraktionieren [Lindahl, 1948]. Im Gegenstromzentrifugationsverfahren werden zur Trennung von Partikeln zwei entgegengesetzt wirkenden Kräfte genutzt, die beide gleichzeitig aber mit variierbaren Stärken auf in einer Trennkammer suspendierte Partikel einwirken. In Trennkammern rotierender Gegenstromzentrifugenrotoren bewirken Zentrifugalkräfte (Z) Sedimentation von Partikeln in Richtung Peripherie, während gleichzeitig eine von außen nach innen strömende Flüssigkeit durch ihre Reibungskraft (R) die Partikel in Richtung Rotorwelle treibt.

Wenn an einem beliebigen Punkt einer Trennkammer für ein bestimmtes Partikel die Bedingung gilt R=Z, bleibt dieses Partikel dort in der Schwebe,
wenn R>Z, wird das Partikel Richtung Rotormitte getrieben,
wenn R<Z, wird das Partikel zur Peripherie geschleudert und wird auf den peripheren Boden der Kammer pelletiert, wenn der aufgrund der verengten Geometrie von Gegenstromtrennkammern in der Nähe des peripheren Kammerbodens beschleunigte Flüssigkeitsstrom nicht ausreicht, die Bedingung R=Z oder R>Z wieder herzustellen.

Nun ist die zentrifugale Kraft, die ein Partikel im rotierenden Rotor entwickelt, von Partikelvolumen und -dichte abhängig, die Reibungskraft (R) aber, mit der die von außen nach innen durch eine Trennkammer strömende Flüssigkeit die Partikel in Richtung Rotormitte treibt, vom Partikeldurchmesser. Daher verlassen kleinere Zellen bei konstanter Rotorgeschwindigkeit bei geringerer Gegenstromgeschwindigkeit bzw. bei konstanter Gegenstromgeschwindigkeit bei höherer Rotorgeschwindigkeit eine Trennkammer in Richtung Rotormitte vor größeren Zellen, ähnliche Dichten der Zellen vorausgesetzt. Dieser Umstand wird genutzt, um im Laufe einer zentrifugalen Elutriation kleine und große Zellen in verschiedenen Fraktionen zu sammeln.

Vor allem Partikel mit Durchmessern von 4 μm bis 20 μm und spezifischen Dichten von 1.05 bis 1.12 kg/l sind mit Hilfe dieser Methode unter Einwirkung moderater physikalischer Kräfte gut trennbar. Dies machte die Gegenstromzentrifuge besonders geeignet, um verschiedene Populationen lebender Zellen schonend zu isolieren [Bauer, 1999]. Die Trennschärfe ist beachtlich, aber leider oft nicht ausreichend. Besondere Probleme bereitet es immer noch, coelutionsbedingte Zellverluste zu vermeiden oder Zellen mit sehr großen Volumenunterschieden zu fraktionieren. Zellen mit sehr unterschiedlichen Volumina divergieren nämlich in ihren Sedimentationsverhalten oft so weit, dass es nicht möglich ist Rotor- und Fluidgegenstromgeschwindigkeiten so einzustellen, dass große Zellen nicht bereits pelletieren, während kleine noch ausgespült werden.

Zur Lösung dieser Probleme wurden bereits einige Anstrengungen unternommen:

i. Zellsuspensionen wurden in zwei Schritten getrennt. Zuerst wurden kleine und große Zellen grob voneinander getrennt und dann wurden die erhaltenen Fraktionen nochmals jeweils einer Feintrennung unterworfen [Lord & Keng, 1984]. Das Verfahren ist zeitaufwendig und belastet die Vitalität der Zellen.
ii. Zwei Rotoren wurden seriell verbunden und mit unterschiedlichen Rotationsgeschwindigkeiten so betrieben, dass während eines Trennvorganges Zellfraktionen, die den ersten Rotor verlassen hatten, im zweiten aufkonzentriert wurden, bevor dort eine Feintrennung stattfand [Figdor et al., 1984]. Dazu war eine komplizierte und teure Ausrüstung nötig.
iii Ein Rotor wurde benutzt, der es erlaubte, zwei sich spiegelbildlich gegenüberliegende Trennkammern mit unterschiedlichen Geometrien einzubauen und seriell zu verbinden. In diesem Rotor wurden bei konstanter Rotorgeschwindigkeit und konstanter Einstellung der Pumpe, welche die Gegenstromflüssigkeit pumpte, Zellen zunächst in eine erste Trennkammer geschickt, in der das Suspensionsmedium wegen verengter Geometrie mit erhöhter Geschwindigkeit in Richtung Rotormitte strömte, so dass nur größere Zellen in Schwebe blieben und kleinere in die zweite Trennkammer gespült wurden, wo wegen erweiterter Geometrie ein langsamerer zur Rotormitte hin strömender Fluidfluss den Verbleib der kleineren Zellen zuließ [Janssen et al., 1984]. Hinterher wurde fraktioniert, indem Rotorgeschwindigkeit oder Pumpeneinstellungen verändert wurden. In diesen Experimenten gelang es, Zellen ganzer Milzen zu trennen, ohne dass Zellklumpungen beobachtet wurden. Allerdings überschritten dabei ganz offensichtlich die Volumenunterschiede zwischen den größten und den kleinsten Zellen den Wert von 1000 Femtoliter (fl) nicht.

