DE10314579A1

DE10314579A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren

Info

Publication number: DE10314579A1
Application number: DE2003114579
Authority: DE
Inventors: Tobias Dr. Neumann; Michael Dr. Kempe; Ralf Wolleschensky
Original assignee: Carl Zeiss Jena GmbH
Current assignee: Jenoptik AG
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2003-03-31
Publication date: 2004-10-14

Abstract

Es wird beschrieben eine Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren (16), mit einer Fixiereinrichtung (13, 18), die Metallpartikel (14) fixiert, einer Transporteinrichtung (10, 17), die Nukleinsäuren (16) an den Metallpartikeln (14) vorbeiführt, und einem Anregungsstrahlengang (A), der im Betrieb an den Metallpartikeln (14) vorbeigeführte Nukleinsäuren (16) zur Abgabe von Autofluoreszenzstrahlung (A) anregt, die aufweist einen Detektionsstrahlengang (6, 5, 4), der Autofluoreszenzstrahlung (A) im Bereich eines einzelnen Metallpartikels (14) aufnimmt und in einen Spektralanalysator (7) leitet, wobei der Spektralanalysator (7) ein die spektrale Zusammensetzung der Autofluoreszenzstrahlung (A) anzeigendes Signal (S) abgibt, und eine Analyseeinheit (9) vorgesehen ist, die die Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure (16) durch eine Spektralanalyse mehrerer während des Vorbeiführens aufgenommener Signale (S) unter Rückgriff auf Referenzspektren einzelner Nukleotide bestimmt.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren, beim dem Nukleinsäuren an Metallpartikeln vorbeigeführt und zur Abgabe von Autofluoreszenzstrahlung angeregt werden. Die Erfindung bezieht sich weiter auf eine Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren, mit einer Fixiereinrichtung, die Metallpartikel fixiert, einer Transporteinrichtung, die Nukleinsäuren an den Metallpartikeln vorbeiführt, und einem Anregungsstrahlengang, der im Betrieb an den Metallpartikeln vorbeigeführte Nukleinsäuren zur Abgabe von Autofluoreszenzstrahlung anregt.

Zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren, wobei unter diesem Begriff hier sowohl genomische DNA oder RNA als auch cDNA umfaßt wird, sind Verfahren bekannt, die entsprechende Label-Substanzen zur Markierung einsetzen. Um eine labelfreie Sequenzanalyse von Nukleinsäuren zu erreichen, kann man den Effekt auszunutzen, daß Silberkörner oder andere Metallpartikel geeigneten Durchmessers die Autofluoreszenz einer Nukleinsäure erhöhen. Die US 2002/0160,400 A1 beschreibt diesbezüglich ein Verfahren der eingangs genannten Art, das die Fluoreszenzintensität eines Biomoleküls durch Variation des Abstands zwischen Biomolekül und einem Metallpartikel verändert und dadurch eine Identifikation einer Nukleinsäure durch Auswertung geeignet aufgenommener Fluoreszenzspektren erreicht. Dabei wird eine Nukleinsäure in einem Fluid in die Nähe einer Oberfläche, auf der sich Metallpartikel befinden, gebracht und durch entsprechende Beleuchtung Fluoreszenzstrahlung angeregt. Zur Sequenzanalyse wird dies wiederholt ausgeführt, wobei jedesmal zuvor Nukleotide vom Nukleinsäure-Strang abgespalten werden, so daß der Strang nach und nach verkürzt wird. Die einzelnen Spektren für die unterschiedlich verkürzten Stränge erlauben dann eine Sequenzbestimmung.

Das Verfahren gemäß US 2002/0160.400 A1 hat jedoch den Nachteil, daß eine aufwendige Abspaltung von Nukleotiden von der Nukleinsäure unerläßlich ist.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren sowie eine Vorrichtung der eingangs genannten Art so weiterzubilden, daß eine Abspaltung von Nukleotiden entfällt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gelöst, daß während des Vorbeiführens die im Bereich eines einzelnen Metallpartikels abgegebene Autofluoreszenzstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird, wobei nacheinander mehrere Spektren aufgenommen werden und die Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure durch eine Spektralanalyse der mehreren Spektren unter Rückgriff auf Referenzspektren einzelner Nukleotide bestimmt wird. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, die einen Detektionsstrahlengang aufweist, der Autofluoreszenzstrahlung im Bereich eines einzelnen Metallpartikels aufnimmt und in einen Spektralanalysator leitet, wobei der Spektralanalysator ein die spektrale Zusammensetzung der Autofluoreszenzstrahlung anzeigendes Signal abgibt, und eine Analyseeinheit vorgesehen ist, die die Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure durch eine Spektralanalyse mehrerer während des Vorbeiführens aufgenommener Signale unter Rückgriff auf Referenzspektren einzelner Nukleotide bestimmt.

Die Erfindung erreicht eine labelfreie Sequenzanalyse von Nukleinsäuren auf Grundlage der Wechselwirkung einer Sonde mit der Nukleinsäure, wobei die Sonde in Form eines Metallpartikels vorliegt und lokal erhöhte Autofluoreszenz der Nukleinsäuren erzeugt. Durch Bewegung der Nukleinsäure gegenüber der Sonde wird eine Sequenzierung der Nukleinsäure möglich. Die zur Sequenzierung notwendige Unterscheidung der Nukleinsäuren erfolgt auf der Grundlage spektraler Fluoreszenzsignaturen durch eine geeignete, spektral und zeitlich auflösende Detektion und Signalverarbeitung. Die Analyse wertet die durch die Bewegung zeitlich variierende Spektralverteilung der Fluoreszenzstrahlung aus. Bei mehreren Sonden erfolgt zusätzlich die Detektion so, daß die Autofluoreszenzstrahlung im Bereich eines einzelnen Metallpartikels erfaßt werden kann.

