DE10309803A1 - New alpha-amylase variants, useful in cleaning and washing compositions and for desizing cotton, have improved activity in alkaline media, also nucleic acid that encodes them - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft α-Amylase-Varianten mit einer verbesserten Aktivität im alkalischen Medium sowie diverse technische Einsatzgebiete für diese α-Amylase-Varianten, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel mit diesen α-Amylase-Varianten.The present invention relates to α-amylase variants with an improved activity in an alkaline medium and various technical fields of application for these α-amylase variants, in particular Detergents and cleaning agents with these α-amylase variants.
α-Amylasen (E.C. 3.2.1.1) hydrolysieren interne α-1,4-glycosidische Bindungen von Stärke und stärkeähnlichen Polymeren unter Bildung von Dextrinen und β-1,6-verzweigten Oligosacchariden. Aufgrund dieser stärkespaltenden Aktivität werden α-Amylasen für zahlreiche technische Anwendungen eingesetzt, darunter als aktive Komponente in Wasch- und Reinigungsmitteln. Weil Wasch- und Reinigungsmittel überwiegend alkalische pH-Werte aufweisen, werden hierfür insbesondere α-Amylasen benötigt, die im alkalischen Medium aktiv sind. Die meisten technisch bedeutenden α-Amylasen werden von Mikroorganismen, d.h. Pilzen oder Bakterien, vor allem denen der Gattungen Aspergillus und Bacillus produziert und sekretiert. Ausgehend von diesen mikrobiologischen Quellen können sie über zumeist (gen-)technisch entsprechend angepaßte Verfahren in industriellem Maßstab gewonnen werden.α-amylases (E.C. 3.2.1.1) hydrolyze internal α-1,4-glycosidic bonds of strength and starch-like Polymers to form dextrins and β-1,6-branched oligosaccharides. by virtue of this divisive starch activity become α-amylases for numerous technical applications, including as an active component in detergents and cleaning agents. Because detergents and cleaning agents are predominant have alkaline pH values, especially α-amylases needed that are active in the alkaline medium. Most of the technically important α-amylases are from Microorganisms, i.e. Fungi or bacteria, especially those of the Genera Aspergillus and Bacillus produced and secreted. outgoing from these microbiological sources, they can mostly be (genetically) technical adjusted accordingly Industrial scale processes be won.
Zur Ermittlung geeigneter α-Amylasen für die jeweiligen Gebiete findet nach wie vor eine intensive Suche nach neuen α-Amylasen aus natürlichen Quellen statt. Viele solcher Enzyme sind im Stand der Technik bereits beschrieben; ihre Zahl nimmt weiterhin zu. Für den Einsatz bei alkalischen pH-Werten sind insbesondere die alkalischen α-Amylasen von Bedeutung, die natürlicherweise von Spezies der Gattung Bacillus gebildet werden. Technisch besonders wichtig sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens und aus B. stearothermophilus. Sie werden in der vorliegenden Anmeldung als BLA, BAA beziehungsweise BStA bezeichnet. Das Wildtyp-Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®ST erhältlich. Die Wildtyp-α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben und die Wildtyp α-Amylase aus B. stearothermophilus unter den Namen BSG®, ebenfalls von der Firma Novozymes.To determine suitable α-amylases for the respective areas, an intensive search for new α-amylases from natural sources continues to take place. Many such enzymes have already been described in the prior art; their number continues to increase. The alkaline α-amylases, which are naturally formed by species of the genus Bacillus, are of particular importance for use at alkaline pH values. The α-amylases from Bacillus licheniformis, from B. amyloliquefaciens and from B. stearothermophilus are of particular technical importance. In the present application they are referred to as BLA, BAA or BStA. The wild-type B. licheniformis enzyme is available from Novozymes under the name Termamyl ® and from Genencor under the name Purastar® ® ST. The wild-type α-amylase from B. amyloliquefaciens is marketed by Novozymes under the name BAN ® and the wild-type α-amylase from B. stearothermophilus under the names BSG ®, likewise from Novozymes.
Eine weitere für den Einsatz in alkalischen
Medien geeignete α-Amylase
(in der vorliegenden Anmeldung als LAMY bezeichnet) wird von der
Fa. Kao in den Anmeldungen WO 94/26881 A1 (
Weitere Beispiele für besonders in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbare amylolytische Enzyme sind die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; hier als A 7-7 bezeichnet), publiziert in WO 02/10356 A2, und das Enzym aus B. agaradherens (DSM 9948), das gleichzeitig als α-Amylase und als Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) angesehen werden kann und in WO 02/44350 A2 publiziert worden ist. Weitere α-Amylasen sind die, die dem in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definierten Sequenzraum angehören.More examples of special amylolytic enzymes that can be used in detergents and cleaning agents the α-amylase from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368; referred to here as A 7-7) in WO 02/10356 A2, and the enzyme from B. agaradherens (DSM 9948), that at the same time as α-amylase and be viewed as cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) can and has been published in WO 02/44350 A2. Other α-amylases are those in the sequence space defined in the application WO 03/002711 A2 belong.
Aus der Anmeldung WO 00/60060 A2 von der Fa. Novozymes gehen die zwei α-Amylasen AA560 (aus Bacillus sp. DSM 12649) und AA349 (aus Bacillus sp. DSM 12648) hervor, die beide ein alkalisches pH-Optimum aufweisen. Zwei weitere Termamyl-ähnliche α-Amylasen mit den Bezeichnungen SP690 und SP722 sowie Varianten dieser Enzyme werden beispielsweise mit der Anmeldung WO 99/23211 A1 offenbart. Sie stimmen hinsichtlich der Zählung der Aminosäure-Positionen mit AA560 und AA349 überein.From the application WO 00/60060 A2 The two α-amylases AA560 (from Bacillus sp. DSM 12649) and AA349 (from Bacillus sp. DSM 12648), both have an alkaline pH optimum. Two other termamyl-like α-amylases with the designations SP690 and SP722 and variants of these enzymes are disclosed for example with the application WO 99/23211 A1. You agree on the count of the amino acid positions with AA560 and AA349.
Eine weitere Bacillus-Amylase wird von Lin et al. in der Publikation „Production and property of a raw-starch-degrading Amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23" (1998), in Biotechnol. AppL. Biochem., Band 28(1), Seiten 61 bis 68, beschrieben. Sie wird hier als TS-23 bezeichnet. Die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen sind beispielsweise in der Datenbank Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Genf, Schweiz; http://www.genebio.com/sprot.html) unter der Nummer Q59222 und in GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) unter der Nummer U22045 hinterlegt.Another Bacillus amylase is by Lin et al. in the publication “Production and property of a raw-starch-degrading amylase from the thermophilic and alkaliphilic Bacillus sp. TS-23 "(1998), in Biotechnol. Appl. Biochem., Vol. 28 (1), pages 61 to 68. It is referred to here as TS-23. The associated DNA and amino acid sequences are, for example, in the Swiss-Prot (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Geneva, Switzerland; http://www.genebio.com/sprot.html) under number Q59222 and in GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) filed under number U22045.
Ein Vergleich der Sequenzen dieser
Enzyme erfordert ein Alignment, in welchem die jeweils einander entsprechenden
Aminosäuren übereinander
zu liegen kommen. Die die vorliegende Erfindung betreffenden, später eingehend
diskutierten Aminosäurepositionen
können
mit diesen wichtigsten Enzymen über
folgende, aus dem Alignment der
Tabelle 1: Zuordnung der Aminosäureaustausche der vorliegenden Anmeldung in der Zählung nach SEQ ID NO. 4 zu den homologen Positionen der wichtigsten im Stand der Technik beschriebenen α-Amylasen.Table 1: Allocation of amino acid exchanges of the present application in the count according to SEQ ID NO. 4 to the homologous positions of the most important α-amylases described in the prior art.
Die Aminosäuren sind im international geräuchlichen Einbuchstabencode angegeben; Abkürzungen der Enzyme wie im Text; k.A. steht für: keine Angabe.The amino acids are international geräuchlichen Single letter code specified; Abbreviations of the Enzymes as in the text; K. A. stands for: no information.
Die natürlicherweise vorkommenden α-Amylase-Moleküle sind auf vielfache Weise, insbesondere über molekularbiologische Modifikationen weiterentwickelt worden, um sie in Hinblick auf spezifische Anwendungen hin zu optimieren. Solche Optimierungen betreffen beispielsweise die Substratspezifitäten, die Stabilität des Enzyms unter verschiedenen Bedingungen oder die enzymatische Aktivität selbst.The naturally occurring α-amylase molecules are in many ways, especially through molecular biological modifications have been developed to meet specific applications to optimize. Such optimizations concern, for example the substrate specificities, the stability of the enzyme under different conditions or the enzymatic activity self.
Als eine molekularbiologisch wichtige
Art der Modifikation kann die Genfusion oder Herstellung von Fusionsproteinen
(Hybriden) betrachtet werden. So wird beispielsweise in der Anmeldung
WO 99/57250 A1 offenbart, daß Waschmittelenzyme
durch Kopplung an Cellulose-Bindungsdomänen (CBD) in ihren Beiträgen zur
Waschleistung gesteigert werden können. In der Patentanmeldung
WO 99/43793 A1 werden Sequenzähnlichkeiten
zwischen Novamyl® (siehe unten) und bekannten
Cyclodextringlucanotransferasen (CGTasen) ausgenutzt, um Hybride
beider Enzyme zu erzeugen. Der Einsatz von Hybriden der α-Amylasen
aus B. amyloliquefaciens und B. licheniformis geht aus der Anmeldung
Ein jedoch nach wie vor wichtiges Prinzip, solche Weiterentwicklungen vorzunehmen, besteht in der Durchführung von Punktmutationen, d.h. Deletionen, Insertionen und vor allem Substitutionen einzelner Aminosäuren. Beispielsweise das zufallsgemäße Mutagenese-Verfahren der Anmeldung WO 99/20768 A1 führt zu α-Amylase-Varianten, die in Gegenwart von Reinigungsmittelbestandteilen besonders stabil sind. Für praktisch alle technisch wichtigen Wildtypenzyme (siehe oben) sind inzwischen zahlreiche durch Punktmutationen verbesserte Varianten beschrieben worden, wobei diese Variationen in der Regel nicht auf die betreffenden Enzyme beschränkt sind sondern für verwandte Moleküle ähnliche Leistungsverbesserungen bewirken.However, this is still an important one The principle of making such further developments is the implementation of Point mutations, i.e. Deletions, insertions and above all substitutions single amino acids. For example, the random mutagenesis process the application WO 99/20768 A1 leads to α-amylase variants, which are particularly stable in the presence of detergent ingredients are. For practically all technically important wild-type enzymes (see above) are meanwhile numerous variants improved by point mutations have been described, these variations usually not the enzymes in question are restricted are for related molecules similar Achieve performance improvements.
Beispielsweise die Anmeldung WO 94/02597 A1 lehrt, Methionin-Reste durch Substitution gegen andere Aminosäuren zu ersetzen und dadurch die Oxidationsempfindlichkeit zu senken und die Aktivität bei höheren Temperaturen zu verbessern. Dies wird anhand von Varianten der α-Amylase aus B.licheniformis illustriert. Weitere Verbesserungen an diesem Termamyl®-Molekül gehen beispielsweise aus WO 95/26397 A1 hervor. Derartige Optimierungsprodukte der α-Amylase aus B. licheniformis sind unter dem Handelsnamen Duramyl® von der Fa. Novozymes erhältlich (SÖFW-Journal, 123, (1997), S. 723–731). Ein weiteres Optimierungsprodukt ist Termamyl®ultra mit geringerer Calcium-Bindung.For example, the application WO 94/02597 A1 teaches to replace methionine residues by substitution with other amino acids and thereby to reduce the sensitivity to oxidation and to improve the activity at higher temperatures. This is illustrated using variants of the α-amylase from B.licheniformis. Further improvements to this Termamyl ® molecule go for example from WO 95/26397 A1 forth. Such optimization products of the α-amylase from B. licheniformis are available under the trade name Duramyl ® by the company. Novozymes (SOFW-Journal, 123, (1997), pp 723-731). Another optimization product is Termamyl ® ultra with less calcium binding.
Die α-Amylasen der Anmeldung WO 97/43424 A1 zeigen über Punktmutationen der Calcium-bindenden Aminosäuren ein geändertes Calciumionen-Bindungsverhalten und damit geänderte enzymatische Eigenschaften. Diese Erkenntnis ist ausgehend von der 3D-Struktur der α-Amylase von B. licheniformis gewonnen worden, sei aber auch auf andere α-Amylasen anwendbar. Auch die Anmeldung WO 96/23874 A1 beruht auf Erkenntnissen aus der 3D-Struktur, und zwar verschiedener Moleküle, darunter auch Hybridamylasen, und schlägt zahlreiche Positionen vor, an denen α-Amylasen, insbesondere die „klassischen" Moleküle BLA, BStA beziehungsweise BAA verändert werden können, um deren enzymatische Eigenschaften zu verändern.The α-amylases of application WO 97/43424 A1 show about Point mutations in the calcium-binding amino acids change the calcium ion binding behavior and thus changed enzymatic properties. This knowledge is based on the 3D structure of α-amylase was obtained from B. licheniformis, but was also on other α-amylases applicable. The application WO 96/23874 A1 is also based on knowledge from the 3D structure of different molecules, including also hybrid amylases, and strikes numerous positions at which α-amylases, especially the "classic" molecules BLA, BStA or BAA changed can be to change their enzymatic properties.
Beispielsweise aus der Anmeldung WO 96/23873 A1 gehen Varianten von α-Amylasen aus verschiedenen Bacilli, darunter B. stearothermophilus, Bacillus sp. #707 und den bereits verbesserten Molekülen gemäß WO 95/26397 A1 hervor, die höhere Oxidationsstabilität, höhere thermische Stabilität und/oder geringere Calcium-Abhängigkeit aufweisen. Die Amylasen der Anmeldung WO 99/02702 A1 mit zusätzlichen Disulfid-Brücken sind bei höheren Temperaturen stabiler als das Ausgangsmolekül. Die Enzyme der Anmeldung WO 99/23211 A1 sind bei hohen pH-Werten und/oder in Gegenwart von Calcium-Ionen stabiler und/oder bei höheren Temperaturen aktiver. Abgeleitete Varianten, insbesondere von der α-Amylase aus B. stearothermophilus gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 02/02726 A1 für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln hervor. Das entsprechende Handelsprodukt der Firma Novozymes trägt den Namen Novamyl®.For example, from application WO 96/23873 A1 variants of α-amylases from various Bacilli, including B. stearothermophilus, Bacillus sp. # 707 and the already improved molecules according to WO 95/26397 A1, which have higher oxidation stability, higher thermal stability and / or less calcium dependence. The amylases of application WO 99/02702 A1 with additional disul fid bridges are more stable than the parent molecule at higher temperatures. The enzymes of application WO 99/23211 A1 are more stable at high pH values and / or in the presence of calcium ions and / or more active at higher temperatures. Derived variants, in particular of the α-amylase from B. stearothermophilus, can be found, for example, in application WO 02/02726 A1 for use in detergents and cleaning agents. The corresponding commercial product from Novozymes bears the name Novamyl ® .
Varianten des Enzyms LAMY (aus Bacillus
sp. KSM-AP1378) offenbart die Anmeldung
Aus der Anmeldung WO 00/60060 A2 von der Fa. Novozymes, die die α-Amylasen AA560 und AA349 offenbart, gehen auch durch Punktmutation erhältliche Varianten dieser Enzyme hervor.From the application WO 00/60060 A2 from Novozymes, which the α-amylases AA560 and AA349 disclosed are also available through point mutation Variants of these enzymes.
Wie die Wildtypenzyme können auch Hybridamylasen zusätzlich durch Punktmutagenese weiterentwickelt werden. Dies offenbart beispielsweise die als Weiterentwicklung von WO 96/23874 A1 anzusehende Anmeldung WO 97/41213 A1. In den Anmeldungen WO 00/60059 A2 und WO 00/60060 A2 werden Varianten offenbart, die hinsichtlich eines veränderten Spaltungsmusters am Substrat Stärke entwickelt worden sind und sich deshalb besonders für die Stärke-Verarbeitung eignen. In diesen Schriften werden zahlreiche Punktmutationen sowohl von nativen α-Amylasen, als auch von Hybridamylasen offenbart.Like the wild type enzymes, too Hybrid amylases additionally be further developed by point mutagenesis. This reveals, for example the application to be regarded as a further development of WO 96/23874 A1 WO 97/41213 A1. In the applications WO 00/60059 A2 and WO 00/60060 A2 variants are disclosed that are modified in terms of Cleavage pattern on the starch substrate have been developed and are therefore particularly suitable for starch processing suitable. In these writings there are numerous point mutations both of native α-amylases, as well as hybrid amylases.
Gegenüber den hier vorgestellten Dokumenten aus dem Stand der Technik sollen im folgenden die die vorliegende Anmeldung betreffenden Positionen und Substitutionen überprüft werden.Compared to the ones presented here Documents from the prior art are the following the present Positions and substitutions relevant to registration are checked.
Aus der Anmeldung WO 97/41213 A1 gehen Varianten hervor, die in der Zählung nach BLA die Austausche D325N, R375E in Kombination mit einer anderen Substitution und L3V, in Kombination mit jeweils mehreren anderen definierten Austauschen aufweisen.From the application WO 97/41213 A1 Variants emerge, which in the BLA count the exchanges D325N, R375E in combination with another substitution and L3V, in combination with several other defined exchanges exhibit.
Die Anmeldung WO 00/60059 A2 offenbart eine Vielzahl von Möglichkeiten, α-Amylasen durch Punktmutationen zu verändern. Darunter wird auch ein Autausch in Position S168 (gemäß BLA) vorgeschlagen, konkret die Variante S168Y.The application WO 00/60059 A2 discloses a variety of ways to use α-amylases by changing point mutations. Among them, an exchange in position S168 (according to BLA) is proposed, specifically the variant S168Y.
Aus der Anmeldung
Aus der Anmeldung WO 96/23874 A1
gehen zahlreiche, die enzymatische Aktivität beeinflussende Varianten
hervor, die durch den Vergleich der 3D-Strukturen verschiedener α-Amylasen
nahegelegt worden sind. Hierunter ist jedoch kein Austausch in einer
die vorliegende Anmeldung betreffenden Position. Das korrespondierende
Patent
Die beiden Anmeldungen WO 91/00343
A2 und
Die Anmeldung WO 95/10603 A1 offenbart wiederum eine Vielzahl von Substitutionen, die u.a. die Beiträge der betreffenden Enzyme zur Waschleistung beeinflussen sollen, angegeben in der Zählung nach BLA. Darunter sollen Austausche fallen, für die nur ganz allgemein Bereiche angegeben sind; aus den dort genannten Bereichen 142–182, 172–178, 260–269 und 369–383 ist konkret jedoch nur die Position 375 vorbeschrieben. Hierfür wird der Austausch R375Y offenbart. Insbesondere im zuletzt genannten Bereich ist als eine Grenze die Position 383 angegeben, ohne daß dieser Position jedoch eine Bedeutung beigemessen wird, so daß wohl nur die zwischen den Randpositionen gelegenen Aminosäuren gemeint zu sein scheinen. Zumindest wird mit keinem Beispiel offenbart, daß gerade diese Position einen Einfluß auf die Alkaliaktivität nimmt. Als weitere relevante Position geht aus dieser Schrift Position 3 hervor; empfohlen wird dafür der Austausch L3V.The application WO 95/10603 A1 discloses again a variety of substitutions that include the contributions of those concerned Enzymes to affect washing performance, specified in the count BLA. This should include exchanges for the general areas only are specified; from areas 142–182, 172–178, 260–269 and 369-383 only position 375 is specifically described. For this the Exchange R375Y revealed. Especially in the latter area position 383 is given as a limit without this Position, however, is given meaning, so that probably only the amino acids between the edge positions appear to be meant. At least no example reveals that it is precisely this position that unites Influence on the alkali activity takes. Another position of relevance to this document is position 3 out; is recommended for this the exchange L3V.
Besonders komplex erscheint die Anmeldung WO 02/092797 A2. Hier werden im Abschnitt „Beispiele" die nun in Tabelle 2 zusammengestellten Aminosäure-Austausche in der Zählung nach BLA „offenbart". Tabelle 2: In WO 02/092797 A2 „offenbarte" Aminosäure-Austausche. The application WO 02/092797 A2 appears to be particularly complex. Here, in the "Examples" section, the amino acid exchanges compiled in Table 2 are "disclosed" in the BLA count. Table 2: Amino acid exchanges "disclosed" in WO 02/092797 A2.
Aus dieser Anmeldung gehen also keine Substitutionen in den Aminosäurepositionen 174 und 383, entsprechend 203 und 414 in der Zählung nach SEQ ID NO. 4 hervor. Zum anderen heißt es in WO 02/092797 A2 lediglich, diese Varianten seien erzeugt worden; es fehlen jedoch Angaben zu den biochemischen Eigenschaften. Für keine dieser Positionen wird jedoch konkret ein Einfluß auf die Verwendbarkeit unter alkalischen Bedingungen beschrieben.So none of this registration Substitutions in the amino acid positions 174 and 383, corresponding to 203 and 414 in the counting according to SEQ ID NO. 4 out. On the other hand it means it only in WO 02/092797 A2 that these variants had been created; however, information on the biochemical properties is missing. For none However, these positions will have an impact on usability described alkaline conditions.
In der oben genannten Anmeldung WO 99/23211 A1 werden auch Varianten der Enzyme SP690 und SP722 bezeichnet, die die Positionen W167, S170, D271 und K385 betreffen, wobei, laut Anspruch, jeweils gegen alle verbleibenden Aminosäuren substituiert werden soll; was in dieser Allgemeinheit bedeutet, daß hier prinzipiell jede Aminosäure möglich ist. Konkret offenbart wird lediglich der Austausch K385R, d.h. die Substitution einer basischen Aminosäure gegen eine andere basische Aminosäure an dieser Position, und zwar in Kombination mit anderen Punktmutationen.In the above application WO 99/23211 A1 are also called variants of the enzymes SP690 and SP722, which concern positions W167, S170, D271 and K385, whereby, according to Claim, each substituted by all remaining amino acids shall be; which means in general that here in principle every amino acid possible is. Only the K385R exchange is specifically disclosed, i.e. the substitution of one basic amino acid for another basic amino acid at this position, in combination with other point mutations.
Zusammenfassend bleibt festzuhalten,
daß im
Stand der Technik keine Austausche in den Positionen 13 und 203
gemäß der Zählung nach
SEQ ID NO. 4 vorbeschrieben sind. In Position 203 ist, wie beispielsweise
aus Tabelle 1 und aus dem Alignment der
Aus dieser einleitenden Darstellung wird auch deutlich, daß ein ungebrochenes Bedürfnis danach besteht, neue und vor allem in Hinblick auf diverse Einsatzmöglichkeiten verbesserte α-Amylasen in der Natur zu finden oder gezielt zu entwickeln. Insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln ergibt sich die Notwendigkeit zur Weiterentwicklung aus den verschiedenen Reingungszwecken, aus den sich ändernden Gewohnheiten und Ansprüchen der Verbraucher, etwa hinsichtlich niedrigerer Reinigungstemperaturen oder spezieller Darreichungsformen oder aus der Weiterentwicklung anderer Inhaltsstoffe, die die Enzyme in ihrer Leistungsfähigkeit beeinflussen, wie etwa bleichenden Verbindungen. Vor allem aber weisen die meisten im Handel erhältlichen Wasch- und Reinigungsmittel einen stark alkalischen pH-Wert auf, so daß eine Verbesserung der Aktivität betreffender Enzyme bei hohen pH-Werten eine permanente Herausforderung an die Optimierung von Wasch- und Reinigungsmittelenzymen darstellt.From this introductory presentation it is also clear that a unbroken need thereafter, there are new ones and especially with regard to various possible uses improved α-amylases to find in nature or to develop in a targeted manner. In particular for the Use in detergents and cleaning agents results in the need for further development from the various cleaning purposes changing habits and claims of the consumer, for example with regard to lower cleaning temperatures or special dosage forms or from further development other ingredients that make the enzymes perform affect, such as bleaching compounds. But especially have the most commercially available Detergents and cleaning agents have a strongly alkaline pH value, so that one Improve activity enzymes in question at high pH values a permanent challenge represents the optimization of detergent and cleaning agent enzymes.
Es stellte sich somit die Aufgabe, neue α-Amylasen oder α-Amylase-Varianten zu entwickeln, die bessere Voraussetzungen zeigen, um im Rahmen von Wasch- und Reinigungsmittelrezepturen eine möglichst hohe Aktivität zu entfalten und somit deren Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung zu verbessern. Hierzu gehört insbesondere eine verbesserte Aktivität unter alkalischen Bedingungen.So the task was new α-amylases or α-amylase variants to develop that show better conditions to work within the framework to develop the highest possible activity of detergent and cleaning agent formulations and thus to improve their washing or cleaning performance. Which also includes especially improved activity under alkaline conditions.
Eine Teilaufgabe bestand in Hinblick auf die gewerbliche Anwendbarkeit dieser Entwicklung darin, die für derartige α-Amylasen codierenden Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, um die betreffenden Enzyme molekularbiologischen Weiterentwicklungen und technischen Herstellverfahren zugänglich zu machen.A subtask existed with regard on the industrial applicability of this development in that for such α-amylases coding nucleic acids to disposal to provide the relevant enzymes molecular biological developments and to make technical manufacturing processes accessible.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch
Bereitstellung von α-Amylase-Varianten mit mindestens
zwei Aminosäureaustauschen
gegenüber
dem Ausgangsmolekül,
die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 13 gemäß der Zählung der α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens (SEQ
Unter α-Amylasen sind erfindungsgemäß und wie
einleitend erläutert
Enzyme der Klassifikation E.C. 3.2.1.1 zu verstehen, die interne α-1,4-glycosidische
Bindungen von Stärke
und stärkeähnlichen
Polymeren unter Bildung von Dextrinen und β-1,6- verzweigten Oligosacchariden hydrolysieren.
Die Erfindung ist prinzipiell auf alle bekannten und noch zu findenden α-Amylasen
anwendbar, soweit sie sich mit der α-Amylase aus B. licheniformis homologisieren
lassen. Solche eine Homologisierung ist in
Unter Varianten sind erfindungsgemäß Proteine
zu verstehen, die sich von Ausgangsproteinen hinsichtlich der Aminosäuresequenz
unterscheiden. Das Pendant hierzu auf der Nukleinsäure-Ebene
ist die Mutante. So handelt es sich bei BAA L13P beispielsweise
um eine Variante der BAA, die alle Aminosäuren bis auf die in Position
13 mit der BAA gemeinsam hat. Dies entspricht auf DNA-Ebene dem
Austausch des Codons CTT (37–39
gemäß SEQ
Unter Aminosäureaustauschen sind Substitutionen
einer Aminosäure
gegen eine andere Aminosäure zu
verstehen. Erfindungsgemäß werden
solche Substitutionen unter Bezeichnung der Positionen, in der der Austausch
erfolgt, gegebenenfalls kombiniert mit den betreffenden Aminosäuren im
international gebräuchlichen
Einbuchstabencode angegeben. „Austausch
in Position 13" bedeutet
beispielsweise, daß eine
Variante in der Position, die in der Sequenz eines Referenzproteins
die Position 13 aufweist, eine andere Aminosäure aufweist. Austausch bedeutet
nicht, daß gegenständlich diese
Aminosäure
geändert
wurde sondern bezeichnet lediglich einen Sequenzunterschied. Üblicherweise
werden solche Austausche auf der DNA-Ebene über Mutationen einzelner Basenpaare
durchgeführt. „L13P" bedeutet beispielsweise,
daß das
Referenzenzym an der Position 13 die Aminosäure Leucin aufweist, während die
betrachtete Variante an der hiermit homologisierbaren Position über die
Aminosäure
Prolin verfügt. „13P" bedeutet, daß jede beliebige,
d.h. in der Regel eine natürlicherweise
vorgegebene Aminosäure,
an einer Position, die der Position 13 entspricht, gegen ein Prolin ersetzt
ist. Ein Beispiel für
einen solchen homologen Austausch wäre L-18P in BLA, d.h. der von
B.licheniformis gebildeten α-Amylase,
weil sich über
Grundsätzlich sind die mit der vorliegenden Anmeldung vorgeschlagenen Aminosäureaustausche nicht darauf beschränkt, daß sie die einzigen Austausche sind, in denen sich die betreffende Variante von dem Wildtypmolekül unterscheidet. Es ist im Stand der Technik bekannt, daß sich die vorteilhaften Eigenschaften einzelner Punktmutationen einander ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften wie etwa Calcium-Bindung oder Stabilität gegenüber Tensiden optimierte α-Amylase kann erfindungsgemäß zusätzlich über die hier vorgestellten Substitutionen weiterentwickelt werden. Somit umfassen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung alle Varianten, die neben anderen Austauschen gegenüber dem Wildtypmolekül auch die erfindungsgemäßen Austausche aufweisen. Dies gilt insbesondere für Moleküle, die über Fusionsmutation (Hybridbildung) erhalten worden sind (siehe unten).Basically, those with the present Registration does not suggest proposed amino acid exchanges limited to that she the only exchanges are in which the variant in question of the wild type molecule different. It is known in the prior art that the advantageous properties of individual point mutations can complement each other. A with regard to certain properties such as calcium binding or stability across from Α-Amylase optimized for surfactants can additionally according to the invention Substitutions presented here are further developed. Consequently include embodiments of the present invention all variants that interchange among others across from the wild type molecule also the exchanges according to the invention exhibit. This is especially true for molecules that have a fusion mutation (hybrid formation) have been obtained (see below).
