DE10309803A1

DE10309803A1 - α-Amylase-Varianten mit verbesserter Alkaliaktivität sowie Wasch- und Reinigungsmittel mit diesen α-Amylase-Varianten

Info

Publication number: DE10309803A1
Application number: DE2003109803
Authority: DE
Inventors: Cornelius Bessler; Susanne Dr. Schmitz; Jutta Schmitt; Rolf Prof. Schmid
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2003-03-05
Filing date: 2003-03-05
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2023-03-06
Also published as: DE10362172B4; DE10309803B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft alpha-Amylase-Varianten mit einer verbesserten Aktivität im alkalischen Medium. Hierbei handelt es sich um Varianten, die, ausgehend von Wildtyp- oder bereits variierten Enzymen, über Substitutionsmutagenese erhalten werden können. Dieser Anmeldung zufolge eignen sich Aminosäureaustausche in den Positionen 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 und/oder 474 gemäß der Zählung der nicht prozessierten alpha-Amylase aus B. amyloliquefaciens zur Verbesserung der Alkaliaktivität. Hierunter sind ganz besonders die Austausche 13P, 32A, 194R, 197P, 203L, 230V, 297S, 356D, 406R, 414S und 474Q hervorzuheben. Insbesondere eine oder mehrere der Positionen 13, 203, 414 und/oder 474 scheinen hierbei von Bedeutung zu sein. Konkret beschrieben werden die Varianten BLA 42 (L13P/W194R/S197P/E356D/N414S), BLA A29 (L13P/V32A/A230V/N297S/K406R/N414S) und BLA B1 (L13P/V32A/I203L/A230V/N297S/K406R/N414S/K474Q). Ferner betrifft die vorliegende Anmeldung diverse technische Einsatzgebiete für diese Amylasen, insbesondere ihren Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln sowie diese Mittel selbst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft α-Amylase-Varianten mit einer verbesserten Aktivität im alkalischen Medium sowie diverse technische Einsatzgebiete für diese α-Amylase-Varianten, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel mit diesen α-Amylase-Varianten.
α-Amylasen (E.C. 3.2.1.1) hydrolysieren interne α-1,4-glycosidische Bindungen von Stärke und stärkeähnlichen Polymeren unter Bildung von Dextrinen und β-1,6-verzweigten Oligosacchariden. Aufgrund dieser stärkespaltenden Aktivität werden α-Amylasen für zahlreiche technische Anwendungen eingesetzt, darunter als aktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln. Weil Wasch- und Reinigungsmittel überwiegend alkalische pH-Werte aufweisen, werden hierfür insbesondere α-Amylasen benötigt, die im alkalischen Medium aktiv sind. Die meisten technisch bedeutenden α-Amylasen werden von Mikroorganismen, d.h. Pilzen oder Bakterien, vor allem denen der Gattungen Aspergillus und Bacillus produziert und sekretiert. Ausgehend von diesen mikrobiologischen Quellen können sie über zumeist (gen-)technisch entsprechend angepaßte Verfahren in industriellem Maßstab gewonnen werden.
Zur Ermittlung geeigneter α-Amylasen für die jeweiligen Gebiete findet nach wie vor eine intensive Suche nach neuen α-Amylasen aus natürlichen Quellen statt. Viele solcher Enzyme sind im Stand der Technik bereits beschrieben; ihre Zahl nimmt weiterhin zu. Für den Einsatz bei alkalischen pH-Werten sind insbesondere die alkalischen α-Amylasen von Bedeutung, die natürlicherweise von Spezies der Gattung Bacillus gebildet werden. Technisch besonders wichtig sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens und aus B. stearothermophilus. Sie werden in der vorliegenden Anmeldung als BLA, BAA beziehungsweise BStA bezeichnet. Das Wildtyp-Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl^® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®ST erhältlich. Die Wildtyp-α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN^® vertrieben und die Wildtyp α-Amylase aus B. stearothermophilus unter den Namen BSG^®, ebenfalls von der Firma Novozymes.
Eine weitere für den Einsatz in alkalischen Medien geeignete α-Amylase (in der vorliegenden Anmeldung als LAMY bezeichnet) wird von der Fa. Kao in den Anmeldungen WO 94/26881 A1 ( EP 670367 A1 ) und WO 97/00324 A1 beschrieben. Sie stammt ebenfalls aus einem alkalischen Mikroorganismus, der als Bacillus sp. KSM-AP1378 (FERM BP-3048) bezeichnet wird. Ferner ist die α-Amylase S707 zu erwähnen, die ursprünglich aus Bacillus sp. #707 isoliert worden ist und mit der Publikation „Nucleotide sequence of the maltohexaose-producing amylase gene from an alkalophilic Bacillus sp. #707 and structural similarity to liquefying type α-amylases" von Tsukamoto et al. in Biochem. Biophys. Res., Comm. (1988), 151(1), 25–31 beschrieben ist.
Weitere Beispiele für besonders in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbare amylolytische Enzyme sind die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; hier als A 7-7 bezeichnet), publiziert in WO 02/10356 A2, und das Enzym aus B. agaradherens (DSM 9948), das gleichzeitig als α-Amylase und als Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) angesehen werden kann und in WO 02/44350 A2 publiziert worden ist. Weitere α-Amylasen sind die, die dem in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definierten Sequenzraum angehören.
Aus der Anmeldung WO 00/60060 A2 von der Fa. Novozymes gehen die zwei α-Amylasen AA560 (aus Bacillus sp. DSM 12649) und AA349 (aus Bacillus sp. DSM 12648) hervor, die beide ein alkalisches pH-Optimum aufweisen. Zwei weitere Termamyl-ähnliche α-Amylasen mit den Bezeichnungen SP690 und SP722 sowie Varianten dieser Enzyme werden beispielsweise mit der Anmeldung WO 99/23211 A1 offenbart. Sie stimmen hinsichtlich der Zählung der Aminosäure-Positionen mit AA560 und AA349 überein.
Eine weitere Bacillus-Amylase wird von Lin et al. in der Publikation „Production and property of a raw-starch-degrading Amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23" (1998), in Biotechnol. AppL. Biochem., Band 28(1), Seiten 61 bis 68, beschrieben. Sie wird hier als TS-23 bezeichnet. Die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen sind beispielsweise in der Datenbank Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) unter der Nummer Q59222 und in GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) unter der Nummer U22045 hinterlegt.
Ein Vergleich der Sequenzen dieser Enzyme erfordert ein Alignment, in welchem die jeweils einander entsprechenden Aminosäuren übereinander zu liegen kommen. Die die vorliegende Erfindung betreffenden, später eingehend diskutierten Aminosäurepositionen können mit diesen wichtigsten Enzymen über folgende, aus dem Alignment der 1 abgeleitete Tabelle zugeordnet werden. Die in der ersten Zeile angegebene Numerierung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (BAA) ist die nach SEQ ID NO. 4.
Tabelle 1: Zuordnung der Aminosäureaustausche der vorliegenden Anmeldung in der Zählung nach SEQ ID NO. 4 zu den homologen Positionen der wichtigsten im Stand der Technik beschriebenen α-Amylasen.
Die Aminosäuren sind im international geräuchlichen Einbuchstabencode angegeben; Abkürzungen der Enzyme wie im Text; k.A. steht für: keine Angabe.
Die natürlicherweise vorkommenden α-Amylase-Moleküle sind auf vielfache Weise, insbesondere über molekularbiologische Modifikationen weiterentwickelt worden, um sie in Hinblick auf spezifische Anwendungen hin zu optimieren. Solche Optimierungen betreffen beispielsweise die Substratspezifitäten, die Stabilität des Enzyms unter verschiedenen Bedingungen oder die enzymatische Aktivität selbst.
Als eine molekularbiologisch wichtige Art der Modifikation kann die Genfusion oder Herstellung von Fusionsproteinen (Hybriden) betrachtet werden. So wird beispielsweise in der Anmeldung WO 99/57250 A1 offenbart, daß Waschmittelenzyme durch Kopplung an Cellulose-Bindungsdomänen (CBD) in ihren Beiträgen zur Waschleistung gesteigert werden können. In der Patentanmeldung WO 99/43793 A1 werden Sequenzähnlichkeiten zwischen Novamyl^® (siehe unten) und bekannten Cyclodextringlucanotransferasen (CGTasen) ausgenutzt, um Hybride beider Enzyme zu erzeugen. Der Einsatz von Hybriden der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens und B. licheniformis geht aus der Anmeldung DE 10138753 hervor. Hybride der α-Amylasen aus B. stearothermophilus und B. licheniformis werden beispielsweise in der Anmeldung EP 208491 A2 offenbart.
Ein jedoch nach wie vor wichtiges Prinzip, solche Weiterentwicklungen vorzunehmen, besteht in der Durchführung von Punktmutationen, d.h. Deletionen, Insertionen und vor allem Substitutionen einzelner Aminosäuren. Beispielsweise das zufallsgemäße Mutagenese-Verfahren der Anmeldung WO 99/20768 A1 führt zu α-Amylase-Varianten, die in Gegenwart von Reinigungsmittelbestandteilen besonders stabil sind. Für praktisch alle technisch wichtigen Wildtypenzyme (siehe oben) sind inzwischen zahlreiche durch Punktmutationen verbesserte Varianten beschrieben worden, wobei diese Variationen in der Regel nicht auf die betreffenden Enzyme beschränkt sind sondern für verwandte Moleküle ähnliche Leistungsverbesserungen bewirken.
Beispielsweise die Anmeldung WO 94/02597 A1 lehrt, Methionin-Reste durch Substitution gegen andere Aminosäuren zu ersetzen und dadurch die Oxidationsempfindlichkeit zu senken und die Aktivität bei höheren Temperaturen zu verbessern. Dies wird anhand von Varianten der α-Amylase aus B.licheniformis illustriert. Weitere Verbesserungen an diesem Termamyl^®-Molekül gehen beispielsweise aus WO 95/26397 A1 hervor. Derartige Optimierungsprodukte der α-Amylase aus B. licheniformis sind unter dem Handelsnamen Duramyl^® von der Fa. Novozymes erhältlich (SÖFW-Journal, 123, (1997), S. 723–731). Ein weiteres Optimierungsprodukt ist Termamyl^®ultra mit geringerer Calcium-Bindung.
Die α-Amylasen der Anmeldung WO 97/43424 A1 zeigen über Punktmutationen der Calcium-bindenden Aminosäuren ein geändertes Calciumionen-Bindungsverhalten und damit geänderte enzymatische Eigenschaften. Diese Erkenntnis ist ausgehend von der 3D-Struktur der α-Amylase von B. licheniformis gewonnen worden, sei aber auch auf andere α-Amylasen anwendbar. Auch die Anmeldung WO 96/23874 A1 beruht auf Erkenntnissen aus der 3D-Struktur, und zwar verschiedener Moleküle, darunter auch Hybridamylasen, und schlägt zahlreiche Positionen vor, an denen α-Amylasen, insbesondere die „klassischen" Moleküle BLA, BStA beziehungsweise BAA verändert werden können, um deren enzymatische Eigenschaften zu verändern.
Beispielsweise aus der Anmeldung WO 96/23873 A1 gehen Varianten von α-Amylasen aus verschiedenen Bacilli, darunter B. stearothermophilus, Bacillus sp. #707 und den bereits verbesserten Molekülen gemäß WO 95/26397 A1 hervor, die höhere Oxidationsstabilität, höhere thermische Stabilität und/oder geringere Calcium-Abhängigkeit aufweisen. Die Amylasen der Anmeldung WO 99/02702 A1 mit zusätzlichen Disulfid-Brücken sind bei höheren Temperaturen stabiler als das Ausgangsmolekül. Die Enzyme der Anmeldung WO 99/23211 A1 sind bei hohen pH-Werten und/oder in Gegenwart von Calcium-Ionen stabiler und/oder bei höheren Temperaturen aktiver. Abgeleitete Varianten, insbesondere von der α-Amylase aus B. stearothermophilus gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 02/02726 A1 für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln hervor. Das entsprechende Handelsprodukt der Firma Novozymes trägt den Namen Novamyl^®.
Varianten des Enzyms LAMY (aus Bacillus sp. KSM-AP1378) offenbart die Anmeldung EP 985731 A1 .
Aus der Anmeldung WO 00/60060 A2 von der Fa. Novozymes, die die α-Amylasen AA560 und AA349 offenbart, gehen auch durch Punktmutation erhältliche Varianten dieser Enzyme hervor.
Wie die Wildtypenzyme können auch Hybridamylasen zusätzlich durch Punktmutagenese weiterentwickelt werden. Dies offenbart beispielsweise die als Weiterentwicklung von WO 96/23874 A1 anzusehende Anmeldung WO 97/41213 A1. In den Anmeldungen WO 00/60059 A2 und WO 00/60060 A2 werden Varianten offenbart, die hinsichtlich eines veränderten Spaltungsmusters am Substrat Stärke entwickelt worden sind und sich deshalb besonders für die Stärke-Verarbeitung eignen. In diesen Schriften werden zahlreiche Punktmutationen sowohl von nativen α-Amylasen, als auch von Hybridamylasen offenbart.
Gegenüber den hier vorgestellten Dokumenten aus dem Stand der Technik sollen im folgenden die die vorliegende Anmeldung betreffenden Positionen und Substitutionen überprüft werden.
Aus der Anmeldung WO 97/41213 A1 gehen Varianten hervor, die in der Zählung nach BLA die Austausche D325N, R375E in Kombination mit einer anderen Substitution und L3V, in Kombination mit jeweils mehreren anderen definierten Austauschen aufweisen.