Aus anwendungstechnischer Sicht ist die dadurch erreichte markierungsfreie Analyse von Nukleinsäuren bzw. deren Nukleotid-Sequenz äußerst interessant, da Verfälschungen durch Markierungsreaktionen oder Vervielfältigungsreaktionen ausgeschlossen werden können. Ebenfalls erschließt sich damit die Möglichkeit, einzelne Nukleinsäure-Stränge zu analysieren, was insbesondere für Anwendungen wie Mikrodisektion, bei der mittels Laserstrahlung wenige Zellen aus einem biologischen Material herausgeschnitten werden, ein großer Gewinn ist, da Nukleinsäurevervielfältigungsmethoden, wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion eine Mindestmenge an Nukleinsäurematerial voraussetzen, was die Möglichkeiten der Probengewinnung stark einschränkt. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen markierungsfreien Analyse von Nukleinsäuren ergibt sich daraus, daß eine Hybridisierungsreaktion nicht mehr erforderlich ist. Unterschiedliche Hybridisierungsaffinitäten von verschiedenen Sequenzabschnitten können somit nicht zu falschen oder ungenauen Ergebnissen führen. Weiter entfällt auch eine üblicherweise notwendige Optimierung von Schmelzpunkt- und Hybridisierungstemperaturen für eine parallele Hybridisierung, wie sie bei Nukleinsäure-Arrays zur Analyse in der Regel unerläßlich ist.

Ein weiterer Vorteil der direkten Sequenzierung besteht darin, daß derivatisierte Nukleotide (z. B. Methylcytosin) ebenfalls detektiert werden können. Informationsverlust durch Auslesen des komplementären „hybridisierten" DNA oder RNA Stranges kann vermieden werden.

Die relative Bewegung der Sonde gegenüber den Nukleinsäuren kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die Nukleinsäuren in einem Fluidstrom an einer Oberfläche, an der sich als Sonde dienende Metallpartikel befinden, vorbeigeführt werden. Die Metallpartikel sind auf der Oberfläche fixiert, die in einem geeigneten Fluidkanal liegen, durch den die Nukleinsäuren in dem Fluidstrom transportiert werden. Der Fluidstrom ist dabei vorteilhafterweise durch Mikrokanäle geführt, die den Durchfluß gestreckter Nukleinsäure-Stränge bewirken und zugleich die Nukleinsäuren in geeignetem Abstand an die Metallpartikel heranführen. Da die Fluoreszenz mit abnehmendem Abstand zwischen Nukleinsäure und Metallpartikeln zunimmt, ist es bevorzugt, die Nukleinsäuren möglichst nah an die Metallpartikel heranzubringen, beispielsweise in einem Abstand von unter 2–10 nm. Die Flußgeschwindigkeit kann dabei im Bereich einiger cm pro Sek. liegen.

Um einen möglichst konstanten Abstand zwischen den Metallpartikeln und den Nukleinsäuren einzustellen, ist es bevorzugt, Polymerasen an Metallpartikel zu binden und die Nukleinsäuren in einer ATP-haltigen Substratlösung an die Polymerasen anzukoppeln. Durch geeignete Einstellung der Substratlösung und eines Fluidstromes der Substratlösung erreicht man einen steten Wechsel der Ankopplung zwischen Polymerasen und Nukleinsäuren, der die Nukleinsäuren in einem bestimmten, durch die Polymerasen vorgegebenen Abstand an den Metallpartikeln vorbeifördert. Die Einstellung der Substratlösung, insbesondere deren ATP-Gehaltes, Temperatur, Salzkonzentration und/oder pH-Wert, beeinflußt die Wandergeschwindigkeit der Nukleinsäuren an den Metallpartikeln vorbei. Durch die Ankopplung der Nukleinsäuren an die Polymerasen ist ein vorbestimmter Abstand zwischen Nukleinsäure und Metallpartikeln konstant eingestellt. Dieser Abstand kann sehr gering sein und beispielsweise in der Größenordnung von 10 nm liegen.

Die Metallpartikel, an denen die Polymerasen angeheftet sind, beispielsweise durch eine kovalente Bindung, sind zweckmäßigerweise zur geeigneten Detektion der Fluoreszenzstrahlung der Nukleinsäuren räumlich fixiert. Diese Fixierung kann beispielsweise durch Aufbringen der Metallpartikel an einer Oberfläche, die beispielsweise als Substrat ausgebildet sein kann, erreicht sein. Alternativ ist es auch möglich, die Metallpartikel in einer optischen Falle zu halten, die dann als Fixiereinrichtung für die Metallpartikel dient, die sich in einer Lösung befinden. Eine solche optische Falle ist beispielsweise in der US 4.893.886 oder US 5.512.745 , deren Offenbarungsgehalt hier vollständig einbezogen wird, beschrieben.