Als Referenzenzym hinsichtlich der
Numerierung der Positionen ist erfindungsgemäß die nicht prozessierte α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens anzusehen, deren Nukleotidsequenz in SEQ
Erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten sind dadurch gekennzeichnet, daß in Position 13 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) ein Prolinrest (P) und in Position 414 ein Serinrest (S) vorliegt.As a result, α-amylase variants according to the invention are characterized in that in Position 13 according to the α-amylase count from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) a proline residue (P) and in Position 414 is a serine residue (S).
Wie einleitend dargestellt sind im
Stand der Technik keine Austausche in der Position 13 gemäß der Zählung nach
SEQ ID NO. 4 vorbeschrieben. Nach
In der Position 414 verfügen die
meisten anderen α-Amylasen über eine
basische Aminosäure
(vgl. Tabelle 1 und
In den Beispielen der vorliegenden Anmeldung sind drei Varianten der α-Amylase von B. licheniformis (BAA A42, BAA A29 und BAA B1) ausführlich beschrieben. Sie verfügen gegenüber diesem Vergleichsmolekül (dem Wildtypenzym), gemessen bei pH 6,5 über deutlich höhere spezifische Aktivitäten (siehe Beispiel 5). Zusätzlich weist die Variante BAA A42 gegenüber dem Wildtypmolekül ein um eine ganze pH-Einheit in den alkalischen Bereich verschobenes pH-Optimum auf. Zudem verfügt sie über eine deutlich erhöhte relative Aktivität bei pH 10 (siehe Beispiel 6).In the examples of the present Registration is for three variants of the α-amylase from B. licheniformis (BAA A42, BAA A29 and BAA B1) in detail described. You have across from this comparison molecule (the Wild type enzyme), measured at pH 6.5 above significantly higher specific activities (see example 5). additionally opposes the variant BAA A42 the wild type molecule one shifted by an entire pH unit into the alkaline range pH optimum. Also has them over a significantly increased relative activity at pH 10 (see example 6).
Diese drei Varianten haben zwei Gemeinsamkeiten, nämlich die beiden Aminosäureaustausche L13P und N414S. Somit ist erfindungsgemäß davon auszugehen, daß diese beiden Austausche die Aktivität von α-Amylasen, insbesondere deren Alkaliaktivität zu steigern vermögen.These three variants have two things in common, namely the two amino acid exchanges L13P and N414S. Thus it can be assumed according to the invention that this both exchanges the activity of α-amylases, especially their alkali activity able to increase.
Bevorzugte α-Amylase-Varianten dieses Erfindungsaspekts sind dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 194, 197 oder 356 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in zwei, besonders bevorzugt in allen drei dieser Positionen.Preferred α-amylase variants of this aspect of the invention are characterized in that in addition at least an amino acid exchange in one of positions 194, 197 or 356 according to the counting of the α-amylase from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) is present, preferably in two, particularly preferably in all three of these positions.
Die Austausche in den Positionen
194 und 197 liegen in einem Bereich, der bei vielen α-Amylasen hochkonserviert
sind; dies geht beispielsweise aus
Den Erfolg dieser Austausche belegt
die BAA-Variante A42, deren DNA- und Aminosäuresequenzen unter SEQ
Bevorzugte α-Amylase-Varianten mit diesen Substitutionen sind dadurch gekennzeichnet, daß in Position 194 ein Arginin- (R) und/oder in Position 197 ein Prolin- (P) und/oder in Position 356 ein Asparaginsäurerest (D) vorliegt.Preferred α-amylase variants with these Substitutions are characterized in that an arginine in position 194 (R) and / or in position 197 a proline (P) and / or in position 356 an aspartic acid residue (D) is present.
Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/194R/197P/356D/414S.It is particularly preferred a variant with the exchanges 13P / 194R / 197P / 356D / 414S.
Dies wird von den genannten überraschend positiven Eigenschaften der Variante BAA A42 unterstützt.This is surprising from those mentioned positive characteristics of the variant BAA A42.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist eine α-Amylase-Variante
mit den Austauschen 13P und 414S dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich mindestens
ein Aminosäureaustausch
in einer der Positionen 32, 230, 297 oder 406 gemäß der Zählung der α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens (SEQ
Die Position 32 ist bei BAA die erste
Aminosäure
des maturen Proteins, bei den meisten anderen α-Amylasen stellt sie die dritte
Aminosäure
des maturen Proteins dar. Möglicherweise
spielt sie für
die Faltung des Proteins eine gewisse Rolle. Die Position 230 (242
gemäß
In einer bevorzugten Ausführungsform liegen α-Amylase-Varianten vor, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 32 ein Alanin- (A) und/oder in Position 230 ein Valin(V) und/oder in Position 297 ein Asparaginsäure- (D) und/oder in Position 406 ein Argininrest vorliegt.In a preferred embodiment are α-amylase variants characterized in that an alanine in position 32 (A) and / or in position 230 a valine (V) and / or in position 297 an aspartic acid (D) and / or there is an arginine residue in position 406.
Insbesondere für Position 230 war nicht zu erwarten gewesen, daß hier eine raumfüllendere Aminosäure als Alanin erfolgreich eingeführt werden kann. Überraschend ist auch, daß die bessere Eignung der erfindungsgemäßen Varianten für alkalische Bedingungen offensichtlich nur in geringem Maße mit der Änderung zu insgesamt stärker alkalischen oder stärker sauren Aminosäuren einhergeht. Denn der Wechsel in Position 297 bedeutet für die BAA den Übergang von einer neutralen zu einer sauren Aminosäure und der in Position 406 von einer basischen zu einer stärker basischen Aminosäure.In particular for position 230 was not closed expected to be here a more space-filling amino acid successfully introduced as alanine can be. Is surprising also that the better suitability of the variants according to the invention for alkaline Conditions apparently only to a small extent with the change to more alkaline overall or stronger acidic amino acids accompanied. Because the change in position 297 means for the BAA the transition from a neutral to an acidic amino acid and that at position 406 from a basic to a stronger one basic amino acid.
Besonders bevorzugt sind derartige α-Amylase-Varianten, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Varianten mit den Austauschen 13P/32A/230V/297D/406R/414S handelt.Such α-amylase variants are particularly preferred, which are characterized in that they are variants with exchanges 13P / 32A / 230V / 297D / 406R / 414S.
Ein solches Molekül wird mit der Variante BAA A29 zur Verfügung gestellt und in den Beispielen hinsichtlich seiner biochemischen Eigenschaften untersucht. Sie weist besonders hohe Aktivitätswerte im Vergleich zum Wildtypenzym, d.h. dem Molekül ohne diese sechs Austausche auf.Such a molecule is used with the BAA variant A29 available put and in the examples regarding its biochemical Properties examined. It shows particularly high activity values compared to the wild type enzyme, i.e. the molecule without these six exchanges on.
Wie oben bereits gesagt besteht ein weiterer Aspekt zur Lösung der Aufgabe in der Bereitstellung von α-Amylase-Varianten mit mindestens zwei Aminosäureaustauschen gegenüber dem Ausgangsmolekül, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ein Austausch in Position 203 und ein Austausch in Position 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt.As already mentioned above, there is a another aspect to the solution the task in the provision of α-amylase variants with at least exchange two amino acids across from the starting molecule, which are characterized in that an exchange in position 203 and an exchange at position 474 according to the B. amyloliquefaciens α-amylase count (SEQ ID NO. 4).
Hierbei kann es sich um Austausche handeln, die an einem Wildtypmolekül vorgenommen worden sind, oder insbesondere um solche, die an einer bereits vorhandenen und möglicherweise in eine bestimmte Richtung verbesserten Variante zusätzlich vorgenommen worden sind.This can be exchanges act on a wild-type molecule, or in particular to those that are connected to an existing and possibly made in a certain direction improved variant additionally have been.
Die Position 203 liegt, wie
In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige α-Amylase-Varianten dadurch gekennzeichnet, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.In a preferred embodiment are such α-amylase variants characterized in that in Position 203 a leucine (L) and / or position 474 a glutamine residue (Q) is present.
Denn über diese beiden Substitutionen unterscheidet sich die erfindungsgemäße Variante BAA B1 von BAA A29. Dadurch erhält sie, wie Beispiel 6 zeigt, bei einem nicht meßbar veränderten pH-Optimum eine höhere relative Aktivität bei pH 10.Because about these two substitutions the variant BAA B1 according to the invention differs from BAA A29. This gives it, as Example 6 shows, with a non-measurably changed pH optimum a higher relative activity at pH 10.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden diese Austausche in den Positionen 203 und 474 nicht an einem Wildtypmolekül sondern an einem Molekül vorgenommen, welches bereits die oben dargestellten erfindungsgemäßen Austausche in den Positionen 13 und 414 und zusätzlich in den Positionen 32, 230, 297 und/oder 406 aufweist. Denn für diese sind die dargestellten vorteilhaften Eigenschaften oben bereits dargestellt.In a preferred embodiment these exchanges in positions 203 and 474 are not on one Wild-type molecule but on a molecule made, which already the above-described exchanges according to the invention in positions 13 and 414 and additionally in positions 32, 230, 297 and / or 406. Because for these are the ones shown advantageous properties already outlined above.
Beansprucht werden somit solche α-Amylase-Varianten, die zusätzlich zu den genannten Austauschen in den Positionen 13 und 414, in Kombination mit denen in den Positionen 32, 230, 297 und/oder 406 dadurch gekennzeichnet sind, daß zusätzlich mindestens ein Aminosäureaustausch in einer der Positionen 203 oder 474 gemäß der Zählung der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) vorliegt, vorzugsweise in beiden Positionen.Such α-amylase variants are thus claimed, the additional to the exchanges mentioned in positions 13 and 414, in combination marked with those in positions 32, 230, 297 and / or 406 are that in addition at least an amino acid exchange in one of the positions 203 or 474 according to the count of the α-amylase from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 4) is present, preferably in both positions.
Entsprechend dem oben gesagten sind auch unter diesen α-Amylase-Varianten jene bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in Position 203 ein Leucin- (L) und/oder in Position 474 ein Glutaminrest (Q) vorliegt.According to what is said above also among these α-amylase variants preferred those characterized in that in position 203 a leucine (L) and / or in position 474 a glutamine residue (Q) is present.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses und des ersten Erfindungsaspekts ist eine α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um eine Variante mit den Austauschen 13P/32A/203L/230V/297D/406R/414S/474Q handelt.A particularly preferred embodiment this and the first aspect of the invention is an α-amylase variant, which is characterized in that it is a variant deals with the exchanges 13P / 32A / 203L / 230V / 297D / 406R / 414S / 474Q.
Ein Vertreter eines solchen Moleküls ist die nach den Beispielen 1 bis 3 erhaltene und in den Beispielen 4 bis 6 charakterisierte Variante BAA B1, die auch den Namen B. amyloliquefaciens-α-Amylase L13P/V32A/1203L/A230V/N297S/K406R/N414S/K474Q trägt. Sie zeichnet sich gegenüber dem Wildtypmolekül BAA insbesondere durch eine erhöhte Aktivität aus (Beispiel 5).A representative of such a molecule is obtained according to Examples 1 to 3 and in Examples 4 to 6 characterized variant BAA B1, which also has the name B. amyloliquefaciens-α-amylase L13P / V32A / 1203L / A230V / N297S / K406R / N414S / K474Q wearing. It stands out the wild type molecule BAA in particular through an increased activity from (Example 5).
Wie einleitend dargestellt sind im Stand der Technik zahlreiche α-Amylasen für den Einsatz zu verschiedenen technischen Zwecken, insbesondere als aktive Komponenten in Wasch- und Reinigungsmitteln etabliert. Hierzu zählen pilzliche und besonders bakterielle Enzyme. Ganz besonders gebräuchlich sind solche aus grampositiven Bakterien, insbesondere der Gattung Bacillus, die an ein alkalisches Milieu angepaßt sind. Denn sie weisen von vornherein günstige Eigenschaften für diese Einsatzgebiete auf. Erfindungsgemäß können sie durch zusätzliche Punktmutationen weiterentwickelt werden. In den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung fällt somit allgemein jede α-Amylase-Variante, die durch die oben bezeichneten Aminosäurevariationen gekennzeichnet ist, vorzugsweise jede, für die bereits ein entsprechender Einsatz beschrieben ist, beispielsweise auch die einleitend dargestellten Moleküle AA560, AA349, SP690 und SP722.As introduced in the introduction State of the art numerous α-amylases for the Use for various technical purposes, especially as an active one Components established in detergents and cleaning agents. These include fungal ones and especially bacterial enzymes. Very common are those from gram-positive bacteria, especially of the genus Bacillus adapted to an alkaline environment. Because they point from cheap in advance Properties for these areas of application. According to the invention, they can be added Point mutations are further developed. In the scope of protection this application falls thus generally every α-amylase variant, which are characterized by the amino acid variations indicated above is, preferably each, for a corresponding use has already been described, for example also the molecules AA560, AA349, SP690 and SP722.
Bevorzugt handelt es dabei um jede α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sich das Ausgangsmolekül von einer α-Amylase ableitet, die ursprünglich aus einer Bacillus-Spezies stammt, vorzugsweise aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt aus B. amyloliquefaciens, B. agaradherens (DSM 9948) oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), ganz besonders aus B. amyloliquefaciens.This is preferably any α-amylase variant, which is characterized in that the starting molecule is an α-amylase derives that originally comes from a Bacillus species, preferably from B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. # 707 or B. sp. A 7-7 (DSM 12368), especially preferably from B. amyloliquefaciens, B. agaradherens (DSM 9948) or E.g. A 7-7 (DSM 12368), very particularly from B. amyloliquefaciens.
Diese Enzyme sind in der Einleitung ausführlich behandelt worden. Besonders bevorzugt sind hierunter zum einen diejenigen, die sich von den α-Amylasen aus aus B. agaradherens (DSM 9948) und aus B. sp. A 7-7 (DSM 12368) ableiten. Das zuerst genannte Molekül, das gleichzeitig als α-Amylase und als Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) angesehen werden kann, wird in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschrieben. Die α-Amylase aus Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), die hier als A 7-7 bezeichnet wird, geht aus der Anmeldung WO 02/10356 A2 hervor. Für beide sind bislang noch keine Leistungsverbesserungen über Punktmutationen beschrieben worden, so daß die erfindungsgemäßen Variationen hierfür besonders vielversprechende erste Ansatzpunkte sein dürften. Zum anderen werden Varianten des Enzyms aus B. amyloliquefaciens (BAA) bevorzugt, weil diese nach den hier ausgeführten Beispielen hergestellt worden sind und die genannten vorteilhaften Eigenschaften aufweisen.These enzymes have been dealt with in detail in the introduction. Particularly preferred are those which derive from the α-amylases from B. agaradherens (DSM 9948) and from B. sp. Derive A 7-7 (DSM 12368). The first-mentioned molecule, which can be regarded as α-amylase and cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) at the same time, is described in application WO 02/44350 A2 wrote. The α-amylase from Bacillus sp. A 7-7 (DSM 12368), which is referred to here as A 7-7, emerges from the application WO 02/10356 A2. No improvements in performance via point mutations have yet been described for either, so that the variations according to the invention are likely to be particularly promising first starting points for this. On the other hand, variants of the enzyme from B. amyloliquefaciens (BAA) are preferred because they have been produced according to the examples given here and have the advantageous properties mentioned.
Wie erwähnt ist die vorliegende Erfindung nicht auf natürliche oder weitgehend unmodifizierte Enzyme beschränkt sondern kann insbesondere auch auf Hybridamylasen angewendet werden. Denn die Erzeugung von α-Amylasen mit positiven Eigenschaften über die Fusionsmutagenese ist im Stand der Technik inzwischen ausführlich beschrieben.As mentioned, the present invention not on natural or largely unmodified enzymes but can in particular can also be applied to hybrid amylases. Because the production of α-amylases with positive characteristics about fusion mutagenesis has now been described in detail in the prior art.
Dementsprechend wird jede erfindungsgemäße α-Amylase-Variante beansprucht, die zusätzlich dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei dem Ausgangsmolekül um eine Hybrid-α-Amylase handelt, vorzugsweise basierend auf mindestens einer der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368), besonders bevorzugt basierend auf mindestens zwei der α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. #707 oder B. sp. A 7-7 (DSM 12368).Accordingly, every α-amylase variant according to the invention claimed that additionally is characterized in that it itself with the starting molecule a hybrid α-amylase acts, preferably based on at least one of the α-amylases from B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. # 707 or B. sp. A 7-7 (DSM 12368), particularly preferably based on at least two of the α-amylases from B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. agaradherens, B. stearothermophilus, B. sp. KSM-AP 1378, B. sp. # 707 or B. sp. A 7-7 (DSM 12368).
Insbesondere aus der Anmeldung
Besonders bevorzugt ist somit jede erfindungsgemäße α-Amylase-Variante, die dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich bei der Hybrid-α-Amylase um eine handelt, deren Teilsequenzen von den α-Amylasen aus B. amyloliquefaciens und aus B. licheniformis abgeleitet sind.Each is therefore particularly preferred α-amylase variant according to the invention, which is characterized in that it is in the hybrid α-amylase is one whose partial sequences from the α-amylases from B. amyloliquefaciens and are derived from B. licheniformis.
Besonders bevorzugt ist eine α-Amylase-Variante, wenn sie dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um eine Variante der α-Amylase von B. amyloliquefaciens mit einer der Aminosäureaustausch-Kombinationen L13P/W194R/S197P/E356D/N414S, L13P/V32A/A230V/N297D/K406R/N414S beziehungsweise L13P/V32A/1203UA230V/N297D/K406R/N414S/K474Q handelt, vorzugsweise mit der Aminosäureaustausch-Kombination L13P/W194R/S197P/E356D/N414S.An α-amylase variant is particularly preferred, if it is characterized by the fact that it is a variant the α-amylase B. amyloliquefaciens with one of the amino acid exchange combinations L13P / W194R / S197P / E356D / N414S, L13P / V32A / A230V / N297D / K406R / N414S or L13P / V32A / 1203UA230V / N297D / K406R / N414S / K474Q deals, preferably with the amino acid exchange combination L13P / W194R / S197P / E356D / N414S.
Denn diese Moleküle sind unter den Bezeichnungen BAA 42, BAA 29 und BAA B1 in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschrieben. Hierunter hat das Enzym mit der Aminosäureaustausch-Kombination L13P/W194R/S197P/E356D/N414S (BAA A42) eine besonders hohe Alkaliaktivität unter Beweis gestellt.Because these molecules are under the names BAA 42, BAA 29 and BAA B1 in the examples of the present application described. Below that is the enzyme with the amino acid exchange combination L13P / W194R / S197P / E356D / N414S (BAA A42) have a particularly high alkaline activity Provided proof.
Vorzugsweise sind diese α-Amylase-Varianten dadurch gekennzeichnet, daß es sich um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6), aus B. amyloliquefaciens A29 (SEQ ID NO. 8) oder aus B. amyloliquefaciens B1 (SEQ ID NO. 10) handelt, vorzugsweise um die α-Amylase-Variante aus B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6).These are preferably α-amylase variants characterized in that it the α-amylase variant from B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6), from B. amyloliquefaciens A29 (SEQ ID NO. 8) or from B. amyloliquefaciens B1 (SEQ ID NO. 10), preferably the α-amylase variant from B. amyloliquefaciens A42 (SEQ ID NO. 6).
In der Tat wurden, wie in Beispiel 1 dargestellt ist, die Moleküle BAA A42, A29 und B1 nicht aus Stämmen der Spezies B. amyloliquefaciens selbst gewonnen. Ursprünglich stammte nur die Sequenz für das Wildtypmolekül aus B. amyloliquefaciens, wie er beispielsweise unter der Nummer DSM 7 von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) erhalten werden kann. Diese ist unter SEQ ID NO.3 beziehungsweise 4 angegeben. Die betreffenden mutanten B. amyloliquefaciens-Stämme können beispielsweise dadurch erzeugt werden, daß die dargestellten pGBAA-Plasmide vorzugsweise hiervon abgeleitete Plasmide mit größeren flankierenden Bereichen zum BAA-Gen in die Wildtypzellen rückübertragen werden. Analog könnten die Gene aus SEQ ID NO. 5, 7 und 9 auch neu synthetisiert und in entsprechende Vektoren eingebracht werden. Durch homologe Rekombination des mutierten Gens in die zugehörige Stelle im Chromosom wird die anspruchsgemäße Mutante von B. amyloliquefaciens erzeugt, die dauerhaft das mutierte Gen exprimiert. Dieses Vorgehen ist dann besonders vorteilhaft, wenn das betreffende Protein auch durch einen Stamm dieser Spezies produziert werden soll.In fact, as in example 1, the molecules BAA A42, A29 and B1 not from strains of the species B. amyloliquefaciens itself. Originally came from just the sequence for the wild type molecule from B. amyloliquefaciens, as for example under the number DSM 7 from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) can be obtained. This is under SEQ ID NO.3 respectively 4 specified. The relevant mutant B. amyloliquefaciens strains can, for example are generated in that the shown pGBAA plasmids preferably derived therefrom plasmids with larger flanking Areas of the BAA gene are transferred back into the wild-type cells. They could be analog Genes from SEQ ID NO. 5, 7 and 9 also newly synthesized and in corresponding Vectors are introduced. By homologous recombination of the mutated Gens in the associated The demanding mutant of B. amyloliquefaciens is located in the chromosome generated that permanently expresses the mutated gene. This procedure is particularly advantageous if the protein in question also to be produced by a strain of this species.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen die Nukleinsäuren dar, die für eine der bislang beschriebenen α-Amylase-Varianten codieren.Your own subject of the invention represent the nucleic acids that for one of the α-amylase variants described so far encode.
Hierunter sind sowohl RNA- als auch DNA-Moleküle sowie DNA-Analoga zu verstehen, sowohl der codierende als auch der codogene Strang, und zwar in jedem Leseraster. Denn beispielsweise wäre es möglich, die mit der Erfindung verbundene Lehre auszunutzen, um über eine interferierende entsprechende RNA eine Regulation entsprechender α-Amylasen vorzunehmen oder die Lebensdauer der genetischen Information zu erhöhen, indem sie in ein in vivo langsamer abbaubares DNA-Analogon überführt wird. Die Nukleinsäuren eröffnen, wie an den weiter unten ausgeführten Erfindungsgegenständen zu erkennen ist, der vorliegenden Erfindung gewissermaßen die molekularbiologische Dimension. Sie sind ensprechend dem oben Gesagten entsprechend bevorzugt.These include both RNA and DNA molecules as well as understanding DNA analogs, both coding and codogenic strand, in every reading frame. Because, for example would it be possible that to use the teaching associated with the invention to a interfering corresponding RNA regulation of corresponding α-amylases or increase the lifespan of the genetic information by it is converted into a slower degradable DNA analog in vivo. The nucleic acids open, like the ones detailed below Invention objects can be seen, the present invention, so to speak molecular biological dimension. They are in accordance with the above accordingly preferred.
Vorzugsweise sind hierunter DNA-Moleküle zu verstehen. Denn über diese ist es möglich, die erfindungsgemäßen α-Amylase-Varianten über an sich bekannte molekularbiologische Verfahren herzustellen und/oder gegebenenfalls weiterzumodifizieren.These are preferably to be understood as DNA molecules. Because about this is it possible the α-amylase variants according to the invention per se to produce known molecular biological methods and / or if necessary weiterzumodifizieren.
Ausgangspunkte für diese Nukleinsäure können die im Sequenzprotokoll angegebenen DNA-Sequenz-Informationen sein, um über chemische Neusynthese die betreffenden Gene zu erhalten. Demgegenüber kann es aber auch vorteilhaft sein, auf in vivo bereits zur Verfügung stehende Nukleinsäuren zurückzugreifen, etwa solchen, die für die im Stand der Technik bekannten α-Amylasen codieren. Eine weitere Alternative besteht darin, entsprechend Beispiel 1 eine Gesamt-DNA-Präparation von bestimmten dafür ins Auge gefaßten Mikroorganismen vorzunehmen und über PCR die endogenen α-Amylasegene zu isolieren. Als Primer können prinzipiell die aus SEQ ID NO. 3 ebenfalls abzulesenden 5'- und 3'-Sequenzabschnitte eingesetzt werden.Starting points for this nucleic acid can be the DNA Se specified in the sequence listing be sequence information in order to obtain the relevant genes via chemical resynthesis. In contrast, it can also be advantageous to use nucleic acids that are already available in vivo, for example those that code for the α-amylases known in the prior art. Another alternative is to carry out a total DNA preparation of certain microorganisms envisaged therefor in accordance with Example 1 and to isolate the endogenous α-amylase genes by means of PCR. In principle, those from SEQ ID NO. 3 5 'and 3' sequence sections, which can also be read, are used.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäure ist somit dadurch gekennzeichnet, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 3 ableitet.A preferred nucleic acid according to the invention is thus characterized in that it is a nucleic acid according to SEQ ID NO. 3 derives.
Darunter sind nicht nur jene zu verstehen, die wie oben erklärt, anhand dieser Sequenz erhalten worden sind, sondern auch alle Mutanten, die in anderen Positionen als nur denen erzeugt worden sind, die mit der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden.This does not only mean those which as explained above have been obtained from this sequence, but also all mutants, that have been created in positions other than just those that are described with the present application.
Eine bevorzugte Ausführungsform greift auf die in der vorliegenden Anmeldung tatsächlich untersuchten Beispiele zurück.A preferred embodiment accesses those actually examined in the present application Examples back.
Besonders bevorzugt ist somit jede erfindungsgemäße Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie sich von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 ableitet, vorzugsweise eine dieser Sequenzen selbst.Each is therefore particularly preferred nucleic acid according to the invention, the is characterized in that it different from a nucleic acid according to SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7 or SEQ ID NO. 9 derives, preferably one of these sequences themselves.
Eine besonders vorteilhafte Form, Nukleinsäuren zu handhaben, stellen Vektoren dar. Denn diese weisen Bereiche auf, die es ermöglichen, das betreffende enthaltene, interessierende Gen zu charakterisieren (etwa über flankierende Bereiche für Segzenzierprimer), zu lagern und durch Transformation gegebenenfalls wieder zu aktivieren oder um es zu exprimieren, wenn das abgeleitete Protein untersucht und in größeren Mengen hergestellt werden soll. Bei Vektoren kann es sich insbesondere bei eukaryontischen Wirtszellen wie etwa Hefe um künstliche Chromosomen handeln; bei Bakterien sind Vektoren in der Regel Plasmide.A particularly advantageous form nucleic acids to handle are vectors. Because these have areas that allow to characterize the contained gene of interest (about about flanking areas for Segregation primer), and if necessary by transformation reactivate it or to express it if the derived one Protein examined and produced in large quantities shall be. For vectors, it can be especially for eukaryotic ones Host cells such as yeast around artificial Act chromosomes; in bacteria, vectors are usually plasmids.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung stellen somit Vektoren dar, die einen Bereich mit einer oben beschriebenen Nukleinsäure enthalten.Your own subject of the invention vectors for implementing the present invention which contain a region with a nucleic acid described above.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Vektor dadurch gekennzeichnet, daß er ein Klonierungsvektor ist.In a preferred embodiment such a vector is characterized by being a cloning vector is.
Denn in dieser Form kann die betreffende DNA wie oben gesagt gelagert werden oder beispielsweise über Einführung weiterer Mutationen weiter verändert werden, wodurch beispielsweise weiterentwickelte erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten erzeugt werden können.Because in this form the concerned DNA can be stored as mentioned above or, for example, by introducing additional ones Mutations further changed are, for example, further developed α-amylase variants according to the invention can be generated.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist solch ein Vektor dadurch gekennzeichnet, daß er ein Expressionsvektor ist.In another preferred embodiment such a vector is characterized in that it is an expression vector is.
Denn dadurch kann eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante auf bequeme molekularbiologische Weise auch in größeren Mengen erzeugt werden.Because an α-amylase variant according to the invention can thereby in a convenient molecular biological way, even in large quantities be generated.
In weiteren vorteilhaften Ausführungsformen weisen die genannten Vektoren Replikationsursprünge für verschiedene Mikroorganismen auf, wodurch sie als sogenannte Shuttle-Vektoren in verschiedene Wirtszellen eingebracht und dort stabil erhalten werden können. Es ist ebenso möglich, Vektoren herzustellen, die sowohl als Klonierungs- als auch als Expressionsvektor betrachtet werden können.In further advantageous embodiments the vectors mentioned indicate origins of replication for different microorganisms on, which makes them so-called shuttle vectors into different Host cells can be introduced and stably maintained there. It is also possible To produce vectors, both as cloning and as Expression vector can be viewed.
Entsprechend dem oben Gesagten und der im Stand der Technik etablierten Methodik erstreckt sich die molekularbiologische Dimension auch auf Organismen, insbesondere auf Mikroorganismen.According to the above and The methodology established in the prior art extends the molecular biological dimension also on organisms, in particular on microorganisms.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen somit Zellen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine der oben bezeichneten Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise auf einem oben bezeichneten Vektor.Your own subject of the invention thus represent cells which are characterized in that they have a of the nucleic acids described above included, preferably on a vector referred to above.
Hierzu gehören beispielsweise solche, die mit einem entsprechenden Klonierungsvektor transformiert worden sind oder sich von solchen ableiten. Dies dient insbesondere der Charakterisierung und/oder der Lagerung des betreffenden Gens. Demgegenüber ist es für die Realisierung der vorliegenden Erfindung besonders wichtig, das betreffende Enzym tatsächlich auch zu erhalten; denn an dessen verbesserten Eigenschaften besteht ein besonderes kommerzielles Interesse. Diese Bildung kann beispielsweise permament und in mit hoher Produktionsrate erfolgen, wenn das interessierende Transgen unter der Kontrolle eines konstitutiven und starken Promotors steht. Alternativ ist es auch möglich, das Gen für die α-Amylase-Variante unter die Kontrolle eines induzierbaren und vorteilhafterweise nicht minder starken Promotors zu stellen. Dadurch kann die Herstellung gezielt von außen eingeschaltet werden, beispielsweise dann, wenn hierfür günstige Bedingungen vorliegen. Dies ist etwa bei der fermentativen Produktion dann der Fall, wenn eine bestimmte Zelldichte erreicht worden ist.These include, for example, which have been transformed with an appropriate cloning vector are or are derived from such. This serves in particular the Characterization and / or storage of the gene in question. In contrast is it for the realization of the present invention is particularly important actual enzyme in question also get; because its improved properties exist a particular commercial interest. This education can for example permanent and in high production rate if that is of interest Transgene under the control of a constitutive and strong promoter stands. Alternatively, it is also possible the gene for the α-amylase variant under the control of an inducible and advantageously not less powerful promoter. This allows the manufacture targeted from the outside be switched on, for example, if there are favorable conditions for this. This is the case, for example, with fermentative production if a certain cell density has been reached.