Die Anmeldung WO 00/60059 A2 offenbart eine Vielzahl von Möglichkeiten, α-Amylasen durch Punktmutationen zu verändern. Darunter wird auch ein Autausch in Position S168 (gemäß BLA) vorgeschlagen, konkret die Variante S168Y.
Aus der Anmeldung EP 985731 A1 gehen α-Amylase-Varianten hervor, die durch Mutation in der Position A202 gemäß LAMY erhalten werden können; insbesondere durch Austausch gegen T, I, L, A, V oder S. Hiervon ist in der Zählung nach SEQ ID NO. 4 die erfindungsrelevante Position A230 betroffen.
Aus der Anmeldung WO 96/23874 A1 gehen zahlreiche, die enzymatische Aktivität beeinflussende Varianten hervor, die durch den Vergleich der 3D-Strukturen verschiedener α-Amylasen nahegelegt worden sind. Hierunter ist jedoch kein Austausch in einer die vorliegende Anmeldung betreffenden Position. Das korrespondierende Patent US 5989169 beschreibt ebenfalls ein Verfahren, um über einen Vergleich der 3D-Strukturen verschiedener α-Amylasen solche Positionen zu erkennen, die die Calcium-Abhängigkeit oder die Stabilität der betreffenden Enzyme betreffen. Nur in diesem speziellen Zusammenhang werden dort neben zahlreichen anderen Positionen auch die Aminosäurepositionen A199 und Q443 von BLA genannt. Eine Vorbeschreibung dessen, daß diese Positionen evtl. für die Alkali-Aktivität betreffen könnten, ist darin nicht zu sehen.
Die beiden Anmeldungen WO 91/00343 A2 und EP 409299 A2 betreffen α-Amylase-Varianten mit reduzierter Stabilität. In diesem Zusammenhang werden u.a. Austausche in den Positionen W163 und S166 gemäß der Zählung von BAA vorgeschlagen.
Die Anmeldung WO 95/10603 A1 offenbart wiederum eine Vielzahl von Substitutionen, die u.a. die Beiträge der betreffenden Enzyme zur Waschleistung beeinflussen sollen, angegeben in der Zählung nach BLA. Darunter sollen Austausche fallen, für die nur ganz allgemein Bereiche angegeben sind; aus den dort genannten Bereichen 142–182, 172–178, 260–269 und 369–383 ist konkret jedoch nur die Position 375 vorbeschrieben. Hierfür wird der Austausch R375Y offenbart. Insbesondere im zuletzt genannten Bereich ist als eine Grenze die Position 383 angegeben, ohne daß dieser Position jedoch eine Bedeutung beigemessen wird, so daß wohl nur die zwischen den Randpositionen gelegenen Aminosäuren gemeint zu sein scheinen. Zumindest wird mit keinem Beispiel offenbart, daß gerade diese Position einen Einfluß auf die Alkaliaktivität nimmt. Als weitere relevante Position geht aus dieser Schrift Position 3 hervor; empfohlen wird dafür der Austausch L3V.
Besonders komplex erscheint die Anmeldung WO 02/092797 A2. Hier werden im Abschnitt „Beispiele" die nun in Tabelle 2 zusammengestellten Aminosäure-Austausche in der Zählung nach BLA „offenbart". Tabelle 2: In WO 02/092797 A2 „offenbarte" Aminosäure-Austausche.
Aus dieser Anmeldung gehen also keine Substitutionen in den Aminosäurepositionen 174 und 383, entsprechend 203 und 414 in der Zählung nach SEQ ID NO. 4 hervor. Zum anderen heißt es in WO 02/092797 A2 lediglich, diese Varianten seien erzeugt worden; es fehlen jedoch Angaben zu den biochemischen Eigenschaften. Für keine dieser Positionen wird jedoch konkret ein Einfluß auf die Verwendbarkeit unter alkalischen Bedingungen beschrieben.
In der oben genannten Anmeldung WO 99/23211 A1 werden auch Varianten der Enzyme SP690 und SP722 bezeichnet, die die Positionen W167, S170, D271 und K385 betreffen, wobei, laut Anspruch, jeweils gegen alle verbleibenden Aminosäuren substituiert werden soll; was in dieser Allgemeinheit bedeutet, daß hier prinzipiell jede Aminosäure möglich ist. Konkret offenbart wird lediglich der Austausch K385R, d.h. die Substitution einer basischen Aminosäure gegen eine andere basische Aminosäure an dieser Position, und zwar in Kombination mit anderen Punktmutationen.
Zusammenfassend bleibt festzuhalten, daß im Stand der Technik keine Austausche in den Positionen 13 und 203 gemäß der Zählung nach SEQ ID NO. 4 vorbeschrieben sind. In Position 203 ist, wie beispielsweise aus Tabelle 1 und aus dem Alignment der 1 hervorgeht, in den meisten α-Amylasen ein Isoleucinrest (I) hochkonserviert. Position 13 liegt innerhalb des Propeptids. Für Position 414 ist bislang lediglich der Ersatz einer basischen Aminosäure gegen eine andere basische Aminosäure tatsächlich offenbart, was damit korreliert, daß in den meisten anderen α-Amylasen an dieser Stelle die Aminosäure Lysin (K) liegt. Eine Substitution gegen eine andere Aminosäure, insbesondere gegen die Aminosäure Serin ist dagegen noch nicht beschrieben worden. Jeweils einzelne der übrigen in der vorliegenden Erfindung betrachteten Positionen sind im Stand der Technik bereits variiert worden, wenn auch nur selten zu den konkret hier vorgeschlagenen neuen Aminosäuren und keinesfalls in diesen Positions-Kombinationen.
Aus dieser einleitenden Darstellung wird auch deutlich, daß ein ungebrochenes Bedürfnis danach besteht, neue und vor allem in Hinblick auf diverse Einsatzmöglichkeiten verbesserte α-Amylasen in der Natur zu finden oder gezielt zu entwickeln. Insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln ergibt sich die Notwendigkeit zur Weiterentwicklung aus den verschiedenen Reingungszwecken, aus den sich ändernden Gewohnheiten und Ansprüchen der Verbraucher, etwa hinsichtlich niedrigerer Reinigungstemperaturen oder spezieller Darreichungsformen oder aus der Weiterentwicklung anderer Inhaltsstoffe, die die Enzyme in ihrer Leistungsfähigkeit beeinflussen, wie etwa bleichenden Verbindungen. Vor allem aber weisen die meisten im Handel erhältlichen Wasch- und Reinigungsmittel einen stark alkalischen pH-Wert auf, so daß eine Verbesserung der Aktivität betreffender Enzyme bei hohen pH-Werten eine permanente Herausforderung an die Optimierung von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen darstellt.
Es stellte sich somit die Aufgabe, neue α-Amylasen oder α-Amylase-Varianten zu entwickeln, die bessere Voraussetzungen zeigen, um im Rahmen von Wasch- und Reinigungsmittelrezepturen eine möglichst hohe Aktivität zu entfalten und somit deren Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung zu verbessern. Hierzu gehört insbesondere eine verbesserte Aktivität unter alkalischen Bedingungen.
Eine Teilaufgabe bestand in Hinblick auf die gewerbliche Anwendbarkeit dieser Entwicklung darin, die für derartige α-Amylasen codierenden Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, um die betreffenden Enzyme molekularbiologischen Weiterentwicklungen und technischen Herstellverfahren zugänglich zu machen.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Bereitstellung von α-Amylase-Varianten mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 13 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) ein Prolinrest (P) und in Position 414 ein Serinrest (S) vorliegt. Ein weiterer Aspekt zur Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Bereitstellung von α-Amylase-Varianten mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Austausch in Position 203 und ein Austausch in Position 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt. Beide Aspekte werden durch entsprechende Varianten veranschaulicht, die in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben sind und entsprechend bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung darstellen (siehe unten).
Unter α-Amylasen sind erfindungsgemäß und wie einleitend erläutert Enzyme der Klassifikation E.C. 3.2.1.1 zu verstehen, die interne α-1,4-glycosidische Bindungen von Stärke und stärkeähnlichen Polymeren unter Bildung von Dextrinen und β-1,6- verzweigten Oligosacchariden hydrolysieren. Die Erfindung ist prinzipiell auf alle bekannten und noch zu findenden α-Amylasen anwendbar, soweit sie sich mit der α-Amylase aus B. licheniformis homologisieren lassen. Solche eine Homologisierung ist in 1 für die technisch wichtigsten α-Amylasen dargestellt und erlaubt beziehungsweise erleichtert es, die der Erfindung entsprechenden Aminosäurepositionen in den anderen Amylasen aufzufinden. Vorzugsweise wird, wie weiter unten ausgeführt, die Erfidung auf solche α-Amylasen angewendet, die bereits bekanntermaßen in technischen Gebieten eingesetzt werden, vorzugsweise in solchen, in denen höhere enzymatische Aktivitäten, insbesondere bei alkalischen pH-Werten erwünscht sind. Beispiele von im Stand der Technik etablierten α-Amylasen sind in der Einleitung angegeben.
Unter Varianten sind erfindungsgemäß Proteine zu verstehen, die sich von Ausgangsproteinen hinsichtlich der Aminosäuresequenz unterscheiden. Das Pendant hierzu auf der Nukleinsäure-Ebene ist die Mutante. So handelt es sich bei BAA L13P beispielsweise um eine Variante der BAA, die alle Aminosäuren bis auf die in Position 13 mit der BAA gemeinsam hat. Dies entspricht auf DNA-Ebene dem Austausch des Codons CTT (37–39 gemäß SEQ ID NO. 3) gegen CCT (gemäß SEQ ID NO. 5).
Unter Aminosäureaustauschen sind Substitutionen einer Aminosäure gegen eine andere Aminosäure zu verstehen. Erfindungsgemäß werden solche Substitutionen unter Bezeichnung der Positionen, in der der Austausch erfolgt, gegebenenfalls kombiniert mit den betreffenden Aminosäuren im international gebräuchlichen Einbuchstabencode angegeben. „Austausch in Position 13" bedeutet beispielsweise, daß eine Variante in der Position, die in der Sequenz eines Referenzproteins die Position 13 aufweist, eine andere Aminosäure aufweist. Austausch bedeutet nicht, daß gegenständlich diese Aminosäure geändert wurde sondern bezeichnet lediglich einen Sequenzunterschied. Üblicherweise werden solche Austausche auf der DNA-Ebene über Mutationen einzelner Basenpaare durchgeführt. „L13P" bedeutet beispielsweise, daß das Referenzenzym an der Position 13 die Aminosäure Leucin aufweist, während die betrachtete Variante an der hiermit homologisierbaren Position über die Aminosäure Prolin verfügt. „13P" bedeutet, daß jede beliebige, d.h. in der Regel eine natürlicherweise vorgegebene Aminosäure, an einer Position, die der Position 13 entspricht, gegen ein Prolin ersetzt ist. Ein Beispiel für einen solchen homologen Austausch wäre L-18P in BLA, d.h. der von B.licheniformis gebildeten α-Amylase, weil sich über 1 die Position 13 von BAA mit der Position -18 von BLA homologisieren läßt.
Grundsätzlich sind die mit der vorliegenden Anmeldung vorgeschlagenen Aminosäureaustausche nicht darauf beschränkt, daß sie die einzigen Austausche sind, in denen sich die betreffende Variante von dem Wildtypmolekül unterscheidet. Es ist im Stand der Technik bekannt, daß sich die vorteilhaften Eigenschaften einzelner Punktmutationen einander ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie etwa Calcium-Bindung oder Stabilität gegenüber Tensiden optimierte α-Amylase kann erfindungsgemäß zusätzlich über die hier vorgestellten Substitutionen weiterentwickelt werden. Somit umfassen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung alle Varianten, die neben anderen Austauschen gegenüber dem Wildtypmolekül auch die erfindungsgemäßen Austausche aufweisen. Dies gilt insbesondere für Moleküle, die über Fusionsmutation (Hybridbildung) erhalten worden sind (siehe unten).
Als Referenzenzym hinsichtlich der Numerierung der Positionen ist erfindungsgemäß die nicht prozessierte α-Amylase aus B. amyloliquefaciens anzusehen, deren Nukleotidsequenz in SEQ ID NO. 1 und deren Aminosäuresequenz in SEQ ID NO. angegeben ist. Diese Aminosäuresequenz geht auch aus den jeweils ersten Zeilen in den Alignments der 1 und 2 (BAA) hervor. Die erfindungsgemäßen Varianten werden über diesen Vergleich beschrieben. Dabei ist gegebenenfalls zu berücksichtigen, daß bei der In-vivo-Synthese dieser Amylase durch B. amyloliquefaciens, die ersten 31 Aminosäuren als sogenanntes Propetid von dem restlichen maturen Protein abgespalten werden. Für manche Enzyme wie beispielsweise AA349 und AA560 werden in der Patentliteratur (siehe oben) lediglich die maturen Seqenzteile angegeben. Eine Homologisierung kann hier nur über die betreffenden Positionen des maturen Bereichs zu erfolgen, und ist durch Sequenzvergleich entsprechend 1 möglich.
Erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten sind dadurch gekennzeichnet, daß in Position 13 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) ein Prolinrest (P) und in Position 414 ein Serinrest (S) vorliegt.
Wie einleitend dargestellt sind im Stand der Technik keine Austausche in der Position 13 gemäß der Zählung nach SEQ ID NO. 4 vorbeschrieben. Nach 1 liegt sie bei allen betrachteten α-Amylasen innerhalb des Propeptids. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist es besonders überraschend, daß ein Aminosäureaustausch in einer Position des Propetids einen positiven Einfluß auf die spätere Aktivität des betreffenden Proteins ausüben kann. Ohne an diese Theorie gebunden sein zu wollen, könnte man vermuten, daß dies auf Faltungseffekte der entstehenden Polypeptidkette zurückzuführen ist. Für Prolin ist bekannt, daß es in Proteinen starken Einfluß auf die Sekundär- und die Tertiärstruktur nimmt.