Die Detektion der von den Nukleinsäuren abgegebenen Fluoreszenzstrahlung erfolgt so, daß die im Bereich eines Metallpartikels abgegebene Strahlung örtlich aufgelöst erfaßt werden kann. Dies geschieht beispielsweise mittels eines Mikroskops, insbesondere eines Fluoreszenzmikroskops.

Eine besonders gute Ortsauflösung erreicht man mit einer konfokalen Anregung und Detektion, da dann eine sehr gute Tiefenauflösung erreicht wird, d.h. Strahlung aus nicht gewünschten Tiefen der Substratlösung wird effizient unterdrückt.

Die Sequenzanalyse wird dadurch ermöglicht, daß die detektierte Fluoreszenzstrahlung für die einzelnen Nukleotide spektral unterschiedlich ist, so liegt das Emissionsmaximum von Adenin bei etwa 320 nm, von Thymin bei 360 bis 370 nm und polyC bei etwa 420 nm. Eine geeignete spektrale Detektion während des Vorbeiführens der Sonde an den Nukleinsäuren ermöglicht somit eine Aussage über das Nukleotid, das gerade an der als Metallpartikel ausgebildeten Sonde vorbeibewegt wurde.

Die zeitliche Entwicklung des Spektrums der Fluoreszenzstrahlung gibt eine Aussage über die Abfolge der Nukleotide in der Nukleinsäure. Es kann dabei natürlich nicht ausgeschlossen werden, daß mehr als ein Nukleotid zur Fluoreszenzstrahlung beiträgt. Ein zu einem bestimmten Zeitpunkt aufgenommenes Spektrum kann deshalb als Gemisch der Fluoreszenzstrahlung verschiedener Nukleotide vorliegen. Die Spektralanalyse erlaubt jedoch eine eindeutige Zuordnung durch Ermittlung der relativen Gewichte der Autofluoreszenzanteile der einzelnen Nukleotide im aufgenommenen Spektrum, da die einzelnen Fluoreszenzanteile der Nukleotide in Form von Referenzspektren vorliegen. Aus der Veränderung der Gewichte von Spektrum zu Spektrum wird die Sequenz der Nukleotide in der Nukleinsäure bestimmt. Bei einem stark schwankenden Abstand zwischen Nukleinsäure und Metallpartikel kann es dabei erforderlich sein, aus statistischen Gründen Nukleinsäuren mehrfach an Metallpartikeln vorbeizuführen. Dies kann entweder dadurch erfolgen, daß eine Nukleinsäure an einem Metallpartikel, aus dessen Umgebung Fluoreszenzstrahlung detektiert wird, mehrfach vorbeigeführt wird. Alternativ können natürlich auch mehrere Metallpartikel verwendet werden, an welchen eine Nukleinsäure nacheinander durchläuft. Üblicherweise wird man parallel mehrere Nukleinsäuren einer Probe gleichzeitig analysieren.

Eine weitere Möglichkeit zur Spektralanalyse besteht in einer Korrelationsanalyse der spektral aufgelösten Detektion zu verschiedenen Meßzeitpunkten. So kann eine Variation eines in einem Zeitintervall aufgenommenen Spektrums und eines in einem benachbarten Zeitintervall aufgenommenen Spektrums so lange vorgenommen werden, bis eine geeignet gewählte Korrelationsfunktion maximiert wird. Die dabei ermittelte Variation enthält die Information über die im Vergleich zu den aufeinanderfolgenden Messungen hinzugetretene Fluoreszenz, die im einfachsten Fall von einer Nukleinsäure stammt. Auch dieser Ansatz kann durch statistische Methoden, d.h. mehrfache Messung verbessert werden.

Solche statistische Methoden können ohne Meßzeitverlängerung durchgeführt werden, wenn Fluoreszenzstrahlung im Bereich mehrerer Metallpartikel mit einer Ortsauflösung detektiert wird, die besser ist als ein Abstand zwischen den einzelnen Metallpartikeln, der beispielsweise in der Größenordnung von 200 bis 400 nm liegen kann.