Bevorzugt ist also jede oben bezeichnete Zelle, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie eine der oben bezeichneten α-Amylase-Varianten bildet oder zu deren Bildung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz einer oben bezeichneten Nukleinsäure, besonders bevorzugt unter Einsatz eines oben bezeichneten Expressionsvektors.So each is preferred above Cell which is characterized in that it is one of the α-amylase variants mentioned above forms or can be stimulated to form them, preferably using a nucleic acid described above, particularly preferably under Use of an expression vector described above.
Eine zusätzlich vorteilhafte Ausführungsform nimmt darauf Bezug, daß die meisten industriell wichtigen α-Amylasen ursprünglich als Enzyme gefunden worden sind, die von den betreffenden Mikroorganismen, insbesondere Bakterien ins umgebende Medium sekretiert werden. Denn in vivo handelt es sich zumeist um Verdauungsenzyme. Dementsprechend ist es vorteilhaft, wenn die industriell hergestellten erfindungsgemäßen Enzyme ebenfalls ins umgebende Medium sekretiert werden. Denn aus diesem können sie ohne Zellaufschluß und damit vergleichsweise leicht aufgearbeitet werden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß die betreffenden Gene um entsprechende Sequenzen ergänzt werden – sofern diese nicht ohnehin vorhanden sind – die für ein Leader-Peptid codieren, welches die betreffende Zelle dazu veranlaßt sie auszuschleusen. Eine Alternative bei gramnegativen Bakterien besteht beispielsweise darin, die äußere Membran zur Abgabe von Proteinen partiell zu öffnen, wie dies beispielsweise in der Anmeldung WO 01/81597 A1 beschrieben ist.An additional advantageous embodiment refers to the fact that most industrially important α-amylases were originally found as enzymes which are secreted into the surrounding medium by the microorganisms in question, in particular bacteria. Because in vivo it is mostly about Digestive enzymes. Accordingly, it is advantageous if the industrially produced enzymes according to the invention are also secreted into the surrounding medium. Because from this they can be processed without cell disruption and thus comparatively easily. This can be achieved, for example, by adding appropriate sequences to the genes in question - if these are not already present - which code for a leader peptide which causes the cell in question to release them. An alternative in the case of Gram-negative bacteria is, for example, to partially open the outer membrane for the release of proteins, as is described, for example, in the application WO 01/81597 A1.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Zelle ist demnach dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um ein Bakterium handelt, insbesondere eines, das die gebildete α-Amylase-Variante ins umgebende Medium sekretiert.A preferred cell according to the invention is therefore characterized in that it is a bacterium acts, in particular one that secretes the α-amylase variant formed into the surrounding medium.
Insbesondere die Charakterisierung von Genen und Enzymen erfolgt im Labormaßstab in der Regel über Zwischenklonierung und/oder Expression in gramnegativen Bakterien. Dies belegen auch die Beispiele der vorliegenden Anmeldung. Es sind aber auch Produktionsverfahren etabliert, die auf gramnegativen Bakterien aufbauen (siehe oben).In particular the characterization genes and enzymes are usually produced on a laboratory scale by intermediate cloning and / or expression in gram-negative bacteria. This is also proven the examples of the present application. But they are also production processes established that build on gram-negative bacteria (see above).
Die bislang beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen sind vorzugsweise somit dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um gramnegative Bakterien handelt, vorzugsweise der Gattungen Escherichia coli oder Klebsiella, insbesondere um Derivate von E. coli K12, von E. coli B oder K. planticola, und ganz besonders um Derivate der Stämme E. coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E.coli JM109, E. coli XL-1 oder K. planticola (Rf).The cells according to the invention described so far are therefore preferably characterized in that it is Gram-negative bacteria, preferably of the genera Escherichia coli or Klebsiella, especially derivatives of E. coli K12, from E. coli B or K. planticola, and especially around derivatives of the tribes E. coli BL21 (DE3), E. coli RV308, E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli XL-1 or K. planticola (RF).
Im Stand der Technik ist insbesondere für die Produktion von Enzymen aus grampositiven Organismen etabliert, für diese auch grampositive Expressionswirte auszuwählen. Aber auch hinsichtlich der Charakterisierungen im Labormaßstab ist es nicht unüblich, mit grampositiven Bakterien zu arbeiten. Besonders vorteilhaft ist es, wenn ein bestimmtes Enzym auch von dem Wirt produziert wird, aus dem es ursprünglich stammt, weil von diesem die betreffenden Reguklationssignale i.A. optimal umgesetzt werden.The prior art is particularly for the Production of enzymes from gram-positive organisms established for this also choose gram-positive expression hosts. But also regarding the characterizations on a laboratory scale, it is not uncommon to use gram positive bacteria to work. It is particularly advantageous if a particular enzyme is also produced by the host where it originally came from because this regulating signals generally optimal be implemented.
Die zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen sind somit nicht minder vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um grampositive Bakterien handelt, insbesondere der Gattungen Staphylococcus, Corynebakterium oder Bacillus, insbesondere der Spezies Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. alcalophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. agaradherens, B. globigii oder B. lentus.The cells according to the invention described above are therefore no less preferably characterized in that it is these are gram-positive bacteria, especially of the genera Staphylococcus, Corynebacterium or Bacillus, especially the Species Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, B. alcalophilus, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. stearothermophilus, B. agaradherens, B. globigii or B. lentus.
Diesem Erfindungsgegenstand sind, schließlich, noch alle Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zuzurechnen. Denn hierdurch wird der wirtschaftlich eigentlich interessierende Gegenstand tatsächlich zur Verfügung gestellt. Solche eine Herstellung kann beispielsweise über eine chemische Synthese des betreffenden Proteins erfolgen.This subject of the invention finally, still all methods for producing an α-amylase variant according to the invention Act. Because this makes the object that is actually of economic interest indeed to disposal posed. Such a production can be done, for example, via a chemical synthesis of the protein in question.
Demgegenüber sind entsprechend den bekannten und oben dargestellten molekularbiologischen Techniken jedoch jene Verfahren bevorzugt, die auf die oben ausgeführten Nukleinsäuren zurückgreifen, besonders bevorzugt unter Verwendung eines oben dargestellten Vektors und ganz besonders bevorzugt unter Verwendung einer oben beschriebenen Zelle.In contrast, are according to the known and molecular biological techniques outlined above, however Preferred methods that use the nucleic acids set out above, particularly preferably using a vector shown above and most preferably using one described above Cell.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellen Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie eine oben beschriebene α-Amylase-Variante enthalten.Your own subject of the invention represent means that are characterized in that they are one above described α-amylase variant contain.
Hiermit ist jedes Mittel gemeint, in dem die betreffende α-Amylase in irgendeiner Form zur Anwendung, d.h in den erwünschten hydrolytischen Kontakt zu ihrem Substrat Stärke oder Stärke-ähnliches Polysaccharid gebracht oder hierfür vorbereitet wird. Der gewünschte Kontakt erfolgt in der Regel in einem wäßrigen Milieu, das günstigerweise auf einen entsprechenden pH-Wert gepuffert ist und gegebenenfalls weitere begünstigende Faktoren enthält. Hierzu gehören beispielsweise weitere Enzyme, die die unmittelbaren Reaktionsprodukte weiter umsetzen, etwa in Hinblick auf Stärkeverflüssigung für die Nahrungsmittel- oder Tierfutterherstellung oder für eine Ethanolproduktion. Ferner gehören hierzu niedermolekulare Verbindungen, die beispielsweise in entstehende Oligosaccharide wie Cyclodextrine eingeschlossen werden, oder niedermolekulare Verbindungen, die die Spaltungsprodukte weiter solubilisieren oder eine den Gesamtprozeß begünstigende Wirkung aufweisen, wie etwa Tenside im Rahmen einer Waschmittelrezeptur. Es kann sich auch um Mittel handeln, in denen die erwünschte amylolytische Aktivität erst mit einer großen Zeitverzögerung induziert werden soll, wie beispielsweise bei temporären Klebeverfahren, nach welchen die α-Amylase-Variante dem betreffenden Klebstoff schon frühzeitig zugesetzt aber erst nach langer Zeit durch Erhöhung des Wassergehalts tatsächlich aktiv wird. Dies trifft beispielsweise auch auf Wasch- und Reinigungsmittel zu, die erst nach einer Phase der Lagerung im Augenblick der Verdünnung in der Waschflotte gegenüber dem Substrat aktiv werden sollen.This means every means in which the α-amylase in question in any form for use, i.e. in the desired brought hydrolytic contact to their substrate starch or starch-like polysaccharide or for this is being prepared. The one you want Contact usually takes place in an aqueous environment, which is beneficial is buffered to an appropriate pH and, if necessary more favorable Contains factors. This includes For example, other enzymes that continue the immediate reaction products implement, for example with regard to starch liquefaction for food or Animal feed production or for an ethanol production. These also include low molecular weight Compounds that arise, for example, in oligosaccharides such as including cyclodextrins, or low molecular weight compounds, which further solubilize the cleavage products or favor the overall process Have an effect, such as surfactants in the context of a detergent formulation. It can also be agents in which the desired amylolytic activity only with a big one Time Delay should be induced, such as in temporary adhesive processes, according to which the α-amylase variant added to the adhesive in question early on after a long time by increasing of the water content actually becomes active. This also applies to detergents and cleaning agents, for example to which only after a phase of storage at the moment of dilution in opposite the wash liquor the substrate should become active.
Eine Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands sind derartige Mittel, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Wasch- oder Reinigungsmittel handelt.An embodiment of this subject of the invention are such means, which are characterized in that it is detergents or cleaning agents.
Die erfindungsgemäßen Eigenschaften und wichtigen Inhaltsstoffe für derartige Wasch- und Reinigungsmittel werden weiter unten ausführlich dargestellt. An dieser Stelle erfolgt zunächst eine Übersicht über die wichtigsten und deshalb erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen derartiger Wasch- und Reinigungsmittel.The properties according to the invention and important ingredients for such detergents and cleaning agents are described in detail below. At this point, an overview of the most important and therefore particularly preferred embodiments of such washing and detergents.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es 0,000001 Gewichts-Prozent bis 5 Gew.-%, und zunehmend bevorzugt 0,00001 bis 4 Gew.-%, 0,0001 bis 3 Gew.-%, 0,001 bis 2 Gew.-% oder 0,01 bis 1 Gew.-% der α-Amylase-Variante enthält.A washing machine according to the invention is preferably or detergent characterized in that it is 0.000001 weight percent to 5% by weight, and more preferably 0.00001 to 4% by weight, 0.0001 up to 3% by weight, 0.001 to 2% by weight or 0.01 to 1% by weight of the α-amylase variant contains.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich andere Enzyme enthält, insbesondere hydrolytische Enzyme oder Oxidoreduktasen, besonders bevorzugt weitere Amylasen, Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Hemicellulasen, Cellulasen, β-Glucanasen, Oxidasen, Peroxidasen, Laccasen.A washing machine according to the invention is preferably or cleaning agent, characterized in that it additionally contains other enzymes, in particular hydrolytic enzymes or oxidoreductases, particularly preferably others Amylases, proteases, lipases, cutinases, hemicellulases, cellulases, β-glucanases, Oxidases, peroxidases, laccases.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß die α-Amylase-Variante durch einen der sonstigen Bestandteile des Mittels stabilisiert und/oder in ihrem Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des Mittels gesteigert wird.A washing machine according to the invention is preferably or cleaning agent, characterized in that the α-amylase variant by a the other ingredients of the agent stabilized and / or in your contribution to the washing or cleaning performance of the Is increased by means.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt fest ist, vorzugsweise nach einem Kompaktierungsschritt für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt, daß es insgesamt kompaktiert ist.A washing machine according to the invention is preferably or detergent characterized in that it is solid overall, preferably after a compacting step for at least one of the components contained, particularly preferred that it is compacted overall.
Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Wasch- oder Reinigungsmittel dadurch gekennzeichnet, daß es insgesamt flüssig, gelförmig oder pastös ist, vorzugsweise unter Verkapselung für mindestens eine der enthaltenen Komponenten, besonders bevorzugt unter Verkapselung mindestens eines der enthaltenen Enzyme, ganz besonders bevorzugt unter Verkapselung der α-Amylase-Variante.A washing machine according to the invention is preferably or cleaning agent characterized in that it is liquid, gel-like or pasty is, preferably encapsulated for at least one of the contained Components, particularly preferably encapsulating at least one of the enzymes contained, very particularly preferably with encapsulation the α-amylase variant.
Ein wichtiges Einsatzgebiet für Amylasen ist das als aktive Komponenten in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Reinigung von Textilien oder von festen Oberflächen, wie beispielsweise Geschirr, Fußböden oder Arbeitsgeräten. In diesen Anwendungen dient die amylolytische Aktivität dazu, kohlenhydrathaltige Verunreinigungen und insbesondere solche auf Stärkebasis hydrolytisch aufzulösen oder vom Untergrund abzulösen. Dabei können sie allein, in geeigneten Medien oder auch in Wasch- oder Reinigungsmitteln zur Anwendung gebracht werden. Die hierfür zu wählenden Bedingungen, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein, also in Bezug auf die Anschmutzung und auf das Trägermaterial. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 10°C bei manuellen Mitteln über 40°C und 60°C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Die übrigen Bedigungen können über die übrigen, unten ausgeführten Bestandteile der Mittel ebenfalls sehr spezifisch auf den jeweiligen Reinigungszweck ausgelegt werden.An important area of application for amylases is that as active components in detergents or cleaning agents for cleaning textiles or solid surfaces, such as for example dishes, floors or tools. In the amylolytic activity serves these applications carbohydrate-containing impurities and especially those starch dissolve hydrolytically or detach from the surface. there can it alone, in suitable media or in detergents or cleaning agents be applied. The conditions to be selected for this, such as Temperature, pH, ionic strength, Redox conditions or mechanical influences should for the respective cleaning problem must be optimized, i.e. with regard to the dirt and on the carrier material. So are usual Temperatures for detergents and cleaning agents in the range of 10 ° C with manual means over 40 ° C and 60 ° C to towards 95 ° at mechanical means or in technical applications. Because with modern Washing machines and dishwashers The temperature is usually continuously adjustable, as are all intermediate levels temperature included. Preferably the ingredients of the funds concerned coordinated. The other conditions can over the rest, outlined below Components of the funds are also very specific to the respective Be designed for cleaning purposes.
Bevorzugte erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel zeichnen sich dadurch aus, daß unter irgendwelchen der auf diese Weise definierbaren Bedingungen die Wasch- oder Reinigungsleistung dieses Mittels durch Zugabe einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante gegenüber der Rezeptur ohne diese Variante verbessert wird. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung.Preferred laundry detergents according to the invention and cleaning agents are characterized in that under any of the conditions that can be defined in this way Washing or cleaning performance this agent by adding an α-amylase variant according to the invention to the Recipe is improved without this variant. Synergies are preferred in terms of cleaning performance.
Eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante kann sowohl in Mitteln für Großverbraucher oder technische Anwender als auch in Produkten für den Privatverbraucher Anwendung finden, wobei alle im Stand der Technik etablierten und/oder zweckmäßigen Darreichungsformen auch Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen. Mit den erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmitteln sind somit alle denkbaren Reinigungsmittelarten gemeint, sowohl Konzentrate, als auch unverdünnt anzuwendende Mittel; zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche, beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet. Jegliche Wasch- oder Reinigungsmittelart stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, sofern sie um eine erfindungsgemäße Amylase bereichert ist.An α-amylase variant according to the invention can both in funds for bulk consumers or technical users as well as in products for private use find, all established and / or appropriate dosage forms in the prior art also embodiments of the present invention. With the washing according to the invention or cleaning agents are all conceivable types of cleaning agents meant both concentrates and agents to be used undiluted; to the Use on a commercial scale, in the washing machine or hand washing, or cleaning. These include detergents, for example for textiles, Carpets, or natural fibers, for according to the present invention, the term detergent is used. This includes for example, dishwashing detergent for dishwashers or manual dishwashing detergent or cleaner for hard surfaces such as metal, glass, porcelain, ceramics, tiles, stone, lacquered Surfaces, Plastics, wood or leather; For according to the present invention, such is the term cleaning agent used. Any type of detergent or cleaning agent represents one embodiment of the present invention, provided that it is an amylase according to the invention is enriched.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle nach den Stand der Technik etablierten und/oder alle zweckmäßigen Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Mittel. Dazu zählen beispielsweise feste, pulverförmige, flüssige, gelförmige oder pastöse Mittel, gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen, komprimiert oder nicht komprimiert; ferner gehören beispielsweise dazu: Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt.Embodiments of the Present Invention encompass all and / or established according to the prior art all appropriate dosage forms of the agents according to the invention. These include for example solid, powdery, liquid, gel or pasty Means, optionally also from several phases, compressed or not compressed; also belong for example: extrudates, granules, tablets or pouches, both in bulk as well as packed in portions.
α-Amylasen, werden in erfindungsgemäßen Mitteln beispielsweise mit einzelnen oder mehreren der folgenden Inhaltsstoffe kombiniert: nichtionische, anionische und/oder kationische Tenside, Bleichmittel, Bleichaktivatoren, Bleichkatalysatoren, Builder und/oder Cobuilder, Lösungsmittel, Verdicker, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Korrosionsinhibitoren, insbesondere Silberschutzmittel, Soil-Release-Wirkstoffe, Farbtransfer (oder -Übertragungs)-Inhibitoren, Schauminhibitoren, Abrasivstoffe, Farbstoffe, Duftstoffe, antimikrobielle Wirkstoffe, UV-Schutzmittel, Enzyme wie beispielsweise Proteasen, (gegebenenfalls andere) Amylasen, Lipasen, Cellulasen, Hemicellulasen oder Oxidasen, Stabilisatoren, insbesondere Enzymstabilisatoren, und andere Komponenten, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.α-Amylases are combined in agents according to the invention, for example, with one or more of the following ingredients: nonionic, anionic and / or cationic surfactants, bleaching agents, bleach activators, bleaching catalysts, builders and / or cobuilders, solvents, thickeners, sequestering agents, electrolytes, optical brighteners, Graying inhibitors, corrosion inhibitors, in particular silver protection agents, soil release agents, color transfer (or transfer) inhibitors, foam inhibitors, abrasives, dyes, fragrances, antimicrobial agents, UV protection agents, enzymes such as, for example Proteases, (optionally other) amylases, lipases, cellulases, hemicellulases or oxidases, stabilizers, in particular enzyme stabilizers, and other components which are known from the prior art.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann, beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, zum Beispiel aus Kokos-, Palm-, Talgfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise C12-14-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-11-Alkohol mit 7 EO, C13-15-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, C12-18-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus C12-14-Alkohol mit 3 EO und C12-18-Alkohol mit 5 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow range ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind Talgfettalkohol mit 14 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO.The nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, in particular primary alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and an average of 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol residue can be linear or preferably methyl-branched in the 2-position , or can contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as are usually present in oxo alcohol radicals. However, alcohol ethoxylates with linear residues of alcohols of native origin with 12 to 18 carbon atoms, for example from coconut, palm, tallow fat or oleyl alcohol, and an average of 2 to 8 EO per mole of alcohol are particularly preferred. The preferred ethoxylated alcohols include, for example, C 12-14 alcohols with 3 EO or 4 EO, C 9-11 alcohol with 7 EO, C 13-15 alcohols with 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, C 12-18 alcohols with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures thereof, such as mixtures of C 12-14 alcohol with 3 EO and C 12-18 alcohol with 5 EO. The degrees of ethoxylation given represent statistical averages, which can be an integer or a fraction for a specific product. Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow range ethoxylates, NRE). In addition to these nonionic surfactants, fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples include tallow fatty alcohol with 14 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester.Another class of preferred nonionic surfactants, either as the sole nonionic Surfactant or used in combination with other nonionic surfactants are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably with 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, in particular Fatty acid methyl ester.
Eine weitere Klasse von nichtionischen Tensiden, die vorteilhafterweise eingesetzt werden können, sind die Alkylpolyglycoside (APG). Einsetzbare Alkypolyglycoside genügen der allgemeinen Formel RO(G)z, in der R für einen linearen oder verzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten, gesättigten oder ungesättigten, aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G das Symbol ist, das für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Glycosylierungsgrad z liegt dabei zwischen 1,0 und 4,0, vorzugsweise zwischen 1,0 und 2,0 und insbesondere zwischen 1,1 und 1,4. Bevorzugt eingesetzt werden lineare Alkylpolyglucoside, also Alkylpolyglycoside, in denen der Polyglycosylrest ein Glucoserest und der Alkylrest ein n-Alkylrest ist.Another class of nonionic surfactants that can advantageously be used are the alkyl polyglycosides (APG). Alkypolyglycosides that can be used satisfy the general formula RO (G) z , in which R denotes a linear or branched, in particular methyl-branched, saturated or unsaturated, aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18, carbon atoms and G is the Is symbol which stands for a glycose unit with 5 or 6 carbon atoms, preferably for glucose. The degree of glycosylation z is between 1.0 and 4.0, preferably between 1.0 and 2.0 and in particular between 1.1 and 1.4. Linear alkyl polyglucosides, ie alkyl polyglycosides, in which the polyglycosyl radical is a glucose radical and the alkyl radical is an n-alkyl radical are preferably used.
Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Der Anteil dieser nichtionischen Tenside liegt vorzugsweise nicht über dem der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere bei nicht mehr als der Hälfte davon.Also non-ionic surfactants of the type the amine oxides, for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallow alkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides can be suitable. The proportion of these nonionic surfactants is preferably no over that of the ethoxylated fatty alcohols, especially when no longer than half from that.
Weitere geeignete Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (II), in der RCO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R1 für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht. Bei den Polyhydroxyfettsäureamiden handelt es sich um bekannte Stoffe, die üblicherweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers mit Ammoniak, einem Alkylamin oder einem Alkanolamin und nachfolgende Acylierung mit einer Fettsäure, einem Fettsäurealkylester oder einem Fettsäurechlorid erhalten werden können.Other suitable surfactants are polyhydroxy fatty acid amides of the formula (II), in which RCO stands for an aliphatic acyl radical with 6 to 22 carbon atoms, R 1 for hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl radical with 1 to 4 carbon atoms and [Z] for a linear or branched polyhydroxyalkyl radical with 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups. The polyhydroxy fatty acid amides are known substances which can usually be obtained by reductive amination of a reducing sugar with ammonia, an alkylamine or an alkanolamine and subsequent acylation with a fatty acid, a fatty acid alkyl ester or a fatty acid chloride.
Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (III), in der R für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R1 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R2 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei C1-4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest steht, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes.The group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (III) in which R represents a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms, R 1 represents a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical having 2 to 8 carbon atoms and R 2 represents a linear, branched or cyclic alkyl radical or an aryl radical or an oxyalkyl radical having 1 to 8 carbon atoms, C 1-4 -alkyl or phenyl radicals being preferred and [Z] being a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted by at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated Derivatives of this remainder.
[Z] wird vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines reduzierenden Zuckers erhalten, beispielsweise Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden.[Z] is preferably obtained by reductive amination of a reducing sugar, for example glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose. The N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can, for example, by reaction with fatty acid methyl esters in counter were an alkoxide as a catalyst in the desired polyhydroxy fatty acid amides.
Als anionische Tenside werden beispielsweise solche vom Typ der Sulfonate und Sulfate eingesetzt. Als Tenside vom Sulfonat-Typ kommen dabei vorzugsweise C9-13-Alkylbenzolsulfonate, Olefinsulfonate, d.h. Gemische aus Alken- und Hydroxyalkansulfonaten sowie Disulfonaten, wie man sie beispielsweise aus C12-18-Monoolefinen mit end- oder innenständiger Doppelbindung durch Sulfonieren mit gasförmigem Schwefeltrioxid und anschließende alkalische oder saure Hydrolyse der Sulfonierungsprodukte erhält, in Betracht. Geeignet sind auch Alkansulfonate, die aus C12-18-Alkanen beispielsweise durch Sulfochlorierung oder Sulfoxidation mit anschließender Hydrolyse beziehungsweise Neutralisation gewonnen werden. Ebenso sind auch die Ester von α-Sulfofettsäuren (Estersulfonate), zum Beispiel die α-sulfonierten Methylester der hydrierten Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren geeignet.Anionic surfactants used are, for example, those of the sulfonate and sulfate type. The surfactants of the sulfonate type are preferably C 9-13- alkylbenzenesulfonates, olefin sulfonates, ie mixtures of alkene and hydroxyalkanesulfonates and disulfonates such as are obtained, for example, from C 12-18 monoolefins with a terminal or internal double bond by sulfonation with gaseous sulfur trioxide and subsequent alkaline or acidic hydrolysis of the sulfonation products. Also suitable are alkanesulfonates obtained from C 12-18 alkanes, for example by sulfochlorination or sulfoxidation with subsequent hydrolysis or neutralization. The esters of α-sulfofatty acids (ester sulfonates), for example the α-sulfonated methyl esters of hydrogenated coconut, palm kernel or tallow fatty acids, are also suitable.
Weitere geeignete Aniontenside sind sulfierte Fettsäureglycerinester. Unter Fettsäureglycerinestern sind die Mono-, Di- und Triester sowie deren Gemische zu verstehen, wie sie bei der Herstellung durch Veresterung von einem Monoglycerin mit 1 bis 3 Mol Fettsäure oder bei der Umesterung von Triglyceriden mit 0,3 bis 2 Mol Glycerin erhalten werden. Bevorzugte sulfierte Fettsäureglycerinester sind dabei die Sulfierprodukte von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, beispielsweise der Capronsäure, Caprylsäure, Caprinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure oder Behensäure.Other suitable anionic surfactants are sulfonated fatty acid glycerol esters. Among fatty acid glycerol esters are the mono-, di- and triesters and their mixtures to understand how they in the manufacture by esterification of a monoglycerin with 1 to 3 moles of fatty acid or in the transesterification of triglycerides with 0.3 to 2 moles of glycerin be preserved. Preferred sulfonated fatty acid glycerol esters are included the sulfonation products of saturated fatty acids with 6 to 22 carbon atoms, for example caproic acid, caprylic acid, capric acid, myristic acid, lauric acid, palmitic acid, stearic acid or Behenic acid.
Als Alk(en)ylsulfate werden die Alkali- und insbesondere die Natriumsalze der Schwefelsäurehalbester der C12-C18-Fettalkohole, beispielsweise aus Kokosfettalkohol, Talgfettalkohol, Lauryl-, Myristyl-, Cetyl- oder Stearylalkohol oder der C10-C20-Oxoalkohole und diejenigen Halbester sekundärer Alkohole dieser Kettenlängen bevorzugt. Weiterhin bevorzugt sind Alk(en)ylsulfate der genannten Kettenlänge, welche einen synthetischen, auf petrochemischer Basis hergestellten geradkettigen Alkylrest enthalten, die ein analoges Abbauverhalten besitzen wie die adäquaten Verbindungen auf der Basis von fettchemischen Rohstoffen. Aus waschtechnischem Interesse sind die C12-C16-Alkylsulfate und C12-C15-Alkylsulfate sowie C14-C15-Alkylsulfate bevorzugt. Auch 2,3-Alkylsulfate sind geeignete Aniontenside.As alk (en) yl sulfates are the alkali and especially the sodium salts of the sulfuric acid half esters of C 12 -C 18 fatty alcohols, for example from coconut fatty alcohol, tallow fatty alcohol, lauryl, myristyl, cetyl or stearyl alcohol or the C 10 -C 20 oxo alcohols and those half-esters of secondary alcohols of this chain length are preferred. Also preferred are alk (en) yl sulfates of the chain length mentioned, which contain a synthetic, petrochemical-based straight-chain alkyl radical which have a degradation behavior similar to that of the adequate compounds based on oleochemical raw materials. The C 12 -C 16 alkyl sulfates and C 12 -C 15 alkyl sulfates as well as C 14 -C 15 alkyl sulfates are preferred from the point of view of washing technology. 2,3-Alkyl sulfates are also suitable anionic surfactants.
Auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7-21-Alkohole, wie 2-Methyl-verzweigte C9-11-Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO, sind geeignet. Sie werden in Reinigungsmitteln aufgrund ihres hohen Schaumverhaltens nur in relativ geringen Mengen, beispielsweise in Mengen bis 5 Gew.-%, üblicherweise von 1 bis 5 Gew.-%, eingesetzt.The sulfuric acid monoesters of the straight-chain or branched C 7-21 alcohols ethoxylated with 1 to 6 mol of ethylene oxide, such as 2-methyl-branched C 9-11 alcohols with an average of 3.5 mol of ethylene oxide (EO) or C 12-18 - Fatty alcohols with 1 to 4 EO are suitable. Because of their high foaming behavior, they are used in cleaning agents only in relatively small amounts, for example in amounts of up to 5% by weight, usually from 1 to 5% by weight.