In der Position 414 verfügen die meisten anderen α-Amylasen über eine basische Aminosäure (vgl. Tabelle 1 und 1). Dementsprechend wird durch den Stand der Technik in dieser Position bislang lediglich der Ersatz einer basischen Aminosäure gegen eine andere basische Aminosäure nahegelegt. Es ist somit völlig überraschend, daß der Austausch zu einer Aminosäure mit einer Hydroxylgruppe die Aktivität beeinflußt, insbesondere im alkalischen Medium.
In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung sind drei Varianten der α-Amylase von B. licheniformis (BAA A42, BAA A29 und BAA B1) ausführlich beschrieben. Sie verfügen gegenüber diesem Vergleichsmolekül (dem Wildtypenzym), gemessen bei pH 6,5 über deutlich höhere spezifische Aktivitäten (siehe Beispiel 5). Zusätzlich weist die Variante BAA A42 gegenüber dem Wildtypmolekül ein um eine ganze pH-Einheit in den alkalischen Bereich verschobenes pH-Optimum auf. Zudem verfügt sie über eine deutlich erhöhte relative Aktivität bei pH 10 (siehe Beispiel 6).
Diese drei Varianten haben zwei Gemeinsamkeiten, nämlich die beiden Aminosäureaustausche L13P und N414S. Somit ist erfindungsgemäß davon auszugehen, daß diese beiden Austausche die Aktivität von α-Amylasen, insbesondere deren Alkaliaktivität zu steigern vermögen.
Bevorzugte α-Amylase-Varianten dieses Erfindungsaspekts sind dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 194, 197 oder 356 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in zwei, besonders bevorzugt in allen drei dieser Positionen.
Die Austausche in den Positionen 194 und 197 liegen in einem Bereich, der bei vielen α-Amylasen hochkonserviert sind; dies geht beispielsweise aus 1 hervor (dort 205 und 208). Es ist also überraschend, daß an diesen Positionen überhaupt erfolgreich variiert werden kann, und trotzdem funktionsfähige Moleküle erhalten werden. Insbesondere eine Steigerung der Leistung war nicht zu erwarten. Auch die Position 356 (368 gemäß 1) ist hochkonserviert: Dort liegt bei den meisten anderen α-Amylasen ein Asparaginsäurerest und nur in der BAA ein Glutaminsäurerest.
Den Erfolg dieser Austausche belegt die BAA-Variante A42, deren DNA- und Aminosäuresequenzen unter SEQ ID NO. 5 beziehungsweise 6 angegeben sind. Aus Beispiel 5 geht die Leistungssteigerung hervor und aus Beispiel 6 die besonders hohe Leistung im alkalischen Medium.
Bevorzugte α-Amylase-Varianten mit diesen Substitutionen sind dadurch gekennzeichnet, daß in Position 194 ein Arginin- (R) und/oder in Position 197 ein Prolin- (P) und/oder in Position 356 ein Asparaginsäurerest (D) vorliegt.
Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/194R/197P/356D/414S.
Dies wird von den genannten überraschend positiven Eigenschaften der Variante BAA A42 unterstützt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist eine α-Amylase-Variante mit den Austauschen 13P und 414S dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 32, 230, 297 oder 406 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in zwei, besonders bevorzugt in drei, ganz besonders bevorzugt in allen vier dieser Positionen.
Die Position 32 ist bei BAA die erste Aminosäure des maturen Proteins, bei den meisten anderen α-Amylasen stellt sie die dritte Aminosäure des maturen Proteins dar. Möglicherweise spielt sie für die Faltung des Proteins eine gewisse Rolle. Die Position 230 (242 gemäß 1) ist in den meisten anderen α-Amylasen natürlicherweise von einem Alaninrest belegt und liegt in einem hochkonservierten Bereich. Es ist also überraschend, daß in solch einer Position ein erfolgreicher Austausch erfolgen kann. Letzteres trifft auch auf die Position 297 (309 gemäß 1) zu, die in der BAA natürlicherweise von einem N, also einer Aminosäure mit einer Säureamidseitenkette belegt wird. In der Position 406 (418 gemäß 1) liegt bei der BAA natürlicherweise ein K; die wichtigsten α-Amylasen aus dem Stand der Technik weisen dort die Aminosäurereste R, Y oder H auf, zeigen also eher ein uneinheitliches Bild; dies insbesondere auch deshalb, weil Y über eine Hydroxylgruppe verfügt.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen α-Amylase-Varianten vor, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 32 ein Alanin- (A) und/oder in Position 230 ein Valin(V) und/oder in Position 297 ein Asparaginsäure- (D) und/oder in Position 406 ein Argininrest vorliegt.
Insbesondere für Position 230 war nicht zu erwarten gewesen, daß hier eine raumfüllendere Aminosäure als Alanin erfolgreich eingeführt werden kann. Überraschend ist auch, daß die bessere Eignung der erfindungsgemäßen Varianten für alkalische Bedingungen offensichtlich nur in geringem Maße mit der Änderung zu insgesamt stärker alkalischen oder stärker sauren Aminosäuren einhergeht. Denn der Wechsel in Position 297 bedeutet für die BAA den Übergang von einer neutralen zu einer sauren Aminosäure und der in Position 406 von einer basischen zu einer stärker basischen Aminosäure.
Besonders bevorzugt sind derartige α-Amylase-Varianten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Varianten mit den Austauschen 13P/32A/230V/297D/406R/414S handelt.
Ein solches Molekül wird mit der Variante BAA A29 zur Verfügung gestellt und in den Beispielen hinsichtlich seiner biochemischen Eigenschaften untersucht. Sie weist besonders hohe Aktivitätswerte im Vergleich zum Wildtypenzym, d.h. dem Molekül ohne diese sechs Austausche auf.
Wie oben bereits gesagt besteht ein weiterer Aspekt zur Lösung der Aufgabe in der Bereitstellung von α-Amylase-Varianten mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Austausch in Position 203 und ein Austausch in Position 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt.
Hierbei kann es sich um Austausche handeln, die an einem Wildtypmolekül vorgenommen worden sind, oder insbesondere um solche, die an einer bereits vorhandenen und möglicherweise in eine bestimmte Richtung verbesserten Variante zusätzlich vorgenommen worden sind.
Die Position 203 liegt, wie 1 zeigt, in einem relativ konservierten Bereich der α-Amylasen; insbesondere das Isoleucin ist an dieser Stelle in allen anderen wichtigen α-Amylasen vorhanden. Für die Position 474 sieht die Situation indifferenter aus, denn hier liegen in den Vergleichsenzymen aus dem Stand der Technik verschiedene Aminosäuren, vor allem K, H, N oder Q. Dennoch deutet nichts darauf hin, daß diese Positionen für die Alkali-Stabilität und insbesondere die Alkali-Aktivität von Bedeutung sein könnten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige α-Amylase-Varianten dadurch gekennzeichnet, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.
Denn über diese beiden Substitutionen unterscheidet sich die erfindungsgemäße Variante BAA B1 von BAA A29. Dadurch erhält sie, wie Beispiel 6 zeigt, bei einem nicht meßbar veränderten pH-Optimum eine höhere relative Aktivität bei pH 10.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Austausche in den Positionen 203 und 474 nicht an einem Wildtypmolekül sondern an einem Molekül vorgenommen, welches bereits die oben dargestellten erfindungsgemäßen Austausche in den Positionen 13 und 414 und zusätzlich in den Positionen 32, 230, 297 und/oder 406 aufweist. Denn für diese sind die dargestellten vorteilhaften Eigenschaften oben bereits dargestellt.
Beansprucht werden somit solche α-Amylase-Varianten, die zusätzlich zu den genannten Austauschen in den Positionen 13 und 414, in Kombination mit denen in den Positionen 32, 230, 297 und/oder 406 dadurch gekennzeichnet sind, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 203 oder 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in beiden Positionen.
Entsprechend dem oben gesagten sind auch unter diesen α-Amylase-Varianten jene bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses und des ersten Erfindungsaspekts ist eine α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/32A/203L/230V/297D/406R/414S/474Q handelt.
Ein Vertreter eines solchen Moleküls ist die nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltene und in den Beispielen 4 bis 6 charakterisierte Variante BAA B1, die auch den Namen B. amyloliquefaciens-α-Amylase L13P/V32A/1203L/A230V/N297S/K406R/N414S/K474Q trägt. Sie zeichnet sich gegenüber dem Wildtypmolekül BAA insbesondere durch eine erhöhte Aktivität aus (Beispiel 5).
Wie einleitend dargestellt sind im Stand der Technik zahlreiche α-Amylasen für den Einsatz zu verschiedenen technischen Zwecken, insbesondere als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln etabliert. Hierzu zählen pilzliche und besonders bakterielle Enzyme. Ganz besonders gebräuchlich sind solche aus grampositiven Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, die an ein alkalisches Milieu angepaßt sind. Denn sie weisen von vornherein günstige Eigenschaften für diese Einsatzgebiete auf. Erfindungsgemäß können sie durch zusätzliche Punktmutationen weiterentwickelt werden. In den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung fällt somit allgemein jede α-Amylase-Variante, die durch die oben bezeichneten Aminosäurevariationen gekennzeichnet ist, vorzugsweise jede, für die bereits ein entsprechender Einsatz beschrieben ist, beispielsweise auch die einleitend dargestellten Moleküle AA560, AA349, SP690 und SP722.
Bevorzugt handelt es dabei um jede α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sich das Ausgangsmolekül von einer α-Amylase ableitet, die ursprünglich aus einer Bacillus-Spezies stammt, vorzugsweise aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt aus B. amyloliquefaciens, B. agaradherens (DSM 9948) oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), ganz besonders aus B. amyloliquefaciens.
Diese Enzyme sind in der Einleitung ausführlich behandelt worden. Besonders bevorzugt sind hierunter zum einen diejenigen, die sich von den α-Amylasen aus aus B. agaradherens (DSM 9948) und aus B. sp. A 7-7 (DSM 12368) ableiten. Das zuerst genannte Molekül, das gleichzeitig als α-Amylase und als Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) angesehen werden kann, wird in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschrieben. Die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), die hier als A 7-7 bezeichnet wird, geht aus der Anmeldung WO 02/10356 A2 hervor. Für beide sind bislang noch keine Leistungsverbesserungen über Punktmutationen beschrieben worden, so daß die erfindungsgemäßen Variationen hierfür besonders vielversprechende erste Ansatzpunkte sein dürften. Zum anderen werden Varianten des Enzyms aus B. amyloliquefaciens (BAA) bevorzugt, weil diese nach den hier ausgeführten Beispielen hergestellt worden sind und die genannten vorteilhaften Eigenschaften aufweisen.
Wie erwähnt ist die vorliegende Erfindung nicht auf natürliche oder weitgehend unmodifizierte Enzyme beschränkt sondern kann insbesondere auch auf Hybridamylasen angewendet werden. Denn die Erzeugung von α-Amylasen mit positiven Eigenschaften über die Fusionsmutagenese ist im Stand der Technik inzwischen ausführlich beschrieben.
Dementsprechend wird jede erfindungsgemäße α-Amylase-Variante beansprucht, die zusätzlich dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei dem Ausgangsmolekül um eine Hybrid-α-Amylase handelt, vorzugsweise basierend auf mindestens einer der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt basierend auf mindestens zwei der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368).
Insbesondere aus der Anmeldung DE 10138753 gehen Hybride der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens und B. licheniformis hervor, die gerade bei Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln positive Eigenschaften zeigen.
Besonders bevorzugt ist somit jede erfindungsgemäße α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei der Hybrid-α-Amylase um eine handelt, deren Teilsequenzen von den α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens und aus B. licheniformis abgeleitet sind.
Besonders bevorzugt ist eine α-Amylase-Variante, wenn sie dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um eine Variante der α-Amylase von B. amyloliquefaciens mit einer der Aminosäureaustausch-Kombinationen L13P/W194R/S197P/E356D/N414S, L13P/V32A/A230V/N297D/K406R/N414S beziehungsweise L13P/V32A/1203UA230V/N297D/K406R/N414S/K474Q handelt, vorzugsweise mit der Aminosäureaustausch-Kombination L13P/W194R/S197P/E356D/N414S.
Denn diese Moleküle sind unter den Bezeichnungen BAA 42, BAA 29 und BAA B1 in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Hierunter hat das Enzym mit der Aminosäureaustausch-Kombination L13P/W194R/S197P/E356D/N414S (BAA A42) eine besonders hohe Alkaliaktivität unter Beweis gestellt.
Vorzugsweise sind diese α-Amylase-Varianten dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6), aus B. amyloliquefaciens A29 (SEQ ID NO. 8) oder aus B. amyloliquefaciens B1 (SEQ ID NO. 10) handelt, vorzugsweise um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6).
In der Tat wurden, wie in Beispiel 1 dargestellt ist, die Moleküle BAA A42, A29 und B1 nicht aus Stämmen der Spezies B. amyloliquefaciens selbst gewonnen. Ursprünglich stammte nur die Sequenz für das Wildtypmolekül aus B. amyloliquefaciens, wie er beispielsweise unter der Nummer DSM 7 von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhalten werden kann. Diese ist unter SEQ ID NO.3 beziehungsweise 4 angegeben. Die betreffenden mutanten B. amyloliquefaciens-Stämme können beispielsweise dadurch erzeugt werden, daß die dargestellten pGBAA-Plasmide vorzugsweise hiervon abgeleitete Plasmide mit größeren flankierenden Bereichen zum BAA-Gen in die Wildtypzellen rückübertragen werden. Analog könnten die Gene aus SEQ ID NO. 5, 7 und 9 auch neu synthetisiert und in entsprechende Vektoren eingebracht werden. Durch homologe Rekombination des mutierten Gens in die zugehörige Stelle im Chromosom wird die anspruchsgemäße Mutante von B. amyloliquefaciens erzeugt, die dauerhaft das mutierte Gen exprimiert. Dieses Vorgehen ist dann besonders vorteilhaft, wenn das betreffende Protein auch durch einen Stamm dieser Spezies produziert werden soll.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Nukleinsäuren dar, die für eine der bislang beschriebenen α-Amylase-Varianten codieren.