Für die Metallpartikel kommen alle Metalle in Frage, bei denen eine Erhöhung der Fluoreszenz einer Nukleinsäure auftritt. Beispielsweise kommen in Frage Rhenium, Rhodium, Radium, Silber, Kupfer, Osmium, Iridium, Platin oder Gold. Generell haben sich Edelmetalle als vorteilhaft herausgestellt. Die Größe der als Sonde dienenden Metallpartikel hat natürlich Einflüsse auf die Auflösung der Messung. Je kleiner die Sonde, desto einfacher fällt die Spektralanalyse. Metallpartikel in einer Größe von 5 bis 10 nm sind hier vorteilhaft, wobei noch kleinere Metallpartikel beispielsweise in der Größenordnung von 1 nm besonders günstig sind, da damit die Spektralanalyse besonders einfach ist.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielshalber noch näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:
1 eine schematische Darstellung einer Analysevorrichtung zur Sequenzanalyse,
2 einen Ausschnitt einer ersten Ausführungsform der Probenkammer der Analysevorrichtung der 1,
3 einen Ausschnitt einer zweiten Version einer Probenkammer der 1,
4 einen Ausschnitt einer dritten Version einer Probenkammer der 1,
5a und 5b schematische Darstellungen eines Detektors der Analysevorrichtung der 1,
6 eine weitere Darstellung des Detektors der 1 und
7 eine schematische Darstellung einer Steuerungseinheit der Analysevorrichtung der 1.
1 zeigt schematisch eine Analysevorrichtung 1 zur Sequenzanalyse von als Probe dienenden Nukleinsäuren. Die Analysevorrichtung 1 weist eine Lichtquelle 2 auf, die ein Strahlbündel 3 emittiert, das als Anregungsstrahlung A verwendet wird, um Autofluoreszenz im Nukleinsäurematerial anzuregen. Das Lichtbündel 3 passiert einen Strahlteiler 4 und fällt durch einen Strahlmanipulator 5. Der Strahlmanipulator 5 bewirkt eine Strahlpositionierung und -konditionierung. Seine Funktion wird später noch deutlich werden.
Das den Strahlmanipulator 5 verlassende Strahlbündel 3 wird von einem Objektiv 6 in eine Probenkammer 7 fokussiert, in der sich die Probe befindet. Die Probe wird dadurch angeregt und gibt Fluoreszenzstrahlurg ab. Auf den Aufbau der Probenkammer 7 wird später anhand der 2 bis 4 noch genauer eingegangen.
Fluoreszenzstrahlung F aus der Probenkammer 7 wird durch das Objektiv 6 aufgenommen und nach Durchlaufen des Strahlmanipulators 5 vom Strahlteiler 4 abgetrennt, der geeignete dichroitische Eigenschaften aufweist, so daß er Fluoreszenzstrahlung F reflektiert, dagegen Anregungsstrahlung A transmittiert. Die Fluoreszenzstrahlung F wird dann in einem Detektor 8 erfaßt, der eine spektral auflösende Detektion der Fluoreszenzstrahlung F vornimmt. Auf den Detektor 8 wird später noch anhand der 5 und 6 eingegangen.
Der Detektor 8 liefert ein entsprechendes Signal über nicht näher bezeichnete Leitungen an eine Steuerungseinheit 9, die unter anderem einen (in 1 nicht dargestellten) Computer aufweist. Die Steuerungseinheit 9 steuert eine Handlingeinheit 10, die über geeignete Fluidanschlüsse 11 mit der Probenkammer 7 verbunden ist und dort die Nukleinsäuren geeignet zur Abgabe der Fluoreszenzstrahlung F bereitstellt. Weiter steuert die Steuerungseinrichtung 9 den Strahlmanipulator 5 über (nicht näher bezeichnete) Verbindungen.
In der Analysevorrichtung 1, die in 1 dargestellt ist, wird die Anregungsstrahlung A auf derselben Seite in die Probenkammer 7 geleitet, auf der auch die Fluoreszenzstrahlung F aufgenommen wird, so daß die Fokussierung der Anregungsstrahlung A in die Probenkammer 7 mit demselben Objektiv erfolgt, das auch die Fluoreszenzstrahlung F aufnimmt.
In einer abgewandelten Ausführungsform wird die Anregungsstrahlung nicht durch das die Fluoreszenzstrahlung 7 aufnehmende Objektiv eingekoppelt, sondern beispielsweise von der Seite oder von unten. In einer solchen Abwandlung kann die Analysevorrichtung 1 ähnlich einem die Totalreflexion nutzenden TIRF-Fluoreszenzmikroskops aufgebaut sein, wie es beispielsweise in der Veröffentlichung Axelrod, D.: „Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflexion fluorescence", J. Cell Biol. 89 (1991), 141–145, beschrieben ist, deren Offenbarungsgehalt hier vollständig einbezogen wird.
2 zeigt eine erste Ausführungsform der Probenkammer 7. Sie ist als ein Array von Mikrokanälen 12 ausgebildet, deren Kanalboden 11 jeweils längs der Kanalachse mit Metallpartikeln 14 besetzt ist. Die Metallpartikel haben einen Durchmesser zwischen 1 und 10 nm und sind im Abstand von mindestens 200 bis 300 nm angeordnet. Die Kanaloberseite 15 ist transparent sowohl für Anregungsstrahlung A als auch für Fluoreszenzstrahlung F.
Die Mikrokanäle 12 haben im Wechselwirkungsbereich einen Durchmesser von 10 bis 100 nm. Die Mikrokanäle 12 sind beispielsweise mittels Elektronenstrahllithographie oder Ionenstrahl-Nanomachining hergestellt. Sie sind über die Fluidanschlüsse 11 mit der Handlingeinheit 10 derart verbunden, daß ein Durchfluß einzelner Nukleinsäuren von DNA-Strängen 16 mit einer Fließgeschwindigkeit im Bereich einiger cm pro Sek. erfolgt. Die Mikrofluidik der Handlingeinheit 10 sorgt dabei dafür, daß die DNA-Stränge 16 in einem Abstand von höchstens 10 nm an den Metallpartikeln 14 vorbeiströmen. Das DNA-Handling ist in diesem Fall ähnlich zum Einsatz von Nahfeldtechniken für die DNA-Analyse (Phys. Rev. Lett., Vol. 86, Issue 7, pp. 1378–1381).