Im Stand der Technik sind zwar schon Elutriationszentrifugen mit 2 seriell geschalteten Trennkammern bekannt, so wie dies in der US 4350283 beschrieben wird. Bei diesen bekannten Zentrifugen sind aber die Trennkammern spiegelbildlich in gleichen Abständen von der Rotormitte angeordnet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Einsatzmöglichkeiten und die Leistungsfähigkeit der bekannten Gegenstromtischzentrifugen zu verbessern, wobei sehr kurze Trennzeiten möglich sein sollen und die physikalische Belastung der Zellen minimiert wird.

Diese Aufgabe wird durch den Gegenstromtischzentrifugenrotor mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Gegenstromtischzentrifugenrotor eingeführt, der zwei Trennkammern enthält, welche seriell miteinander verbunden sind. Er ist in den Abbildungen (Abb.) graphisch dargestellt, wobei
1 einen Querschnitt durch den Rotor und die montierten Einsätze,
2 Frontansichten der Einsätze 8 (oben) und 9 (unten),
3 einen Querschnitt durch ein Trennkammerunterteil (14a = 14b),
4 Querschnitte durch ein kurzes (15, oben) und ein langes (16, unten) Verbindungsstück, welche die Abstände zwischen Rotorwelle (3) und Trennkammerunterteilen (14a oder 14b) festlegen, und
5 Querschnitte durch lange (17, oben) und kurze (18, unten) Ergänzungsstücke, welche die Rotorkörperteile (2a oder 2b) zwischen Trennkammerunterteilen (14a oder 14b) und Kappen (1) ausfüllen, zeigt.
Der besagte neue Rotor unterscheidet sich von allen bisher bekannten Gegenstromzentrifugenrotoren mit zwei seriell verbundenen Trennkammern, z.B. nach der US 4,350,283 , US 4,798,579 , DE 38 79 686 T2 , EP 0346422 B1 und WO 89/04215 A1, insbesondere dadurch, dass die Einsätze (8,9) näher als 0,5 cm an die Rotormitte heranreichen, direkt an die Rotorwelle angekuppelt werden und aus 3 Modultypen aufgebaut sind. Das nahe Heranführen der Einsätze an die Rotormitte und der Aufbau aus 3 Modulen ermöglichen es, die in die Einsätze (8,9) eingearbeiteten Trennkammern (10,11) unabhängig voneinander in ihren Abständen von der Rotormitte um mindestens eine Trennkammerlänge so zu variieren (1), dass in einem Gegenstromzentrifugenrotor bei gegebener Rotationsgeschwindigkeit in zwei seriell geschalteten Trennkammern unterschiedliche Zentrifugalkräfte auf Partikel einwirken. Die Abstände der Trennkammern von der Rotormitte und somit die in jeder Trennkammer bei gegebener Rotationsgeschwindigkeit auftretenden Zentrifugalkräfte sind flexibel einstellbar und können im Unterschied zu bereits bekannten Zentrifugationsverfahren mit zwei von der Rotormitte verschieden weit entfernten Trennkammern nach der DT 26 24 154 A1 dem jeweils vorliegenden Trennproblem unter Beibehaltung des Prinzips der Gegenstromelutriation angepasst werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird der in der DE 88 04 339 U1 beschriebene rohrförmige Gegenstromtischzentrifugenrotor weiterentwickelt, in welchem nur ein Einsatz mit einer 0.5 ml fassenden Trennkammer direkt an die zentrale Rotorwelle angekuppelt wird. Wie der ursprüngliche passt auch der verbesserte Gegenstromtischzentrifugenrotor in die vorgenannte Gegenstromtischzentrifuge. Diese hat eine Antriebsvorrichtung, auf die der Rotor über den Kupplungsteil (4) gesetzt wird und ein Gehäuse, welches eine Rotorkammer bildet, die durch einen Deckel verschließbar ist, welcher einen mit dem Fluidleitungsanschluß (5) des Rotors koppelbaren stationären Fluidkupplungsteil zum Verbinden der Fluidleitungen der Rotorwelle (3) mit einem externen Fluidsystem hat.
Die Verbesserungen gegenüber dem Vorläufermodell und den bisher bekannten Elutriatormodellen bestehen wie im folgenden näher erläutert und in den Ansprüchen gekennzeichnet darin:
Der neue Rotor (1) hat drei voneinander unabhängige Fluidleitungskanäle (20a/b,22, 25a/b), welche, weil sie wie folgt, in die stählerne Rotorwelle (3) eingearbeitet sind, eine direkte Ankupplung der Einsätze an die Rotorwelle erlauben:

i. Von einer an der Stirnseite der Rotorwelle (3) mündenden mittigen Öffnung (6) führt eine erste Fluidleitung (20a/b) zuerst axial (20a) durch die Rotorwelle (3) bis zu einer Stelle, die ein Drittel des Innendurchmessers des rohrförmigen Rotorkörpers (2a,2b) unter dessen oberen Innenseite liegt, dann radial (20b) zum ersten Rotorkörperteil (2a);
ii. an einer Stelle, die ein Drittel des Innendurchmessers des rohrförmigen Rotorkörpers (2a,2b) über dessen unteren Innenseite liegt, verbindet eine zweite, die Rotorwelle (3) radial durchquerende Fluidleitung (22) die beiden rohrförmigen Rotorkörperteile 2a und 2b;
iii. von einer Öffnung (7) am Boden der Ringnut (27), welche an der Stirnseite der Rotorwelle (3) koaxial die mittige Öffnung (6) umgibt, führt eine dritte Fluidleitung (25a/b) zuerst axial (25a) durch die Rotorwelle (3) bis zu einer Stelle, die ein Drittel des Innendurchmessers des rohrförmigen Rotorkörpers (2a,2b) unter dessen oberen Innenseite liegt, dann radial (25b) zum zweiten Rotorkörperteil (2b).

Da die in die Rotorwelle (3) gebohrten Fluidleitungen (20a/b,22,25a/b) in den beiden rohrförmigen Rotorkörpern (2a,2b) exakt ein Drittel ihrer Innendurchmesser unter ihren oberen Innenseiten bzw. über ihren unteren Innenseiten enden, ist es möglich jedes Modul in jedem der zwei gegenüberliegenden rohrförmigen Rotorkörperteile (2a,2b) zu montieren und die Stirnseiten der Einsätze bis auf 0.5 cm an die Rotormitte heranzuführen, so dass die Lage einer Trennkammer über nahezu der ganze Länge eines rohrförmigen Rotorkörperteils verändert werden kann. Wenn in beiden gegenüberliegenden Rotorkörperteilen (2a, 2b) die Einsätze (8,9) montiert sind, komplettieren sie ein geschlossenes Zentrifugengegenstromsystem mit seriell verbundenen Trennkammern, durch welches Flüssigkeit wie in 1 durch Pfeile dargestellt gepumpt werden kann. Jeder Einsatz (8,9) enthält eine Trennkammer (10,11) sowie je eine Flüssigkeitsleitung zur Trennkammerbeschickung (21,24) und je eine zur Trennkammerentladung (23,26), welche beide im Unterschied zu bereits beschriebenen verstellbaren Flüssigkeitszufuhr- und -ableitungsvorrichtungen für Zentrifugen , z.B. nach der DE 1 657 657 B , so aufeinander abgestimmt sind, dass zwischen Zufuhr- und Abfuhrleitungen eine geschlossene Trennkammer liegt, welche von außen nach innen mit Flüssigkeit durchströmt zentrifugale Elutriation ermöglicht.
Die beiden Flüssigkeitsleitungen jedes Einsatzes (8,9) beginnen an den Stirnseiten (2), welche bei der Montage im Rotorkörper (2a,2b) an den abgeflachten Stellen (12,13) der Rotorwelle 3 in nur 0,5 cm Entfernung von der Rotormitte so angepasst werden dass:

i. die Öffnung der Flüssigkeitsleitung (21), die von der Stirnseite des ersten Einsatzes (8) an die Peripherie der ersten Trennkammer (10) führt, dem Ende der ersten Fluidleitung (20b) genau gegenüber liegt;
ii. die Öffnung der Flüssigkeitsleitung (23), welche von dem der Rotormitte zugewandten Ende der ersten Trennkammer (10) an die Stirnseite des ersten Einsatzes (8) führt, genau gegenüber der im ersten Rotorkörperteil (2a) beginnenden Öffnung der zweiten Fluidleitung (22) liegt;
iii. die Öffnung der Flüssigkeitsleitung (24), die von der Stirnseite des zweiten Einsatzes (9) an die Peripherie der zweiten Trennkammer (11) führt, genau gegenüber der im Rotorkörperteil 2b endenden Öffnung der zweiten Fluidleitung (22) liegt;
iv. die Öffnung der Flüssigkeitsleitung (26), welche von dem der Rotormitte zugewandten Ende der zweiten Trennkammer (11) an die Stirnseite des zweiten Einsatzes (9) führt, genau gegenüber dem Anfang der dritten Fluidleitung (25b) liegt.

Die Einsätze (8,9), welche die oben beschriebene Flüssigkeitsleitungen (21,24 bzw. 23,26) sowie je eine Trennkammer (10,11) enthalten, werden aus folgenden Kunststoffmodulen aufgebaut:

i. Trennkammerunterteilen (14a oder 14b) mit neuer oder bewährter Trennkammergeometrie [Bauer & Hannig, 1988; Bauer und Stünkel, 1991; Bauer et al., 1992], (3)
ii. unterschiedlich langen Verbindungsstücken (15,16), welche die für eine optimale Lösung eines gegebenen Partikeltrennproblems benötigten Abstände der jeweiligen Trennkammerunterteile (14a oder 14b) zur Rotorwelle (3) festlegen. Sie enthalten Flüssigkeitsleitungskanäle (21,24 bzw. 23,26), welche (21,24) Flüssigkeit von der Rotorwelle (3) wegleiten und welche (23,26) mit ihren erweiterten Enden, mit denen sie die Trennkammerunterteile (14a bzw. 14b) zu ganzen Trennkammern (10,11) komplettieren, Flüssigkeit an den jeweiligen, der Rotormitte zugewandten Enden der Trennkammern (10,11) aufnehmen und zur Rotorwelle zurückleiten (4).
iii. unterschiedlich langen Ergänzungsstücken (17,18), welche in den Rotorkörperteilen, 2a oder 2b, die Restabstände zwischen den jeweiligen Trennkammerunterteilen (14a bzw. 14b) und den Kappen (1) ausfüllen und sowohl zur exakten Fixierung der Einsätze als auch zur Herstellung des Rotationsgleichgewichtes dienen (5).