Weitere geeignete Aniontenside sind auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8-18-Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen (Beschreibung siehe unten). Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen.Other suitable anionic surfactants are also the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters and which are monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and especially ethoxylated fatty alcohols. Preferred sulfosuccinates contain C 8-18 fatty alcohol residues or mixtures thereof. Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol residue, which is derived from ethoxylated fatty alcohols, which in themselves are nonionic surfactants (description see below). Again, sulfosuccinates, the fatty alcohol residues of which are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are particularly preferred. It is also possible to use alk (en) ylsuccinic acid with preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof.
Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierte Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Talgfettsäuren, abgeleitete Seifengemische.Other anionic surfactants especially soaps. Saturated fatty acid soaps are suitable, like the salts of lauric acid, myristic, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and especially from natural ones fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids, derived soap mixtures.
Die anionischen Tenside einschließlich der Seifen können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.The anionic surfactants including the Can soaps in the form of their sodium, potassium or Ammonium salts as well as soluble Salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine, are present. The anionic surfactants are preferably in the form of their sodium or potassium salts, especially in the form of the sodium salts.
Die Tenside können in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln insgesamt in einer Menge von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, bezogen auf das fertige Mittel, enthalten sein.The surfactants can be used in the cleaning agents according to the invention. or detergents in total in an amount of preferably 5% by weight up to 50% by weight, in particular from 8% by weight to 30% by weight on the finished product.
Erfindungsgemäße Mittel können Bleichmittel enthalten. Unter den als Bleichmittel dienenden, in Wasser H2O2 liefernden Verbindungen haben das Natriumpercarbonat, das Natriumperborattetrahydrat und das Natriumperboratmonohydrat besondere Bedeutung. Weitere brauchbare Bleichmittel sind beispielsweise Peroxopyrophosphate, Citratperhydrate sowie H2O2 liefernde persaure Salze oder Persäuren, wie Persulfate beziehungsweise Perschwefelsäure. Brauchbar ist auch das Harnstoffperoxohydrat Percarbamid, das durch die Formel HN2-CO-NH2·H2O2 beschrieben werden kann. Insbesondere beim Einsatz der Mittel für das Reinigen harter Oberflächen, zum Beispiel beim maschinellen Geschirrspülen, können sie gewünschtenfalls auch Bleichmittel aus der Gruppe der organischen Bleichmittel enthalten, obwohl deren Einsatz prinzipiell auch bei Mitteln für die Textilwäsche möglich ist. Typische organische Bleichmittel sind die Diacylperoxide, wie zum Beispiel Dibenzoylperoxid. Weitere typische organische Bleichmittel sind die Peroxysäuren, wobei als Beispiele besonders die Alkylperoxysäuren und die Arylperoxysäuren genannt werden. Bevorzugte Vertreter sind die Peroxybenzoesäure und ihre ringsubstituierten Derivate, wie Alkylperoxybenzoesäuren, aber auch Peroxy-α-Naphthoesäure und Magnesium-monoperphthalat, die aliphatischen oder substituiert aliphatischen Peroxysäuren, wie Peroxylaurinsäure, Peroxystearinsäure, ε-Phthalimidoperoxycapronsäure (Phthalimidoperoxyhexansäure, PAP), o-Carboxybenzamidoperoxycapronsäure, N-Nonenylamidoperadipinsäure und N-Nonenylamidopersuccinate, und aliphatische und araliphatische Peroxydicarbonsäuren, wie 1,12-Diperoxycarbonsäure, 1,9-Diperoxyazelainsäure, Diperoxysebacinsäure, Diperoxybrassylsäure, die Diperoxyphthalsäuren, 2-Decyldiperoxybutan-1,4-disäure, N,N-Terephthaloyl-di(6-aminopercapronsäure) können eingesetzt werden.Agents according to the invention can contain bleaching agents. Among the compounds which serve as bleaching agents and supply H 2 O 2 in water, sodium percarbonate, sodium perborate tetrahydrate and sodium perborate monohydrate are of particular importance. Further bleaching agents that can be used are, for example, peroxopyrophosphates, citrate perhydrates and H 2 O 2 -producing peracidic salts or peracids, such as persulfates or persulfuric acid. The urea peroxohydrate percarbamide can also be used, which can be described by the formula HN 2 -CO-NH 2 .H 2 O 2 . In particular when using the agents for cleaning hard surfaces, for example in automatic dishwashing, they can, if desired, also contain bleaching agents from the group of organic bleaching agents, although their use is in principle also possible for agents for textile washing. Typical organic bleaching agents are the diacyl peroxides, such as dibenzoyl peroxide. Other typical organic bleaching agents are peroxy acids, examples of which include alkyl peroxy acids and aryl peroxy acids. Preferred representatives are the Peroxybenzoic acid and its ring-substituted derivatives, such as alkylperoxybenzoic acids, but also peroxy-α-naphthoic acid and magnesium monoperphthalate, the aliphatic or substituted aliphatic peroxyacids, such as peroxylauric acid, peroxystearic acid, ε-phthalimidoperoxycaproic acid (phthalimidoxyoxyamide), phthalimidoxybenzoic acid, phthalimidoxybenzoic acid and phthalimidoxybenzoic acid, phthalimidoxybenzoic acid, phthalimidoxybenzoic acid, phthalimidoxybenzoic acid, phthalimidoxybenzoic acid and phthalimidoxybenzoic acid, N-nonenylamidopersuccinates, and aliphatic and araliphatic peroxydicarboxylic acids, such as 1,12-diperoxycarboxylic acid, 1,9-diperoxyazelaic acid, diperoxysebacic acid, diperoxybrassylic acid, the diperoxyphthalic acids, 2-decyldiperoxybutane-1,4-dereo, Noyl aminopercaproic acid) can be used.
Der Gehalt der Mittel an Bleichmittel kann 1 bis 40 Gew.-% und insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, betragen, wobei vorteilhafterweise Perboratmonohydrat oder Percarbonat eingesetzt wird. Eine synergistische Verwendung von Amylase mit Percarbonat oder von Amylase mit Percarbonsäure wird mit den Anmeldungen WO 99/63036, beziehungsweise WO 99/63037 offenbart.The bleach content of the agent can be 1 to 40% by weight and in particular 10 to 20% by weight, where perborate monohydrate or percarbonate is advantageously used becomes. A synergistic use of amylase with percarbonate or of amylase with percarboxylic acid is with the applications WO 99/63036 and WO 99/63037 disclosed.
Um beim Waschen bei Temperaturen
von 60°C
und darunter, und insbesondere bei der Wäschevorbehandlung eine verbesserte
Bleichwirkung zu erreichen, können
die Mittel auch Bleichaktivatoren enthalten. Als Bleichaktivatoren
können
Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit
vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen,
insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte
Perbenzoesäure
ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder
N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte
Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine,
insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate,
insbesondere 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin
(DADHT), acylierte Glycolurile, insbesondere 1,3,4,6-Tetraacetylglycoluril
(TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate,
insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- beziehungsweise iso-NOBS),
acylierte Hydroxycarbonsäuren,
wie Triethyl-O-acetylcitrat
(TEOC), Carbonsäureanhydride,
insbesondere Phthalsäureanhydrid,
Isatosäureanhydrid
und/oder Bernsteinsäureanhydrid,
Carbonsäureamide,
wie N-Methyldiacetamid,
Glycolid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin,
Ethylenglycoldiacetat, Isopropenylacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran
und die aus den deutschen Patentanmeldungen
Zusätzlich zu den konventionellen
Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch sogenannte Bleichkatalysatoren
enthalten sein. Bei diesen Stoffen handelt es sich um bleichverstärkende Übergangsmetallsalze
beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe
wie beispielsweise Mn-, Fe-, Co-, Ru- oder Mo-Salenkomplexe oder
-carbonylkomplexe. Auch Mn-, Fe-, Co-, Ru-, Mo-, Ti-, V- und Cu-Komplexe
mit N-haltigen Tripod-Liganden sowie Co-, Fe-, Cu- und Ru-Aminkomplexe
sind als Bleichkatalysatoren geeignet, wobei solche Verbindungen
bevorzugt eingesetzt werden, die in der
Erfindungsgemäße Mittel enthalten in der Regel einen oder mehrere Builder, insbesondere Zeolithe, Silikate, Carbonate, organische Cobuilder und – wo keine ökologischen Gründe gegen ihren Einsatz sprechen – auch die Phosphate. Letztere sind insbesondere in Reinigungsmitteln für das maschinelle Geschirrspülen bevorzugt einzusetzende Gerüststoffe.Agents according to the invention contain in the Usually one or more builders, especially zeolites, silicates, Carbonates, organic cobuilders and - where there are no ecological reasons speak their commitment - too the phosphates. The latter are in particular in cleaning agents for the machine Wash the dishes preferably used builders.
Zu nennen sind hier kristalline,
schichtförmige
Natriumsilikate der allgemeinen Formel NaMSixO2x+1·yH2O, wobei M Natrium oder Wasserstoff bedeutet,
x eine Zahl von 1,6 bis 4, vorzugsweise 1,9 bis 4,0 und y eine Zahl
von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Derartige
kristalline Schichtsilicate werden beispielsweise in der europäischen Patentanmeldung
Einsetzbar sind auch amorphe Natriumsilikate mit einem Modul Na2O : SiO2 von 1:2 bis 1:3,3, vorzugsweise von 1:2 bis 1:2,8 und insbesondere von 1:2 bis 1:2,6, welche löseverzögert sind und Sekundärwascheigenschaften aufweisen. Die Löseverzögerung gegenüber herkömmlichen amorphen Natriumsilikaten kann dabei auf verschiedene Weise, beispielsweise durch Oberflächenbehandlung, Compoundierung, Kompaktierung/Verdichtung oder durch Übertrocknung hervorgerufen worden sein. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter dem Begriff "amorph" auch "röntgenamorph" verstanden. Dies heißt, daß die Silikate bei Röntgenbeugungsexperimenten keine scharten Röntgenreflexe liefern, wie sie für kristalline Substanzen typisch sind, sondern allenfalls ein oder mehrere Maxima der gestreuten Röntgenstrahlung, die eine Breite von mehreren Gradeinheiten des Beugungswinkels aufweisen. Es kann jedoch sehr wohl sogar zu besonders guten Buildereigenschaften führen, wenn die Silikatpartikel bei Elektronenbeugungsexperimenten verwaschene oder sogar scharte Beugungsmaxima liefern. Dies ist so zu interpretieren, daß die Produkte mikrokristalline Bereiche der Größe 10 bis einige Hundert nm aufweisen, wobei Werte bis max. 50 nm und insbesondere bis max. 20 nm bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt sind verdichtete/kompaktierte amorphe Silikate, compoundierte amorphe Silikate und übertrocknete röntgenamorphe Silikate.Amorphous sodium silicates with a modulus Na 2 O: SiO 2 of 1: 2 to 1: 3.3, preferably 1: 2 to 1: 2.8 and in particular 1: 2 to 1: 2.6, can also be used are delayed in dissolving and have secondary washing properties. The delay in dissolution compared to conventional amorphous sodium silicates can be caused in various ways, for example by surface treatment, compounding, compacting / compression or by overdrying. In the context of this invention, the term “amorphous” is also understood to mean “X-ray amorphous”. This means that the silicates in X-ray diffraction experiments do not provide the sharp X-ray reflections that are typical of crystalline substances, but at most one or more maxima of the scattered X-rays which have a width of several degree units of the diffraction angle. However, it can very well lead to particularly good builder properties if the silicate particles deliver washed-out or even sharp diffraction maxima in electron diffraction experiments. This is to be interpreted as meaning that the products have microcrystalline areas of size 10 to a few hundred nm, values up to max. 50 nm and in particular up to max. 20 nm are preferred. Compacted / compacted amorphous silicates, compounded amorphous silicates and over-dried X-ray amorphous silicates are particularly preferred.
Ein gegebenenfalls einsetzbarer,
feinkristalliner, synthetischer und gebundenes Wasser enthaltender Zeolith
ist vorzugsweise Zeolith A und/oder P. Als Zeolith P wird Zeolith
MAP® (Handelsprodukt
der Firma Crosfield) besonders bevorzugt. Geeignet sind jedoch auch
Zeolith X sowie Mischungen aus A, X und/oder P. Kommerziell erhältlich und
im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt einsetzbar ist beispielsweise
auch ein Co-Kristallisat
aus Zeolith X und Zeolith A (ca. 80 Gew.-% Zeolith X), das von der
Firma CONDEA Augusta S.p.A. unter dem Markennamen VEGOBOND AX® vertrieben
wird und durch die Formel
Selbstverständlich ist auch ein Einsatz der allgemein bekannten Phosphate als Buildersubstanzen möglich, sofern ein derartiger Einsatz nicht aus ökologischen Gründen vermieden werden sollte. Unter der Vielzahl der kommerziell erhältlichen Phosphate haben die Alkalimetallphosphate unter besonderer Bevorzugung von Pentanatrium- beziehungsweise Pentakaliumtriphosphat (Natrium- beziehungsweise Kaliumtripolyphosphat) in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie die größte Bedeutung.Of course, there is also a stake of the well-known phosphates possible as builder substances, provided that such use is not avoided for ecological reasons should be. Among the variety of commercially available The alkali metal phosphates have a particular preference for phosphates Pentasodium respectively Pentapotassium triphosphate (sodium or potassium tripolyphosphate) of greatest importance in the detergent and cleaning agent industry.
Alkalimetallphosphate ist dabei die summarische Bezeichnung für die Alkalimetall-(insbesondere Natrium- und Kalium-)-Salze der verschiedenen Phosphorsäuren, bei denen man Metaphosphorsäuren (HPO3)n und Orthophosphorsäure H3PO4 neben höhenmolekularen Vertretern unterscheiden kann. Die Phosphate vereinen dabei mehrere Vorteile in sich: Sie wirken als Alkaliträger, verhindern Kalkbeläge auf Maschinenteilen beziehungsweise Kalkinkrustationen in Geweben und tragen überdies zur Reinigungsleistung bei.Alkali metal phosphates is the general term for the alkali metal (especially sodium and potassium) salts of the various phosphoric acids, in which one can distinguish between metaphosphoric acids (HPO 3 ) n and orthophosphoric acid H 3 PO 4 in addition to high molecular weight representatives. The phosphates combine several advantages: They act as alkali carriers, prevent limescale deposits on machine parts or lime incrustations in tissues and also contribute to cleaning performance.
Natriumdihydrogenphosphat, NaH2PO4, existiert als Dihydrat (Dichte 1,91 gcm–3, Schmelzpunkt 60°) und als Monohydrat (Dichte 2,04 gcm–3). Beide Salze sind weiße, in Wasser sehr leicht lösliche Pulver, die beim Erhitzen das Kristallwasser verlieren und bei 200°C in das schwach saure Diphosphat (Dinatriumhydrogendiphosphat, Na2H2P2O7), bei höherer Temperatur in Natiumtrimetaphosphat (Na3P3O9) und Maddrellsches Salz (siehe unten), übergehen. NaH2PO4 reagiert sauer; es entsteht, wenn Phosphorsäure mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und die Maische versprüht wird. Kaliumdihydrogenphosphat (primäres oder einbasiges Kaliumphosphat, Kaliumbiphosphat, KDP), KH2PO4, ist ein weißes Salz der Dichte 2,33 gcm–3, hat einen Schmelzpunkt 253° [Zersetzung unter Bildung von Kaliumpolyphosphat (KPO3)x] und ist leicht löslich in Wasser.Sodium dihydrogen phosphate, NaH 2 PO 4 , exists as a dihydrate (density 1.91 gcm -3 , melting point 60 °) and as a monohydrate (density 2.04 gcm -3 ). Both salts are white, water-soluble powders that lose water of crystallization when heated and at 200 ° C into the weakly acidic diphosphate (disodium hydrogen diphosphate, Na 2 H 2 P 2 O 7 ), at higher temperature in sodium trimetaphosphate (Na 3 P 3 O 9 ) and Maddrell's salt (see below). NaH 2 PO 4 is acidic; it arises when phosphoric acid with sodium hydroxide solution on egg a pH of 4.5 is set and the mash is sprayed. Potassium dihydrogen phosphate (primary or monobasic potassium phosphate, potassium biphosphate, KDP), KH 2 PO 4 , is a white salt with a density of 2.33 gcm -3 , has a melting point of 253 ° [decomposition to form potassium polyphosphate (KPO 3 ) x ] and is light soluble in water.
Dinatriumhydrogenphosphat (sekundäres Natriumphosphat), Na2HPO4, ist ein farbloses, sehr leicht wasserlösliches kristallines Salz. Es existiert wasserfrei und mit 2 Mol. (Dichte 2,066 gcm–3, Wasserverlust bei 95°), 7 Mol. (Dichte 1,68 gcm–3, Schmelzpunkt 48° unter Verlust von 5 H2O) und 12 Mol. Wasser (Dichte 1,52 gcm–3, Schmelzpunkt 35° unter Verlust von 5 H2O), wird bei 100° wasserfrei und geht bei stärkerem Erhitzen in das Diphosphat Na4P2O7 über. Dinatriumhydrogenphosphat wird durch Neutralisation von Phosphorsäure mit Sodalösung unter Verwendung von Phenolphthalein als Indikator hergestellt. Dikaliumhydrogenphosphat (sekundäres od. zweibasiges Kaliumphosphat), K2HPO4, ist ein amorphes, weißes Salz, das in Wasser leicht löslich ist.Disodium hydrogen phosphate (secondary sodium phosphate), Na 2 HPO 4 , is a colorless, very easily water-soluble crystalline salt. It exists anhydrous and with 2 mol. (Density 2.066 gcm -3 , water loss at 95 °), 7 mol. (Density 1.68 gcm -3 , melting point 48 ° with loss of 5 H 2 O) and 12 mol. Water ( Density 1.52 gcm -3 , melting point 35 ° with loss of 5 H 2 O), becomes anhydrous at 100 ° and changes to the diphosphate Na 4 P 2 O 7 when heated to a greater extent. Disodium hydrogen phosphate is prepared by neutralizing phosphoric acid with soda solution using phenolphthalein as an indicator. Dipotassium hydrogen phosphate (secondary or dibasic potassium phosphate), K 2 HPO 4 , is an amorphous, white salt that is easily soluble in water.
Trinatriumphosphat, tertiäres Natriumphosphat, Na3PO4, sind farblose Kristalle, die als Dodecahydrat eine Dichte von 1,62 gcm–3 und einen Schmelzpunkt von 73–76°C (Zersetzung), als Decahydrat (entsprechend 19–20% P2O5) einen Schmelzpunkt von 100°C und in wasserfreier Form (entsprechend 39–40% P2O5) eine Dichte von 2,536 gcm–3 aufweisen. Trinatriumphosphat ist in Wasser unter alkalischer Reaktion leicht löslich und wird durch Eindampfen einer Lösung aus genau 1 Mol Dinatriumphosphat und 1 Mol NaOH hergestellt. Trikaliumphosphat (tertiäres oder dreibasiges Kaliumphosphat), K3PO4, ist ein weißes, zerfließliches, körniges Pulver der Dichte 2,56 gcm–3, hat einen Schmelzpunkt von 1340° und ist in Wasser mit alkalischer Reaktion leicht löslich. Es entsteht zum Beispiel beim Erhitzen von Thomasschlacke mit Kohle und Kaliumsulfat. Trotz des höheren Preises werden in der Reinigungsmittel-Industrie die leichter löslichen, daher hochwirksamen, Kaliumphosphate gegenüber entsprechenden Natrium-Verbindungen vielfach bevorzugt.Trisodium phosphate, tertiary sodium phosphate, Na 3 PO 4 , are colorless crystals which, as dodecahydrate, have a density of 1.62 gcm -3 and a melting point of 73-76 ° C (decomposition), as decahydrate (corresponding to 19-20% P 2 O) 5 ) have a melting point of 100 ° C. and, in anhydrous form (corresponding to 39-40% P 2 O 5 ), a density of 2.536 gcm -3 . Trisodium phosphate is readily soluble in water with an alkaline reaction and is produced by evaporating a solution of exactly 1 mol of disodium phosphate and 1 mol of NaOH. Tripotassium phosphate (tertiary or triphase potassium phosphate), K 3 PO 4 , is a white, deliquescent, granular powder with a density of 2.56 gcm -3 , has a melting point of 1340 ° and is easily soluble in water with an alkaline reaction. It arises, for example, when Thomas slag is heated with coal and potassium sulfate. Despite the higher price, the more soluble, therefore highly effective, potassium phosphates are often preferred over corresponding sodium compounds in the cleaning agent industry.
Tetranatriumdiphosphat (Natriumpyrophosphat), Na4P2O7, existiert in wasserfreier Form (Dichte 2,534 gcm–3, Schmelzpunkt 988°, auch 880° angegeben) und als Decahydrat (Dichte 1,815–1,836 gcm–3, Schmelzpunkt 94° unter Wasserverlust). Beide Substanzen sind farblose, in Wasser mit alkalischer Reaktion lösliche Kristalle. Na4P2O7 entsteht beim Erhitzen von Dinatriumphosphat auf > 200°C oder indem man Phosphorsäure mit Soda im stöchiometrischem Verhältnis umsetzt und die Lösung durch Versprühen entwässert. Das Decahydrat komplexiert Schwermetall-Salze und Härtebildner und verringert daher die Härte des Wassers. Kaliumdiphosphat (Kaliumpyrophosphat), K4P2O7, existiert in Form des Trihydrats und stellt ein farbloses, hygroskopisches Pulver mit der Dichte 2,33 gcm–3 dar, das in Wasser löslich ist, wobei der pH-Wert der 1%igen Lösung bei 25° 10,4 beträgt.Tetrasodium diphosphate (sodium pyrophosphate), Na 4 P 2 O 7 , exists in anhydrous form (density 2.534 gcm -3 , melting point 988 °, also given 880 °) and as decahydrate (density 1.815-1.836 gcm -3 , melting point 94 ° with loss of water) , Both substances are colorless crystals that are soluble in water with an alkaline reaction. Na 4 P 2 O 7 is formed by heating disodium phosphate to> 200 ° C or by reacting phosphoric acid with soda in a stoichiometric ratio and dehydrating the solution by spraying. The decahydrate complexes heavy metal salts and hardness formers and therefore reduces the hardness of the water. Potassium diphosphate (potassium pyrophosphate), K 4 P 2 O 7 , exists in the form of the trihydrate and is a colorless, hygroscopic powder with a density of 2.33 gcm -3 , which is soluble in water, the pH of which is 1% Solution at 25 ° is 10.4.
Durch Kondensation des NaH2PO4 beziehungsweise des KH2PO4 entstehen höhermolekulare Natrium- und Kaliumphosphate, bei denen man cyclische Vertreter, die Natrium- beziehungsweise Kaliummetaphosphate und kettenförmige Typen, die Natrium- beziehungsweise Kaliumpolyphosphate, unterscheiden kann. Insbesondere für letztere sind eine Vielzahl von Bezeichnungen in Gebrauch: Schmelz- oder Glühphosphate, Grahamsches Salz, Kurrolsches und Maddrellsches Salz. Alle höheren Natrium- und Kaliumphosphate werden gemeinsam als kondensierte Phosphate bezeichnet.Condensation of the NaH 2 PO 4 or the KH 2 PO 4 results in higher molecular weight sodium and potassium phosphates, in which one can differentiate cyclic representatives, the sodium or potassium metaphosphates and chain-like types, the sodium or potassium polyphosphates. A large number of terms are used in particular for the latter: melt or glow phosphates, Graham's salt, Kurrol's and Maddrell's salt. All higher sodium and potassium phosphates are collectively referred to as condensed phosphates.
Das technisch wichtige Pentanatriumtriphosphat,
Na5P3O10 (Natriumtripolyphosphat),
ist ein wasserfrei oder mit 6 H2O kristallisierendes,
nicht hygroskopisches, weißes,
wasserlösliches
Salz der allgemeinen Formel NaO-[P(O)(ONa)-O]n-Na
mit n = 3. In 100 g Wasser lösen
sich bei Zimmertemperatur etwa 17 g, bei 60° ca. 20 g, bei 100° rund 32
g des kristallwasserfreien Salzes; nach zweistündigem Erhitzen der Lösung auf 100° entstehen
durch Hydrolyse etwa 8% Orthophosphat und 15% Diphosphat. Bei der
Herstellung von Pentanatriumtriphosphat wird Phosphorsäure mit
Sodalösung
oder Natronlauge im stöchiometrischen
Verhältnis zur
Reaktion gebracht und die Lösung
durch Versprühen
entwässert. Ähnlich wie
Grahamsches Salz und Natriumdiphosphat löst Pentanatriumtriphosphat
viele unlösliche
Metall-Verbindungen (auch Kalkseifen usw.). Pentakaliumtriphosphat,
K5P3O10 (Kaliumtripolyphosphat),
kommt beispielsweise in Form einer 50 Gew.-%-igen Lösung (> 23% P2O5, 25% K2O) in den
Handel. Die Kaliumpolyphosphate finden in der Wasch- und Reinigungsmittel-Industrie
breite Verwendung. Weiter existieren auch Natriumkaliumtripolyphosphate, welche
ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind.
Diese entstehen beispielsweise, wenn man Natriumtrimetaphosphat
mit KOH hydrolysiert:
Diese sind erfindungsgemäß genau wie Natriumtripolyphosphat, Kaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus diesen beiden einsetzbar; auch Mischungen aus Natriumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Mischungen aus Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat oder Gemische aus Natriumtripolyphosphat und Kaliumtripolyphosphat und Natriumkaliumtripolyphosphat sind erfindungsgemäß einsetzbar.According to the invention, these are accurate such as sodium tripolyphosphate, potassium tripolyphosphate or mixtures usable from these two; also mixtures of sodium tripolyphosphate and sodium potassium tripolyphosphate or mixtures of potassium tripolyphosphate and sodium potassium tripolyphosphate or mixtures of sodium tripolyphosphate and are potassium tripolyphosphate and sodium potassium tripolyphosphate usable according to the invention.
Als organische Cobuilder können in den erfindungsgemäßen Wasch- und Reinigungsmitteln insbesondere Polycarboxylate oder Polycarbonsäuren, polymere Polycarboxylate, Polyasparaginsäure, Polyacetale, gegebenenfalls oxidierte Dextrine, weitere organische Cobuilder (siehe unten) sowie Phosphonate eingesetzt werden. Diese Stoffklassen werden nachfolgend beschrieben.Organic cobuilders which can be used in the washing and cleaning agents according to the invention are, in particular, polycarboxylates or polycarboxylic acids, polymeric polycarboxylates, polyaspartic acid, polyacetals, optionally oxidized dextrins, other organic cobuilders (see below) and phosphonates can be used. These classes of substances are described below.
Brauchbare organische Gerüstsubstanzen sind beispielsweise die in Form ihrer Natriumsalze einsetzbaren Polycarbonsäuren, wobei unter Polycarbonsäuren solche Carbonsäuren verstanden werden, die mehr als eine Säurefunktion tragen. Beispielsweise sind dies Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Zuckersäuren, Aminocarbonsäuren, Nitrilotriessigsäure (NTA), sofern ein derartiger Einsatz aus ökologischen Gründen nicht zu vermeiden ist, sowie Mischungen aus diesen. Bevorzugte Salze sind die Salze der Polycarbonsäuren wie Citronensäure, Adipinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Weinsäure, Zuckersäuren und Mischungen aus diesen.Usable organic builders are, for example, those that can be used in the form of their sodium salts polycarboxylic being under polycarboxylic acids such carboxylic acids can be understood that carry more than one acid function. For example these are citric acid, adipic acid, Succinic acid, Glutaric acid, malic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, sugar acids, aminocarboxylic acids, nitrilotriacetic acid (NTA), unless such use for ecological reasons is to be avoided, as well as mixtures of these. Preferred salts are the salts of polycarboxylic acids like citric acid, adipic acid, Succinic acid, glutaric, Tartaric acid, sugar acids and mixtures of these.
Auch die Säuren an sich können eingesetzt werden. Sie besitzen neben ihrer Builderwirkung typischerweise auch die Eigenschaft einer Säuerungskomponente und dienen somit auch zur Einstellung eines niedrigeren und milderen pH-Wertes von Wasch- oder Reinigungsmitteln, sofern nicht der sich durch die Mischung der übrigen Komponenten ergebende pH-Wert gewünscht ist. Insbesondere sind hierbei system-unbd umweltverträgliche Säuren wie Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Gluconsäure und beliebige Mischungen aus diesen zu nennen. Aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide können als pH-Regulatoren dienen. Derartige Regulatoren sind in den erfindungemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.The acids themselves can also be used become. In addition to their builder effect, they typically also have the property of an acidifying component and thus also serve to set a lower and milder one pH of washing or Detergents, unless the mixture of other components Resulting pH desired is. In particular, system-compatible and environmentally compatible acids such as citric acid, Acetic acid, Tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, gluconic acid and to name any mixtures of these. But also mineral acids, in particular sulfuric acid or bases, in particular ammonium or alkali metal hydroxides, can be used as pH regulators are used. Such regulators are in the inventive means in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
Als Builder sind weiter polymere Polycarboxylate geeignet, dies sind beispielsweise die Alkalimetallsalze der Polyacrylsäure oder der Polymethacrylsäure, beispielsweise solche mit einer relativen Molekülmasse von 500 bis 70 000 g/mol.Polymers are also used as builders Suitable polycarboxylates, these are, for example, the alkali metal salts of polyacrylic acid or polymethacrylic acid, for example those with a molecular weight of 500 to 70,000 g / mol.