Die Anregungsstrahlung 18 wird auf die Kanaloberseite 15 durch die Analysevorrichtung 1 so eingebracht, daß Anregung nur im Bereich eines einzelnen Mikropartikels 14 erfolgt. Die dadurch im DNA-Strang 16, der durch den Mikrokanal 12 gefordert wird, abgegebene Fluoreszenzstrahlung F wird wiederum von der Analysevorrichtung 1 aufgenommen und wellenlängenaufgelöst sowie zeitaufgelöst detektiert.
Die Ortsauflösung ist derart, daß die Fluoreszenzstrahlung F im Bereich eines einzelnen Mikropartikels 14 detektiert wird. Die Ortsauflösung kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die Analysevorrichtung 1 als konfokales Mikroskop ausgebildet ist, wobei zum Abtasten mehrerer Metallpartikel 14 eine entsprechende Scanbewegung ausgeführt werden kann.
Die Analysevorrichtung 1 sammelt also die Fluoreszenzstrahlung F mit einer Ortsauflösung, die die Anteile von einzelnen Metallpartikel zu unterscheiden erlaubt. Bei einer Ausbildung als konfokales Mikroskop gilt dies auch für die Anregung mittels der Anregungsstrahlung A.
Die Analysevorrichtung 1 führt folgendes Verfahren durch: Gestreckte DNA-Stränge 16 werden durch die Mikrokanäle 12 transportiert, wobei auch mehrere DNA-Stränge gleichzeitig in parallelen Mikrokanälen 12 fließen können. Fluoreszenz eines DNA-Strangs 16 wird an einer definierten Stelle innerhalb des Kanals 12 in der unmittelbaren Nähe eines Metallpartikels 14 angeregt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung F wird aus einem Volumen aufgesammelt, dessen laterale Ausdehnung kleiner ist als der Abstand der Metallpartikel 14.
Die Fluoreszenzstrahlung F wird spektral aufgelöst in einem Zeitintervall [t, t + Δt] detektiert. Es erfolgt eine Zuordnung der Veränderung der in der Meßzeit Δt eingesammelten Fluoreszenzstrahlung F im Bereich eines Metallpartikels 14 zu einem Nukleotid oder eine Folge weniger Nukleotide in dem DNA-Strang 16 durch einen Vergleich zu einer vorherigen Messung in einem Meßintervall [t – Δt, t]. Auf die Details dieser Analyse wird noch eingegangen werden.
2 zeigt eine weitere Ausführungsform der Analysevorrichtung 1 bezüglich der Probenkammer 7. Ähnlich der Ausführungsform der 2 sind an einem Kanalboden 13 Mikropartikel 14 angebracht. An jedes Mikropartikel 14 ist eine RNA-Polymerase 17 kovalent gebunden. Über dem Kanalboden 13, der nun nicht mehr unbedingt in einem Mikrokanal 12 liegen muß, befindet sich eine Substratlösung, die hinsichtlich ATP-Konzentration, Temperatur, Salzkonzentration und pH-Wert bestimmten Bedingungen genügt. Die Substratlösung ist dabei so eingestellt, daß ein DNA-Strang 16 an die RNA-Polymerase 17 ankoppeln kann. Durch geeignete Fluidsteuerung und Einstellung der Substratlösung wechselt dabei die Ankoppelung zwischen DNA-Strang 16 und RNA-Polymerase 17 derart, daß der DNA-Strang 16 an der Metallinsel 14 vorbeibewegt wird.
Die Analysevorrichtung 1 nutzt also dabei folgendes Verfahren:
An einen gestreckten DNA-Strang 16 wird die RNA-Polymerase angekoppelt, wodurch ein vorbestimmter Abstand zum Metallpartikel 14 vorgegeben ist. Die Anregungsstrahlung A regt nun den DNA-Strang 16, der sich in einem vorbestimmten Abstand zum Metallpartikel 14 befindet, zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung F an. Diese Fluoreszenzstrahlung F wird aus in einem Volumen aufgesammelt, dessen laterale Abmessung kleiner ist, als der Abstand der Metallinseln, der z. B. zwischen 200 und 300 nm liegt. Die Fluidik und die Substratlösung bewirkt, daß die Ankopplung der RNA-Polymerase 17 an den DNA-Strang 16 ein Vorbeibewegung des DNA-Strangs 16 am Metallpartikel 14 zur Folge hat. Die zeitlich aufgelöste spektrale Detektion der Fluoreszenzstrahlung F mit geeigneter Auswertung, auf die später noch eingegangen werden wird, erlaubt so wiederum die Abfolge der Nukleotide im DNA-Strang 16 zu ermitteln.
4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Probenkammer 7 der Analysevorrichtung 1. Es handelt sich um eine Kammer, in die eine geeignete Substratlösung eingebracht wird, die einzelne DNA-Stränge 16, ATP sowie mehrere, jeweils an RNA-Polymerase gebundene Metallpartikel 14 enthält.
Der Strahlmanipulator 5 sorgt nun dafür, daß in der Probenkammer 7 eine optische Falle 18 gebildet ist. Dazu bewirkt der Strahlmanipulator 5 die Einkopplung geeigneter Fixierstrahlung OF in die Probenkammer 7, die ein Metallpartikel 14 mit angekoppelter RNA-Polymerase 17 räumlich fixiert. Die Fixierstrahlung OF kann beispielsweise im nahen infraroten Spektralbereich liegen, in dem keine Fluoreszenz in der Probenkammer 7 oder am DNA-Strang 16 angeregt werden kann.