Alle Module haben auf ihrer Oberfläche Rinnen (28a, 28b), in welche die Führungsschienen (29a, 29b) genau passen, die im ersten Rotorkörperteil (2a) unten und im zweiten Rotorkörperteil (2b) oben befestigt sind. Die Rinnen verlaufen längsseitig und liegen in den Verbindungsstücken (15, 16) nahest den Flüssigkeitsleitungen (23,26), welche mit ihren erweiterten Enden die Trennkammern (10,11) an ihren der Rotorwelle zugewandten Seiten komplettieren (4), während sie auf den Trennkammerunterteilen (14a,14b) gegenüber den Flüssigkeitsleitungen (21,24) liegen, die zur Peripherie der Trennkammern (10,11) führen (3). Die verschiedenen Module werden durch Schrauben lösbar so miteinander verbunden, daß durchgehende Rinnen (28a,28b) entstehen.
Durch entsprechende Kombination der oben beschriebenen Module entstehen Paare von Einsätzen (8,9), die in den Rotorkörperteilen (2a und 2b) gegenüberliegend montiert zusammen mit der Rotorwelle eine durchgehende Flüssigkeitsleitung bilden (1). Eingebettet in diese Leitung sind die beiden Trennkammern (10,11), deren Geometrien identisch oder unterschiedlich sein mögen, deren Abstände von der Rotormitte sich aber um mindestens eine Trennkammerlänge unterscheiden können (1). Zusammengebaute Einsätze werden im jeweiligen Rotorkörperteil (2a oder 2b) mit Hilfe der jeweiligen Führungsschiene (29a oder 29b) und aufschraubbaren Kappen (1) fixiert.
Die Erfindung erweitert die Einsatzmöglichkeiten der Gegenstromzentrifugation im allgemeinen und verbessert die Leistungsfähigkeit der früher beschriebenen Gegenstromtischzentrifuge [Bauer & Hannig, 1988; Bauer und Stünkel, 1991; Bauer et al., 1992], welche als kleine Tischzentrifuge auch unter Sterilhauben betrieben wird, bei kleinen Zellmengen optimal arbeitet, wegen der benötigten geringen Mengen von Gegenstromflüssigkeit (ca. 100 ml) auch mit teurem, aber zellfreundlichem Kulturmedium gegengeströmt werden kann, sehr kurze Trennzeiten erlaubt und dadurch die physikalische Belastung der Zellen minimiert. Die vorliegende Erfindung wird die Trennschärfe verbessern, da sie Coelutionen, die in Einkammersystemen häufig beim Beladen oder im semikontinuierlichen Betrieb beobachtet wurden, durch erneutes Trennen in einer zweiten Kammer vermindert [Figdor, 1984] und sie wird Möglichkeiten eröffnen, auch Partikel, die sich in ihren Volumina um mehr als 1500 fl unterscheiden während des Trennvorganges gleichzeitig in Schwebe zu halten, solange noch eine weitere Art von Partikeln durch das System gespült wird. Partikel, die sich in ihren Volumina um mehr als 1500 fl unterscheiden fallen sehr häufig an, wenn menschliche Organ- oder Tumorgewebe in Einzelzellen zerlegt werden.
Der Effekt der Erfindung ist wie folgt zu berechnen:
Aus der Literatur [Sandersonet al., 1976] ist bekannt:
In einer Gegenstromzentrifuge bleibt ein Partikel in Schwebe,
wenn (ρ_P – ρ_M)·ω²·a·V = k₁ηvd
Dabei ist (ρ_P – ρ_M) der Unterschied zwischen der Dichte eines Partikels (ρ_P) und der Dichte des umgebenden Fluids (ρ_M), (V) das Volumen eines Partikels, (ω) die Rotationsgeschwindigkeit, (a) der aktuelle Abstand zwischen der Mitte des Rotors und der Stelle, an der ein Partikel gerade rotiert, (d) der Durchmesser des Partikels, (v) die Geschwindigkeit, mit der Flüssigkeit in Richtung Rotormitte am Partikel vorbeiströmt, (η) die Viskosität der Gegenstromflüssigkeit und k eine Konstante, die die Form eines Partikels berücksichtigt.
Da für das Volumen V = k₂d³ gilt, kann man die obige Gleichung umformen in: (ρ_P – ρ_M)·ω²·a·k₂·d³ = k₁ηvd
Dies gibt: (ρ_P – ρ_M)·ω²·a·k₂·d² = k₁ηv
Bei gegebener Gegenströmungsgeschwindigkeit (v), gegebener Rotorgeschwindigkeit (ω), gegebener Flüssigkeitsviskosität (η) und gegebener Dichtedifferenz (ρ_P – ρ_M) bleiben in einer Gegenstromzentrifuge zwei gleichgeformte Partikel also dann in Schwebe, wenn das Produkt aus ihrem aktuellen Abständen (a) von der Mitte des Rotors und dem Quadrat ihrer Durchmesser (d²) gleich bleiben, d.h. wenn a·d² = konstant bleibt.
Wenn nun a um den Faktor f geändert wird, muss der Durchmesser d eines Partikels um den Faktor 1/f ^½ geändert sein, damit das Produkt aus a·d² konstant bleibt.
Werden also ähnlich geformte Partikel wie Zellen in einer Gegenstromzentrifuge mit zwei seriell geschalteten Trennkammern rotiert, bleiben zwei unterschiedlich große Partikel in den gegenüberliegenden Trennkammern an Stellen gleicher Gegenstromgeschwindigkeit gleichzeitig in Schwebe, wenn diese beiden Bedingungen erfüllt sind:

i. die Durchmesser des kleinen und des großen Partikels unterscheiden sich um den Faktor 1/f^½,
ii. die Stelle in der einen Trennkammmern, an der das kleinere Partikel einer gegebenen Gegenstromgeschwindigkeit ausgesetzt ist, ist f-mal so weit von der Rotormitte entfernt als die entsprechende Stelle in der anderen Trennkammer, an der das größere Partikel der gleichen Gegenstromgeschwindigkeit ausgesetzt ist.