Hierunter sind sowohl RNA- als auch DNA-Moleküle sowie DNA-Analoga zu verstehen, sowohl der codierende als auch der codogene Strang, und zwar in jedem Leseraster. Denn beispielsweise wäre es möglich, die mit der Erfindung verbundene Lehre auszunutzen, um über eine interferierende entsprechende RNA eine Regulation entsprechender α-Amylasen vorzunehmen oder die Lebensdauer der genetischen Information zu erhöhen, indem sie in ein in vivo langsamer abbaubares DNA-Analogon überführt wird. Die Nukleinsäuren eröffnen, wie an den weiter unten ausgeführten Erfindungsgegenständen zu erkennen ist, der vorliegenden Erfindung gewissermaßen die molekularbiologische Dimension. Sie sind ensprechend dem oben Gesagten entsprechend bevorzugt.
Vorzugsweise sind hierunter DNA-Moleküle zu verstehen. Denn über diese ist es möglich, die erfindungsgemäßen α-Amylase-Varianten über an sich bekannte molekularbiologische Verfahren herzustellen und/oder gegebenenfalls weiterzumodifizieren.
Ausgangspunkte für diese Nukleinsäure können die im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenz-Informationen sein, um über chemische Neusynthese die betreffenden Gene zu erhalten. Demgegenüber kann es aber auch vorteilhaft sein, auf in vivo bereits zur Verfügung stehende Nukleinsäuren zurückzugreifen, etwa solchen, die für die im Stand der Technik bekannten α-Amylasen codieren. Eine weitere Alternative besteht darin, entsprechend Beispiel 1 eine Gesamt-DNA-Präparation von bestimmten dafür ins Auge gefaßten Mikroorganismen vorzunehmen und über PCR die endogenen α-Amylasegene zu isolieren. Als Primer können prinzipiell die aus SEQ ID NO. 3 ebenfalls abzulesenden 5'- und 3'-Sequenzabschnitte eingesetzt werden.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäure ist somit dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 3 ableitet.
Darunter sind nicht nur jene zu verstehen, die wie oben erklärt, anhand dieser Sequenz erhalten worden sind, sondern auch alle Mutanten, die in anderen Positionen als nur denen erzeugt worden sind, die mit der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform greift auf die in der vorliegenden Anmeldung tatsächlich untersuchten Beispiele zurück.
Besonders bevorzugt ist somit jede erfindungsgemäße Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 ableitet, vorzugsweise eine dieser Sequenzen selbst.
Eine besonders vorteilhafte Form, Nukleinsäuren zu handhaben, stellen Vektoren dar. Denn diese weisen Bereiche auf, die es ermöglichen, das betreffende enthaltene, interessierende Gen zu charakterisieren (etwa über flankierende Bereiche für Segzenzierprimer), zu lagern und durch Transformation gegebenenfalls wieder zu aktivieren oder um es zu exprimieren, wenn das abgeleitete Protein untersucht und in größeren Mengen hergestellt werden soll. Bei Vektoren kann es sich insbesondere bei eukaryontischen Wirtszellen wie etwa Hefe um künstliche Chromosomen handeln; bei Bakterien sind Vektoren in der Regel Plasmide.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung stellen somit Vektoren dar, die einen Bereich mit einer oben beschriebenen Nukleinsäure enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Vektor dadurch gekennzeichnet, daß er ein Klonierungsvektor ist.
Denn in dieser Form kann die betreffende DNA wie oben gesagt gelagert werden oder beispielsweise über Einführung weiterer Mutationen weiter verändert werden, wodurch beispielsweise weiterentwickelte erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten erzeugt werden können.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Vektor dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.
Denn dadurch kann eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante auf bequeme molekularbiologische Weise auch in größeren Mengen erzeugt werden.
In weiteren vorteilhaften Ausführungsformen weisen die genannten Vektoren Replikationsursprünge für verschiedene Mikroorganismen auf, wodurch sie als sogenannte Shuttle-Vektoren in verschiedene Wirtszellen eingebracht und dort stabil erhalten werden können. Es ist ebenso möglich, Vektoren herzustellen, die sowohl als Klonierungs- als auch als Expressionsvektor betrachtet werden können.
Entsprechend dem oben Gesagten und der im Stand der Technik etablierten Methodik erstreckt sich die molekularbiologische Dimension auch auf Organismen, insbesondere auf Mikroorganismen.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen somit Zellen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine der oben bezeichneten Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise auf einem oben bezeichneten Vektor.
Hierzu gehören beispielsweise solche, die mit einem entsprechenden Klonierungsvektor transformiert worden sind oder sich von solchen ableiten. Dies dient insbesondere der Charakterisierung und/oder der Lagerung des betreffenden Gens. Demgegenüber ist es für die Realisierung der vorliegenden Erfindung besonders wichtig, das betreffende Enzym tatsächlich auch zu erhalten; denn an dessen verbesserten Eigenschaften besteht ein besonderes kommerzielles Interesse. Diese Bildung kann beispielsweise permament und in mit hoher Produktionsrate erfolgen, wenn das interessierende Transgen unter der Kontrolle eines konstitutiven und starken Promotors steht. Alternativ ist es auch möglich, das Gen für die α-Amylase-Variante unter die Kontrolle eines induzierbaren und vorteilhafterweise nicht minder starken Promotors zu stellen. Dadurch kann die Herstellung gezielt von außen eingeschaltet werden, beispielsweise dann, wenn hierfür günstige Bedingungen vorliegen. Dies ist etwa bei der fermentativen Produktion dann der Fall, wenn eine bestimmte Zelldichte erreicht worden ist.
Bevorzugt ist also jede oben bezeichnete Zelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine der oben bezeichneten α-Amylase-Varianten bildet oder zu deren Bildung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz einer oben bezeichneten Nukleinsäure, besonders bevorzugt unter Einsatz eines oben bezeichneten Expressionsvektors.
Eine zusätzlich vorteilhafte Ausführungsform nimmt darauf Bezug, daß die meisten industriell wichtigen α-Amylasen ursprünglich als Enzyme gefunden worden sind, die von den betreffenden Mikroorganismen, insbesondere Bakterien ins umgebende Medium sekretiert werden. Denn in vivo handelt es sich zumeist um Verdauungsenzyme. Dementsprechend ist es vorteilhaft, wenn die industriell hergestellten erfindungsgemäßen Enzyme ebenfalls ins umgebende Medium sekretiert werden. Denn aus diesem können sie ohne Zellaufschluß und damit vergleichsweise leicht aufgearbeitet werden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die betreffenden Gene um entsprechende Sequenzen ergänzt werden – sofern diese nicht ohnehin vorhanden sind – die für ein Leader-Peptid codieren, welches die betreffende Zelle dazu veranlaßt sie auszuschleusen. Eine Alternative bei gramnegativen Bakterien besteht beispielsweise darin, die äußere Membran zur Abgabe von Proteinen partiell zu öffnen, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 01/81597 A1 beschrieben ist.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zelle ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein Bakterium handelt, insbesondere eines, das die gebildete α-Amylase-Variante ins umgebende Medium sekretiert.
Insbesondere die Charakterisierung von Genen und Enzymen erfolgt im Labormaßstab in der Regel über Zwischenklonierung und/oder Expression in gramnegativen Bakterien. Dies belegen auch die Beispiele der vorliegenden Anmeldung. Es sind aber auch Produktionsverfahren etabliert, die auf gramnegativen Bakterien aufbauen (siehe oben).
Die bislang beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen sind vorzugsweise somit dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von E. coli K12, von E. coli B oder K. planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme E. coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder K. planticola (Rf).
Im Stand der Technik ist insbesondere für die Produktion von Enzymen aus grampositiven Organismen etabliert, für diese auch grampositive Expressionswirte auszuwählen. Aber auch hinsichtlich der Charakterisierungen im Labormaßstab ist es nicht unüblich, mit grampositiven Bakterien zu arbeiten. Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein bestimmtes Enzym auch von dem Wirt produziert wird, aus dem es ursprünglich stammt, weil von diesem die betreffenden Reguklationssignale i.A. optimal umgesetzt werden.
Die zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen sind somit nicht minder vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um grampositive Bakterien handelt, insbesondere der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterium oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. alcalophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. agaradherens, B. globigii oder B. lentus.
Diesem Erfindungsgegenstand sind, schließlich, noch alle Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zuzurechnen. Denn hierdurch wird der wirtschaftlich eigentlich interessierende Gegenstand tatsächlich zur Verfügung gestellt. Solche eine Herstellung kann beispielsweise über eine chemische Synthese des betreffenden Proteins erfolgen.
Demgegenüber sind entsprechend den bekannten und oben dargestellten molekularbiologischen Techniken jedoch jene Verfahren bevorzugt, die auf die oben ausgeführten Nukleinsäuren zurückgreifen, besonders bevorzugt unter Verwendung eines oben dargestellten Vektors und ganz besonders bevorzugt unter Verwendung einer oben beschriebenen Zelle.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine oben beschriebene α-Amylase-Variante enthalten.
Hiermit ist jedes Mittel gemeint, in dem die betreffende α-Amylase in irgendeiner Form zur Anwendung, d.h in den erwünschten hydrolytischen Kontakt zu ihrem Substrat Stärke oder Stärke-ähnliches Polysaccharid gebracht oder hierfür vorbereitet wird. Der gewünschte Kontakt erfolgt in der Regel in einem wäßrigen Milieu, das günstigerweise auf einen entsprechenden pH-Wert gepuffert ist und gegebenenfalls weitere begünstigende Faktoren enthält. Hierzu gehören beispielsweise weitere Enzyme, die die unmittelbaren Reaktionsprodukte weiter umsetzen, etwa in Hinblick auf Stärkeverflüssigung für die Nahrungsmittel- oder Tierfutterherstellung oder für eine Ethanolproduktion. Ferner gehören hierzu niedermolekulare Verbindungen, die beispielsweise in entstehende Oligosaccharide wie Cyclodextrine eingeschlossen werden, oder niedermolekulare Verbindungen, die die Spaltungsprodukte weiter solubilisieren oder eine den Gesamtprozeß begünstigende Wirkung aufweisen, wie etwa Tenside im Rahmen einer Waschmittelrezeptur. Es kann sich auch um Mittel handeln, in denen die erwünschte amylolytische Aktivität erst mit einer großen Zeitverzögerung induziert werden soll, wie beispielsweise bei temporären Klebeverfahren, nach welchen die α-Amylase-Variante dem betreffenden Klebstoff schon frühzeitig zugesetzt aber erst nach langer Zeit durch Erhöhung des Wassergehalts tatsächlich aktiv wird. Dies trifft beispielsweise auch auf Wasch- und Reinigungsmittel zu, die erst nach einer Phase der Lagerung im Augenblick der Verdünnung in der Waschflotte gegenüber dem Substrat aktiv werden sollen.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind derartige Mittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.
Die erfindungsgemäßen Eigenschaften und wichtigen Inhaltsstoffe für derartige Wasch- und Reinigungsmittel werden weiter unten ausführlich dargestellt. An dieser Stelle erfolgt zunächst eine Übersicht über die wichtigsten und deshalb erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen derartiger Wasch- und Reinigungsmittel.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es 0,000001 Gewichts-Prozent bis 5 Gew.-%, und zunehmend bevorzugt 0,00001 bis 4 Gew.-%, 0,0001 bis 3 Gew.-%, 0,001 bis 2 Gew.-% oder 0,01 bis 1 Gew.-% der α-Amylase-Variante enthält.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich andere Enzyme enthält, insbesondere hydrolytische Enzyme oder Oxidoreduktasen, besonders bevorzugt weitere Amylasen, Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Hemicellulasen, Cellulasen, β-Glucanasen, Oxidasen, Peroxidasen, Laccasen.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amylase-Variante durch einen der sonstigen Bestandteile des Mittels stabilisiert und/oder in ihrem Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des Mittels gesteigert wird.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt fest ist, vorzugsweise nach einem Kompaktierungsschritt für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt, daß es insgesamt kompaktiert ist.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt flüssig, gelförmig oder pastös ist, vorzugsweise unter Verkapselung für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt unter Verkapselung mindestens eines der enthaltenen Enzyme, ganz besonders bevorzugt unter Verkapselung der α-Amylase-Variante.
Ein wichtiges Einsatzgebiet für Amylasen ist das als aktive Komponenten in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Reinigung von Textilien oder von festen Oberflächen, wie beispielsweise Geschirr, Fußböden oder Arbeitsgeräten. In diesen Anwendungen dient die amylolytische Aktivität dazu, kohlenhydrathaltige Verunreinigungen und insbesondere solche auf Stärkebasis hydrolytisch aufzulösen oder vom Untergrund abzulösen. Dabei können sie allein, in geeigneten Medien oder auch in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Anwendung gebracht werden. Die hierfür zu wählenden Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein, also in Bezug auf die Anschmutzung und auf das Trägermaterial. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C bei manuellen Mitteln über 40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Die übrigen Bedigungen können über die übrigen, unten ausgeführten Bestandteile der Mittel ebenfalls sehr spezifisch auf den jeweiligen Reinigungszweck ausgelegt werden.