Durch Ankoppeln eines DNA-Stranges 16 an die RNA-Polymerase 17 wird wiederum ein vorbestimmter Abstand zwischen dem DNA-Strang 16 und dem Metallpartikel 14 eingestellt. Die Substratlösung in der Probenkammer 7 hat die gleiche Wirkung, wie bei der Ausführungsform der 3, nämlich das ein DNA-Strang 16 durch wechselnde Ankopplung der RNA-Polymerase am Metallpartikel 14 vorbeibewegt wird, das in der optischen Falle 16 mittels der Fixierstrahlung OF gehalten ist. Die nach Einstrahlung von Anregungsstrahlen A abgegebene Fluoreszenzstrahlung F ermöglicht wiederum die Sequenzanalyse.
Die spektral auflösende Detektion der Fluoreszenzstrahlung F ist für die Analysevorrichtung 1 wesentlich. 5a und 5b zeigen diesbezüglich in Schemadarstellungen mögliche Ausführungsformen des Detektors 8. Die Fluoreszenzstrahlung F wird zuerst von einer abbildenden Optik 19 erfaßt und bei einer konfokalen Detektion durch eine Pinhole-Blende 20 fokussiert. Die Strahlung fällt dann auf ein winkeldispersives Element 21, das das spektrale Gemisch der Fluoreszenzstrahlung F in Spektralanteile zerlegt. Als winkeldispersives Element 21 kommen Prismen, Gitter oder beispielsweise akusto-optische Elemente in Frage. Die vom winkeldispersiven Element 21 in ihren spektralen Bestandteile aufgespaltene Fluoreszenzstrahlung F wird dann auf einen Zeilendetektor 22 abgebildet. Der Zeilendetektor 22 mißt die einzelnen spektralen Anteile der Fluoreszenzstrahlung F und gibt ein entsprechendes elektrisches Signal S ab. Zur Unterdrückung eventuell in der Fluoreszenzstrahlung F eingemischter Anregungsstrahlung A kann zusätzlich an geeigneter Stelle, beispielsweise vor der abbildenden Optik 19, im Bereich der Pinhole-Blende 20, oder vor dem dispersiven Element 21 bzw. dem Zeilendetektor 22 ein geeignetes spektrales Filter verwendet werden.
Findet keine konfokale Detektion in der Analysevorrichtung 1 statt, entfällt die Pinhole-Blende 20; dies ist schematisch in 5b gezeigt.
Eine mögliche Ausführungsform des optischen Strahlenganges gemäß der 5 ist in 6 dargestellt. Der dort gezeigte Detektor 8 ist im wesentlichen ein Cerny-Turner-Aufbau. Bei einer konfokal arbeitenden Analysevorrichtung 1 wird die Fluoreszenzstrahlung F, die aus der Probenkammer 7 aufgenommen wird, durch die abbildende Optik 17 in die Pinhole-Blende 20 fokussiert. Bei einer nicht konfokalen Detektion kann die Pinhole-Blende 20 entfallen. Die von der abbildenden Optik 20 fokussierte Fluoreszenzstrahlung F fällt auf einen ersten abbildenden Spiegel 23, der ein als winkeldispersives Element 21 fungierendes Gitter 24 beleuchtet. Das Gitter 24 kann beispielsweise eine Linienzahl von 651 pro mm haben. Es beugt das Licht entsprechend der Wellenlänge in verschiedene Richtungen.
Ein zweiter abbildender Spiegel 28 nimmt die vom Gitter 24 kommende, gebeugte Strahlung auf und fokussiert die einzelnen spektral aufgespaltenen Wellenlängenanteile auf entsprechende Detektorelemente des Zeilendetektors 22. Als Zeilendetektor 22 kann Vorteilhafterweise ein Zeilen-Sekundärelektronenvervielfacher, beispielsweise vom Typ H7260 von Hamamatsu verwendet werden. Er besitzt 32 Kanäle und ermöglicht durch eine hohe Empfindlichkeit eine sehr gute spektrale Analyse.
Der zweite abbildende Spiegel 25 ist so auf das Gitter 24 abgestimmt, daß der auszuwertende Spektralbereich von etwa 350 nm gleichmäßig auf die Detektorelemente 26 des Zeilendetektors 22 verteilt wird. Bei der Verwendung des erwähnten Detektors N7260 wird eine optische Auflösung von etwa 10 nm erreicht. Zwar ist diese Auflösung für eine spektroskopische Anwendung noch nicht das Optimum, jedoch ist der Signalpegel pro Detektorelement aufgrund des relativ weit detektierten Spektralbandes relativ hoch. Eine Verschiebung des freien Spektralbereichs kann zusätzlich durch eine Verdrehung des Gitters um einen in 8 eingezeichneten Drehpunkt DP erreicht werden.
Eine mögliche Anordnung zum Auslesen des Zeilendetektors 22 ist in 7 schematisch dargestellt. Der an den Anoden des hier als Zeilen-Sekundärelektronenvervielfacher ausgebildeten Zeilendetektors 22 fließende Strom wird jeweils durch einen Vorverstärker 27 aufgenommen, der als Strom/Spannungs-Wandler geschaltet ist. Die vom Vorverstärker 27 abgegebene Spannung wird einem Integrator 28 zugeführt, der das Signal über eine entsprechende Zeit, z.B. die sogenannte Pixelverweilzeit, integriert.
Zur schnelleren Auswertung kann dem Integrator 28 ein Komperator 29 nachgeschaltet werden, der bei Überschreitung eines Ausgangssignals des Integrators 28 ein digitales Signal erzeugt. Alternativ kann er als Fensterkomperator ausgebildet sein, der dann ein digitales Ausgangssignal auf hohem Pegel abgibt, wenn sich das Eingangssignal zwischen einer oberen und einer unteren Schaltschwelle befindet, oder wenn das Eingangssignal außerhalb der Schaltschwellen liegt. Der Komperator 29 kann sowohl vor dem Integrator 28 als auch danach liegen. Auch sind Schaltungsanordnungen ohne Integrator denkbar, bei denen ein Komperator 29 für eine geeignete Pegelanpassung vorgehalten wird.