Bei den für polymere Polycarboxylate angegebenen Molmassen handelt es sich im Sinne dieser Schrift um gewichtsmittlere Molmassen Mw der jeweiligen Säureform, die grundsätzlich mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bestimmt wurden, wobei ein UV-Detektor eingesetzt wurde. Die Messung erfolgte dabei gegen einen externen Polyacrylsäure-Standard, der aufgrund seiner strukturellen Verwandtschaft mit den untersuchten Polymeren realistische Molgewichtswerte liefert. Diese Angaben weichen deutlich von den Molgewichtsangaben ab, bei denen Polystyrolsulfonsäuren als Standard eingesetzt werden. Die gegen Polystyrolsulfonsäuren gemessenen Molmassen sind in der Regel deutlich höher als die in dieser Schrift angegebenen Molmassen.In the context of this document, the molecular weights given for polymeric polycarboxylates are weight-average molecular weights M w of the particular acid form, which were determined in principle by means of gel permeation chromatography (GPC), a UV detector being used. The measurement was carried out against an external polyacrylic acid standard, which provides realistic molecular weight values due to its structural relationship to the polymers investigated. This information differs significantly from the molecular weight information for which polystyrene sulfonic acids are used as standard. The molecular weights measured against polystyrene sulfonic acids are generally significantly higher than the molecular weights given in this document.
Geeignete Polymere sind insbesondere Polyacrylate, die bevorzugt eine Molekülmasse von 2 000 bis 20 000 g/mol aufweisen. Aufgrund ihrer überlegenen Löslichkeit können aus dieser Gruppe wiederum die kurzkettigen Polyacrylate, die Molmassen von 2 000 bis 10 000 g/mol, und besonders bevorzugt von 3 000 bis 5 000 g/mol, aufweisen, bevorzugt sein.Suitable polymers are in particular Polyacrylates, which preferably have a molecular weight of 2,000 to 20,000 have g / mol. Because of their superior solubility can from this group, in turn, the short-chain polyacrylates, the molecular weights from 2,000 to 10,000 g / mol, and particularly preferably from 3,000 to 5,000 g / mol, may be preferred.
Geeignet sind weiterhin copolymere Polycarboxylate, insbesondere solche der Acrylsäure mit Methacrylsäure und der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Maleinsäure. Als besonders geeignet haben sich Copolymere der Acrylsäure mit Maleinsäure erwiesen, die 50 bis 90 Gew.-% Acrylsäure und 50 bis 10 Gew.-% Maleinsäure enthalten. Ihre relative Molekülmasse, bezogen auf freie Säuren, beträgt im allgemeinen 2 000 bis 70 000 g/mol, vorzugsweise 20 000 bis 50 000 g/mol und insbesondere 30 000 bis 40 000 g/mol. Die (co-)polymeren Polycarboxylate können entweder als Pulver oder als wässerige Lösung eingesetzt werden. Der Gehalt der Mittel an (co-)polymeren Polycarboxylaten kann von 0,5 bis 20 Gew.-%, insbesondere 1 bis 10 Gew.-%, betragen.Copolymers are also suitable Polycarboxylates, especially those of acrylic acid with methacrylic acid and of acrylic acid or methacrylic acid with maleic acid. Copolymers of acrylic acid have been particularly suitable maleic proven to contain 50 to 90 wt .-% acrylic acid and 50 to 10 wt .-% maleic acid. Your relative molecular mass, based on free acids, is generally 2,000 to 70,000 g / mol, preferably 20,000 to 50 000 g / mol and in particular 30,000 to 40,000 g / mol. The (co) polymers Polycarboxylates can either as a powder or as an aqueous one solution be used. The content of the agents in (co) polymeric polycarboxylates can be from 0.5 to 20% by weight, in particular 1 to 10% by weight.
Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit können die Polymere auch Allylsulfonsäuren, wie beispielsweise Allyloxybenzolsulfonsäure und Methallylsulfonsäure, als Monomer enthalten.To improve water solubility can the polymers also allylsulfonic acids, such as allyloxybenzenesulfonic acid and methallylsulfonic acid, as Contain monomer.
Insbesondere bevorzugt sind auch biologisch abbaubare Polymere aus mehr als zwei verschiedenen Monomereinheiten, beispielsweise solche, die als Monomere Salze der Acrylsäure und der Maleinsäure sowie Vinylalkohol beziehungsweise Vinylalkohol-Derivate oder die als Monomere Salze der Acrylsäure und der 2-Alkylallylsulfonsäure sowie Zucker-Derivate enthalten.Are also particularly preferred biodegradable polymers from more than two different monomer units, for example those which are salts of acrylic acid and monomers the maleic acid as well as vinyl alcohol or vinyl alcohol derivatives or the salts as monomers of acrylic acid and 2-alkylallylsulfonic acid as well as sugar derivatives.
Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Acrolein und Vinylacetat aufweisen.Other preferred copolymers are those that preferably contain acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts as monomers or acrolein and vinyl acetate.
Ebenso sind als weitere bevorzugte Buildersubstanzen polymere Aminodicarbonsäuren, deren Salze oder deren Vorläufersubstanzen zu nennen. Besonders bevorzugt sind Polyasparaginsäuren beziehungsweise deren Salze und Derivate.Are also preferred as others Builder substances polymeric aminodicarboxylic acids, their salts or their precursors to call. Polyaspartic acids or are particularly preferred their salts and derivatives.
Weitere geeignete Buildersubstanzen sind Polyacetale, welche durch Umsetzung von Dialdehyden mit Polyolcarbonsäuren, welche 5 bis 7 C-Atome und mindestens 3 Hydroxylgruppen aufweisen, erhalten werden können. Bevorzugte Polyacetale werden aus Dialdehyden wie Glyoxal, Glutaraldehyd, Terephthalaldehyd sowie deren Gemischen und aus Polyolcarbonsäuren wie Gluconsäure und/oder Glucoheptonsäure erhalten.Other suitable builder substances are polyacetals, which by reacting dialdehydes with polyol carboxylic acids Have 5 to 7 carbon atoms and at least 3 hydroxyl groups can be. Preferred polyacetals are derived from dialdehydes such as glyoxal, glutaraldehyde, Terephthalaldehyde and mixtures thereof and from polyol carboxylic acids such as gluconic and / or glucoheptonic acid receive.
Weitere geeignete organische Buildersubstanzen sind Dextrine, beispielsweise Oligomere beziehungsweise Polymere von Kohlenhydraten, die durch partielle Hydrolyse von Stärken erhalten werden können. Die Hydrolyse kann nach üblichen, beispielsweise säure- oder enzymkatalysierten Verfahren durchgeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich um Hydrolyseprodukte mit mittleren Molmassen im Bereich von 400 bis 500 000 g/mol. Dabei ist ein Polysaccharid mit einem Dextrose-Äquivalent (DE) im Bereich von 0,5 bis 40, insbesondere von 2 bis 30 bevorzugt, wobei DE ein gebräuchliches Maß für die reduzierende Wirkung eines Polysaccharids im Vergleich zu Dextrose ist, welche ein DE von 100 besitzt. Brauchbar sind sowohl Maltodextrine mit einem DE zwischen 3 und 20 und Trockenglucosesirupe mit einem DE zwischen 20 und 37 als auch sogenannte Gelbdextrine und Weißdextrine mit höheren Molmassen im Bereich von 2 000 bis 30 000 g/mol.Other suitable organic builder substances are dextrins, for example oligomers or polymers of carbohydrates, which can be obtained by partial hydrolysis of starches. The hydrolysis can be carried out by customary, for example acid or enzyme-catalyzed, processes. They are preferably hydrolysis products with average molecular weights in the range from 400 to 500,000 g / mol. A polysaccharide with a dextrose equivalent (DE) in the range from 0.5 to 40, in particular from 2 to 30, is preferred, DE being a customary measure of the reducing effect of a polysaccharide compared to dextrose, which has a DE of 100 has. Both maltodextrins with a DE between 3 and 20 and dry glucose syrups with a DE between 20 and 37 as well as so-called yellow dextrins and white dextrins with higher molar masses in the range from 2,000 to 30,000 g / mol can be used.
Bei den oxidierten Derivaten derartiger
Dextrine handelt es sich um deren Umsetzungsprodukte mit Oxidationsmitteln,
welche in der Lage sind, mindestens eine Alkoholfunktion des Saccharidrings
zur Carbonsäurefunktion
zu oxidieren. Besonders bevorzugte organische Builder für erfindungsgemäße Mittel
sind oxidierte Stärken,
beziehungsweise deren Derivate aus den Anmeldungen
Auch Oxydisuccinate und andere Derivate von Disuccinaten, vorzugsweise Ethylendiamindisuccinat, sind weitere geeignete Cobuilder. Dabei wird Ethylendiamin-N,N'-disuccinat (EDDS) bevorzugt in Form seiner Natrium- oder Magnesiumsalze verwendet. Weiterhin bevorzugt sind in diesem Zusammenhang auch Glycerindisuccinate und Glycerintrisuccinate. Geeignete Einsatzmengen liegen in zeolithhaltigen und/oder silicathaltigen Formulierungen zwischen 3 und 15 Gew.-%.Also oxydisuccinates and other derivatives of disuccinates, preferably ethylenediamine disuccinate, are others suitable cobuilders. This is ethylenediamine-N, N'-disuccinate (EDDS) preferably used in the form of its sodium or magnesium salts. Glycerol disuccinates are also preferred in this context and glycerol trisuccinates. Suitable amounts are those containing zeolite and / or formulations containing silicate between 3 and 15 wt .-%.
Weitere brauchbare organische Cobuilder sind beispielsweise acetylierte Hydroxycarbonsäuren beziehungsweise deren Salze, welche gegebenenfalls auch in Lactonform vorliegen können und welche mindestens 4 Kohlenstoffatome und mindestens eine Hydroxygruppe sowie maximal zwei Säuregruppen enthalten.Other useful organic cobuilders are, for example, acetylated hydroxycarboxylic acids or their Salts, which may also be in lactone form, and which have at least 4 carbon atoms and at least one hydroxy group and a maximum of two acid groups contain.
Eine weitere Substanzklasse mit Cobuildereigenschaften stellen die Phosphonate dar. Dabei handelt es sich insbesondere um Hydroxyalkan- beziehungsweise Aminoalkanphosphonate. Unter den Hydroxyalkanphosphonaten ist das 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonat (HEDP) von besonderer Bedeutung als Cobuilder. Es wird vorzugsweise als Natriumsalz eingesetzt, wobei das Dinatriumsalz neutral und das Tetranatriumsalz alkalisch (pH 9) reagiert. Als Aminoalkanphosphonate kommen vorzugsweise Ethylendiamintetramethylenphosphonat (EDTMP), Diethylentriaminpentamethylenphosphonat (DTPMP) sowie deren höhere Homologe in Frage. Sie werden vorzugsweise in Form der neutral reagierenden Natriumsalze, zum Beispiel als Hexanatriumsalz der EDTMP beziehungsweise als Hepta- und Octa-Natriumsalz der DTPMP, eingesetzt. Als Builder wird dabei aus der Klasse der Phosphonate bevorzugt HEDP verwendet. Die Aminoalkanphosphonate besitzen zudem ein ausgeprägtes Schwermetallbindevermögen. Dementsprechend kann es, insbesondere wenn die Mittel auch Bleiche enthalten, bevorzugt sein, Aminoalkanphosphonate, insbesondere DTPMP, einzusetzen, oder Mischungen aus den genannten Phosphonaten zu verwenden.Another class of substances with cobuilder properties represent the phosphonates. These are in particular around hydroxyalkane or aminoalkanephosphonates. Among the Hydroxyalkane phosphonates, 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonate (HEDP) is particularly special Meaning as a cobuilder. It is preferably used as the sodium salt the disodium salt being neutral and the tetrasodium salt being alkaline (pH 9) reacts. Preferred aminoalkane phosphonates are ethylenediaminetetramethylenephosphonate (EDTMP), diethylenetriaminepentamethylenephosphonate (DTPMP) and their higher Homologues in question. They are preferably in the form of neutral reactions Sodium salts, for example as the hexasodium salt of EDTMP or used as the hepta and octa sodium salt of DTPMP. As a builder HEDP is preferably used from the class of the phosphonates. The aminoalkanephosphonates also have a pronounced ability to bind heavy metals. Accordingly it may be preferred, especially if the agents also contain bleach be to use aminoalkanephosphonates, in particular DTPMP, or mixtures to use from the phosphonates mentioned.
Darüberhinaus können alle Verbindungen, die in der Lage sind, Komplexe mit Erdalkaliionen auszubilden, als Cobuilder eingesetzt werden.In addition, all connections that are able to form complexes with alkaline earth ions as cobuilders be used.
Buildersubstanzen können in den erfindungsgemäßen Mitteln gegebenenfalls in Mengen bis zu 90 Gew.-% enthalten sein. Sie sind vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-% enthalten. Erfindungsgemäße Waschmittel weisen Buildergehalte von insbesondere 5 Gew.-% bis 50 Gew.-% auf. In erfindungsgemäßen Mitteln für die Reinigung harter Oberflächen, insbesondere zur maschinellen Reinigung von Geschirr, beträgt der Gehalt an Buildersubstanzen insbesondere 5 Gew.-% bis 88 Gew.-%, wobei in derartigen Mitteln vorzugsweise keine wasserunlöslichen Buildermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel zur insbesondere maschinellen Reinigung von Geschirr sind 20 Gew.-% bis 40 Gew.-% wasserlöslicher organischer Builder, insbesondere Alkalicitrat, 5 Gew.-% bis 15 Gew. % Alkalicarbonat und 20 Gew.% bis 40 Gew.-% Alkalidisilikat enthalten.Builders can in the agents according to the invention optionally contained in amounts up to 90 wt .-%. they are preferably contained in amounts up to 75 wt .-%. Detergents according to the invention have builder contents of in particular 5% by weight to 50% by weight. In agents according to the invention for the Cleaning hard surfaces, the content is especially for machine cleaning of dishes of builder substances in particular 5% by weight to 88% by weight, where preferably no water-insoluble in such agents Builder materials are used. In a preferred embodiment, agents according to the invention for particularly machine cleaning of dishes, 20% by weight up to 40% by weight more water-soluble organic builder, in particular alkali citrate, 5% by weight to 15 % By weight of alkali carbonate and 20% by weight to 40% by weight of alkali disilicate contain.
Lösungsmittel, die in den flüssigen bis gelförmigen Zusammensetzungen von Wasch- und Reinigungsmitteln eingesetzt werden können, stammen beispielsweise aus der Gruppe ein- oder mehrwertigen Alkohole, Alkanolamine oder Glycolether, sofern sie im angegebenen Konzentrationsbereich mit Wasser mischbar sind. Vorzugsweise werden die Lösungsmittel ausgewählt aus Ethanol, n- oder i-Propanol, Butanolen, Ethylenglykolmethylether, Ethylenglykolethylether, Ethylenglykolpropylether, Ethylenglykolmono-n-butylether, Diethylenglykol-methylether, Diethylenglykolethylether, Propylenglykolmethyl-, -ethyl- oder -propyl-ether, Dipropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Di-isopropylenglykolmonomethyl-, oder -ethylether, Methoxy-, Ethoxy- oder Butoxytriglykol, 1-Butoxyethoxy-2-propanol, 3-Methyl-3-methoxybutanol, Propylen-glykol-t-butylether sowie Mischungen dieser Lösungsmittel.Solvent, those in the liquid to gel-shaped Compositions of washing and cleaning agents are used can, come, for example, from the group of mono- or polyhydric alcohols, alkanolamines or glycol ether, provided they are in the specified concentration range are miscible with water. The solvents are preferred selected from ethanol, n- or i-propanol, butanols, ethylene glycol methyl ether, Ethylene glycol ethyl ether, ethylene glycol propyl ether, ethylene glycol mono-n-butyl ether, Diethylene glycol methyl ether, diethylene glycol ethyl ether, propylene glycol methyl ether, ethyl or propyl ether, dipropylene glycol monomethyl or ethyl ether, Di-isopropylene glycol monomethyl or ethyl ether, methoxy, ethoxy or butoxytriglycol, 1-butoxyethoxy-2-propanol, 3-methyl-3-methoxybutanol, Propylene glycol t-butyl ether and mixtures of these solvents.
Lösungsmittel können in den erfindungsgemäßen flüssigen bis gelförmigen Wasch- und Reinigungsmitteln in Mengen zwischen 0,1 und 20 Gew.-%, bevorzugt aber unter 15 Gew.-% und insbesondere unterhalb von 10 Gew.-% eingesetzt werden.solvent can in the liquid up to the invention gel Detergents and cleaning agents in amounts between 0.1 and 20% by weight, but preferably below 15% by weight and in particular below 10 % By weight are used.
Zur Einstellung der Viskosität können erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ein oder mehrere Verdicken, beziehungsweise Verdickungssysteme zugesetzt werden. Diese hochmolekularen Stoffe, die auch Quell(ungs)mittel genannt werden, saugen meist die Flüssigkeiten auf und quellen dabei auf, um schließlich in zähflüssige echte oder kolloide Lösungen überzugehen.Compositions according to the invention can be used to adjust the viscosity one or more thickening or thickening systems added become. These high-molecular substances, which are also swelling agents are usually sucked up and swell the liquids going to eventually in viscous real ones or to go over colloidal solutions.
Geeignete Verdicker sind anorganische oder polymere organische Verbindungen. Zu den anorganischen Verdickern zählen beispielsweise Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäuern und Bentonite. Die organischen Verdicken stammen aus den Gruppen der natürlichen Polymere, der abgewandelten natürlichen Polymere und der vollsynthetischen Polymere. Solche aus der Natur stammenden Polymere sind beispielsweise Agar-Agar, Carrageen, Tragant, Gummi arabicum, Alginate, Pektine, Polyosen, Guar-Mehl, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine und Casein. Abgewandelte Naturstoffe, die als Verdicker verwendet werden, stammen vor allem aus der Gruppe der modifizierten Stärken und Cellulosen. Beispielhaft seien hier Carboxymethylcellulose und andere Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose sowie Kernmehlether genannt. Vollsynthetische Verdicker sind Polymere wie Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen, Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine, Polyamide und Polyurethane.Suitable thickeners are inorganic or polymeric organic compounds. The inorganic thickeners include, for example, polysilicic acids, clay minerals such as montmorillonites, zeolites, silicas and bentonites. The organic thickeners come from the groups of natural polymers, the modified natural polymers and the fully synthetic polymers. Such natural polymers are, for example, agar-agar, carrageenan, tragacanth, gum arabic, alginates, pectins, polyoses, guar flour, locust bean gum, starch, dextrins, gelatin and casein. Modified natural substances that are used as thickeners mainly come from the group of modified starches and celluloses. Examples include carboxymethyl cellulose and other cellulose ethers, hydroxyethyl and propyl cellulose and core meal ether. Fully synthetic thickeners are polymers such as polyacrylic and polymethacrylic compounds, vinyl polymers, polycarboxylic acids, polyethers, polyimines, polyamides and polyurethanes.
Die Verdicken können in einer Menge bis zu 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-%, und besonders bevorzugt von 0,1 bis 1,5 Gew.-%, bezogen auf die fertige Zusammensetzung, enthalten sein.The thickening can be up to 5% by weight, preferably from 0.05 to 2% by weight, and particularly preferred from 0.1 to 1.5% by weight, based on the finished composition, be included.
Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann gegebenenfalls als weitere übliche Inhaltsstoffe Sequestrierungsmittel, Elektrolyte und weitere Hilfsstoffe enthalten.The washing or cleaning agent according to the invention can optionally be used as another usual Ingredients sequestrants, electrolytes and other auxiliary substances contain.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'-disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2-Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.Textile detergents according to the invention can be used as optical brightener derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid respectively whose alkali metal salts contain. Salts, for example, are suitable 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1,3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulfonic acid or similarly structured compounds that replace the morpholino group a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or carry a 2-methoxyethylamino group. Brighteners can also be used of the type substituted diphenyl styrenes may be present, for example the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) or 4- (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl) diphenyl. Mixtures of the aforementioned optical brighteners can also be used become.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-Salz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.Graying inhibitors have that Task, the dirt detached from the textile fiber suspended in the fleet to keep. For this purpose, they are water soluble Suitable colloids mostly of an organic nature, e.g. starch, glue, Gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of strength or the cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters cellulose or starch. Also water soluble, polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose. Farther can be used other than the above-mentioned starch derivatives to Example aldehyde starches. Cellulose ethers such as carboxymethyl cellulose (sodium salt) are preferred. Methyl cellulose, hydroxyalkyl cellulose and mixed ethers, such as methyl hydroxyethyl cellulose, Methyl hydroxypropyl cellulose, methyl carboxymethyl cellulose and their Mixtures, for example in amounts of 0.1 to 5 wt .-%, based on the means used.
Um einen Silberkorrosionsschutz zu
bewirken, können
in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln
für Geschirr
Silberkorrosionsinhibitoren eingesetzt werden. Solche sind aus dem
Stand der Technik bekannt, beispielsweise Benzotriazole, Eisen(III)-chlorid
oder CoSO4. Wie beispielsweise aus der europäischen Patentschrift
"Soil-Release"-Wirkstoffe oder "Soil-Repellents" sind zumeist Polymere, die bei der Verwendung in einem Waschmittel der Wäschefaser schmutzabstoßende Eigenschaften verleihen und/oder das Schmutzablösevermögen der übrigen Waschmittelbestandteile unterstützen. Ein vergleichbarer Effekt kann auch bei deren Einsatz in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen beobachtet werden.Soil release agents or soil repellents are mostly polymers, those when used in a laundry detergent of the laundry fiber dirt-repellent Give properties and / or the dirt-removing ability of the other detergent components support. A comparable effect can also be used when used in cleaning agents for hard surfaces to be watched.
Besonders wirksame und seit langer
Zeit bekannte Soil-Release-Wirkstoffe sind Copolyester mit Dicarbonsäure-, Alkylenglykol-
und Polyalkylenglykoleinheiten. Beispiele dafür sind Copolymere oder Mischpolymere
aus Polyethylenterephthalat und Polyoxyethylenglykol (DT 16 17 141,
beziehungsweise DT 22 00 911). In der deutschen Offenlegungsschrift
DT 22 53 063 sind saure Mittel genannt, die unter anderem ein Copolymer
aus einer dibasigen Carbonsäure
und einem Alkylen- oder Cycloalkylenpolyglykol enthalten. Polymere aus
Ethylenterephthalat und Polyethylenoxidterephthalat und deren Einsatz
in Waschmitteln sind in den deutschen Schriften
Zu den für den Einsatz in erfindungsgemäßen Textilwaschmitteln in Frage kommenden Farbübertragungsinhibitoren gehören insbesondere Polyvinylpyrrolidone, Polyvinylimidazole, polymere N-Oxide wie Poly-(vinylpyridin-N-oxid) und Copolymere von Vinylpyrrolidon mit Vinylimidazol.To those for use in textile detergents according to the invention candidate color transfer inhibitors belong in particular polyvinylpyrrolidones, polyvinylimidazoles, polymers N-oxides such as poly (vinyl pyridine-N-oxide) and copolymers of vinyl pyrrolidone with vinylimidazole.
Beim Einsatz in maschinellen Reinigungsverfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bistearylethylendiamid. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granulare, in Wasser lösliche, beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamiden bevorzugt.When used in machine cleaning processes, it may be advantageous to add foam inhibitors to the agents. Suitable foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids. Suitable non-surfactant-like foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and their mixtures with microfine, optionally silanized silica, and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and their mixtures with silanized silica or bistearylethylenediamide. Mixtures of various foam inhibitors are also used with advantages, for example those made of silicone, paraffins or waxes. The foam inhibitors, in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are preferably bound to a granular, water-soluble or dispersible carrier substance. Mixtures of paraffins and bistearylethylenediamides are particularly preferred.
Ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel für harte Oberflächen kann darüber hinaus abrasiv wirkende Bestandteile, insbesondere aus der Gruppe umfassend Quarzmehle, Holzmehle, Kunststoffmehle, Kreiden und Mikroglaskugeln sowie deren Gemische, enthalten. Abrasivstoffe sind in den erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 15 Gew.-%, enthalten.An inventive cleaning agent for hard surfaces can about it abrasive components, especially from the group including quartz flours, wood flours, plastic flours, chalks and micro glass balls and mixtures thereof. Abrasives are in the cleaning agents according to the invention preferably not over 20 wt .-%, in particular from 5 wt .-% to 15 wt .-%, contain.
Farb- und Duftstoffe werden Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt, um den ästhetischen Eindruck der Produkte zu verbessern und dem Verbraucher neben der Wasch- und Reinigungsleistung ein visuell und sensorisch "typisches und unverwechselbares" Produkt zur Verfügung zu stellen. Als Parfümöle beziehungsweise Duftstoffe können einzelne Riechstoffverbindungen, zum Beispiel die synthetischen Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe verwendet werden. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind zum Beispiel Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzyl-carbinylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenyl-glycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden zum Beispiel die linearen Alkanale mit 8–18 C-Atomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen zum Beispiel die Jonone, α-Isomethylionon und Methyl-cedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene wie Limonen und Pinen. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Solche Parfümöle können auch natürliche Riechstoffgemische enthalten, wie sie aus pflanzlichen Quellen zugänglich sind, zum Beispiel Pine-, Citrus-, Jasmin-, Patchouly-, Rosen- oder Ylang-Ylang-Öl. Ebenfalls geeignet sind Muskateller, Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeeröl, Vetiveröl, Olibanumöl, Galbanumöl und Labdanumöl sowie Orangenblütenöl, Neroliol, Orangenschalenöl und Sandelholzöl. Üblicherweise liegt der Gehalt von Wasch- und Reinigungsmitteln an Farbstoffen unter 0,01 Gew.-%, während Duftstoffe bis zu 2 Gew.-% der gesamten Formulierung ausmachen können.Dyes and fragrances are washing and detergents added to the aesthetic impression of the products to improve and the consumer in addition to the washing and cleaning performance a visually and sensory "typical and distinctive "product to disposal to deliver. As perfume oils respectively Fragrances can individual fragrance compounds, for example the synthetic ones Products of the ester, ether, aldehyde, ketone, alcohol and type Hydrocarbons are used. Fragrance compounds from Examples of the esters are benzyl acetate, phenoxyethyl isobutyrate, p-tert-butylcyclohexyl acetate, linalyl acetate, dimethylbenzylcarbinylacetate, Phenylethyl acetate, linalyl benzoate, benzyl formate, ethyl methylphenyl glycinate, Allyl cyclohexyl propionate, styrallyl propionate and benzyl salicylate. Count among the ethers for example benzyl ethyl ether, for example the aldehydes linear alkanals with 8–18 Carbon atoms, citral, citronellal, citronellyloxyacetaldehyde, cyclamenaldehyde, Hydroxycitronellal, Lilial and Bourgeonal, to the ketones for example the Jonone, α-isomethyl ionone and methyl cedryl ketone, to the alcohols anethole, citronellol, eugenol, Geraniol, linalool, phenylethyl alcohol and terpineol, to the hydrocarbons belong mainly the terpenes like limes and pinene. However, mixtures are preferred different fragrances, which together make an appealing Generate fragrance. Such perfume oils can also natural Contain fragrance mixtures as they are accessible from plant sources, for example pine, citrus, jasmine, patchouly, rose or ylang-ylang oil. Likewise suitable are muscatel, sage oil, chamomile oil, clove oil, lemon balm oil, mint oil, cinnamon leaf oil, linden blossom oil, juniper berry oil, vetiver oil, olibanum oil, galbanum oil and labdanum oil as well as Orange blossom oil, neroliol, Orange peel oil and sandalwood oil. Usually is the content of detergents and cleaning agents in dyes below 0.01 wt%, while Fragrances can make up up to 2% by weight of the total formulation.
Die Duftstoffe können direkt in die Wasch- und Reinigungsmittel eingearbeitet werden, es kann aber auch vorteilhaft sein, die Duftstoffe auf Träger aufzubringen, die die Haftung des Parfüms auf dem Reinigungsgut verstärken und durch eine langsamere Duftfreisetzung für langanhaltenden Duft, insbesondere von behandelten Textilien sorgen. Als solche Trägermaterialien haben sich beispielsweise Cyclodextrine bewährt, wobei die Cyclodextrin-Parfüm-Komplexe zusätzlich noch mit weiteren Hilfsstoffen beschichtet werden können. Ein weiter bevorzugter Träger für Duftstoffe ist der beschriebene Zeolith X, der anstelle von oder in Mischung mit Tensiden auch Duftstoffe aufnehmen kann. Bevorzugt sind daher Wasch- und Reinigungsmittel, die den beschriebenen Zeolith X und Duftstoffe, die vorzugsweise zumindest teilweise an dem Zeolithen absorbiert sind, enthalten.The fragrances can be used directly in the washing and Detergents can be incorporated, but it can also be beneficial be the fragrances on carriers to apply, which increase the adhesion of the perfume to the items to be cleaned and through a slower fragrance release for long-lasting fragrance, in particular of treated textiles. Such carrier materials have, for example Proven cyclodextrins, taking the cyclodextrin perfume complexes additionally can be coated with other auxiliaries. A further preferred carrier for fragrances is the described zeolite X, which instead of or in a mixture can also absorb fragrances with surfactants. Are therefore preferred Detergents and cleaning agents containing the described zeolite X and Fragrances that are preferably at least partially on the zeolite are absorbed.
Bevorzugte Farbstoffe, deren Auswahl dem Fachmann keinerlei Schwierigkeit bereitet, besitzen eine hohe Lagerstabilität und Unempfindlichkeit gegenüber den übrigen Inhaltsstoffen der Mittel und gegen Licht sowie keine ausgeprägte Substantivität gegenüber Textilfasern, um diese nicht anzufärben.Preferred dyes, their selection the expert has no difficulty, have a high storage stability and insensitivity to the rest Ingredients of the agents and against light and no pronounced substantivity towards textile fibers, so as not to stain them.