Bevorzugte erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel zeichnen sich dadurch aus, daß unter irgendwelchen der auf diese Weise definierbaren Bedingungen die Wasch- oder Reinigungsleistung dieses Mittels durch Zugabe einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante gegenüber der Rezeptur ohne diese Variante verbessert wird. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung.
Eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante kann sowohl in Mitteln für Großverbraucher oder technische Anwender als auch in Produkten für den Privatverbraucher Anwendung finden, wobei alle im Stand der Technik etablierten und/oder zweckmäßigen Darreichungsformen auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Mit den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln sind somit alle denkbaren Reinigungsmittelarten gemeint, sowohl Konzentrate, als auch unverdünnt anzuwendende Mittel; zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet. Jegliche Wasch- oder Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um eine erfindungsgemäße Amylase bereichert ist.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Mittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.
α-Amylasen, werden in erfindungsgemäßen Mitteln beispielsweise mit einzelnen oder mehreren der folgenden Inhaltsstoffe kombiniert: nichtionische, anionische und/oder kationische Tenside, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Builder und/oder Cobuilder, Lösungsmittel, Verdicker, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, insbesondere Silberschutzmittel, Soil-Release-Wirkstoffe, Farbtransfer (oder -Übertragungs)-Inhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe, antimikrobielle Wirkstoffe, UV-Schutzmittel, Enzyme wie beispielsweise Proteasen, (gegebenenfalls andere) Amylasen, Lipasen, Cellulasen, Hemicellulasen oder Oxidasen, Stabilisatoren, insbesondere Enzymstabilisatoren, und andere Komponenten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C_12-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C_9-11-Alkohol mit 7 EO, C_13-15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C_12-18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C_12-14-Alkohol mit 3 EO und C_12-18-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden können, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)_z, in der R für einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II),
in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R¹ für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III),
in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R¹ für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R² für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C_1-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C_9-13-Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, d.h. Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C_12-18-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus C_12-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren geeignet.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierprodukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der C₁₂-C₁₈-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C₁₀-C₂₀-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C₁₂-C₁₆-Alkylsulfate und C₁₂-C₁₅-Alkylsulfate sowie C₁₄-C₁₅-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C_7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C_9-11-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C_12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C_8-18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe unten). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.
Erfindungsgemäße Mittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H₂O₂ liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H₂O₂ liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel HN₂-CO-NH₂·H₂O₂ beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12-Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.
Der Gehalt der Mittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird. Eine synergistische Verwendung von Amylase mit Percarbonat oder von Amylase mit Percarbonsäure wird mit den Anmeldungen WO 99/63036, beziehungsweise WO 99/63037 offenbart.
Um beim Waschen bei Temperaturen von 60°C und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte Bleichwirkung zu erreichen, können die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-Tetraacetylglycoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), acylierte Hydroxycarbonsäuren, wie Triethyl-O-acetylcitrat (TEOC), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Isatosäureanhydrid und/oder Bernsteinsäureanhydrid, Carbonsäureamide, wie N-Methyldiacetamid, Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und die aus den deutschen Patentanmeldungen DE 196 16 693 und DE 19616 767 bekannten Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren in der europäischen Patentanmeldung EP 0 525 239 beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglucose (PAG), Pentaacetylfructose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin beziehungsweise Gluconolacton, Triazol beziehungsweise Triazolderivate und/oder teilchenförmige Caprolactame und/oder Caprolactamderivate, bevorzugt N-acylierte i-actame, beispielsweise N-Benzoylcaprolactam und N-Acetylcaprolactam, die aus den internationalen Patentanmeldungen WO 94/27970, WO 94/28102, WO 94/28103, WO 95/00626, WO 95/14759 und WO 95/17498 bekannt sind. Die aus der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 769 bekannten hydrophil substituierten Acylacetale und die in der deutschen Patentanmeldung DE 196 16 770 sowie der internationalen Patentanmeldung WO 95/14075 beschriebenen Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch die aus der deutschen Patentanmeldung DE 4443 177 bekannten Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Ebenso können Nitrilderivate wie Cyanopyridine, Nitrilquats, zum Beispiel N-Alkylammoniumacetonitrile, und/oder Cyanamidderivate eingesetzt werden. Bevorzugte Bleichaktivatoren sind Natrium-4-(octanoyloxy)-benzolsulfonat, n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS), Undecenoyloxybenzolsulfonat (UDOBS), Natriumdodecanoyloxybenzolsulfonat (DOBS), Decanoyloxybenzoesäure (DOBA, OBC 10) und/oder Dodecanoyloxybenzolsulfonat (OBS 12), sowie N-Methylmorpholinum-acetonitril (MMA). Derartige Bleichaktivatoren können im üblichen Mengenbereich von 0,01 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 10 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, enthalten sein.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru- oder Mo-Salenkomplexe oder -carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Aminkomplexe sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen bevorzugt eingesetzt werden, die in der DE 197 09 284 A1 beschrieben sind. Gemäß WO 99/63038 vermögen auch Acetonitril-Derivate und gemäß WO 99/63041 bleichaktivierende Übergangsmetallkomplexverbindungen in Kombination mit Amylasen eine bleichaktivierende Wirkung zu entfalten.
Erfindungsgemäße Mittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und – wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen – auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe.
Zu nennen sind hier kristalline, schichtförmige Natriumsilikate der allgemeinen Formel NaMSi_xO_2x+1·yH₂O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet, x eine Zahl von 1,6 bis 4, vorzugsweise 1,9 bis 4,0 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Derartige kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung EP 0164 514 beschrieben. Bevorzugte kristalline Schichtsilicate der angegebenen Formel sind solche, in denen M für Natrium steht und x die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilicate Na₂Si₂O₅·yH₂O bevorzugt. Im Handel befinden sich derartige Verbindungen beispielsweise unter der Bezeichnung SKS^® (Fa. Clariant). So handelt es sich bei SKS-6^® vorwiegend um ein δ-Natriumdisilicat mit der Formel Na₂Si₂O₅·yH₂O, bei SKS-7^® vorwiegend um das β-Natriumdisilicat. Durch Reaktion mit Säuren (zum Beispiel Citronensäure oder Kohlensäure) entsteht aus dem δ-Natriumdisilicat Kanemit NaHSi₂O₅·yH₂O, im Handel unter den Bezeichnungen SKS-9^® beziehungsweise SKS-10^® (Fa. Clariant). Von Vorteil kann es auch sein, chemische Modifikationen dieser Schichtsilicate einzusetzen. So kann beispielsweise die Alkalität der Schichtsilicate geeignet beeinflußt werden. Mit Phosphat beziehungsweise mit Carbonat dotierte Schichtsilicate weisen im Vergleich zu dem δ-Natriumdisilicat veränderte Kristallmorphologien auf, lösen sich schneller und zeigen im Vergleich zu δ-Natriumdisilicat ein erhöhtes Calciumbindevermögen. So sind Schichtsilicate der allgemeinen Summenformel x Na₂O·y SiO₂·z P₂O₅, in der das Verhältnis x zu y einer Zahl 0,35 bis 0,6, das Verhältnis x zu z einer Zahl von 1,75 bis 1200 und das Verhältnis y zu z einer Zahl von 4 bis 2800 entsprechen, in der Patentanmeldung DE 19601 063 beschrieben. Die Löslichkeit der Schichtsilicate kann auch erhöht werden, indem besonders feinteilige Schichtsilicate eingesetzt werden. Auch Compounds aus den kristallinen Schichtsilicaten mit anderen Inhaltsstoffen können eingesetzt werden. Dabei sind insbesondere Compounds mit Cellulosederivaten, die Vorteile in der desintegrierenden Wirkung aufweisen und insbesondere in Waschmitteltabletten eingesetzt werden, sowie Compounds mit Polycarboxylaten, zum Beispiel Citronensäure, beziehungsweise polymeren Polycarboxylaten, zum Beispiel Copolymeren der Acrylsäure, zu nennen.
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na₂O : SiO₂ von 1:2 bis 1:3,3, vorzugsweise von 1:2 bis 1:2,8 und insbesondere von 1:2 bis 1:2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharten Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharte Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.
Ein gegebenenfalls einsetzbarer, feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith MAP^® (Handelsprodukt der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise auch ein Co-Kristallisat aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der Firma CONDEA Augusta S.p.A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX^® vertrieben wird und durch die Formel nNa₂O·(1-n)K₂O·Al₂O₃·(2 – 2,5)SiO₂·(3,5 – 5,5)H₂O beschrieben werden kann. Geeignete Zeolithe weisen eine mittlere Teilchengröße vonweniger als 10 μm (Volumenverteilung; Meßmethode: Coulter Counter) auf und enthalten vorzugsweise 18 bis 22 Gew.-%, insbesondere 20 bis 22 Gew.-% an gebundenem Wasser.
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall-(insbesondere Natrium- und Kalium-)-Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO₃)_n und Orthophosphorsäure H₃PO₄ neben höhenmolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH₂PO₄, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gcm^–3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gcm^–3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 200°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na₂H₂P₂O₇), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na₃P₃O₉) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH₂PO₄ reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH₂PO₄, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gcm^–3, hat einen Schmelzpunkt 253° [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO₃)_x] und ist leicht löslich in Wasser.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na₂HPO₄, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gcm^–3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gcm^–3, Schmelzpunkt 48° unter Verlust von 5 H₂O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gcm^–3, Schmelzpunkt 35° unter Verlust von 5 H₂O), wird bei 100° wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na₄P₂O₇ über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K₂HPO₄, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.
Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na₃PO₄, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gcm^–3 und einen Schmelzpunkt von 73–76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19–20% P₂O₅) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39–40% P₂O₅) eine Dichte von 2,536 gcm^–3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K₃PO₄, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gcm^–3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na₄P₂O₇, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gcm^–3, Schmelzpunkt 988°, auch 880° angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815–1,836 gcm^–3, Schmelzpunkt 94° unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na₄P₂O₇ entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf > 200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K₄P₂O₇, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gcm^–3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25° 10,4 beträgt.
Durch Kondensation des NaH₂PO₄ beziehungsweise des KH₂PO₄ entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium- beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.
Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat, Na₅P₃O₁₀ (Natriumtripolyphosphat), ist ein wasserfrei oder mit 6 H₂O kristallisierendes, nicht hygroskopisches, weißes, wasserlösliches Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]_n-Na mit n = 3. In 100 g Wasser lösen sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60° ca. 20 g, bei 100° rund 32 g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100° entstehen durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit Sodalösung oder Natronlauge im stöchiometrischen Verhältnis zur Reaktion gebracht und die Lösung durch Versprühen entwässert. Ähnlich wie Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat viele unlösliche Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat, K₅P₃O₁₀ (Kaliumtripolyphosphat), kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P₂O₅, 25% K₂O) in den Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind. Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat mit KOH hydrolysiert: (NaPO₃)₃ + 2 KOH → Na₃K₂P₃O₁₀ + H₂O
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system-unbd umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen M_w der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.
Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-)polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol-Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln, welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings zur Carbonsäurefunktion zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel sind oxidierte Stärken, beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen EP 472 042 , WO 97125399, und EP 755 944 .
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolithhaltigen und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.
Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriaminpentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, zum Beispiel als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Mitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew. % Alkalicarbonat und 20 Gew.% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propyl-ether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.
Zur Einstellung der Viskosität können erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein oder mehrere Verdicken, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicken stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.
Die Verdicken können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe enthalten.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu bewirken, können in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln für Geschirr Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(III)-chlorid oder CoSO₄. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift EP 0 736084 B1 bekannt ist, sind für die gemeinsame Verwendung mit Enzymen besonders geeignete Silberkorrosionsinhibitoren Mangan-, Titan-, Zirkonium-, Hafnium-, Vanadium-, Cobalt- oder Cersalze und/oder -komplexe, in denen die genannten Metalle in einer der Oxidationsstufen II, III, IV, V oder VI vorliegen. Beispiele für derartige Verbindungen sind MnSO₄, V₂O₅, V₂O₄, VO₂, TiOSO₄, K₂TiF₆, K₂ZrF₆, Co(NO₃)₂, Co(NO₃) ₃ , sowie deren Gemische.
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.
Besonders wirksame und seit langer Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol- und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141, beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer aus einer dibasigen Carbonsäure und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus Ethylenterephthalat und Polyethylenoxidterephthalat und deren Einsatz in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften DE 28 57 292 und DE 33 24 258 und der Europäischen Patentschrift EP 0 253 567 beschrieben. Das europäische Patent EP 066 944 betrifft Mittel, die einen Copolyester aus Ethylenglykol, Polyethylenglykol, aromatischer Dicarbonsäure und sulfonierter aromatischer Dicarbonsäure in bestimmten Molverhältnissen enthalten. Aus dem europäischen Patent EP 0 185 427 sind Methyl- oder Ethylgruppen-endverschlossene Polyester mit Ethylen- und/oder Propylen-terephthalat- und Polyethylenoxid-terephthalat-Einheiten und Waschmitel, die derartiges Soil-release-Polymer enthalten, bekannt. Das europäische Patent EP 0 241 984 betrifft einen Polyester, der neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten auch substituierte Ethyleneinheiten sowie Glycerineinheiten enthält. Aus dem europäischen Patent EP 0 241 985 sind Polyester bekannt, die neben Oxyethylen-Gruppen und Terephthalsäureeinheiten 1,2-Propylen-, 1,2-Butylen- und/oder 3-Methoxy-1,2-propylengruppen sowie Glycerineinheiten enthalten und mit C₁- bis C₄-Alkylgruppen endgruppenverschlossen sind. Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 272 033 sind zumindest anteilig durch C_1-4-Alkyl- oder Acylreste endgruppenverschlossene Polyester mit Poly-propylenterephthalat- und Polyoxyethylenterephthalat-Einheiten bekannt. Das europäische Patent EP 0 274907 beschreibt sulfoethyl-endgruppenverschlossene terephthalathaltige Soil-release-Polyester. Gemäß der europäischen Patentanmeldung EP 0 357280 werden durch Sulfonierung ungesättigter Endgruppen Soil-Release-Polyester mit Terephthalat-, Alkylenglykol- und Poly-C_2-4-Glykol-Einheiten hergestellt. Die internationale Patentanmeldung WO 95/32232 betrifft saure, aromatische schmutzablösevermögende Polyester. Aus der internationalen Patentanmeldung WO 97/31085 sind nicht polymere soil-repellent-Wirkstoffe für Materialien aus Baumwolle mit mehreren funktionellen Einheiten bekannt: Eine erste Einheit, die beispielsweise kationisch sein kann, ist zur Adsorption auf die Baumwolloberfläche durch elektrostatische Wechselwirkung befähigt, und eine zweite Einheit, die hydrophob ausgebildet ist, ist verantwortlich für das Verbleiben des Wirkstoffs an der Wasser/Baumwolle-Grenzfläche.