Der Ausgang des Komperators 29 dient in 7 als Eingangssignal für ein Schaltregister 30, das es erlaubt, die aktiven Kanäle über eine geeignete Steuerleitung 31 ab- oder einzuschalten. Das am Ausgang des Schaltregisters 30 für jedes Detektorelement 26 abgegebene Signal wird dann von einem Nachverstärker 32 aufgenommen, der eine Pegelanpassung für einen nachfolgenden AD-Wandler 33 vornimmt. Die derart in digitale Werte umgesetzten Signale der Detektorelemente 26 werden dann über eine Schnittstelle 34 einem Computer 32 zugeführt, der die nachfolgend noch erläuterte Datenverarbeitung vornimmt.
Zur Vermeidung von Artefakten ist es bei der Messung der Fluoreszenzstrahlung F sinnvoll, von der Probe rückgestreute Anregungsstrahlung A zu unterdrücken oder zumindest so stark abzuschwächen, daß sie kleiner ist oder in gleicher Größenordnung liegt, wie das auszuwertende Emissionsmaximum in der Fluoreszenzstrahlung F. Hierzu kann entweder der oben erwähnte Filter im Detektor 8 verwendet werden, oder der Strahlteiler 4 geeignete dichroitische Eigenschaften haben. Alternativ kann Anregungsstrahlung A auch im Detektor 8 unterdrückt werden.
Wird als Strahlungsquelle 2 ein schmalbandiger Laser verwendet, ist die spektrale Breite der Anregungsstrahlung A regelmäßig sehr viel kleiner, als die von einem Detektorelement 26 aufzunehmende spektrale Bandbreite. Dadurch kann rückgestreute oder reflektierte Anregungsstrahlung A auch durch gezieltes Ausschalten des mit der Wellenlänge der Anregungsstrahlung A beaufschlagten Einzelkanals mittels des Schaltregisters 30 erfolgen. Trifft die Wellenlänge der Anregungsstrahlung A auf zwei Detektorelemente 26, so kann entweder durch eine Verdrehung des Gitters, eine Verschiebung des Zeilendetektors 22 oder eine Verstellung der abbildenden Spiegel 23 oder 25 eine Verschiebung erreicht werden, nach der die Wellenlänge der Anregungsstrahlung nur noch auf ein einziges, dann einfach abzuschaltendes Detektorelement 26 fällt.
Anstelle der erwähnten Integratorschaltung zur Detektion der Signale aus den Detektorelementen 26 kann auch eine Photonenzählung in den Einzelkanälen mit nachfolgender Addition der Photonenzahlen erfolgen.
Der Computer 35 erhält über die Schnittstelle 34 das Signal S, das eine Spektralinformation trägt. Die Spektren können auf verschiedene Art und Weise ausgewertet werden.
Eine Möglichkeit beinhaltet das „Entmischen" eines aufgenommenen Spektrums S → nach den Einzelspektren
der Autofluoreszenz der verschiedenen Nukleinsäuren i (i = A, T, C oder G):
Dabei werden die relativen Gewichte der Autofluoreszenzanteile a_A für das Nukleotid A, a_T für das Nukleotid T, a_C für das Nukleotid C und a_G für das Nukleotid G ermittelt. Die Autofluoreszenzspektren
mit i = A, T, C oder G wurden vorher von reinen Proben als Referenzspektren aufgenommen und im Computer 35 abgespeichert.
Aus der Veränderung der Gewichte a_i von Messung zur Messung kann dabei auf die Sequenz der Nukleotide in der Nukleinsäure geschlossen werden. Dabei ist die gegebenenfalls räumlich veränderliche Autofluoreszenz von Nukleotiden, die sich in verschiedenem Abstand zum Metallpartikel 14 befinden, zu berücksichtigen. Gegebenenfalls muß durch statische Methoden und mehrfache Vermessung hier eine eindeutliche Zuordnung und Sequenzanalyse erreicht werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht in einer Korrelationsanalyse der spektral aufgelösten Detektion der Fluoreszenzstrahlung F zu verschiedenen Meßzeiten. So kann eine Variation des in einem Zeitintervall [t, t+ Δt] aufgenommenen Spektrum S →(t + Δt) und dem in einem Zeitintervall [t – Δ t, t] aufgenommenen Spektrums S →(t) so lange vorgenommen werden, bis folgender Korrelationskoeffizient möglichst nahe an dem Wert 1 heranreicht:
Hierbei bezeichnet S_a die in den einzelnen Detektionskanälen a des Zeilendetektors 22 detektierten spektralen Komponenten des Signals, das als aus den n spektralen Bestandteilen aufgebauter Vektor S → = (S₁,.... S_n) aufgefaßt werden kann.
Die Variation
enthält die Information über die im Vergleich zur vorhergehenden Messung hinzugekommenen Autofluoreszenz, die im einfachsten Fall von einem Nukleotid stammt. Die Variation
enthält dagegen Information über die im Vergleich zur vorhergehenden Messung verlorene Autofluoreszenz. Im Prozeß des Sequenzings entsteht durch die Kenntnis über
und
teilweise reduntante Information über die Nukleinsäureabfolge, die zur Verbesserung der statistischen Sicherheit verwendet werden kann. Falls mehr als eine Nukleinsäure zur Variation
beiträgt, kann wieder die oben beschriebene spektrale Entmischung – diesmal aber nur für die Variationen – zur Anwendung kommen. Auch bei Auswertung des Korrelationskoeffizienten kann natürlich durch geeignete statistische Methoden, d.h. durch Wiederholung der Messung eine möglicherweise bei einer einfachen Messung noch nicht eindeutige Sequenzanalyse erreicht werden.
Die zeitliche Auflösung, mit der die Spektren erfaßt werden, ist an die Transportgeschwindigkeit der DNA-Stränge 16 angepaßt. Idealerweise liegt die Frequenz der Spektrenerfassung im Bereich oder über der zweifachen Frequenz mit der Nukleotide an einem Metallpartikel 14 durchlaufen.