Zellen deren Durchmesser sich um den Faktor 1/f^½ unterscheiden, unterscheiden sich im Volumen um den Faktor 1/f^½. Dies bedeutet: Zwei ähnlich geformte Partikel, die gleiche spezifische Dichten haben, aber sich im Volumen um den Faktor 3 unterscheiden, kann man während einer zentrifugalen Elutriation bei gegebener Rotorgeschwindigkeit in zwei identischen Trennkammmern an Positionen identischer Gegenstromgeschwindigkeit in Schwebe halten, wenn man, wie im neuen Gegenstromtischzentrifugenrotor möglich, die Trennkammern so lokalisiert, dass sich die Abstände der gewünschten Positionen von der Rotormitte um den Faktor 2,08 unterscheiden.
Werden nun Trennkammern benutzt, deren Geometrie im Einkammersystem es ermöglicht, Zellen zwischen 200 und 1300 fl zu trennen [Bauer & Stünkel, 1991], ohne dass die großen Zellen pelletieren, während die kleinen fraktioniert werden, ist das Zweikammersystem, mit einer der Rotormitte sehr nahe liegenden ersten Trennkammer und einer dem Einkammersystem gleichen zweiten Trennkammer [Bauer & Hannig, 1988] geeignet, Gemische von Zellen mit Volumenunterschieden von 200 bis ca. 3600 fl zu trennen, wie sie z.B. bei der Fraktionierung von Zellen aus Tumorgeweben auftreten [Lord & Keng; 1984; Bauer et al., 1992]. Gleichzeitig können auch noch Partikel (z.B. zerstörte Zellen mit dem Suspensionsmedium sehr ähnlichen spezifischen Dichten) vorweg ausgewaschen werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hatte der rohrförmige Rotorkörper eine Länge von 18.5 cm und einen Außendurchmesser von 3 cm. Die Rotorkörpereinsätze hatten eine Länge von 7.3 cm und einen Durchmesser von 2.5 cm. Die Trennkammern hatten ein Trennkammervolumen von 0.5 ml und eine Länge von 2.5 cm. Ihre Abstände von der Mitte des Rotors mögen, gemessen an den peripheren Enden zwischen 3.7 cm und 7.5 cm variieren. Der Durchmesser der Kanäle beträgt 1 mm. Rotordrehzahlen bis 3500 l/min sind möglich. Es werden Trennkammern mit einer Geometrie benutzt, die sich bei der Fraktionierung von Gemischen kleiner Zellen (z. B. Blutzellen) und Gemischen großer Zellen (z. B.: Prostatatumorzellen) bereits bewährt hat [Bauer & Hannig, 1988; Bauer und Stünkel, 1991; Bauer et al., 1992]. Für optimalen Betrieb sind kleine Zellmengen ausreichend, die z.B. aus einer 150 ml Kulturflasche oder 25 ml Blut gewonnen werden können. Für ein Trennexperiment werden ca. 80 ml Gegenstrommedium benötigt.
Die Erfindung zielt vor allem darauf ab, Einzelzellgemische zu trennen, die aus normalen oder entarteten menschlichen oder tierischen Geweben gewonnen werden. Sowohl normale tierische oder menschliche Organe als auch Tumore enthalten unterschiedliche Zellen. Ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal der Zellen sind ihre Volumina (Bauer, 1999). Von Geweben erhaltene Einzelzellgemische enthalten häufig Zellen mit sehr unterschiedlichen Volumina, z.B. Leukozyten mit 200 fl bis 500 fl, Makrophagen und Endothelzellen mit 800 fl bis 2000 fl, epitheliale Gewebszellen mit oft über 3000 fl und geschädigte Zellen. Die spezifischen Dichten der vitalen Zellen schwanken zwischen 1.06 kg/l und 1.11 kg/l. Wenn Zellen beim Isolieren beschädigt werden oder absterben, wird ihre Zellmembran durchlässig und die Unterschiede der spezifischen Dichten des Zellinneren und der Zellumgebung werden weitgehend ausgeglichen, so daß sie in Rotoren mit Durchmessern unter 20 cm bei maximalen 3500 l/min kaum noch sedimentieren, weil die Differenz ρ_P – ρ_M sehr klein wird.
Um Funktionen verschiedenen Körperzellen zu erkennen und sie, wenn sie krankheitsverursachend ausfallen, gezielt wieder herstellen zu können, ist es wichtig die verschiedenen Zellen zu studieren, solange sie noch in ihrem ursprünglichen in vivo Status sind. Per zentrifugaler Elutriation innerhalb von Minuten getrennte Zellpopulationen bieten eine optimale Voraussetzung, um Information über aktuelle in vivo Zustände von Körperzellen zu gewinnen.
Neben der hier bevorzugten Anwendung wird die erfindungsgemäße Gegenstromtischzentrifuge für viele Zelltrennungsprobleme in der Forschung und Biotechnologie geeignet sein [Bauer, 1999]. Auch volumen- und dichteabhängige Trennungen anorganischer Partikel mit Durchmessern zwischen 5 und 30 μm sind denkbar. Das neue Zweikammersystem mit der Möglichkeit die Trennkammerabstände von der Rotorwelle flexibel einzustellen, wird in vielen Fällen geeignete Einstellungen von Trennkammerabständen und von Rotor- und Fluidgegenstromgeschwindigkeiten erlauben, unter denen gleichzeitig große Partikel in der ersten, der Rotormitte näher gelegenen Trennkammer und kleine in der zweiten, der Rotormitte weiter entfernten Trennkammer in Schwebe gehalten werden können.