Zur Bekämpfung von Mikroorganismen können Wasch- oder Reinigungsmittel antimikrobielle Wirkstoffe enthalten. Hierbei unterscheidet man je nach antimikrobiellem Spektrum und Wirkungsmechanismus zwischen Bakteriostatika und Bakteriziden, Fungistatika und Fungiziden usw. Wichtige Stoffe aus diesen Gruppen sind beispielsweise Benzalkoniumchloride, Alkylarylsulfonate, Halogenphenole und Phenolmercuriacetat. Die Begriffe antimikrobielle Wirkung und antimikrobieller Wirkstoff haben im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre die fachübliche Bedeutung, die beispielsweise von K. H. Wallhäußer in „Praxis der Sterilisation, Desinfektion-Konservierung : Keimidentifizierung-Betriebshygiene" (5. Aufl. – Stuttgart; New York Thieme, 1995) wiedergegeben wird, wobei alle dort beschriebenen Substanzen mit antimikrobieller Wirkung eingesetzt werden können. Geeignete antimikrobielle Wirkstoffe sind vorzugsweise ausgewählt aus den Gruppen der Alkohole, Amine, Aldehyde, antimikrobiellen Säuren beziehungsweise deren Salze, Carbonsäureester, Säureamide, Phenole, Phenolderivate, Diphenyle, Diphenylalkane, Harnstoffderivate, Sauerstoff-, Stickstoff-acetate sowie -formale, Benzamidine, Isothiazoline, Phthalimidderivate, Pyridinderivate, antimikrobiellen oberflächenaktiven Verbindungen, Guanidine, antimikrobiellen amphoteren Verbindungen, Chinoline, 1,2-Dibrom-2,4-dicyanobutan, Iodo-2-propyl-butyl-carbamat, Iod, Iodophore, Peroxoverbindungen, Halogenverbindungen sowie beliebigen Gemischen der voranstehenden.To combat microorganisms, detergents or cleaning agents can contain antimicrobial agents. Depending on the antimicrobial spectrum and mechanism of action, a distinction is made between bacteriostatics and bactericides, fungistatics and fungicides, etc. Important substances from these groups are, for example, benzalkonium chlorides, alkylarylsulfonates, halophenols and phenol mercuric acetate. In the context of the teaching according to the invention, the terms antimicrobial activity and antimicrobial active substance have the customary meaning, as used, for example, by KH Wallhäußer in "Practice of Sterilization, Disinfection-Preservation: Germ Identification-Industrial Hygiene" (5th ed. - Stuttgart; New York Thieme, 1995) Suitable antimicrobial active ingredients are preferably selected from the groups of alcohols, amines, aldehydes, antimicrobial acids or their salts, carboxylic acid esters, acid amides, phenols, phenol derivatives, diphenyls, diphenylalkanes, urea derivatives , Oxygen, nitrogen acetate and formals, benzamidines, isothiazolines, phthalimide derivatives, pyridine derivatives, antimicrobial surface-active compounds, guanidines, antimicrobial amphoteric compounds, quinolines, 1,2-dibromo-2,4-dicyanobutane, iodo-2-propyl-butyl carbamate , Iodine, iodophores, peroxo compounds, halogen compounds and any mixtures of the foregoing.
Der antimikrobielle Wirkstoff kann dabei ausgewählt sein aus Ethanol, n-Propanol, i-Propanol, 1,3-Butandiol, Phenoxyethanol, 1,2-Propylenglykol, Glycerin, Undecylensäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Dihydracetsäure, o-Phenylphenol, N-Methylmorpholinacetonitril (MMA), 2-Benzyl-4-chlorphenol, 2,2'-Methylen-bis-(6-brom-4-chlorphenol), 4,4'-Dichlor-2'-hydroxydiphenylether (Dichlosan), 2,4,4'-Trichlor-2'-hydroxydiphenylether (Trichlosan), Chlorhexidin, N-(4-Chlorphenyl)-N-(3,4-dichlorphenyl)-harnstoff, N,N'-(1,10-decan-diyldi-1-pyridinyl-4-yliden)-bis-(1-octanamin)-dihydrochlorid, N,N'-Bis-(4-chlorphenyl)-3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecandiimidamid, Glucoprotaminen, antimikrobiellen oberflächenaktiven quaternären Verbindungen, Guanidinen einschl. den Bi- und Polyguanidinen, wie beispielsweise 1,6-Bis-(2-ethylhexyl-biguanido-hexan)-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-tetrahydochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-phenyl-N1,N1-methyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-o-chlorophenyldiguanido- N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,6-dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-[N1,N1'-beta-(p-methoxyphenyl)diguanido-N5,N5']-hexane-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-alpha-methyl-beta.-phenyldiguanido-N5,N5')-hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-p-nitrophenyldiguanido-N5,N5')hexan-dihydrochlorid, omega:omegα-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-dihydrochlorid, omega:omega'-Di-(N1,N1'-p-chlorophenyldiguanido-N5,N5')-di-n-propylether-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,4-dichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-p-methylphenyldiguanido- N5,N5')hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-2,4,5-trichlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-[N1,N1'-alpha-(p-chlorophenyl) ethyldiguanido-N5,N5'] hexan-dihydrochlorid, omega:omega-Di-(N1,N1'-p-chlorophenyldiguanido-N5,N5')m-xylene-dihydrochlorid, 1,12-Di-(N1,N1'-p-chlorophenyldiguanido-N5,N5') dodecan-dihydrochlorid, 1,10-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido-N5,N5')-decan-tetrahydrochlorid, 1,12-Di-(N1,N1'-phenyldiguanido- N5,N5') dodecan-tetrahydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-o-chlorophenyldiguanido- N5,N5') hexan-dihydrochlorid, 1,6-Di-(N1,N1'-o-chlorophenyldiguanido-N5,N5')hexan-tetrahydrochlorid, Ethylen-bis-(1-tolyl biguanid), Ethylen-bis-(p-tolyl biguanide), Ethylen-bis-(3,5-dimethylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(p-tert-amylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(nonylphenylbiguanid), Ethylen-bis-(phenylbiguanid), Ethylen-bis-(N-butylphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,5-diethoxyphenylbiguanid), Ethylen-bis (2,4-dimethylphenyl biguanid), Ethylen-bis (o-diphenylbiguanid), Ethylen-bis (mixed amyl naphthylbiguanid), N-Butyl-ethylen-bis-(phenylbiguanid), Trimethylen bis (o-tolylbiguanid), N-Butyl-trimethyle- bis-(phenyl biguanide) und die entsprechenden Salze wie Acetate, Gluconate, Hydrochloride, Hydrobromide, Citrate, Bisulfate, Fluoride, Polymaleate, N-Cocosalkylsarcosinate, Phosphite, Hypophosphite, Perfluorooctanoate, Silicate, Sorbate, Salicylate, Maleate, Tartrate, Fumarate, Ethylendiamintetraacetate, Iminodiacetate, Cinnamate, Thiocyanate, Arginate, Pyromellitate, Tetracarboxybutyrate, Benzoate, Glutarate, Monofluorphosphate, Perfluorpropionate sowie beliebige Mischungen davon. Weiterhin eignen sich halogenierte Xylol- und Kresolderivate, wie p-Chlormetakresol oder p-Chlor-meta-xylol, sowie natürliche antimikrobielle Wirkstoffe pflanzlicher Herkunft (zum Beispiel aus Gewürzen oder Kräutern), tierischer sowie mikrobieller Herkunft. Vorzugsweise können antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindungen, ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft und/oder ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft, äußerst bevorzugt mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff pflanzlicher Herkunft aus der Gruppe, umfassend Coffein, Theobromin und Theophyllin sowie etherische Öle wie Eugenol, Thymol und Geraniol, und/oder mindestens ein natürlicher antimikrobieller Wirkstoff tierischer Herkunft aus der Gruppe, umfassend Enzyme wie Eiweiß aus Milch, Lysozym und Lactoperoxidase, und/oder mindestens eine antimikrobiell wirkende oberflächenaktive quaternäre Verbindung mit einer Ammonium-, Sulfonium-, Phosphonium-, Iodonium- oder Arsoniumgruppe, Peroxoverbindungen und Chlorverbindungen eingesetzt werden. Auch Stoffe mikrobieller Herkunft, sogenannte Bakteriozine, können eingesetzt werden.The antimicrobial active ingredient can be selected from ethanol, n-propanol, i-propanol, 1,3-butanediol, phenoxyethanol, 1,2-propylene glycol, glycerin, undecylenic acid, benzoic acid, salicylic acid, dihydracetic acid, o-phenylphenol, N-methylmorpholinacetonitrile ( MMA), 2-benzyl-4-chlorophenol, 2,2'-methylene-bis- (6-bromo-4-chlorophenol), 4,4'-dichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (dichlosan), 2,4,4 '-Trichlor-2'-hydroxydiphenyl ether (trichlosan), chlorhexidine, N- (4-chlorophenyl) -N- (3,4-dichlorophenyl) urea, N, N' - (1,10-decane-diyldi-1- pyridinyl-4-ylidene) bis (1-octanamine) dihydrochloride, N, N'-bis (4-chlorophenyl) -3,12-diimino-2,4,11,13-tetraaza-tetradecanediimidamide, glucoprotamines, antimicrobial surface-active quaternary compounds, guanidines including the bi- and polyguanidines, such as, for example, 1,6-bis (2-ethylhexyl-biguanido-hexane) dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 '-phenyldiguanido- N 5 , N 5 ') -hexane-tetrahydochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 ' -phenyl-N 1 , N 1 -methyldiguanido-N 5 , N 5 ') -hexane-dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 ' -o-chlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') -hexane-dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 ' -2,6-dichlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') hexane dihydrochloride, 1,6-di- [N 1 , N 1 ' -beta- (p-methoxyphenyl) diguanido-N 5 , N 5 '] hexanes -dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 '-alpha-methyl-beta.-phenyldiguanido-N 5 , N 5 ') -hexane-dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 '-p-nitrophenyldiguanido-N5, N5') hexane dihydrochloride, omega: omegα-di- (N 1 , N 1 '-phenyldiguanido-N 5 , N 5 ') -di-n-propylether dihydrochloride, omega: omega '-Di- (N 1 , N 1 ' -p-chlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') -di-n-propylether-tetrahydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 ' -2,4- dichlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') hexane-tetrahydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 ' -p-methylphenyldiguanido-N 5 , N 5 ') hexane-dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 '-2,4,5-trichlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') hexane-tetrahydrochloride, 1,6-di- [N 1 , N 1 '-alpha- (p-chlorophenyl) ethyldiguanido-N5, N5 '] hexane dihydrochloride, omega: omega-di- (N 1 , N 1 ' -p-chlorophenyl diguanide o-N 5 , N 5 ') m-xylene-dihydrochloride, 1,12-di- (N 1 , N 1 ' -p-chlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') dodecane-dihydrochloride, 1,10-di- (N 1 , N 1 '-phenyldiguanido-N 5 , N 5 ') -decane-tetrahydrochloride, 1,12-di- (N 1 , N 1 '-phenyldiguanido-N 5 , N 5 ') dodecane-tetrahydrochloride, 1.6 -Di- (N 1 , N 1 '-o-chlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ') hexane dihydrochloride, 1,6-di- (N 1 , N 1 '-o-chlorophenyldiguanido-N 5 , N 5 ' ) hexane tetrahydrochloride, ethylene bis (1-tolyl biguanide), ethylene bis (p-tolyl biguanide), ethylene bis (3,5-dimethylphenyl biguanide), ethylene bis (p-tert-amylphenyl biguanide) , Ethylene bis (nonylphenyl biguanide), ethylene bis (phenyl biguanide), ethylene bis (N-butylphenyl biguanide), ethylene bis (2,5-diethoxyphenyl biguanide), ethylene bis (2,4-dimethylphenyl biguanide), Ethylene bis (o-diphenyl biguanide), ethylene bis (mixed amyl naphthyl biguanide), N-butyl ethylene bis (phenyl biguanide), trimethylene bis (o-tolyl biguanide), N-butyl trimethyl bis (phenyl biguanide) and the corresponding salts such as acetates, glucon ate, hydrochlorides, hydrobromides, citrates, bisulfates, fluorides, polymaleates, N-Cocosalkylsarcosinate, phosphites, hypophosphites, perfluorooctanoate, silicates, sorbates, salicylates, maleates, tartrates, fumarates, ethylenediamine tetraacetates, iminodiacetates, cinnamates, thiocyanates, arginates, pyromellitates, tetracarboxybutyrates, Benzoates, glutarates, monofluorophosphates, perfluoropropionates and any mixtures thereof. Halogenated xylene and cresol derivatives, such as p-chlorometacresol or p-chloro-meta-xylene, as well as natural antimicrobial active ingredients of vegetable origin (for example from spices or herbs), animal and microbial origin are also suitable. Preferably, antimicrobial surface-active quaternary compounds, a natural antimicrobial agent of plant origin and / or a natural antimicrobial agent of animal origin, most preferably at least one natural antimicrobial agent of plant origin from the group comprising caffeine, theobromine and theophylline, and essential oils such as eugenol, thymol and geraniol, and / or at least one natural antimicrobial active ingredient of animal origin from the group comprising enzymes such as protein from milk, lysozyme and lactoperoxidase, and / or at least one antimicrobial surface-active quaternary compound with an ammonium, sulfonium, phosphonium, iodonium - Or arsonium group, peroxo compounds and chlorine compounds are used. Substances of microbial origin, so-called bacteriocins, can also be used.
Die als antimikrobielle Wirkstoffe geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen (QAV) weisen die allgemeine Formel (R1)(R2)(R3)(R4) N+ X– auf, in der R1 bis R4 gleiche oder verschiedene C1-C22-Alkylreste, C7-C28-Aralkylreste oder heterozyklische Reste, wobei zwei oder im Falle einer aromatischen Einbindung wie im Pyridin sogar drei Reste gemeinsam mit dem Stickstoffatom den Heterozyklus, zum Beispiel eine Pyridinium- oder Imidazoliniumverbindung, bilden, darstellen und X– Halogenidionen, Sulfationen, Hydroxidionen oder ähnliche Anionen sind. Für eine optimale antimikrobielle Wirkung weist vorzugsweise wenigstens einer der Reste eine Kettenlänge von 8 bis 18, insbesondere 12 bis 16, C-Atomen auf.The quaternary ammonium compounds (QAV) suitable as antimicrobial active ingredients have the general formula (R 1 ) (R 2 ) (R 3 ) (R 4 ) N + X - , in which R 1 to R 4 are identical or different C 1 -C 4 22 alkyl radicals, C 7 -C 28 aralkyl radicals or heterocyclic radicals, where two or, in the case of an aromatic integration, as in pyridine, even three radicals together with the nitrogen atom form the heterocycle, for example a pyridinium or imidazolinium compound, and X - Halide ions, sulfate ions, hydroxide ions or similar anions. For an optimal antimicrobial effect, at least one of the Residues have a chain length of 8 to 18, in particular 12 to 16, carbon atoms.
QAV sind durch Umsetzung tertiärer Amine mit Alkylierungsmitteln, wie zum Beispiel Methylchlorid, Benzylchlorid, Dimethylsulfat, Dodecylbromid, aber auch Ethylenoxid herstellbar. Die Alkylierung von tertiären Aminen mit einem langen Alkyl-Rest und zwei Methyl-Gruppen gelingt besonders leicht, auch die Quaternierung von tertiären Aminen mit zwei langen Resten und einer Methyl-Gruppe kann mit Hilfe von Methylchlorid unter milden Bedingungen durchgeführt werden. Amine, die über drei lange Alkyl-Reste oder Hydroxy-substituierte Alkyl-Reste verfügen, sind wenig reaktiv und werden bevorzugt mit Dimethylsulfat quaterniert.QAV are due to the implementation of tertiary amines with alkylating agents such as methyl chloride, benzyl chloride, Dimethyl sulfate, dodecyl bromide, but also ethylene oxide can be produced. The alkylation of tertiary amines with a long alkyl radical and two methyl groups is particularly successful easy, also the quaternization of tertiary amines with two long ones Residues and a methyl group can be taken with the help of methyl chloride mild conditions become. Amines that over have three long alkyl radicals or hydroxy-substituted alkyl radicals not very reactive and are preferably quaternized with dimethyl sulfate.
Geeignete QAV sind beispielweise Benzalkoniumchlorid (N-Alkyl-N,N-dimethyl-benzyl-ammoniumchlorid, CAS No. 8001-54-5), Benzalkon B (m,p-Dichlorbenzyl-dimethyl-C12-alkylammoniumchlorid, CAS No. 58390-78-6), Benzoxoniumchlorid (Benzyl-dodecyl-bis-(2-hydroxyethyl)-ammonium-chlorid), Cetrimoniumbromid (N-Hexadecyl-N,N-trimethyl-ammoniumbromid, CAS No. 57-09-0), Benzetoniumchlorid (N,N-Dimethyl-N-[2-[2-[p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-pheno-xy]ethoxy]ethyl]-benzylammoniumchlorid, CAS No. 121-54-0), Dialkyldimethylammonium-chlonide wie Di-n-decyl-dimethyl-ammoniumchlorid (CAS No. 7173-51-5-5), Didecyldi-methylammoniumbromid (CAS No. 2390-68-3), Dioctyldimethyl-ammoniumchloric, 1-Cetylpyridiniumchlorid (CAS No. 123-03-5) und Thiazoliniodid (CAS No. 15764-48-1) sowie deren Mischungen. Besonders bevorzugte QAV sind die Benzalkoniumchloride mit C8-C18-Alkylresten, insbesondere C12-C14-Aklyl-benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid.Suitable QAC are, for example, benzalkonium chloride (N-alkyl-N, N-dimethyl-benzyl-ammonium chloride, CAS No. 8001-54-5), benzalkon B (m, p-dichlorobenzyl-dimethyl-C12-alkylammonium chloride, CAS No. 58390- 78-6), benzoxonium chloride (benzyl-dodecyl-bis- (2-hydroxyethyl) ammonium chloride), cetrimonium bromide (N-hexadecyl-N, N-trimethyl-ammonium bromide, CAS No. 57-09-0), benzetonium chloride ( N, N-Dimethyl-N- [2- [2- [p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenoxy] ethoxy] ethyl] benzylammonium chloride, CAS No. 121-54-0), Dialkyldimethylammonium chlonides such as di-n-decyldimethylammonium chloride (CAS No. 7173-51-5-5), didecyldimethylammonium bromide (CAS No. 2390-68-3), dioctyldimethylammoniumchloric, 1-cetylpyridinium chloride (CAS No . 123-03-5) and thiazoline iodide (CAS No. 15764-48-1) and their mixtures. Particularly preferred QAV are the benzalkonium chlorides with C 8 -C 18 -alkyl radicals, in particular C 12 -C 14 -alkyl-benzyl-dimethyl-ammonium chloride.
Benzalkoniumhalogenide und/oder substituierte Benzalkoniumhalogenide sind beispielsweise kommerziell erhältlich als Barquat® ex Lonza, Marquat® ex Mason, Variquat® ex Witco/Sherex und Hyamine® ex Lonza, sowie Bardac® ex Lonza. Weitere kommerziell erhältliche antimikrobielle Wirkstoffe sind N-(3-Chlorallyl)-hexaminiumchlorid wie Dowicide® und Dowicil® ex Dow, Benzethoniumchlorid wie Hyamine® 1622 ex Rohm & Haas, Methylbenzethoniumchlorid wie Hyamine® 10X ex Rohm & Haas, Cetylpyridiniumchlorid wie Cepacolchlorid ex Merrell Labs.Benzalkonium halides and / or substituted benzalkonium halides are for example commercially available as Barquat ® ex Lonza, Marquat® ® ex Mason, Variquat ® ex Witco / Sherex and Hyamine ® ex Lonza and as Bardac ® ex Lonza. Other commercially obtainable antimicrobial agents are N- (3-chloroallyl) hexaminium chloride such as Dowicide and Dowicil ® ® ex Dow, benzethonium chloride such as Hyamine ® 1622 ex Rohm & Haas, methylbenzethonium as Hyamine ® 10X ex Rohm & Haas, cetylpyridinium chloride such as Cepacol ex Merrell Labs ,
Die antimikrobiellen Wirkstoffe werden in Mengen von 0,0001 Gew.-% bis 1 Gew.-%, bevorzugt von 0,001 Gew.-% bis 0,8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 0,005 Gew.-% bis 0,3 Gew.-% und insbesondere von 0,01 bis 0,2 Gew.-% eingesetzt.The antimicrobial agents are in amounts of 0.0001% by weight to 1% by weight, preferably 0.001% by weight up to 0.8% by weight, particularly preferably from 0.005% by weight to 0.3% by weight and in particular from 0.01 to 0.2% by weight.
Die Mittel können UV-Absorbenzien (UV-Absorber) enthalten, die auf die behandelten Textilien aufziehen und die Lichtbeständigkeit der Fasern und/oder die Lichtbeständigkeit sonstiger Rezepturbestandteile verbessern. Unter UV-Absorber sind organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längenwelliger Strahlung, zum Beispiel Wärme wieder abzugeben.The agents can UV absorbers (UV absorbers) contain that absorb on the treated textiles and the light resistance the fibers and / or the lightfastness of other recipe components improve. Under UV absorbers are organic substances (light protection filters) to understand who are able to absorb ultraviolet rays and the absorbed energy in the form of long-wave radiation, for example Heat again leave.
Verbindungen, die diese gewünschten
Eigenschaften aufweisen, sind beispielsweise die durch strahlungslose
Desaktivierung wirksamen Verbindungen und Derivate des Benzophenons
mit Substituenten in 2- und/oder 4-Stellung. Weiterhin sind auch
substituierte Benzotriazole, in 3-Stellung Phenylsubstituierte Acrylate (Zimtsäurederivate,
gegebenenfalls mit Cyanogruppen in 2-Stellung), Salicylate, organische
Ni-Komplexe sowie Naturstoffe wie Umbelliferon und die körpereigene
Urocansäure
geeignet. Besondere Bedeutung haben Biphenyl- und vor allem Stilbenderivate
wie sie beispielsweise in der
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere
Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1,3-dion,
4-tert.-Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan (Parsol
1789), 1-Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1,3-dion sowie Enaminverbindungen,
wie beschrieben in der
Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse, vorzugsweise nanoisierte Metalloxide beziehungsweise Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente bereits für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d.h. hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind ummantelte Titandioxide, wie zum Beispiel Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck; als hydrophobe Coatingmittel kommen dafür bevorzugt Silicone und besonders bevorzugt Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P. Finkel in SÖFW-Journal, Band 122 (1996), S. 543 zu entnehmen.The UV-A and UV-B filters can of course also be used in mixtures. In addition to the soluble substances mentioned, insoluble light-protection pigments, namely finely dispersed, preferably nanoized metal oxides or salts, are also suitable for this purpose. Examples of suitable metal oxides are, in particular, zinc oxide and titanium dioxide and, in addition, oxides of iron, zirconium, silicon, manganese, aluminum and cerium and mixtures thereof. Silicates (talc), barium sulfate or zinc stearate can be used as salts. The oxides and salts are already used in the form of the pigments for skin-care and skin-protecting emulsions and decorative cosmetics. The particles should have an average diameter of less than 100 nm, preferably between 5 and 50 nm and in particular between 15 and 30 nm. They can have a spherical shape, but it is also possible to use particles which have an ellipsoidal shape or a shape which differs in some other way from the spherical shape. The pigments can also be surface-treated, ie hydrophilized or hydrophobicized. Typical examples are coated titanium dioxides, such as titanium dioxide T 805 (Degussa) or Eusolex ® T2000 (Merck; silicones and particularly preferably trialkoxyoctylsilanes or simethicones are preferred as hydrophobic coating agents. Micronized zinc oxide is preferably used. Other suitable UV light protection filters are see the overview by P. Finkel in SÖFW-Journal, volume 122 (1996), p. 543.
Die UV-Absorbenzien werden üblicherweise in Mengen von 0,01 Gew.-% bis 5 Gew.-%, vorzugsweise von 0,03 Gew.-% bis 1 Gew.-%, eingesetzt.The UV absorbers are usually in amounts from 0.01% by weight to 5% by weight, preferably from 0.03% by weight up to 1% by weight.
Erfindungsgemäße Mittel können zur Steigerung der Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung zusätzlich zu den erfindungsgemäßen α-Amylase-Varianten weitere Enzyme enthalten, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Hierzu gehören insbesondere Proteasen, andere Amylasen, Lipasen, Hemicellulasen, Cellulasen oder Oxidoreduktasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10–6 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret- Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden.Agents according to the invention can contain further enzymes in addition to the α-amylase variants according to the invention in order to increase the washing or cleaning performance, in principle all enzymes established in the prior art for these purposes can be used. These include in particular proteases, other amylases, lipases, hemicellulases, cellulases or oxidoreductases, and preferably their mixtures. In principle, these enzymes are of natural origin; Based on the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaning agents, which are accordingly preferred. Agents according to the invention preferably contain enzymes in total amounts of 1 × 10 -6 to 5 percent by weight based on active protein. The protein concentration can be determined using known methods, for example the BCA method (bicinchoninic acid; 2,2'-bichinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
Unter den Proteasen sind solche vom
Subtilisin-Typ bevorzugt. Beispiele hierfür sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die
Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease
aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht
mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme
Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Subtilisin
Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen
Alcalase® von
der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Die Subtilisine 147
und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise
Savinase® von
der Firma Novozymes vertrieben. Von der Protease aus Bacillus lentus
DSM 5483 (WO 91/02792 A1) leiten sich die unter der Bezeichnung
BLAP® geführten Varianten
ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340
A2 und PCT/EP02/11725 (noch nicht publiziert) beschrieben werden.
Weitere verwendbare Proteasen aus verschiedenen Bacillus sp. und
B. gibsonii gehen aus den noch nicht veröffentlichten Patentanmeldungen
Weitere brauchbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozymes® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect®OxP und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.Other usable proteases are, for example, under the trade names Durazym ®, relase ®, Everlase® ®, Nafizym, Natalase ®, Kannase® ® and Ovozymes ® from Novozymes, under the trade names Purafect ®, Purafect ® OxP and Properase.RTM ® by the company Genencor, which is sold under the trade name Protosol ® by Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, which is sold under the trade name Wuxi ® by Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, and in the trade name Proleather ® and Protease P ® by the company Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and the enzyme available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbaie Amylasen sind die α-Amylasen aus Bacillus licheniformis, aus B. amyloliquefaciens oder aus B. stearothermophilus sowie deren für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Weiterentwicklungen. Das Enzym aus B. licheniformis ist von der Firma Novozymes unter dem Namen Termamyl® und von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®ST erhältlich. Weiterentwicklungsprodukte dieser α-Amylase sind von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Duramyl® und Termamyl®ultra, von der Firma Genencor unter dem Namen Purastar®OxAm und von der Firma Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, als Keistase® erhältlich. Die α-Amylase von B. amyloliquefaciens wird von der Firma Novozymes unter dem Namen BAN® vertrieben, und abgeleitete Varianten von der α-Amylase aus B. stearothermophilus unter den Namen BSG® und Novamyl®, ebenfalls von der Firma Novozymes.Examples of amylases which can be used according to the invention are the α-amylases from Bacillus licheniformis, from B. amyloliquefaciens or from B. stearothermophilus and their further developments which are improved for use in detergents and cleaning agents. The enzyme from B. licheniformis is available from Novozymes under the name Termamyl ® and from Genencor under the name Purastar® ® ST. Development products of this α-amylase are available from Novozymes under the trade names Duramyl ® and Termamyl ® ultra, from Genencor under the name Purastar® ® OxAm and from Daiwa Seiko Inc., Tokyo, Japan, as Keistase ®. The α-amylase from B. amyloliquefaciens is marketed by Novozymes under the name BAN ®, and variants derived from the α-amylase from B. stearothermophilus under the names BSG ® and Novamyl ®, likewise from Novozymes.
Desweiteren sind für diesen
Zweck die in der Anmeldung WO 02/10356 A2 offenbarte α-Amylase aus Bacillus
sp. A 7-7 (DSM 12368) und die in der Anmeldung WO 02/44350 A2 beschriebene
Cyclodextrin-Glucanotransferase (CGTase) aus B. agaradherens (DSM
9948) hervorzuheben. Ferner sind die amylolytischen Enzyme einsetzbar,
die dem Sequenzraum von α-Amylasen
angehören,
der in der Anmeldung WO 03/002711 A2 definiert wird, und die, die
in der noch nicht publizierten Anmeldung
Darüber hinaus sind die unter den Handelsnamen Fungamyl® von der Firma Novozymes erhältlichen Weiterentwicklungen der α-Amylase aus Aspergillus niger und A. oryzae geeignet. Ein weiteres Handelsprodukt ist beispielsweise die Amylase-LT®.In addition, the enhancements available under the trade names Fungamyl.RTM ® by Novozymes of α-amylase from Aspergillus niger and A. oryzae. Another commercial product is the Amylase-LT ® .