Claims

Verfahren zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren, beim dem Nukleinsäuren an Metallpartikeln vorbeigeführt und zur Abgabe von Autofluoreszenzstrahlung angeregt werden, dadurch gekennzeichnet, daß während des Vorbeiführens die im Bereich eines einzelnen Metallpartikels abgegebene Autofluoreszenzstrahlung spektral aufgelöst detektiert wird, wobei nacheinander mehrere Spektren aufgenommen werden und die Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure durch eine Spektralanalyse der mehreren Spektren unter Rückgriff auf Referenzspektren einzelner Nukleotide bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren in einem Fluidstrom an einer Oberfläche, auf der sich Metallpartikel befinden, vorbeigeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an die Metallpartikel Nukleinsäure-Polymerasen angekoppelt sind und die Nukleinsäuren in einer ATP-haltigen Substratlösung an die Polymerasen angekoppelt werden, wobei durch geeignete Einstellung der Substratlösung und eines Fluidstromes der Substratlösung ein die Nukleinsäuren an den Metallpartikeln vorbeiführender Wechsel der Ankopplung bewirkt wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Metallpartikel in einer optischen Falle gehalten wird.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die im Bereich eines einzelnen Metallpartikels abgegebene Autofluoreszenzstrahlung mittels eines Mikroskops detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine konfokale Anregung und Detektion erfolgt.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Autofluoreszenzstrahlung im Bereich mehrerer einzelner Metallpartikel mit einer Ortsauflösung detektiert wird, die größer ist als ein Abstand zwischen den einzelnen Metallpartikeln.
Vorrichtung zur Sequenzanalyse von Nukleinsäuren (16), mit einer Fixiereinrichtung (13, 18), die Metallpartikel (14) fixiert, einer Transporteinrichtung (10, 17), die Nukleinsäuren (16) an den Metallpartikeln (14) vorbeiführt, und einem Anregungsstrahlengang (A), der im Betrieb an den Metallpartikeln (14) vorbeigeführte Nukleinsäuren (16) zur Abgabe von Autofluoreszenzstrahlung (A) anregt, gekennzeichnet durch einen Detektionsstrahlengang (6, 5, 4), der Autofluoreszenzstrahlung (A) im Bereich eines einzelnen Metallpartikels (14) aufnimmt und in einen Spektralanalysator (7) leitet, wobei der Spektralanalysator (7) ein die spektrale Zusammensetzung der Autofluoreszenzstrahlung (A) anzeigendes Signal (S) abgibt, und eine Analyseeinheit (9) vorgesehen ist, die die Nukleotidsequenz in der Nukleinsäure (16) durch eine Spektralanalyse mehrerer während des Vorbeiführens aufgenommener Signale (S) unter Rückgriff auf Referenzspektren einzelner Nukleotide bestimmt.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixiereinrichtung als Substrat (13) ausgebildet ist, an dem Metallpartikel (14) angeheftet sind, und daß die Transporteinrichtung einen Fluidkanal (12) über dem Substrat (13) aufweist, durch den die Nukleinsäuren (16) in einem Fluidstrom transportiert werden.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Transporteinrichtung an die Metallpartikel (14) angekoppelte Polymerasen (17) in einer geeigneten Substratlösung aufweist, wobei die Polymerasen (17) zur wechselnden Ankopplung an die Nukleinsäuren (16) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixiereinrichtung eine optische Falle (18) aufweist, die in einer Lösung befindliche Metallpartikel (14) hält.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsstrahlengang (6, 5, 4) Teil eines Fluoreszenzmikroskops ist.
Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungsstrahlengang Anregungsstrahlung (A) unter Ausnutzung der Totalreflexion einkoppelt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektions- und der Anregungsstrahlengang Teil eines konfokalen Mikroskops sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Detektionsstrahlengang Autofluoreszenzstrahlung (A) im Bereich mehrerer einzelner beabstandeter Metallpartikel (14) mit einer Ortsauflösung aufnimmt, die besser ist, als der Abstand der Metallpartikel (14).