Claims

Gegenstromtischzentrifugenrotor bestehend aus rohrförmigen, durch aufgeschraubte Kappen (1) verschließbaren Rotorkörperteilen (2a,2b) und einer Rotorwelle (3), welche an einem Ende ein Kupplungsteil (4) für eine Antriebsvorrichtung und am anderen Ende einen Fluidleitungsanschluß (5) aufweist, an dem zwei Fluidleitungen (20a,25a) münden, wobei in den zwei gegenüberliegenden rohrförmigen Rotorkörperteilen (2a,2b) je ein modular aufgebauter Einsatz (8,9) mit je einer Trennkammer (10,11) so montiert ist, dass die Einsätze (8,9) mit ihren Stirnseiten an je eine der beiden, in weniger als 1 cm Abstand gegenüberliegenden, innerhalb der Rotorkörperteile (2a,2b) abgeflachten Stellen (12,13) der Rotorwelle (3) angekuppelt werden, wobei die Trennkammern (10,11) so angeordnet sind, dass deren Abstände von ihren Stirnseiten sich mindestens so weit unterscheiden, dass, wenn beide Trennkammern (10,11) während eines Trennvorganges innerhalb der beiden Rotorkörperteile (2a und 2b) rotieren, die Zentrifugalkräfte am peripheren Ende der der Rotormitte nahen ersten Trennkammer (10) geringer sind als die Zentrifugalkräfte, die gleichzeitig an dem der Rotormitte zugewandten Ende der zweiten Trennkammer (11) wirksam sind und wobei Flüssigkeit, in der Partikel suspendiert sein können, durch den laufenden Rotor gepumpt wird, wobei diese nacheinander durch die erste Trennkammer (10) und anschließend durch die zweite Trennkammer (11) jeweils von der Peripherie in Richtung Rotorwelle (3) fließt, bevor sie den Rotor wieder verlässt.
Gegenstromtischzentrifugenrotor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Einsätze (8,9) direkt an die Rotorwelle gekuppelt werden und aus jeweils folgenden drei Modultypen, nämlich i. aus Trennkammerunterteilen (14a bzw. 14b) mit geeigneter Gegenstromtrennkammergeometrie, ii. aus unterschiedlich langen Verbindungsstücken (15,16), die den Abstand von Trennkammerunterteilen (14a oder 14b) zur Rotorwelle (3) festlegen und Flüssigkeitsleitungskanäle (21,24; 23,26) enthalten, wobei die Flüssigkeitsleitungskanäle (21,24) Flüssigkeit von der Rotorwelle (3) in Richtung Peripherie der Trennkammern (10,11) leiten und wobei die Flüssigkeitsleitungskanäle (23,26) mit ihren erweiterten Enden, mit welchen sie die Trennkammerunterteile (14a bzw. 14b) zu ganzen Trennkammern (10,11) komplettieren, Flüssigkeit, die Partikelfraktionen enthalten mag, an den jeweiligen, der Rotormitte zugewandten Enden der Trennkammern aufnehmen und zur Rotorwelle zurückleiten, iii. aus unterschiedlich langen Ergänzungsstücken (17,18), welche in den Rotorkörperteilen (2a, 2b) die Restabstände zwischen den jeweiligen Trennkammerunterteilen (14a bzw. 14b) und den Kappen (1) ausfüllen und sowohl zur exakten Fixierung der Einsätze als auch zur Herstellung des Rotationsgleichgewichtes mittels Metallteilen (19) dienen, aufgebaut sind.
Gegenstromtischzentrifugenrotor gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung des benötigten Flüssigkeitsleitungssystems, das von der mittigen Öffnung (6) an der Stirnseite der Rotorwelle (3) durch die Rotorwelle (3), dann durch den ersten (8), anschließend durch den zweiten Einsatz (9) und wieder zurück zur Rotorwelle und dort zur Öffnung (7) am Boden der die mittige Öffnung (6) koaxial umgebenden Ringnut (27) führt und zur direkten Ankupplung der nach Anspruch 2 flexibel gestalteten