Erfindungsgemäße Mittel können Lipasen oder Cutinasen, insbesondere wegen ihrer Triglycerid-spaltenden Aktivitäten enthalten, aber auch, um aus geeigneten Vorstufen in situ Persäuren zu erzeugen. Hierzu gehören beispielsweise die ursprünglich aus Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) erhältlichen, beziehungsweise weiterentwickelten Lipasen, insbesondere solche mit dem Aminosäureaustausch D96L. Sie werden beispielsweise von der Firma Novozymes unter den Handelsnamen Lipolase®, Lipolase®Ultra, LipoPrime®, Lipozyme® und Lipex® vertrieben. Desweiteren sind beispielsweise die Cutinasen einsetzbar, die ursprünglich aus Fusarium solani pisi und Humicola insolens isoliert worden sind. Ebenso brauchbare Lipasen sind von der Firma Amano unter den Bezeichnungen Lipase CE®, Lipase P®, Lipase B®, beziehungsweise Lipase CES®, Lipase AKG®, Bacillis sp. Lipase®, Lipase AP®, Lipase M-AP® und Lipase AML® erhältlich. Von der Firma Genencor sind beispielsweise die Lipasen, beziehungsweise Cutinasen einsetzbar, deren Ausgangsenzyme ursprünglich aus Pseudomonas mendocina und Fusarium solanii isoliert worden sind. Als weitere wichtige Handelsprodukte sind die ursprünglich von der Firma Gist-Brocades vertriebenen Präparationen M1 Lipase® und Lipomax® und die von der Firma Meito Sangyo KK, Japan, unter den Namen Lipase MY-30®, Lipase OF® und Lipase PL® vertriebenen Enzyme zu erwähnen, ferner das Produkt Lumafast® von der Firma Genencor.Agents according to the invention can contain lipases or cutinases, in particular because of their triglyceride-cleaving activities, but also in order to generate peracids in situ from suitable precursors. These include, for example, the lipases originally obtainable from Humicola lanuginosa (Thermomyces lanuginosus) or further developed, in particular those with the amino acid exchange D96L. They are sold, for example, by Novozymes under the trade names Lipolase ® , Lipolase ® Ultra, LipoPrime ® , Lipozyme ® and Lipex ® . Furthermore, for example, the cutinases can be used, which were originally isolated from Fusarium solani pisi and Humicola insolens. Likewise useable lipases are available from Amano under the designations Lipase CE ®, Lipase P ®, Lipase B ®, or lipase CES ®, Lipase AKG ®, Bacillis sp. Lipase ® , Lipase AP ® , Lipase M-AP ® and Lipase AML ® available. For example, the Genencor company can use the lipases or cutinases whose starting enzymes were originally isolated from Pseudomonas mendocina and Fusarium solanii. Other important commercial products, the preparations originally sold by Gist-Brocades M1 Lipase ® and Lipomax® ® and the enzymes marketed by Meito Sangyo KK, Japan under the names Lipase MY-30 ®, Lipase OF ® and lipase PL ® to mention, also the product Lumafast ® from Genencor.
Erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere wenn sie für die Behandlung von Textilien gedacht sind, Cellulasen enthalten, je nach Zweck als reine Enzyme, als Enzympräparationen oder in Form von Mischungen, in denen sich die einzelnen Komponenten vorteilhafterweise hinsichtlich ihrer verschiedenen Leistungsaspekte ergänzen. Zu diesen Leistungsaspekten zählen insbesondere Beiträge zur Primärwaschleistung, zur Sekundärwaschleistung des Mittels (Antiredepositionswirkung oder Vergrauungsinhibition) und Avivage (Gewebewirkung), bis hin zum Ausüben eines „stone washed"-Effekts.Agents according to the invention can, especially if they for the Treatment of textiles are thought to contain cellulases, each by purpose as pure enzymes, as enzyme preparations or in the form of Mixtures in which the individual components are advantageously complement in terms of their various performance aspects. To count these performance aspects especially contributions for primary washing performance, for secondary washing performance of the agent (anti-redeposition effect or graying inhibition) and finish (tissue effect), up to the exertion of a "stone washed" effect.
Eine brauchbare pilzliche, Endoglucanase(EG)-reiche Cellulase-Präparation, beziehungsweise deren Weiterentwicklungen werden von der Firma Novozymes unter dem Handelsnamen Celluzyme® angeboten. Die ebenfalls von der Firma Novozymes erhältlichen Produkte Endolase® und Carezyme® basieren auf der 50 kD-EG, beziehungsweise der 43 kD-EG aus N. insolens DSM 1800. Weitere einsetzbare Handelsprodukte dieser Firma sind Cellusoft® und Renozyme®. Letzteres basiert auf der Anmeldung WO 96/29397 A1. Leistungsverbesserte Cellulase-Varianten gehen beispielsweise aus der Anmeldung WO 98/12307 A1 hervor. Ebenso sind die in der Anmeldung WO 97/14804 A1 offenbarten Cellulasen einsetzbar; beispielsweise die darin offenbarte 20 kD-EG aus Melanocarpus, die von der Firma AB Enzymes, Finnland, unter den Handelsnamen Ecostone® und Biotouch® erhältlich ist. Weitere Handelprodukte der Firma AB Enzymes sind Econase® und Ecopulp®. Weitere geeignete Cellulasen aus Bacillus sp. CBS 670.93 und CBS 669.93 werden in WO 96/34092 A2 offenbart, wobei die aus Bacillus sp. CBS 670.93 von der Firma Genencor unter dem Handelsnamen Puradax® erhältlich ist. Weitere Handelsprodukte der Firma Genencor sind „Genencor detergent Cellulase L" und IndiAge®Neutra.A useful fungal, endoglucanase (EG) -rich cellulase preparation or its further developments are offered by the Novozymes company under the trade name Celluzyme ® . The products Endolase ® and Carezyme ®, which are also available from Novozymes, are based on the 50 kD-EG and the 43 kD-EG from N. insolens DSM 1800. Other usable commercial products from this company are Cellusoft ® and Renozyme ® . The latter is based on the application WO 96/29397 A1. Performance-improved cellulase variants can be found, for example, in the application WO 98/12307 A1. The cellulases disclosed in application WO 97/14804 A1 can also be used; For example, it revealed 20 kD EG Melanocarpus, available from AB Enzymes, Finland, under the trade names Ecostone® ® and Biotouch ®. Other commercial products from AB Enzymes are Econase ® and Ecopulp ® . Other suitable cellulases from Bacillus sp. CBS 670.93 and CBS 669.93 are disclosed in WO 96/34092 A2, the ones from Bacillus sp. CBS is available from Genencor under the trade name Puradax® ® 670.93. Other commercial products from Genencor are "Genencor detergent Cellulase L" and IndiAge ® Neutra.
Erfindungsgemäße Mittel können insbesondere zur Entfernung bestimmter Problemanschmutzungen weitere Enzyme enthalten, die unter dem Begriff Hemicellulasen zusammengefaßt werden. Hierzu gehören beispielsweise Mannanasen, Xanthanlyasen, Pektinlyasen (= Pektinasen), Pektinesterasen, Pektatlyasen, Xyloglucanasen (= Xylanasen), Pullulanasen und β-Glucanasen. Geeignete Mannanasen sind beispielsweise unter den Namen Gamanase® und Pektinex AR® von der Firma Novozymes, unter dem Namen Rohapec® B1L von der Firma AB Enzymes und unter dem Namen Pyrolase® von der Firma Diversa Corp., San Diego, CA, USA erhältlich. Eine geeignete β-Glucanase aus einem B. alcalophilus geht beispielsweise aus der Anmeldung WO 99/06573 A1 hervor. Die aus B. subtilis gewonnene β-Glucanase ist unter dem Namen Cereflo® von der Firma Novozymes erhältlich.Agents according to the invention can contain further enzymes, in particular for removing certain problem soils, which are summarized under the term hemicellulases. These include, for example, mannanases, xanthan lyases, pectin lyases (= pectinases), pectin esterases, pectate lyases, xyloglucanases (= xylanases), pullulanases and β-glucanases. Suitable mannanases are available, for example under the name Gamanase ® and Pektinex AR ® from Novozymes, under the name Rohapec ® B1 from AB Enzymes and under the name Pyrolase® ® from Diversa Corp., San Diego, CA, United States. A suitable β-glucanase from a B. alcalophilus can be found, for example, in the application WO 99/06573 A1. The obtained from B. subtilis β-glucanase is available under the name Cereflo ® from Novozymes.
Zur Erhöhung der bleichenden Wirkung können erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittel Oxidoreduktasen, beispielsweise Oxidasen, Oxygenasen, Katalasen, Peroxidasen, wie Halo-, Chloro-, Bromo-, Lignin-, Glucose- oder Mangan-peroxidasen, Dioxygenasen oder Laccasen (Phenoloxidasen, Polyphenoloxidasen) enthalten. Als geeignete Handelsprodukte sind Denilite® 1 und 2 der Firma Novozymes zu nennen. Vorteilhafterweise werden zusätzlich vorzugsweise organische, besonders bevorzugt aromatische, mit den Enzymen wechselwirkende Verbindungen zugegeben, um die Aktivität der betreffenden Oxidoreduktasen zu verstärken (Enhancer) oder um bei stark unterschiedlichen Redoxpotentialen zwischen den oxidierenden Enzymen und den Anschmutzungen den Elektronenfluß zu gewährleisten (Mediatoren).To increase the bleaching effect, washing and cleaning agents according to the invention can contain oxidoreductases, for example oxidases, oxygenases, catalases, peroxidases, such as halo-, chloro-, bromo-, lignin, glucose or manganese peroxidases, dioxygenases or laccases (phenol oxidases, polyphenol oxidases) contain. Suitable commercial products are Denilite ® 1 and 2 from Novozymes. Advantageously, organic, particularly preferably aromatic, compounds interacting with the enzymes are additionally added in order to increase the activity of the oxidoreductases in question (enhancers) or to ensure the flow of electrons (mediators) in the case of greatly different redox potentials between the oxidizing enzymes and the soiling.
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, etwa durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder filamentöse Fungi.The enzymes used in agents according to the invention either originate originally from microorganisms, for example of the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola, or Pseudomonas, and / or are produced by suitable microorganisms according to known biotechnological processes, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or filamentous fungi.
Die Aufreinigung der betreffenden Enzyme erfolgt günstigerweise über an sich etablierte Verfahren, beispielsweise über Ausfällung, Sedimentation, Konzentrierung, Filtration der flüssigen Phasen, Mikrofiltration, Ultrafiltration, Einwirken von Chemikalien, Desodorierung oder geeignete Kombinationen dieser Schritte.Purification of the concerned Enzymes are conveniently made by themselves established processes, for example via precipitation, sedimentation, concentration, Filtration of the liquid Phases, microfiltration, ultrafiltration, exposure to chemicals, Deodorization or suitable combinations of these steps.
Erfindungsgemäßen Mitteln können die Enzyme in jeder nach dem Stand der Technik etablierten Form zugesetzt werden. Hierzu gehören beispielsweise die durch Granulation, Extrusion oder Lyophilisierung erhaltenen festen Präparationen oder, insbesondere bei flüssigen oder gelförmigen Mitteln, Lösungen der Enzyme, vorteilhafterweise möglichst konzentriert, wasserarm und/oder mit Stabilisatoren versetzt.Agents according to the invention can Enzymes are added in any form established according to the prior art become. This includes for example by granulation, extrusion or lyophilization obtained solid preparations or, especially with liquid or gel-shaped Means, solutions the enzymes, advantageously if possible concentrated, low in water and / or mixed with stabilizers.
Alternativ können die Enzyme sowohl für die feste als auch für die flüssige Darreichungsform verkapselt werden, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Extrusion der Enzymlösung zusammen mit einem, vorzugsweise natürlichen Polymer oder in Form von Kapseln, beispielsweise solchen, bei denen die Enzyme wie in einem erstarrten Gel eingeschlossen sind oder in solchen vom Kern-Schale-Typ, bei dem ein enzymhaltiger Kern mit einer Wasser-, Luft- und/oder Chemikalien-undurchlässigen Schutzschicht überzogen ist. In aufgelagerten Schichten können zusätzlich weitere Wirkstoffe, beispielsweise Stabilisatoren, Emulgatoren, Pigmente, Bleich- oder Farbstoffe aufgebracht werden. Derartige Kapseln werden nach an sich bekannten Methoden, beispielsweise durch Schüttel- oder Rollgranulation oder in Fluid-bed-Prozessen aufgebracht. Vorteilhafterweise sind derartige Granulate, beispielsweise durch Aufbringen polymerer Filmbildner, staubarm und aufgrund der Beschichtung lagerstabil.Alternatively, the enzymes can be used for both the solid for as well the liquid Dosage form are encapsulated, for example by spray drying or extrusion of the enzyme solution together with a, preferably natural polymer or in the form of capsules, for example those in which the enzymes as in enclosed in a solidified or in the core-shell type, in which an enzyme-containing core with a water, air and / or Chemical-impermeable Protective layer covered is. Additional active ingredients, for example stabilizers, emulsifiers, pigments, bleaching agents or Dyes are applied. Such capsules are after known methods, for example by shaking or Roll granulation or applied in fluid-bed processes. Are advantageous granules of this type, for example by applying polymeric film formers, low dust and storage stable due to the coating.
Weiterhin ist es möglich, zwei oder mehrere Enzyme zusammen zu konfektionieren, so daß ein einzelnes Granulat mehrere Enzymaktivitäten aufweist.It is also possible to have two or assemble several enzymes so that a single Granulate multiple enzyme activities having.
Ein in einem erfindungsgemäßen Mittel enthaltenes Protein und/oder Enzym kann besonders während der Lagerung gegen Schädigungen wie beispielsweise Inaktivierung, Denaturierung oder Zerfall etwa durch physikalische Einflüsse, Oxidation oder proteolytische Spaltung geschützt werden. Bei mikrobieller Gewinnung der Proteine und/oder Enzyme ist eine Inhibierung der Proteolyse besonders bevorzugt, insbesondere wenn auch die Mittel Proteasen enthalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Mittel enthalten zu diesem Zweck Stabilisatoren.One in an agent according to the invention contained protein and / or enzyme can be particularly during the Storage against damage such as inactivation, denaturation or decay, for example through physical influences, Oxidation or proteolytic cleavage are protected. With microbial Obtaining the proteins and / or enzymes is an inhibition of Proteolysis is particularly preferred, especially if the agents Proteases included. Preferred agents according to the invention contain this Purpose stabilizers.
Eine Gruppe von Stabilisatoren sind reversible Proteaseinhibitoren. Häufig werden hierfür Benzamidin-Hydrochlorid, Borax, Borsäuren, Boronsäuren oder deren Salze oder Ester eingesetzt, darunter vor allem Derivate mit aromatischen Gruppen, etwa ortho-, meta- oder para-substituierte Phenylboronsäuren, insbesondere 4-Formylphenyl-Boronsäure, beziehungsweise die Salze oder Ester der genannten Verbindungen. Auch Peptidaldehyde, das heißt Oligopeptide mit reduziertem C-Terminus, insbesondere solche aus 2 bis 50 Monomeren werden zu diesem Zweck eingesetzt. Zu den peptidischen reversiblen Proteaseinhibitoren gehören unter anderem Ovomucoid und Leupeptin. Auch spezifische, reversible Peptid-Inhibitoren für die Protease Subtilisin sowie Fusionsproteine aus Proteasen und spezifischen Peptid-Inhibitoren sind hierfür geeignet.A group of stabilizers are reversible protease inhibitors. Benzamidine hydrochloride, Borax, boric acids, boronic acids or their salts or esters, including mainly derivatives with aromatic groups, for example ortho-, meta- or para-substituted phenylboronic acids, in particular 4-formylphenyl boronic acid, or the salts or esters of the compounds mentioned. Also peptide aldehydes, that is Oligopeptides with reduced C-terminus, especially those from 2 to 50 monomers are used for this purpose. To the peptidic Reversible protease inhibitors include ovomucoid, among others and leupeptin. Also specific, reversible peptide inhibitors for the protease Subtilisin as well as fusion proteins from proteases and specific Peptide inhibitors are for this suitable.
Weitere Enzymstabilisatoren sind Aminoalkohole wie Mono-, Di-, Triethanol- und -Propanolamin und deren Mischungen, aliphatische Carbonsäuren bis zu C12, wie beispielsweise Bernsteinsäure, andere Dicarbonsäuren oder Salze der genannten Säuren. Auch endgruppenverschlossene Fettsäureamidalkoxylate sind für diesen Zweck geeignet. Bestimmte als Builder eingesetzte organische Säuren vermögen, wie in WO 97/18287 offenbart, zusätzlich ein enthaltenes Enzym zu stabilisieren.Further enzyme stabilizers are amino alcohols such as mono-, di-, triethanol- and -propanolamine and their mixtures, aliphatic carboxylic acids up to C 12 , such as succinic acid, other dicarboxylic acids or salts of the acids mentioned. End-capped fatty acid amide alkoxylates are also suitable for this purpose. Certain organic acids used as builders, as disclosed in WO 97/18287, can additionally stabilize an enzyme contained.
Niedere aliphatische Alkohole, vor allem aber Polyole, wie beispielsweise Glycerin, Ethylenglykol, Propylenglykol oder Sorbit sind weitere häufig eingesetzte Enzymstabilisatoren. Auch Di-Glycerinphosphat schützt gegen Denaturierung durch physikalische Einflüsse. Ebenso werden Calcium- und/oder Magnesiumsalze eingesetzt, wie beispielsweise Calciumacetat oder Calcium-Formiat.Lower aliphatic alcohols but above all polyols, such as glycerol, ethylene glycol, Propylene glycol or sorbitol are other frequently used enzyme stabilizers. Di-glycerol phosphate also protects against denaturation by physical influences. Calcium and / or magnesium salts, such as calcium acetate or calcium formate.
Polyamid-Oligomere oder polymere Verbindungen wie Lignin, wasserlösliche Vinyl-Copolymere oder Cellulose-Ether, Acryl-Polymere und/oder Polyamide stabilisieren die Enzym-Präparation unter anderem gegenüber physikalischen Einflüssen oder pH-Wert-Schwankungen. Polyamin-N-Oxid-enthaltende Polymere wirken gleichzeitig als Enzymstabilisatoren und als Farbübertragungsinhibitoren. Andere polymere Stabilisatoren sind lineare C8-C18 Polyoxyalkylene. Auch Alkylpolyglycoside können die enzymatischen Komponenten des erfindungsgemäßen Mittels stabilisieren und vermögen vorzugsweise, diese zusätzlich in ihrer Leistung zu steigern. Vernetzte N-haltige Verbindungen erfüllen vorzugsweise eine Doppelfunktion als Soil-release-Agentien und als Enzym-Stabilisatoren. Hydrophobes, nichtionisches Polymer stabilisiert insbesondere eine gegebenenfalls enthaltene Cellulase.Polyamide oligomers or polymeric compounds such as lignin, water-soluble vinyl copolymers or cellulose ethers, acrylic polymers and / or polyamides stabilize the enzyme preparation, among other things, against physical influences or pH fluctuations. Polymers containing polyamine-N-oxide act simultaneously as enzyme stabilizers and as color transfer inhibitors. Other polymeric stabilizers are linear C 8 -C 18 polyoxyalkylenes. Alkyl polyglycosides can also stabilize the enzymatic components of the agent according to the invention and preferably are capable of additionally increasing their performance. Crosslinked N-containing compounds preferably fulfill a double function as soil release agents and as enzyme stabilizers. Hydrophobic, nonionic polymer in particular stabilizes any cellulase that may be present.
Reduktionsmittel und Antioxidantien erhöhen die Stabilität der Enzyme gegenüber oxidativem Zerfall; hierfür sind beispielsweise schwefelhaltige Reduktionsmittel geläufig. Andere Beispiele sind Natrium-Sulfat und reduzierende Zucker.Reducing agents and antioxidants increase the stability of the enzymes oxidative decay; therefor for example, sulfur-containing reducing agents are common. Other Examples are sodium sulfate and reducing sugars.
Besonders bevorzugt werden Kombinatonen von Stabilisatoren eingesetzt, beispielsweise aus Polyolen, Borsäure und/oder Borax, die Kombination von Borsäure oder Borat, reduzierenden Salzen und Bernsteinsäure oder anderen Dicarbonsäuren oder die Kombination von Borsäure oder Borat mit Polyolen oder Polyaminoverbindungen und mit reduzierenden Salzen. Die Wirkung von Peptid-Aldehyd-Stabilisatoren wird günstigerweise durch die Kombination mit Borsäure und/oder Borsäurederivaten und Polyolen gesteigert und noch weiter durch die zusätzliche Wirkung von zweiwertigen Kationen, wie zum Beispiel Calcium-Ionen.Combinations of stabilizers are particularly preferably used, for example made of polyols, boric acid and / or borax, the combination of boric acid or borate, reducing salts and succinic acid or other dicarboxylic acids or the combination of boric acid or borate with polyols or polyamino compounds and with reducing salts. The action of peptide-aldehyde stabilizers is favorably increased by the combination with boric acid and / or boric acid derivatives and polyols and even more further by the additional action of divalent cations, such as calcium ions.
Erfindungsgemäße Mittel sind in einer bevorzugten Ausführungsform dadurch gekennzeichnet, daß sie, beispielsweise um die enthaltenen Wirkstoffe zeitlich oder räumlich voneinander getrennt freizusetzen, aus mehr als einer Phase bestehen. Dabei kann es sich um Phasen in verschiedenen, insbesondere aber um Phasen in denselben Aggregatzuständen handeln.Agents according to the invention are preferred embodiment characterized in that for example, around the active ingredients contained in time or space release separately, consist of more than one phase. there can be phases in different, but especially phases in the same physical states act.
Erfindungsgemäße Mittel, die aus mehr als
einer festen Komponente zusammengesetzt sind, können auf einfache Weise dadurch
hergestellt werden, daß verschiedene
feste Komponenten, insbesondere Pulver, Granulate oder Extrudate
mit verschiedenen Inhaltsstoffen und/oder unterschiedlichem Freisetzungsverhalten in
insgesamt loser Form miteinander vermischt werden. Die Herstellung
erfindungsgemäßer fester
Mittel aus einer oder mehreren Phasen kann auf bekannte Weise, zum
Beispiel durch Sprühtrocknen
oder Granulation erfolgen, wobei die Enzyme und eventuelle weitere
thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel
gegebenenfalls später
separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel
mit erhöhtem
Schüttgewicht,
insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein aus der
europäischen
Patentschrift
Proteine können für feste Mittel beispielsweise in getrockneter, granulierter, verkapselter oder verkapselter und zusätzlich getrockneter Form eingesetzt werden. Sie können separat, das heißt als eigene Phase, oder mit anderen Bestandteilen zusammen in derselben Phase, mit oder ohne Kompaktierung zugesetzt werden. Sollen mikroverkapselte Enzyme in fester Form verarbeitet werden, so kann das Wasser mit aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren aus den sich aus der Aufarbeitung ergebenden wäßrigen Lösungen entfernt werden, wie Sprühtrocknung, Abzentrifugieren oder durch Umsolubilisieren. Die auf diese Weise erhaltenen Teilchen haben üblicherweise eine Teilchengröße zwischen 50 und 200 um.Proteins can be used for solid agents, for example in dried, granulated, encapsulated or encapsulated and additionally dried form can be used. You can use them separately, that is, as your own Phase, or with other ingredients together in the same phase, with or without compacting. Should be microencapsulated Enzymes are processed in solid form, so the water can with processes known from the prior art from the Workup resulting aqueous solutions removed like spray drying, Spin down or by re-solubilization. That way obtained particles usually have a particle size between 50 and 200 µm.
Die verkapselte Form bietet sich
an, um die Enzyme vor anderen Bestandteilen, wie beispielsweise Bleichmitteln,
zu schützen
oder um eine kontrollierte Freisetzung (controlled release) zu ermöglichen.
Je nach der Größe dieser
Kapseln wird nach Milli-, Mikro- und Nanokapseln unterschieden,
wobei Mikrokapseln für
Enzyme besonders bevorzugt sind. Solche Kapseln werden beispielsweise
mit den Patentanmeldungen WO 97/24177 und
Es können auch mindestens zwei feste Phasen miteinander verbunden vorliegen. So besteht eine Möglichkeit, ein festes erfindungsgemäßes Mittel zur Verfügung zu stellen, in dem Verpressen oder Kompaktieren zu Tabletten. Solche Tabletten können ein- oder mehrphasig sein. Damit bietet auch diese Darreichungsform die Möglichkeit, ein festes erfindungsgemäßes Mittel mit zwei festen Phasen vorzulegen. Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig sein können und/oder aus einer mehreren Schichten bestehen können, werden vorzugsweise alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN/cm2, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN/cm2 verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN/cm2, insbesondere bei 10 bis 15 kN/cm2 durchgeführt. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind.At least two solid phases can also be connected to one another. There is thus a possibility of providing a solid agent according to the invention by compressing or compacting it into tablets. Such tablets can be single or multi-phase. This dosage form therefore also offers the possibility of presenting a solid agent according to the invention with two solid phases. For the preparation of agents according to the invention in tablet form, which can be single-phase or multi-phase, single-color or multi-color and / or can consist of several layers, all constituents - if appropriate one layer each - are preferably mixed with one another in a mixer and the mixture by means of conventional tablet presses, for example eccentric presses or rotary presses, with pressing forces in the range from about 50 to 100 kN / cm 2 , preferably at 60 to 70 kN / cm 2 . In the case of multi-layer tablets in particular, it can be advantageous if at least one layer is pre-compressed. This is preferably carried out at press forces between 5 and 20 kN / cm 2 , in particular at 10 to 15 kN / cm 2 . A tablet produced in this way preferably has a weight of 10 g to 50 g, in particular 15 g to 40 g. The three-dimensional shape of the tablets is arbitrary and can be round, oval or angular, intermediate forms also being possible.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn in mehrphasigen Mitteln wenigstens eine der Phasen ein Amylase-sensitives Material, insbesondere Stärke enthält oder von diesem zumindest teilweise umgeben oder beschichtet ist. Auf diese Weise wird diese Phase mechanisch stabilisiert und/oder gegen Einflüsse von außen geschützt und gleichzeitig über eine in der Waschflotte wirksame Amylase angegriffen, so daß die Freisetzung der Inhaltsstoffe erleichtert wird.It is particularly advantageous if in multiphase agents at least one of the phases is an amylase sensitive Material, especially starch contains or is at least partially surrounded or coated by it. In this way, this phase is mechanically stabilized and / or against influences protected from the outside and at the same time over attacked an effective amylase in the wash liquor, so that the release of the Ingredients is facilitated.
Ebenfalls bevorzugte erfindungsgemäße Mittel sind dadurch gekennzeichnet, daß sie insgesamt flüssig, gelförmig oder pastös vorliegen. Die enthaltenen Proteine, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Protein, werden solchen Mitteln bevorzugt ausgehend von einer nach dem Stand der Technik durchgeführten Proteingewinnung und Präparation in konzentrierter wäßriger oder nichtwäßriger Lösung, beispielsweise in flüssiger Form, etwa als Lösung, Suspension oder Emulsion, aber auch in Gelform oder verkapselt oder als getrocknetes Pulver zugesetzt. Derartige erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel in Form von Lösungen in üblichen Lösungsmitteln werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe hergestellt, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können.Also preferred agents according to the invention are characterized in that they overall liquid, gel or pasty available. The proteins contained, preferably a protein according to the invention, are such means preferably starting from one according to the prior art Technology performed Protein extraction and preparation in concentrated aqueous or non-aqueous solution, for example in liquid form, as a solution, Suspension or emulsion, but also in gel form or encapsulated or added as a dried powder. Such washing or cleaning agents according to the invention in the form of solutions in usual solvents are usually made by simply mixing the ingredients, those in bulk or as a solution can be placed in an automatic mixer.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind solche flüssigen, gelförmigen oder pastösen Mittel, denen ein erfindungswesentliches Protein und/oder eines der anderen enthaltenen Proteine und/oder einer der anderen enthaltenene Inhaltsstoffe verkapselt, vorzugsweise in Form von Mikrokapseln zugesetzt worden ist. Besonders bevorzugt sind darunter solche mit Kapseln aus amylasesensitivem Material. Solch eine gemeinsame Verwendung von Amylase-sensitiven Materialien und dem erfindungswesentlichen amylolytischen Enzym in einem Wasch- oder Reinigungsmittel kann Synergieeffekte zeigen, etwa dergestalt daß das stärkespaltende Enzym die Spaltung der Mikrokapseln unterstützt und somit den Freisetzungsprozeß der verkapselten Inhaltsstoffe steuert, so daß deren Freisetzung nicht während der Lagerung und/oder nicht zu Beginn des Reinigungsvorgangs, sondern erst zu einem bestimmten Zeitpunkt erfolgt. Auf diesem Mechanismus können komplexe Wasch- und Reinigungsmittelsysteme mit verschiedensten Inhaltsstoffen und verschiedensten Kapseltypen beruhen, die besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.One embodiment of the present invention is such a liquid, gel-like or pasty Agents to which a protein essential to the invention and / or one of the other proteins and / or one of the other contained ingredients has been encapsulated, preferably in the form of microcapsules. Those with capsules made of amylase-sensitive material are particularly preferred. Such a joint use of amylase-sensitive materials and the amylolytic enzyme essential to the invention in a washing or cleaning agent can show synergy effects, for example in such a way that the starch-splitting enzyme supports the cleavage of the microcapsules and thus controls the release process of the encapsulated ingredients so that their release does not take place during storage and / or not at the beginning of the cleaning process, but only at a certain time. Complex detergent and cleaning agent systems with a wide variety of ingredients and a wide variety of capsule types, which represent particularly preferred embodiments of the present invention, can be based on this mechanism.
Ein vergleichbarer Effekt ist dann gegeben, wenn sich die Inhaltsstoffe des Wasch- oder Reinigungsmittels auf mindestens zwei unterschiedliche Phasen verteilen, beispielsweise zwei oder mehr feste, miteinander verbundene Phasen eines tablettenförmigen Wasch- oder Reinigungsmittels, oder verschiedene Granulate innerhalb desselben pulverförmigen Mittels. Zwei- oder Mehrphasenreiniger sind für die Anwendung sowohl in maschinellen Geschirrspülern als auch in Waschmitteln Stand der Technik. Die Aktivität eines amylolytischen Enzyms in einer früher aktivierten Phase ist Voraussetzung für die Aktivierung einer späteren Phase, wenn diese von einer Amylase-sensitiven Hülle oder Beschichtung umgeben ist oder das Amylase-sensitive Material einen integralen Bestandteil der festen Phase darstellt, bei dessen teilweiser oder vollständiger Hydrolyse die betreffende Phase desintegriert. Der Einsatz des erfindungswesentlichen Enzyms für diesen Zweck stellt somit eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.A comparable effect is then given when the ingredients of the detergent or cleaning agent spread over at least two different phases, for example two or more solid, interconnected phases of a tablet-like detergent or cleaning agent, or different granules within the same powdery agent. Two or multi-phase cleaners are for use in both machine dishwashers as well as in detergents prior art. The activity of a Amylolytic enzyme in a previously activated phase is a prerequisite for the Activation of a later one Phase, if this is surrounded by an amylase-sensitive envelope or coating or the amylase-sensitive material is an integral part represents the solid phase, in its partial or complete hydrolysis disintegrates the phase in question. The use of what is essential to the invention Enzyme for this is the purpose of a preferred embodiment of the present Invention.