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylimidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinylpyrrolidon mit Vinylimidazol.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C₁₈-C₂₄-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.
Farb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8–18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, α-Isomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.
Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in „Praxis der Sterilisation, Desinfektion-Konservierung : Keimidentifizierung-Betriebshygiene" (5. Aufl. – Stuttgart; New York Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetate sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyridinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, Iodo-2-propyl-butyl-carbamat, Iod, Iodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.
Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholinacetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1,10-decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphenyl)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-phenyl-N₁,N₁-methyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido- N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,6-dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-[N₁,N₁'-beta-(p-methoxyphenyl)diguanido-N₅,N₅']-hexane-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-alpha-methyl-beta.-phenyldiguanido-N₅,N₅')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-p-nitrophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, omega:omegα-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N₁,N₁'-p-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,4-dichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-p-methylphenyldiguanido- N₅,N₅')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-2,4,5-trichlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-[N₁,N₁'-alpha-(p-chlorophenyl) ethyldiguanido-N5,N5'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N₁,N₁'-p-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')m-xylene-dihydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁'-p-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅') dodecan-dihydrochlorid, 1,10-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido-N₅,N₅')-decan-tetrahydrochlorid, 1,12-Di-(N₁,N₁'-phenyldiguanido- N₅,N₅') dodecan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido- N₅,N₅') hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N₁,N₁'-o-chlorophenyldiguanido-N₅,N₅')hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1-tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5-diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o-diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis-(phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfate, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, Iodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R¹)(R²)(R³)(R⁴) N⁺ X^– auf, in der R¹ bis R⁴ gleiche oder verschiedene C₁-C₂₂-Alkylreste, C₇-C₂₈-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X^– Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere 12 bis 16, C-Atomen auf.
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12-alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis-(2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl-ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121-54-0), Dialkyldimethylammonium-chlonide wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyldimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C₈-C₁₈-Alkylresten, insbesondere C₁₂-C₁₄-Aklyl-benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat^® ex Lonza, Marquat^® ex Mason, Variquat^® ex Witco/Sherex und Hyamine^® ex Lonza, sowie Bardac^® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide^® und Dowicil^® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine^® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine^® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.
Die Mittel können UV-Absorbenzien (UV-Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längenwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.
Verbindungen, die diese gewünschten Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate, gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene Urocansäure geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate wie sie beispielsweise in der EP 0728749 A beschrieben werden und kommerziell als Tinosorb^® FD oder Tinosorb^® FR ex Ciba erhältlich sind. Als UV-B-Absorber sind zu nennen: 3-Benzylidencampher beziehungsweise 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, zum Beispiel 3-(4-Methylbenzyliden)campher, wie in der EP 0693471 B1 beschrieben; 4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)benzoesäureamylester; Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 2-Cyano-3,3-phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester; Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon; Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2-ethylhexylester; Triazinderivate, wie zum Beispiel 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1'-hexyloxy)-1,3,5-triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb^® HEB); Propan-1,3-dione, wie zum Beispiel 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-(4'methoxyphenyl)propan-1,3-dion; Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben. Weiterhin geeignet sind 2-Phenylbenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze; Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze; Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie zum Beispiel 4-(2-Oxo-3-bornylidenmethyl)benzol-sulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)sulfonsäure und deren Salze.
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion, 4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF).
Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d.h. hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex^® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal, Band 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.
Erfindungsgemäße Mittel können zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung zusätzlich zu den erfindungsgemäßen α-Amylase-Varianten weitere Enzyme enthalten, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Hierzu gehören insbesondere Proteasen, andere Amylasen, Lipasen, Hemicellulasen, Cellulasen oder Oxidoreduktasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10^–6 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret- Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden.
Unter den Proteasen sind solche vom Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase^® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase^®, beziehungsweise Savinase^® von der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP^® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 und PCT/EP02/11725 (noch nicht publiziert) beschrieben werden. Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und B. gibsonii gehen aus den noch nicht veröffentlichten Patentanmeldungen DE 10162727 , DE 10163883 , DE 10163884 und DE 10162728 hervor.
Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym^®, Relase^®, Everlase^®, Nafizym, Natalase^®, Kannase^® und Ovozymes^® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect^®, Purafect^®OxP und Properase^® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol^® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi^® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather^® und Protease P^® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbaie Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens oder aus B. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl^® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl^® und Termamyl^®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar^®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase^® erhältlich. Die α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN^® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α-Amylase aus B. stearothermophilus unter den Namen BSG^® und Novamyl^®, ebenfalls von der Firma Novozymes.
Desweiteren sind für diesen Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschriebene Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus B. agaradherens (DSM 9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar, die dem Sequenzraum von α-Amylasen angehören, der in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die in der noch nicht publizierten Anmeldung DE 10163748 A1 beschrieben werden. Ebenso sind Fusionsprodukte der genannten Moleküle einsetzbar, beispielsweise die aus der Anmeldung DE 10138753 A1 .
Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl^® von der Firma Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Ein weiteres Handelsprodukt ist beispielsweise die Amylase-LT^®.
Erfindungsgemäße Mittel können Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase^®, Lipolase^®Ultra, LipoPrime^®, Lipozyme^® und Lipex^® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE^®, Lipase P^®, Lipase B^®, beziehungsweise Lipase CES^®, Lipase AKG^®, Bacillis sp. Lipase^®, Lipase AP^®, Lipase M-AP^® und Lipase AML^® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen, beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase^® und Lipomax^® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30^®, Lipase OF^® und Lipase PL^® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast^® von der Firma Genencor.
Erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere wenn sie für die Behandlung von Textilien gedacht sind, Cellulasen enthalten, je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere Beiträge zur Primärwaschleistung, zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition) und Avivage (Gewebewirkung), bis hin zum Ausüben eines „stone washed"-Effekts.
Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen werden von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme^® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase^® und Carezyme^® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus N. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft^® und Renozyme^®. Letzteres basiert auf der Anmeldung WO 96/29397 A1. Leistungsverbesserte Cellulase-Varianten gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 98/12307 A1 hervor. Ebenso sind die in der Anmeldung WO 97/14804 A1 offenbarten Cellulasen einsetzbar; beispielsweise die darin offenbarte 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone^® und Biotouch^® erhältlich ist. Weitere Handelprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase^® und Ecopulp^®. Weitere geeignete Cellulasen aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93 werden in WO 96/34092 A2 offenbart, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax^® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind „Genencor detergent Cellulase L" und IndiAge^®Neutra.
Erfindungsgemäße Mittel können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen weitere Enzyme enthalten, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (= Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (= Xylanasen), Pullulanasen und β-Glucanasen. Geeignete Mannanasen sind beispielsweise unter den Namen Gamanase^® und Pektinex AR^® von der Firma Novozymes, unter dem Namen Rohapec^® B1L von der Firma AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase^® von der Firma Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich. Eine geeignete β-Glucanase aus einem B. alcalophilus geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 99/06573 A1 hervor. Die aus B. subtilis gewonnene β-Glucanase ist unter dem Namen Cereflo^® von der Firma Novozymes erhältlich.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite^® 1 und 2 der Firma Novozymes zu nennen. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluß zu gewährleisten (Mediatoren).
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, etwa durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder filamentöse Fungi.
Die Aufreinigung der betreffenden Enzyme erfolgt günstigerweise über an sich etablierte Verfahren, beispielsweise über Ausfällung, Sedimentation, Konzentrierung, Filtration der flüssigen Phasen, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Einwirken von Chemikalien, Desodorierung oder geeignete Kombinationen dieser Schritte.
Erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme in jeder nach dem Stand der Technik etablierten Form zugesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren versetzt.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem, vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so daß ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.
Ein in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenes Protein und/oder Enzym kann besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung der Proteine und/oder Enzyme ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt, insbesondere wenn auch die Mittel Proteasen enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Mittel enthalten zu diesem Zweck Stabilisatoren.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren. Häufig werden hierfür Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren sind hierfür geeignet.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C₁₂, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.
Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Auch Di-Glycerinphosphat schützt gegen Denaturierung durch physikalische Einflüsse. Ebenso werden Calcium- und/oder Magnesiumsalze eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat.
Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl-Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare C₈-C₁₈ Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise, diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfat und reduzierende Zucker.
Besonders bevorzugt werden Kombinatonen von Stabilisatoren eingesetzt, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird günstigerweise durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und noch weiter durch die zusätzliche Wirkung von zweiwertigen Kationen, wie zum Beispiel Calcium-Ionen.
Erfindungsgemäße Mittel sind in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß sie, beispielsweise um die enthaltenen Wirkstoffe zeitlich oder räumlich voneinander getrennt freizusetzen, aus mehr als einer Phase bestehen. Dabei kann es sich um Phasen in verschiedenen, insbesondere aber um Phasen in denselben Aggregatzuständen handeln.
Erfindungsgemäße Mittel, die aus mehr als einer festen Komponente zusammengesetzt sind, können auf einfache Weise dadurch hergestellt werden, daß verschiedene feste Komponenten, insbesondere Pulver, Granulate oder Extrudate mit verschiedenen Inhaltsstoffen und/oder unterschiedlichem Freisetzungsverhalten in insgesamt loser Form miteinander vermischt werden. Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel aus einer oder mehreren Phasen kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation erfolgen, wobei die Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein aus der europäischen Patentschrift EP 0 486 592 bekanntes, einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt. Eine weitere bevorzugte Herstellung mit Hilfe eines Granulationsverfahrens ist in der europäischen Patentschrift EP 0 642 576 beschrieben.
Proteine können für feste Mittel beispielsweise in getrockneter, granulierter, verkapselter oder verkapselter und zusätzlich getrockneter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 um.
Die verkapselte Form bietet sich an, um die Enzyme vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln, zu schützen oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen. Je nach der Größe dieser Kapseln wird nach Milli-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden, wobei Mikrokapseln für Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und DE 199 18 267 offenbart. Eine weitere mögliche Verkapselungs methode besteht darin, daß die für die Verwendung in Wasch- oder Reinigungsmitteln geeigneten Enzyme, ausgehend von einer Mischung der Enzymlösung mit einer Lösung oder Suspension von Stärke oder einem Stärkederivat, in Stärke, beziehungsweise dem Stärkederivat verkapselt werden. Ein solches Verkapselungsverfahren wird mit der deutschen Anmeldung DE 199 56 382 beschrieben.
Es können auch mindestens zwei feste Phasen miteinander verbunden vorliegen. So besteht eine Möglichkeit, ein festes erfindungsgemäßes Mittel zur Verfügung zu stellen, in dem Verpressen oder Kompaktieren zu Tabletten. Solche Tabletten können ein- oder mehrphasig sein. Damit bietet auch diese Darreichungsform die Möglichkeit, ein festes erfindungsgemäßes Mittel mit zwei festen Phasen vorzulegen. Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig sein können und/oder aus einer mehreren Schichten bestehen können, werden vorzugsweise alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN/cm², vorzugsweise bei 60 bis 70 kN/cm² verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN/cm², insbesondere bei 10 bis 15 kN/cm² durchgeführt. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn in mehrphasigen Mitteln wenigstens eine der Phasen ein Amylase-sensitives Material, insbesondere Stärke enthält oder von diesem zumindest teilweise umgeben oder beschichtet ist. Auf diese Weise wird diese Phase mechanisch stabilisiert und/oder gegen Einflüsse von außen geschützt und gleichzeitig über eine in der Waschflotte wirksame Amylase angegriffen, so daß die Freisetzung der Inhaltsstoffe erleichtert wird.
Ebenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie insgesamt flüssig, gelförmig oder pastös vorliegen. Die enthaltenen Proteine, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Protein, werden solchen Mitteln bevorzugt ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, beispielsweise in flüssiger Form, etwa als Lösung, Suspension oder Emulsion, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver zugesetzt. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel in Form von Lösungen in üblichen Lösungsmitteln werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind solche flüssigen, gelförmigen oder pastösen Mittel, denen ein erfindungswesentliches Protein und/oder eines der anderen enthaltenen Proteine und/oder einer der anderen enthaltenene Inhaltsstoffe verkapselt, vorzugsweise in Form von Mikrokapseln zugesetzt worden ist. Besonders bevorzugt sind darunter solche mit Kapseln aus amylasesensitivem Material. Solch eine gemeinsame Verwendung von Amylase-sensitiven Materialien und dem erfindungswesentlichen amylolytischen Enzym in einem Wasch- oder Reinigungsmittel kann Synergieeffekte zeigen, etwa dergestalt daß das stärkespaltende Enzym die Spaltung der Mikrokapseln unterstützt und somit den Freisetzungsprozeß der verkapselten Inhaltsstoffe steuert, so daß deren Freisetzung nicht während der Lagerung und/oder nicht zu Beginn des Reinigungsvorgangs, sondern erst zu einem bestimmten Zeitpunkt erfolgt. Auf diesem Mechanismus können komplexe Wasch- und Reinigungsmittelsysteme mit verschiedensten Inhaltsstoffen und verschiedensten Kapseltypen beruhen, die besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Ein vergleichbarer Effekt ist dann gegeben, wenn sich die Inhaltsstoffe des Wasch- oder Reinigungsmittels auf mindestens zwei unterschiedliche Phasen verteilen, beispielsweise zwei oder mehr feste, miteinander verbundene Phasen eines tablettenförmigen Wasch- oder Reinigungsmittels, oder verschiedene Granulate innerhalb desselben pulverförmigen Mittels. Zwei- oder Mehrphasenreiniger sind für die Anwendung sowohl in maschinellen Geschirrspülern als auch in Waschmitteln Stand der Technik. Die Aktivität eines amylolytischen Enzyms in einer früher aktivierten Phase ist Voraussetzung für die Aktivierung einer späteren Phase, wenn diese von einer Amylase-sensitiven Hülle oder Beschichtung umgeben ist oder das Amylase-sensitive Material einen integralen Bestandteil der festen Phase darstellt, bei dessen teilweiser oder vollständiger Hydrolyse die betreffende Phase desintegriert. Der Einsatz des erfindungswesentlichen Enzyms für diesen Zweck stellt somit eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Die Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln vermögen sich geeigneterweise gegenseitig in ihrer Leistung zu unterstützen. Die synergistische Verwendung von Amylase und Farbübertragungsinhibitoren zur Steigerung der Reinigungsleistung wird beispielsweise mit der Anmeldung WO 99/63035 offenbart. Es ist auch bekannt, daß Polymere, die gleichzeitig als Cobuilder eingesetzt werden können, wie beispielsweise Alkyl-Poly-Glykoside, die Aktivität und die Stabilität von enthaltenen Enzymen stabilisieren und steigern können, so aus der Anmeldung WO 98/45396. Somit ist es bevorzugt, wenn eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante durch einen der übrigen, oben aufgeführten Bestandteile modifiziert, insbesondere stabilisiert und/oder in seinem Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des Mittels gesteigert wird. Entsprechend abgestimmte Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel stellen somit besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Im Rahmen entsprechender Mittel können erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten zur Aktivierung der eigenen oder anderer Phasen dienen, wenn sie allein oder zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff in einem aus mehr als einer Phase bestehenden Wasch- oder Reinigungsmittel bereitgestellt werden. In entsprechender Weise können sie auch dazu dienen, Inhaltsstoffe aus Kapseln freizusetzen, wenn sie oder ein anderer Wirkstoff in einem Wasch- oder Reinigungsmittel in verkapselter Form bereitgestellt wird.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine oben beschriebene erfindungsgemäße α-Amylase-Variante aktiv wird.
Denn in dieser Ausführungsform wird die Erfindung dadurch realisiert, daß die erfindungsgemäß verbesserten enzymatischen Eigenschaften, insbesondere die Alkaliaktivität hinsichtlich einer Verbesserung prinzipiell jeden Reinigungsverfahrens ausgenutzt werden. Jedes Reinigungsverfahren wird um die betreffende Aktivität bereichert, wenn sie in wenigstens einem Verfahrensschritt zugesetzt wird. Derartige Verfahren werden beispielsweise mit Maschinen wie gängigen Haushaltsgeschirrspülmaschinen oder Haushaltswaschmaschinen verwirklicht. Bevorzugte Verfahren werden entsprechend den oben gemachten Angaben entsprechend bevorzugt.
Weiter bevorzugt sind derartige Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die α-Amylase-Variante über ein oben beschriebenes Mittel eingesetzt wird.
Besonders bevorzugt ist jedes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die α-Amylase in dem betreffenden Verfahrensschritt in einer Menge von 0,01 mg bis 400 mg pro entsprechendem Verfahrensschritt eingesetzt wird, vorzugsweise von 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt von 0,03 mg bis 100 mg.
Günstigenfalls ergeben sich dabei Konzentrationswerte von 0,0005 bis 20 mg pro 1, bevorzugt 0,005 bis 10 mg pro 1, besonders bevorzugt 0,005 bis 8 mg des amylolytischen Proteins pro 1 Waschflotte. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden.
Entsprechend den bisherigen Ausführungen wird die vorliegende Erfindung auch durch die Verwendung erfindungsgemäßer α-Amylase-Varianten realisiert. Denn auch hierbei kommen die günstigen Eigenschaften der betreffenden Enzym zur Wirkung. Diese gelten insbesondere für Reinigungszwecke.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt somit die Verwendung einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.
Dabei kann es als einzige wirksame Kompoente eingesetzt werden. Vorzugsweise geschieht dies zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff.
Bevorzugt ist somit eine derartige Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die α-Amylase-Variante über ein oben beschriebenes Mittel eingesetzt wird.
Günstigerweise ist eine solche Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß pro Anwendung, vorzugsweise pro Anwendung in einer Geschirrspülmaschine oder einer Waschmaschine 0,01 mg bis 400 mg der α-Amylase-Variante eingesetzt werden, bevorzugt 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt 0,03 mg bis 100 mg.
Denn hierdurch ergeben sich in der Waschflotte günstigerweise die oben angegebenen Konzentrationswerte. Diese Dosierung kann, je nach Reinigungsproblem vom Hersteller des Mittels oder vom Endverbraucher vorgenommen werden.
Eine weitere Ausführungsform stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zur Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung dar, insbesondere zum Entschlichten von Baumwolle.
Rohmaterialien und Zwischenprodukte der Textilherstellung, beispielsweise für solche auf Baumwollbasis, werden im Rahmen ihrer Herstellung und Weiterverarbeitung mit Stärke ausgerüstet, um eine bessere Verarbeitung zu ermöglichen. Dieses sowohl auf Garne, auf Zwischenprodukte, als auch auf Textilien angewendete Verfahren nennt man Schlichten (sizing). Zur Entfernung der Schlichte, also der stärkehaltigen Schutzschicht (Entschlichten, desizing) sind erfindungsgemäße amylolytische Proteine geeignet. Dies insbesondere dann, wenn alkalische Bedingungen herrschen oder wenn weitere Inhaltsstoffe wie beispielsweise Tenside anwesend sind.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Darstellung der B. amyloliquefaciens-Amylasemutanten durch Error-prone-Mutagenese
Ausgehend von einer Total-DNA-Präpartation von B. amyloliquefaciens, wie er unter der Nummer DSM 7 von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschenoder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) bezogen werden kann, wurde über PCR ein ca. 1700 by großes Fragment erhalten, welches das 1545 by umfassende Gen für die α-Amylase enthielt. Dieses Fragment wurde nach Restriktion mit BamHI und SpeI in den Expressionsvektor pCYTEX P1 ligiert, der zuvor mit denselben Enzymen geschnitten worden war, wodurch der in 3 dargestellte Vektor pCYTBAA erhalten wurde. Anschließend wurde über standargemäß durchgeführte ortsgerichtete Mutagenese vor das Start-Codon des BAA-Gens eine NdeI-Restriktionsschnittstelle eingeführt. Nun wurde das durch Restriktion mit NdeI und PstI erhaltene BAA-Fragment in die NdeI/PstI-Stelle des Vektors pG-PFE ligiert, wodurch der in 4 dargestellte Vektor pGBAA-WT erhalten wurde. Prinzipiell hätte analog auch jeder andere Klonieungsvektor für die Insertion des α-Amylase-Gens verwendet werden können. Über Sequenzierung wurde abschließend (1.) verifiziert, daß die Orientierung des Inserts wie in 4 dargestellt, d.h. richtig gegenüber zu dem zur Expression vorgesehenen Promotor war, und (2.) das Gen noch die vollständig korrekte Wildtypsequenz aufwies, wie sie in SEQ ID NO. 3 darsgestellt ist.
Eine Präparation dieses Vektors pGBAA-WT wurde nun entsprechend der Beschreibung von H. Zhao et al. (1999) „Methods for Optimizing Industrial Enzymes by Directed Evolution" in Industrial Microbiology and Biotechnology; Hrsg. Demain, A. L. et al., Washington D. C., ASM Press, Seiten 597–604 einer Error-prone-PCR unterworfen. Dabei wird über ein unausgeglichenes Nukleotid-Verhältnisse und durch die Gegenwart von Manganchlorid die Fehlerrate der DNA-Polymerase erhöht. Im einzelnen wurden für einen 100 μl-Ansatz folgende Substanzen zusammengegeben: 10 μl 10 × Mutagenesepuffer (70 mmol/l MgCl₂, 500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris-HCl-Puffer (pH 8), 0,1 Gew.-% Gelatine), 10 μl dNTP-Mix (je 2 mmol/l dGTP und dATP, je 10 mmol/l dCTP und dTTP), 50 pmol jedes Primers (SEQ ID NO. 1 und 2), 5–15 ng Template-DNA, eine entsprechende Menge ddH₂O und 3 μl MnCl₂ (5 mmol/l). Anschließend wurden 5 U kommerziell erhältlicher Taq-Polymerase (Fa. QIAGEN, Hilden, Deutschland) zugegeben und der Ansatz folgendem Temperaturprogramm unterzogen: 60 s Denaturierung bei 95°C, 25 Zyklen mit je (a) 30 s bei 95 °C, (b) 30 s bei 50°C und (c) 45 s bei 72°C und abschließend 120 s bei 72°C.
Das PCR-Produkt wurde nach beendeter Reaktion aufgereinigt und in geeignete Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren kloniert. In diesem Fall wurde zur Reinigung das Qlaquick^®PCR-Purification Kit (Fa. QIAGEN, Hilden) gewählt, und das PCR-Produkt nach Restriktion mit den Enzymen NdeI und PstI in die NdeI-PstI-Restriktionsschnittstelle des Vektors pGASTON (E. Henke, Doktorarbeit, Institut für technische Biochemie, Universität Stuttgart) kloniert.
Zur Expression der erhaltenen BAA-Varianten wurden zunächst kompetente Zellen von E. coli XL1-blue (erhältlich von der Fa. Stratagene, LaJolla, USA) mit dem Vektor pJL3 (Fa. MoBi-Tech, Göttingen, Deutschland) transformiert, um über das Bacteriocin release protein (BRP) die später in den Überstand abgegebene Enzymausbeute zu erhöhen. Anschließend wurden sie mit den betreffenden pGASTON-Plasmiden transformiert und auf Mikrotiterplatten vereinzelt.
Beispiel 2
Screening der B. amyloliquefaciens-α-Amylasemutanten nach verbesserter Alkaliaktivität des abgeleiteten Enzyms
Zubereitung der Enzymlösung
Die die Amylase exprimierenden Zellen wurden aufgeschlossen, indem die ganzen Mikrotiterplatten zweimal in flüssigem Stickstoff (–196°C) eingefroren und für 45 min bei 37°C aufgetaut wurden. Das Zellpellet wurde durch Zentrifugation (1000 g, 15 min, 25°C) der Mikrotiterplatten von dem Überstand getrennt und dieser enzymhaltige Überstand direkt für den Aktivitätstest eingesetzt.
Durchführung des Aktivitätstests
Für eine Testdurchführung bei pH 7 (Standard) werden in einem 50 ml Falcon-Tube zu 30 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) 4 Phadebas^®-Tabletten (quervernetzte Stärke mit kovalent daran gebundenem Farbstoff; erhältlich von der Fa. Pharmacia & Upjohn GmbH, Diagnostics, Freiburg; Best.-Nr. 10-5380-32) gegeben und suspendiert. Für eine Durchführung bei pH 10 werden 4 Phadebas^®-Tabletten wie oben beschrieben suspendiert, in einer Glasfritte (Porengröße 1 oder 2) von der flüssigen Phase getrennt und zweimal mit je 10 ml ddH₂O gewaschen. Das Retentat wird in 30 ml eines 0,1 M Glycin/NaON-Puffers (pH 10) mit 0,25 mmol/l CaCl₂ resuspendiert.
150 μl der für die jeweiligen pH-Werte erhaltenen Suspensionen wurden nach gutem Aufschlämmen in jedes Well einer MAR5 N50^®-Filtermikrotiterplatte (Fa. Millipore, Schwalbach) pipettiert. Diese wurden mit 50–75 μl enzymhaltiger Lösung versetzt, gemischt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die flüssigen Phasen wurden durch Zentrifugation aus der Filtermikrotiterplatte (15 min, 1000 g, 25°C) in eine darunterliegende zweite Mikrotiterplatte überführt und die Absorption der auf diese Weise erhaltenen flüssigen Phasen bei einer Wellenlänge von 620 nm gemessen.
Auf diese Weise wurden drei Mutanten des α-Amylase-Gens identifiziert: die Stämme A42, A29 und B1.
Beispiel 3
Anzucht der Stämme, Gewinnung des zugehörigen Gens und dessen Sequenzierung.
Die auf diese Weise identifizierten Stämme wurden nach Routine-Methoden unter Antibiotikum-Selektion in Kultur genommen, die betreffenden pGASTON-Mutanten-Plasmide isoliert und über Sequenzierung die Abweichungen gegenüber der Ausgangs-DNA ermittelt.