Einsätze an die Rotorwelle folgende drei Fluidleitungen (20a/b, 22, 25a/b) in die Rotorwelle (3) gebohrt sind: i. eine erste Fluidleitung (20a/b) führt von der an der Stirnseite der Rotorwelle (3) mittig mündenden Öffnung (6), zuerst über einen axialen Kanal (20a) dann über einen im Abstand von einem Drittel des Innendurchmessers des Rotorkörpers (2a) unterhalb der oberen Innenseite des Rotorkörpers angebrachten radialen Kanal (20b) zu einer Öffnung im nach Anspruch 1 abgeflachten, dem ersten Rotorkörperteil (2a). zugewandten Abschnitt (12) der Rotorwelle (3), um durchströmende Flüssigkeit an die Flüssigkeitsleitung (21) des ersten Rotoreinsatzes (8) zu befördern, welche diese zum peripheren Ende der ersten nach den Ansprüchen 1 und 2 gebauten Trennkammer (10) leitet; ii. eine zweite Fluidleitung (22) durchquert radial die Rotorwelle (3) im Abstand von einem Drittel des Innendurchmessers des Rotorkörpers oberhalb der unteren Innenseite der Rotorkörperteile (2a und 2b), um die Flüssigkeitsleitung (23) des nach Ansprüchen 1 und 2 gebauten, im ersten Rotorkörperteil (2a) liegenden Einsatzes (8), welche Flüssigkeit von dem der Rotormitte zugewandten Ende der ersten Trennkammer (10) abführt, mit der Flüssigkeitsleitung (24) des nach Ansprüchen 1 und 2 gebauten, im zweiten Rotorkörperteil (2b) liegenden Einsatzes (9) zu verbinden, welche Flüssigkeit zum peripheren Ende der zweiten Trennkammer (11) leitet; iii. eine dritte Fluidleitung (25a/b) führt von einer Öffnung (7) am Boden der Ringnut (27), welche an der Stirnseite der Rotorwelle (3) koaxial die mittige Öffnung (6) umgibt, zuerst axial (25a) durch die Rotorwelle (3) bis zu einer Stelle, die ein Drittel des Innendurchmessers des rohrförmigen Rotorkörpers (2b) unter dessen oberen Innenseite liegt, dann radial (25b) zu einer Öffnung im nach Anspruch 1 abgeflachten, dem zweiten Rotorkörperteil (2b) zugewandten Abschnitt (13) der Rotorwelle (3), um dort Flüssigkeit aufzunehmen, welche aus der zweiten Trennkammer (11) des im zweiten Rotorkörperteil (2b) liegenden Einsatzes (9) an dem der Rotormitte zugewandten Ende über die Flüssigkeitsleitung (26) austritt, und um diese Flüssigkeit dann zur Ringnut (27) zu leiten.
Gegenstromtischzentrifugenrotor gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Fixierung der Einsätze (8,9) im ersten Rotorkörperteil (2a), in dem die nach Anspruch 3i gelegte Fluidleitung (20b) endet, eine Führungsschiene (29a) an der unteren Innenseite befestigt ist und im zweiten Rotorkörperteil (2b), in dem die nach Anspruch 3iii gelegte Fluidleitung (25b) beginnt, eine Führungsschiene (29b) an der oberen Innenseite befestigt ist.
Gegenstromtischzentrifugenrotor gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einsätze (8,9) an ihren Außenseiten durchgehende Rinnen (28a,28b) aufweisen, in welche die Führungsschienen (29a,29b) genau passen und welche jeweils nahest den Flüssigkeitsleitungen (23,26) liegen, welche von den der Rotormitte zugewandten Enden der Trennkammern (10,11) an die Stirnseiten der Einsätze (8,9) führen, und jeweils entferntest den Flüssigkeitsleitungen (21,24) liegen, welche von den Stirnseiten der Einsätze (8,9) zur Peripherie der Trennkammern (10,11) führen, so dass jeder Modultyp (14-18) zur Konstruktion eines Einsatzes (8,9) geeignet ist, der sowohl in den ersten (2a) als auch in den zweiten (2b) Rotorkörperteil passt.