Die hierdurch erhaltenen DNA- und Aminosäuresequenzen der α-Amylasen BAA A42, BAA A29 und BAA B1 sind im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 5 und 6, SEQ ID NO. 7 und 8, beziehungsweise unter SEQ ID NO. 9 und 10 angegeben. Die zugehörigen Aminosäuresequenzen sind außerdem im Alignment der 2 der Wildtypsequenz gegenübergestellt.
Diese Varianten unterscheiden sich vom Wildtyp der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens durch Austausche in einzelnen Positionen von 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 und 474 in der Zählung nach SEQ ID NO. 4. Konkret wurden folgende Austausche ermittelt: L13P, V32A, W194R, S197P, 1203L, A230V, N297D, E356D, K406R, N414S und K474Q.
Im Detail verfügt BAA A42 über die Austausche L13P, W194R, S197P, E356D und N414S, BAA A29 über die Austausche L13P, V32A, A230V, N297S, K406R und N414S, und BAA B1 über die Austausche L13P, V32A, 1203L, A230V, N297S, K406R, N414S und K474Q. Sie können daher statt als α-Amylasen BAA A42, A29 und B1 auch als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase L13P/W194R/S197P/E356D/N414S, als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase L13P/V32A/A230V/N297S/K406R/N414S, beziehungsweise als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase L13P/V32A/1203L/A230V/N297S/K406R/N414S/K474Q bezeichnet werden.
Bemerkenswert ist, daß die Austausche in den Positionen 13 und 414 (L13P und N414S) in allen drei α-Amylase-Varianten vorkommen. A42 verfügt über drei zusätzliche Austausche in den Positionen 194, 197 und 356 (W194R, S197P und E356D). A29 weist vier zusätzliche Austausche zu denen in den Positionen 13 und 414 auf, nämlich in den Positionen 32, 230, 297 und 406 (V32A, A230V, N297S und K406R). Gegenüber A29 verfügt B1 zusätzlich über zwei weitere Aminosäure-Substitutionen, nämlich in den Positionen 203 und 474, konkret über die Variationen I203L und K474Q.
Beispiel 4
Reinigung und Charakterisierung der jeweiligen B. amyloliquefaciens-Amylasevariante
Reinigung der α-Amylase
Die diese drei α-Amylasen produzierenden Stämme wurden nach Standardmethoden in Flüssigkultur genommen und die transgen gebildete α-Amylase-isoliert. Die Reinigung der α-Amylase erfolgte nach einem Protokoll von Candussio, A., et al. (1990): „Biochemical and genetic analysis of a maltopentaose-producing amylase from alkaliphilic Grampositive bacterium", Eur. J. Biochem., Band 191, Seiten 177–185.
Proteingehalts- und Aktivitätsbestimmung
Die die Aufreinigung begleitenden Proteingehaltbestimmungen erfolgten mit dem Micro-BCA Protein Assay Kit der Fa. Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA (Best.-Nr. 23235) und BSA als Standard nach Angaben des Herstellers. Die Amylase-Aktivitäten wurden wie in Beispiel 2 angegeben bestimmt. dabei wurden durchschnittliche Aktivitätsausbeuten von 5 bis 10% erzielt.
Beispiel 5
Aktivitätsbestimmung
1 Unit an Amylaseaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die pro 1 Minute 1 umol glucosidische Bindungen bei 37°C hydrolysiert.
Phadebas^®-Test
Eine Phadebas^®-Tablette wird in 10 ml ddH₂O suspendiert. Davon werden je Messung 500 μl-Aliquots mit 50 μl entsprechend verdünnter Probe (Aktivitätskonzentration < 1000 U/l) versetzt. Nach 15 min Inkubation bei 37°C, wobei über die in der Tablette enthaltenen Puffersubstanzen ein pH-Wert von 6,5 herrscht, wird die Reaktion durch die Zugabe von 150 μl 0,5 M NaOH abgestopt. Zur Bestimmung des Blindwerts werden 500 μl Phadebas-Suspension für 15 min bei 37°C inkubiert und nach der sofortigen Zugabe von 150 μl 0,5 M NaOH mit 50 μl Probe versetzt. Nach Zentrifugation für 2 min bei 14.000 Upm (Centrifuge 5417C der Fa. Eppendorf, Hamburg) werden 500 μl des Überstands in einer Küvette 1:2 mit ddH₂O verdünnt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 620 nm gegen den entsprechend erhaltenen Blindwert gemessen. Die Aktivität kann aus einer vorher mit einer Amylasepräparation bekannter Aktivität erstellten Kalibrierkurve abgelesen werden.
Auf diese Weise wurden die in Tabelle 1 angegebenen spezifischen Aktivitäten ermittelt, die für jedes Enzym eine charakteristische Größe darstellen. Tabelle 3: Spezifische Aktivitäten von erfindungsgemäßen B. amyloliquefaciens-Amylase-Varianten unter den Bedingugen des Phadebas^®-Tests
Beispiel 6
pH-Aktivitätsprofile
Zur Aufnahme eines pH-Aktivitätsprofils werden 8 Phadebas^®-Tabletten in 40 ml ddH₂O suspendiert. Das feste Substrat wird durch Filtration über eine Glasfritte (Porengröße 0 oder 1) abgetrennt und in 40 ml ddH₂O aufgenommen. Je 5 ml der gut aufgeschlämmten Substratsuspension werden mit 5 ml des 0,1 M Puffers mit entsprechendem pH versetzt. Hierbei werden für Messungen im pH-Bereich von 4 bis 6 Acetatpuffer, für den Bereich 7 bis 8 Tris/HCl-Puffer, für pH 9 und pH 10 Glycin/NaOH-Puffer und für die Messungen bei pH 11 Carbonatpuffer verwendet. Für jeden pH-Wert wird eine Dreifachbestimmung analog zu dem Protokoll für den Phadebas^®-Schnelltest durchgeführt. Zudem werden die Blindwerte bei pH 6 und pH 10 ebenfalls dreifach bestimmt.
Die erhaltenen Werte stellen ebenfalls enzymspezifische Eigenschaften dar. Tabelle 4: pH-Optima und relative Aktivität bei pH 10 der Varianten A42, A29 und B1 im Vergleich zur Wildytp-BAA
Hier zeigt sich, daß insbesondere die Variante BAA 42 gegenüber dem Ausgangsmolekül, aber auch gegenüber den anderen Varianten eine deutlich verbesserte Alkaliaktivität aufweist. Dies kann nur auf einen oder beide Austausche in den Positionen 203 und/oder 474, konkret 1203L und K474Q zurückzuführen sein.
Beschreibung der Figuren
1: Alignment der α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens mit den wichtigsten anderen α-Amylasen aus dem Stand der Technik.
Darin bedeuten:
BAA α-Amylase aus B. amyloliquefaciens
BLA α-Amylase aus B. licheniformis
LAMY α-Amylase aus Bacillus sp. KSM-AP1378
S707 α-Amylase aus Bacillus sp. #707
BStA α-Amylase aus B. stearothermophilus
TS-23 α-Amylase aus Bacillus sp. TS-23
Der Beginn der maturen Proteine liegt in der Zählung dieses Alignments einheitlich bei Position 41 beziehungsweise 43.
2: Alignment der Wildtyp-α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (BAA) mit den erfindungsgemäß besonders bevorzugten α-Amylasen.
Darin bedeuten:
BAA α-Amylase aus B. amyloliquefaciens, Wildtypenzym
BAA_42 α-Amylase aus B. amyloliquefaciens, Variante A42
BAA_A29 α-Amylase aus B. amyloliquefaciens, Variante A29
BAA_B1 α-Amylase aus B. amyloliquefaciens, Variante B1
3: Der Klonierungsvektor pCYTBAA
Wie in Beispiel 1 dargestellt wurde das Wildtypgen der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) vor der Überführung in einen Expressionsvektor zwischenkloniert, um eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle einzuführen.
4: Der Expressionsvektor pGBAA-WT
Wie in Beispiel 1 dargestellt wurde das Wildtypgen der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) nach der Zwischenklonierung auf diesen Expressionsvektor überführt und dieser einer Error-prone-PCR unterworfen, wodurch die erfindungsgemäßen BAA-Varianten erhalten wurden.

Claims

α-Amylase-Variante mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 13 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) ein Prolinrest (P) und in Position 414 ein Serinrest (S) vorliegt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 194, 197 oder 356 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in zwei, besonders bevorzugt in allen drei dieser Positionen.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 194 ein Arginin- (R) und/oder in Position 197 ein Prolin- (P) und/oder in Position 356 ein Asparaginsäurerest (D) vorliegt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/194R/197P/356D/414S handelt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 32, 230, 297 oder 406 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in zwei, besonders bevorzugt in drei, ganz besonders bevorzugt in allen vier dieser Positionen.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 32 ein Alanin- (A) und/oder in Position 230 ein Valin- (V) und/oder in Position 297 ein Asparaginsäure- (D) und/oder in Position 406 ein Argininrest vorliegt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/32A/230V/297D/406R/414S handelt.
α-Amylase-Variante mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, dadurch gekennzeichnet, daß ein Austausch in Position 203 und ein Austausch in Position 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.
α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 203 oder 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in beiden Positionen.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/32A/203L/230V/297D/406R/414S/474Q handelt.
α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Ausgangsmolekül von einer α-Amylase ableitet, die ursprünglich aus einer Bacillus-Spezies stammt, vorzugsweise aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt aus B. amyloliquefaciens, B. agaradherens (DSM 9948) oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), ganz besonders aus B. amyloliquefaciens.
α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Ausgangsmolekül um eine Hybrid-α-Amylase handelt, vorzugsweise basierend auf mindestens einer der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt basierend auf mindestens zwei der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368).
α-Amylase-Variante nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Hybrid-α-Amylase um eine handelt, deren Teilsequenzen von den α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens und aus B. licheniformis abgeleitet sind.
α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Variante der α-Amylase von B. amyloliquefaciens mit einer der Aminosäureaustausch-Kombinationen L13P/W194R/S197P/E356D/N414S, L13P/V32A/A230V/N297D/K406R/N414S beziehungsweise L13P/V32A/1203L/A230V/N297D/K406R/N414S/K474Q handelt, vorzugsweise mit der Aminosäureaustausch-Kombination L13P/V1I194R/S197P/E356D/N414S.
α-Amylase-Variante nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6), aus B. amyloliquefaciens A29 (SEQ ID NO. 8) oder aus B. amyloliquefaciens B1 (SEQ ID NO. 10) handelt, vorzugsweise um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6).
Nukleinsäure, die für eine der α-Amylase-Varianten nach einem der Ansprüche 1 bis 17 codiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 3 ableitet.
Nukleinsäure nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 ableitet, vorzugsweise eine dieser Sequenzen selbst.
Vektor, der einen Bereich mit einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 20 enthält.
Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Klonierungsvektor ist.
Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.
Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in den Ansprüchen 18 bis 20 bezeichneten Nukleinsäuren enthält, vorzugsweise auf einem Vektor nach einem der Ansprüche 21 bis 23.
Zelle nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in Ansprüchen 1 bis 17 bezeichneten α-Amylase-Varianten bildet oder zu deren Bildung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 20, besonders bevorzugt unter Einsatz eines Expressionsvektors nach Anspruch 23.
Zelle nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein Bakterium handelt, insbesondere eines, das die gebildete α-Amylase-Variante ins umgebende Medium sekretiert.
Zelle nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein gramnegatives Bakterium handelt, vorzugsweise der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von E. coli K12, von E. coli B oder K. planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme E. coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5a, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder K. planticola (Rf).
Zelle nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um grampositive Bakterien handelt, insbesondere der Gattungen Staphylococcus, Connebakterium oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Connebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. alcalophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. agaradherens, B. globigii oder B. lentus.
Verfahren zur Herstellung einer α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 17, vorzugsweise unter Verwendung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 18 bis 20, besonders bevorzugt unter Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 21 bis 23, ganz besonders bevorzugt unter Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 24 bis 28.
Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 17 enthält.
Mittel nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es 0,000001 Gewichts-Prozent bis 5 Gew.-%, insbesondere 0,00001 bis 3 Gew.-% der α-Amylase-Variante enthält.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich andere Enzyme enthält, insbesondere hydrolytische Enzyme oder Oxidoreduktasen, besonders bevorzugt weitere Amylasen, Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Hemicellulasen, Cellulasen, β-Glucanasen, Oxidasen, Peroxidasen, Laccasen.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amylase-Variante durch einen der sonstigen Bestandteile des Mittels stabilisiert und/oder in ihrem Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des Mittels gesteigert wird.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt fest ist, vorzugsweise nach einem Kompaktierungsschritt für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt, daß es insgesamt kompaktiert ist.
Wasch- oder Reinigungsmittel nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt flüssig, gelförmig oder pastös ist, vorzugsweise unter Verkapselung für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt unter Verkapselung mindestens eines der enthaltenen Enzyme, ganz besonders bevorzugt unter Verkapselung der α-Amylase-Variante.
Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 17 aktiv wird.
Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amylase-Variante über ein Mittel nach einem der Ansprüche 31 bis 36 eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß die a-Amylase in dem betreffenden Verfahrensschritt in einer Menge von 0,01 mg bis 400 mg pro entsprechendem Verfahrensschritt eingesetzt wird, vorzugsweise von 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt von 0,03 mg bis 100 mg.
Verwendung einer α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen.
Verwendung nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amylase-Variante über ein Mittel nach einem der Ansprüche 31 bis 36 eingesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß pro Anwendung, vorzugsweise pro Anwendung in einer Geschirrspülmaschine oder einer Waschmaschine 0,01 mg bis 400 mg der α-Amylase-Variante eingesetzt werden, bevorzugt 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt 0,03 mg bis 100 mg.
Verwendung einer α-Amylase-Variante nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entschlichten von Baumwolle.