Die Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln vermögen sich geeigneterweise gegenseitig in ihrer Leistung zu unterstützen. Die synergistische Verwendung von Amylase und Farbübertragungsinhibitoren zur Steigerung der Reinigungsleistung wird beispielsweise mit der Anmeldung WO 99/63035 offenbart. Es ist auch bekannt, daß Polymere, die gleichzeitig als Cobuilder eingesetzt werden können, wie beispielsweise Alkyl-Poly-Glykoside, die Aktivität und die Stabilität von enthaltenen Enzymen stabilisieren und steigern können, so aus der Anmeldung WO 98/45396. Somit ist es bevorzugt, wenn eine erfindungsgemäße α-Amylase-Variante durch einen der übrigen, oben aufgeführten Bestandteile modifiziert, insbesondere stabilisiert und/oder in seinem Beitrag zur Wasch-, beziehungsweise Reinigungsleistung des Mittels gesteigert wird. Entsprechend abgestimmte Rezepturen für erfindungsgemäße Mittel stellen somit besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.The ingredients of washing and Detergents suitably support each other in their performance. The synergistic use of amylase and color transfer inhibitors for The cleaning performance is increased, for example, with the registration WO 99/63035. It is also known that polymers that coexist can be used as cobuilders, for example alkyl polyglycosides, the activity and stability of the enzymes contained can stabilize and increase, so from application WO 98/45396. It is therefore preferred if one α-Amylase variant according to the invention by one of the rest, listed above Components modified, in particular stabilized and / or in its Contribution to the washing or cleaning performance of the product is increased. Appropriate formulations for agents according to the invention thus represent particularly preferred embodiments of the present Invention.
Im Rahmen entsprechender Mittel können erfindungsgemäße α-Amylase-Varianten zur Aktivierung der eigenen oder anderer Phasen dienen, wenn sie allein oder zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff in einem aus mehr als einer Phase bestehenden Wasch- oder Reinigungsmittel bereitgestellt werden. In entsprechender Weise können sie auch dazu dienen, Inhaltsstoffe aus Kapseln freizusetzen, wenn sie oder ein anderer Wirkstoff in einem Wasch- oder Reinigungsmittel in verkapselter Form bereitgestellt wird.Within the scope of appropriate means, α-amylase variants according to the invention can serve to activate your own or other phases if they alone or together with at least one other cleaning active or the active ingredient supporting the cleaning effect in one detergents or cleaning agents consisting of more than one phase to be provided. In a corresponding manner, they can also serve Release ingredients from capsules when they or someone else Active ingredient in a detergent or cleaning agent in encapsulated Form is provided.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, daß in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine oben beschriebene erfindungsgemäße α-Amylase-Variante aktiv wird.Another subject of the invention are processes for cleaning textiles or hard surfaces, which are characterized in that in at least one of the process steps an α-amylase variant according to the invention described above becomes active.
Denn in dieser Ausführungsform wird die Erfindung dadurch realisiert, daß die erfindungsgemäß verbesserten enzymatischen Eigenschaften, insbesondere die Alkaliaktivität hinsichtlich einer Verbesserung prinzipiell jeden Reinigungsverfahrens ausgenutzt werden. Jedes Reinigungsverfahren wird um die betreffende Aktivität bereichert, wenn sie in wenigstens einem Verfahrensschritt zugesetzt wird. Derartige Verfahren werden beispielsweise mit Maschinen wie gängigen Haushaltsgeschirrspülmaschinen oder Haushaltswaschmaschinen verwirklicht. Bevorzugte Verfahren werden entsprechend den oben gemachten Angaben entsprechend bevorzugt.Because in this embodiment the invention is realized in that the improved according to the invention enzymatic properties, especially regarding the alkali activity In principle, every cleaning process is used for improvement become. Every cleaning process is enriched by the activity in question, if it is added in at least one process step. such Processes are used, for example, with machines such as common household dishwashers or household washing machines. Preferred procedures are preferred according to the information given above.
Weiter bevorzugt sind derartige Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die α-Amylase-Variante über ein oben beschriebenes Mittel eingesetzt wird.Such methods are further preferred, which are characterized in that the α-amylase variant via one described above Means is used.
Besonders bevorzugt ist jedes Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die α-Amylase in dem betreffenden Verfahrensschritt in einer Menge von 0,01 mg bis 400 mg pro entsprechendem Verfahrensschritt eingesetzt wird, vorzugsweise von 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt von 0,03 mg bis 100 mg.Any method is particularly preferred, which is characterized in that the α-amylase in the process step concerned used in an amount of 0.01 mg to 400 mg per corresponding process step is, preferably from 0.02 mg to 300 mg, particularly preferably from 0.03 mg to 100 mg.
Günstigenfalls ergeben sich dabei Konzentrationswerte von 0,0005 bis 20 mg pro 1, bevorzugt 0,005 bis 10 mg pro 1, besonders bevorzugt 0,005 bis 8 mg des amylolytischen Proteins pro 1 Waschflotte. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden.At best, This results in concentration values of 0.0005 to 20 mg per 1, preferably 0.005 to 10 mg per 1, particularly preferably 0.005 to 8 mg of the amylolytic protein per 1 wash liquor. The protein concentration can be done using known methods, for example the BCA method (Bicinchonic acid; 2,2'-bichinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (A.G. Gornall, C. S. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem. 177 (1948), pp. 751-766) be determined.
Entsprechend den bisherigen Ausführungen wird die vorliegende Erfindung auch durch die Verwendung erfindungsgemäßer α-Amylase-Varianten realisiert. Denn auch hierbei kommen die günstigen Eigenschaften der betreffenden Enzym zur Wirkung. Diese gelten insbesondere für Reinigungszwecke.According to the previous versions the present invention is also achieved through the use of α-amylase variants according to the invention realized. Because here too come the favorable properties of the concerned Enzyme to work. These apply in particular to cleaning purposes.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt somit die Verwendung einer der oben beschriebenen erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar.Your own subject of the invention thus represents the use of one of the α-amylase variants according to the invention described above for cleaning textiles or hard surfaces.
Dabei kann es als einzige wirksame Kompoente eingesetzt werden. Vorzugsweise geschieht dies zusammen mit mindestens einem anderen reinigungsaktiven oder die Reinigungswirkung unterstützenden Wirkstoff.It can be the only effective one Components are used. This is preferably done together with at least one other cleaning active or the cleaning effect supportive Active ingredient.
Bevorzugt ist somit eine derartige Verwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die α-Amylase-Variante über ein oben beschriebenes Mittel eingesetzt wird.Such is therefore preferred Use, which is characterized in that the α-amylase variant via a agent described above is used.
Günstigerweise ist eine solche Verwendung dadurch gekennzeichnet, daß pro Anwendung, vorzugsweise pro Anwendung in einer Geschirrspülmaschine oder einer Waschmaschine 0,01 mg bis 400 mg der α-Amylase-Variante eingesetzt werden, bevorzugt 0,02 mg bis 300 mg, besonders bevorzugt 0,03 mg bis 100 mg.conveniently, such use is characterized in that per application, preferably per application in a dishwasher or washing machine 0.01 mg to 400 mg of the α-amylase variant are used, preferably 0.02 mg to 300 mg, particularly preferably 0.03 mg to 100 mg.
Denn hierdurch ergeben sich in der Waschflotte günstigerweise die oben angegebenen Konzentrationswerte. Diese Dosierung kann, je nach Reinigungsproblem vom Hersteller des Mittels oder vom Endverbraucher vorgenommen werden.Because this results in the Wash liquor favorably the concentration values given above. This dosage can depending on the cleaning problem from the manufacturer of the product or from the end user be made.
Eine weitere Ausführungsform stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen α-Amylase-Variante zur Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung dar, insbesondere zum Entschlichten von Baumwolle.Another embodiment is the use an α-amylase variant according to the invention Treatment of raw materials or intermediate products in textile production , especially for desizing cotton.
Rohmaterialien und Zwischenprodukte der Textilherstellung, beispielsweise für solche auf Baumwollbasis, werden im Rahmen ihrer Herstellung und Weiterverarbeitung mit Stärke ausgerüstet, um eine bessere Verarbeitung zu ermöglichen. Dieses sowohl auf Garne, auf Zwischenprodukte, als auch auf Textilien angewendete Verfahren nennt man Schlichten (sizing). Zur Entfernung der Schlichte, also der stärkehaltigen Schutzschicht (Entschlichten, desizing) sind erfindungsgemäße amylolytische Proteine geeignet. Dies insbesondere dann, wenn alkalische Bedingungen herrschen oder wenn weitere Inhaltsstoffe wie beispielsweise Tenside anwesend sind.Raw materials and intermediates textile production, for example for those based on cotton, are equipped with starch in the course of their manufacture and further processing to enable better processing. This applies to both yarns, intermediate products and textiles the procedures used are called sizing. For removal the simple, that is the starchy protective layer (Desizing, desizing) amylolytic proteins according to the invention are suitable. This is particularly the case when there are alkaline conditions or if other ingredients such as surfactants are present.
BeispieleExamples
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.All molecular biological work steps follow standard methods, such as those found in the manual by Fritsch, Sambrook and Maniatis “Molecular cloning: a laboratory manual, "Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989, or equivalent are specified. Enzymes and kits (Kits) were used according to the information of the respective manufacturer.
Beispiel 1example 1
Darstellung der B. amyloliquefaciens-Amylasemutanten durch Error-prone-MutageneseRepresentation of the B. amyloliquefaciens amylase mutants through error-prone mutagenesis
Ausgehend von einer Total-DNA-Präpartation
von B. amyloliquefaciens, wie er unter der Nummer DSM 7 von der
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschenoder
Weg 1b, 38124 Braunschweig (http://www.dsmz.de) bezogen werden kann,
wurde über
PCR ein ca. 1700 by großes Fragment
erhalten, welches das 1545 by umfassende Gen für die α-Amylase enthielt. Dieses Fragment
wurde nach Restriktion mit BamHI und SpeI in den Expressionsvektor
pCYTEX P1 ligiert, der zuvor mit denselben Enzymen geschnitten worden
war, wodurch der in
Eine Präparation dieses Vektors pGBAA-WT wurde nun entsprechend der Beschreibung von H. Zhao et al. (1999) „Methods for Optimizing Industrial Enzymes by Directed Evolution" in Industrial Microbiology and Biotechnology; Hrsg. Demain, A. L. et al., Washington D. C., ASM Press, Seiten 597–604 einer Error-prone-PCR unterworfen. Dabei wird über ein unausgeglichenes Nukleotid-Verhältnisse und durch die Gegenwart von Manganchlorid die Fehlerrate der DNA-Polymerase erhöht. Im einzelnen wurden für einen 100 μl-Ansatz folgende Substanzen zusammengegeben: 10 μl 10 × Mutagenesepuffer (70 mmol/l MgCl2, 500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris-HCl-Puffer (pH 8), 0,1 Gew.-% Gelatine), 10 μl dNTP-Mix (je 2 mmol/l dGTP und dATP, je 10 mmol/l dCTP und dTTP), 50 pmol jedes Primers (SEQ ID NO. 1 und 2), 5–15 ng Template-DNA, eine entsprechende Menge ddH2O und 3 μl MnCl2 (5 mmol/l). Anschließend wurden 5 U kommerziell erhältlicher Taq-Polymerase (Fa. QIAGEN, Hilden, Deutschland) zugegeben und der Ansatz folgendem Temperaturprogramm unterzogen: 60 s Denaturierung bei 95°C, 25 Zyklen mit je (a) 30 s bei 95 °C, (b) 30 s bei 50°C und (c) 45 s bei 72°C und abschließend 120 s bei 72°C.A preparation of this vector pGBAA-WT has now been described in accordance with the description by H. Zhao et al. (1999) "Methods for Optimizing Industrial Enzymes by Directed Evolution" in Industrial Microbiology and Biotechnology; Ed. Demain, AL et al., Washington DC, ASM Press, pages 597-604, is subjected to an error-prone PCR unbalanced nucleotide ratios and the error rate of DNA polymerase increased due to the presence of manganese chloride. The following substances were combined for a 100 μl batch: 10 μl 10 × mutagenesis buffer (70 mmol / l MgCl 2 , 500 mmol / l KCl, 100 mmol / l Tris-HCl buffer (pH 8), 0.1% by weight gelatin), 10 μl dNTP mix (2 mmol / l dGTP and dATP, 10 mmol / l dCTP and dTTP), 50 pmol of each primer (SEQ ID NO. 1 and 2), 5-15 ng of template DNA, a corresponding amount of ddH 2 O and 3 μl of MnCl 2 (5 mmol / l). 5 U of commercially available Taq polymerase (Fa QIAGEN, Hilden, Germany) and the approach following the temperature program trained: 60 s denaturation at 95 ° C, 25 cycles with (a) 30 s at 95 ° C, (b) 30 s at 50 ° C and (c) 45 s at 72 ° C and finally 120 s at 72 ° C.
Das PCR-Produkt wurde nach beendeter Reaktion aufgereinigt und in geeignete Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren kloniert. In diesem Fall wurde zur Reinigung das Qlaquick®PCR-Purification Kit (Fa. QIAGEN, Hilden) gewählt, und das PCR-Produkt nach Restriktion mit den Enzymen NdeI und PstI in die NdeI-PstI-Restriktionsschnittstelle des Vektors pGASTON (E. Henke, Doktorarbeit, Institut für technische Biochemie, Universität Stuttgart) kloniert.After the reaction had ended, the PCR product was purified and cloned into suitable cloning and / or expression vectors. In this case, for cleaning the QIAquick ® PCR Purification Kit (Fa. QIAGEN, Hilden) is selected, and the PCR product was, after restriction with the enzymes NdeI and PstI into the NdeI-PstI restriction site of the vector pGASTON (E. Henke, PhD thesis, Institute for Technical Biochemistry, University of Stuttgart).
Zur Expression der erhaltenen BAA-Varianten wurden zunächst kompetente Zellen von E. coli XL1-blue (erhältlich von der Fa. Stratagene, LaJolla, USA) mit dem Vektor pJL3 (Fa. MoBi-Tech, Göttingen, Deutschland) transformiert, um über das Bacteriocin release protein (BRP) die später in den Überstand abgegebene Enzymausbeute zu erhöhen. Anschließend wurden sie mit den betreffenden pGASTON-Plasmiden transformiert und auf Mikrotiterplatten vereinzelt.To express the BAA variants obtained were initially competent cells from E. coli XL1-blue (available from Stratagene, LaJolla, USA) with the vector pJL3 (MoBi-Tech, Göttingen, Germany) transformed to over the bacteriocin release protein (BRP) is the enzyme yield later released into the supernatant to increase. Subsequently they were transformed with the pGASTON plasmids in question and isolated on microtiter plates.
Beispiel 2Example 2
Screening der B. amyloliquefaciens-α-Amylasemutanten nach verbesserter Alkaliaktivität des abgeleiteten EnzymsScreening of the B. amyloliquefaciens α-amylase mutants after improved alkaline activity of the derived enzyme
Zubereitung der EnzymlösungPreparation of the enzyme solution
Die die Amylase exprimierenden Zellen wurden aufgeschlossen, indem die ganzen Mikrotiterplatten zweimal in flüssigem Stickstoff (–196°C) eingefroren und für 45 min bei 37°C aufgetaut wurden. Das Zellpellet wurde durch Zentrifugation (1000 g, 15 min, 25°C) der Mikrotiterplatten von dem Überstand getrennt und dieser enzymhaltige Überstand direkt für den Aktivitätstest eingesetzt.The cells expressing the amylase were disrupted by placing the whole microtiter plate twice in liquid Frozen nitrogen (-196 ° C) and for 45 min at 37 ° C have been thawed. The cell pellet was removed by centrifugation (1000 g, 15 min, 25 ° C) the microtiter plates from the supernatant separated and this enzyme-containing supernatant used directly for the activity test.
Durchführung des AktivitätstestsConducting the activity test
Für eine Testdurchführung bei pH 7 (Standard) werden in einem 50 ml Falcon-Tube zu 30 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) 4 Phadebas®-Tabletten (quervernetzte Stärke mit kovalent daran gebundenem Farbstoff; erhältlich von der Fa. Pharmacia & Upjohn GmbH, Diagnostics, Freiburg; Best.-Nr. 10-5380-32) gegeben und suspendiert. Für eine Durchführung bei pH 10 werden 4 Phadebas®-Tabletten wie oben beschrieben suspendiert, in einer Glasfritte (Porengröße 1 oder 2) von der flüssigen Phase getrennt und zweimal mit je 10 ml ddH2O gewaschen. Das Retentat wird in 30 ml eines 0,1 M Glycin/NaON-Puffers (pH 10) mit 0,25 mmol/l CaCl2 resuspendiert.To carry out a test at pH 7 (standard), 4 Phadebas ® tablets (cross-linked starch with covalently bound dye) are available in a 50 ml Falcon tube to 30 ml double distilled water (ddH 2 O); available from Pharmacia & Upjohn GmbH, Diagnostics, Freiburg; Order No. 10-5380-32) and suspended. To carry out at pH 10, 4 Phadebas ® tablets are suspended as described above, separated from the liquid phase in a glass frit (pore size 1 or 2) and washed twice with 10 ml each of ddH 2 O. The retentate is resuspended in 30 ml of a 0.1 M glycine / NaON buffer (pH 10) with 0.25 mmol / l CaCl 2 .
150 μl der für die jeweiligen pH-Werte erhaltenen Suspensionen wurden nach gutem Aufschlämmen in jedes Well einer MAR5 N50®-Filtermikrotiterplatte (Fa. Millipore, Schwalbach) pipettiert. Diese wurden mit 50–75 μl enzymhaltiger Lösung versetzt, gemischt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die flüssigen Phasen wurden durch Zentrifugation aus der Filtermikrotiterplatte (15 min, 1000 g, 25°C) in eine darunterliegende zweite Mikrotiterplatte überführt und die Absorption der auf diese Weise erhaltenen flüssigen Phasen bei einer Wellenlänge von 620 nm gemessen.After a good suspension, 150 μl of the suspensions obtained for the respective pH values were pipetted into each well of a MAR5 N50 ® filter microtiter plate (Millipore, Schwalbach). These were mixed with 50-75 μl enzyme-containing solution, mixed and incubated for 15 min at 37 ° C. The liquid phases were transferred by centrifugation from the filter microtiter plate (15 min, 1000 g, 25 ° C.) to an underlying second microtiter plate and the absorption of the liquid phases obtained in this way was measured at a wavelength of 620 nm.
Auf diese Weise wurden drei Mutanten des α-Amylase-Gens identifiziert: die Stämme A42, A29 und B1.In this way, three mutants were created of the α-amylase gene identified: the tribes A42, A29 and B1.
Beispiel 3Example 3
Anzucht der Stämme, Gewinnung des zugehörigen Gens und dessen Sequenzierung.Cultivation of the strains, extraction the associated Gene and its sequencing.
Die auf diese Weise identifizierten Stämme wurden nach Routine-Methoden unter Antibiotikum-Selektion in Kultur genommen, die betreffenden pGASTON-Mutanten-Plasmide isoliert und über Sequenzierung die Abweichungen gegenüber der Ausgangs-DNA ermittelt.The identified in this way strains were cultivated according to routine methods with antibiotic selection taken, the pGASTON mutant plasmids in question were isolated and sequenced the deviations from the starting DNA determined.
Die hierdurch erhaltenen DNA- und
Aminosäuresequenzen
der α-Amylasen
BAA A42, BAA A29 und BAA B1 sind im Sequenzprotokoll unter SEQ ID
NO. 5 und 6, SEQ ID NO. 7 und 8, beziehungsweise unter SEQ ID NO.
9 und 10 angegeben. Die zugehörigen
Aminosäuresequenzen
sind außerdem
im Alignment der
Diese Varianten unterscheiden sich vom Wildtyp der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens durch Austausche in einzelnen Positionen von 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 und 474 in der Zählung nach SEQ ID NO. 4. Konkret wurden folgende Austausche ermittelt: L13P, V32A, W194R, S197P, 1203L, A230V, N297D, E356D, K406R, N414S und K474Q.These variants differ of the wild type of the α-amylase from B. amyloliquefaciens by exchange in individual positions of 13, 32, 194, 197, 203, 230, 297, 356, 406, 414 and 474 in the Counting after SEQ ID NO. 4. Specifically, the following exchanges were determined: L13P, V32A, W194R, S197P, 1203L, A230V, N297D, E356D, K406R, N414S and K474Q.
Im Detail verfügt BAA A42 über die Austausche L13P, W194R,
S197P, E356D und N414S, BAA A29 über
die Austausche L13P, V32A, A230V, N297S, K406R und N414S, und BAA
B1 über
die Austausche L13P, V32A, 1203L, A230V, N297S, K406R, N414S und
K474Q. Sie können
daher statt als α-Amylasen
BAA A42, A29 und B1 auch als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase
L13P/W194R/S197P/E356D/N414S, als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase
L13P/V32A/A230V/N297S/K406R/N414S, beziehungsweise als
– B. amyloliquefaciens-α-Amylase
L13P/V32A/1203L/A230V/N297S/K406R/N414S/K474Q bezeichnet werden.In detail, BAA A42 has exchanges L13P, W194R, S197P, E356D and N414S, BAA A29 has exchanges L13P, V32A, A230V, N297S, K406R and N414S, and BAA B1 has exchanges L13P, V32A, 1203L, A230V, N297S, K406R, N414S and K474Q. They can therefore also be used instead of as α-amylases BAA A42, A29 and B1
- B. amyloliquefaciens α-amylase L13P / W194R / S197P / E356D / N414S, as
- B. amyloliquefaciens-α-amylase L13P / V32A / A230V / N297S / K406R / N414S, or as
- B. amyloliquefaciens-α-amylase L13P / V32A / 1203L / A230V / N297S / K406R / N414S / K474Q.
Bemerkenswert ist, daß die Austausche in den Positionen 13 und 414 (L13P und N414S) in allen drei α-Amylase-Varianten vorkommen. A42 verfügt über drei zusätzliche Austausche in den Positionen 194, 197 und 356 (W194R, S197P und E356D). A29 weist vier zusätzliche Austausche zu denen in den Positionen 13 und 414 auf, nämlich in den Positionen 32, 230, 297 und 406 (V32A, A230V, N297S und K406R). Gegenüber A29 verfügt B1 zusätzlich über zwei weitere Aminosäure-Substitutionen, nämlich in den Positionen 203 und 474, konkret über die Variationen I203L und K474Q.It is noteworthy that the exchanges in positions 13 and 414 (L13P and N414S) in all three α-amylase variants occurrence. A42 has three additional Exchange in positions 194, 197 and 356 (W194R, S197P and E356D). A29 has four additional ones Exchanges to those in positions 13 and 414, namely in positions 32, 230, 297 and 406 (V32A, A230V, N297S and K406R). Opposite A29 has B1 additionally over two further amino acid substitutions, namely in positions 203 and 474, specifically about the variations I203L and K474Q.
Beispiel 4Example 4
Reinigung und Charakterisierung der jeweiligen B. amyloliquefaciens-AmylasevariantePurification and characterization the respective B. amyloliquefaciens amylase variant
Reinigung der α-AmylasePurification of the α-amylase
Die diese drei α-Amylasen produzierenden Stämme wurden nach Standardmethoden in Flüssigkultur genommen und die transgen gebildete α-Amylase-isoliert. Die Reinigung der α-Amylase erfolgte nach einem Protokoll von Candussio, A., et al. (1990): „Biochemical and genetic analysis of a maltopentaose-producing amylase from alkaliphilic Grampositive bacterium", Eur. J. Biochem., Band 191, Seiten 177–185.The strains producing these three α-amylases were taken in liquid culture according to standard methods and isolated the transgenic α-amylase. Purification of the α-amylase was carried out according to a protocol by Candussio, A., et al. (1990): "Biochemical and genetic analysis of a maltopentaose-producing amylase from alkaliphilic Gram positive bacterium ", Eur. J. Biochem., Vol. 191, pages 177-185.
Proteingehalts- und AktivitätsbestimmungProtein content and activity determination
Die die Aufreinigung begleitenden Proteingehaltbestimmungen erfolgten mit dem Micro-BCA Protein Assay Kit der Fa. Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA (Best.-Nr. 23235) und BSA als Standard nach Angaben des Herstellers. Die Amylase-Aktivitäten wurden wie in Beispiel 2 angegeben bestimmt. dabei wurden durchschnittliche Aktivitätsausbeuten von 5 bis 10% erzielt.Accompanying the purification Protein content was determined using the Micro-BCA Protein Assay Kit from Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA (Order No. 23235) and BSA as standard according to the manufacturer. The amylase activities were determined as indicated in Example 2. doing so were average activity yields achieved from 5 to 10%.
Beispiel 5Example 5
Aktivitätsbestimmungactivity determination
1 Unit an Amylaseaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die pro 1 Minute 1 umol glucosidische Bindungen bei 37°C hydrolysiert.1 unit of amylase activity is defined than the amount of enzyme that produces 1 µmol glucosidic linkages per minute at 37 ° C hydrolyzed.
Phadebas®-TestPhadebas ® test
Eine Phadebas®-Tablette wird in 10 ml ddH2O suspendiert. Davon werden je Messung 500 μl-Aliquots mit 50 μl entsprechend verdünnter Probe (Aktivitätskonzentration < 1000 U/l) versetzt. Nach 15 min Inkubation bei 37°C, wobei über die in der Tablette enthaltenen Puffersubstanzen ein pH-Wert von 6,5 herrscht, wird die Reaktion durch die Zugabe von 150 μl 0,5 M NaOH abgestopt. Zur Bestimmung des Blindwerts werden 500 μl Phadebas-Suspension für 15 min bei 37°C inkubiert und nach der sofortigen Zugabe von 150 μl 0,5 M NaOH mit 50 μl Probe versetzt. Nach Zentrifugation für 2 min bei 14.000 Upm (Centrifuge 5417C der Fa. Eppendorf, Hamburg) werden 500 μl des Überstands in einer Küvette 1:2 mit ddH2O verdünnt und die Absorption bei einer Wellenlänge von 620 nm gegen den entsprechend erhaltenen Blindwert gemessen. Die Aktivität kann aus einer vorher mit einer Amylasepräparation bekannter Aktivität erstellten Kalibrierkurve abgelesen werden.A Phadebas ® tablet is suspended in 10 ml ddH 2 O. 500 μl aliquots of this are mixed with 50 μl of appropriately diluted sample (activity concentration <1000 U / l) per measurement. After 15 minutes of incubation at 37 ° C., the pH of the buffer substances contained in the tablet being 6.5, the reaction is stopped by the addition of 150 μl of 0.5 M NaOH. To determine the blank value, 500 μl of Phadebas suspension are incubated for 15 min at 37 ° C. and, after the immediate addition of 150 μl of 0.5 M NaOH, 50 μl of sample are added. After centrifugation for 2 min at 14,000 rpm (Centrifuge 5417C from Eppendorf, Hamburg), 500 μl of the supernatant are diluted 1: 2 with ddH 2 O in a cuvette and the absorption at a wavelength of 620 nm is measured against the correspondingly obtained blank value. The activity can be read from a calibration curve previously established with an amylase preparation known activity.
Auf diese Weise wurden die in Tabelle 1 angegebenen spezifischen Aktivitäten ermittelt, die für jedes Enzym eine charakteristische Größe darstellen. Tabelle 3: Spezifische Aktivitäten von erfindungsgemäßen B. amyloliquefaciens-Amylase-Varianten unter den Bedingugen des Phadebas®-Tests In this way, the specific activities given in Table 1 were determined, which represent a characteristic variable for each enzyme. Table 3: Specific activities of B. amyloliquefaciens amylase variants according to the invention under the conditions of the Phadebas ® test
Beispiel 6Example 6
pH-AktivitätsprofilepH activity profiles
Zur Aufnahme eines pH-Aktivitätsprofils werden 8 Phadebas®-Tabletten in 40 ml ddH2O suspendiert. Das feste Substrat wird durch Filtration über eine Glasfritte (Porengröße 0 oder 1) abgetrennt und in 40 ml ddH2O aufgenommen. Je 5 ml der gut aufgeschlämmten Substratsuspension werden mit 5 ml des 0,1 M Puffers mit entsprechendem pH versetzt. Hierbei werden für Messungen im pH-Bereich von 4 bis 6 Acetatpuffer, für den Bereich 7 bis 8 Tris/HCl-Puffer, für pH 9 und pH 10 Glycin/NaOH-Puffer und für die Messungen bei pH 11 Carbonatpuffer verwendet. Für jeden pH-Wert wird eine Dreifachbestimmung analog zu dem Protokoll für den Phadebas®-Schnelltest durchgeführt. Zudem werden die Blindwerte bei pH 6 und pH 10 ebenfalls dreifach bestimmt.To record a pH activity profile, 8 Phadebas ® tablets are suspended in 40 ml ddH 2 O. The solid substrate is separated by filtration through a glass frit (pore size 0 or 1) and taken up in 40 ml ddH 2 O. 5 ml of the 0.1 M buffer with the appropriate pH are added to 5 ml of the well-suspended substrate suspension. For measurements in the pH range from 4 to 6 acetate buffers, for the range 7 to 8 Tris / HCl buffers, for pH 9 and pH 10 glycine / NaOH buffers and for the measurements at pH 11 carbonate buffers are used. For each pH value, a triple determination is carried out analogously to the protocol for the Phadebas ® quick test. In addition, the blank values at pH 6 and pH 10 are also determined in triplicate.
Die erhaltenen Werte stellen ebenfalls enzymspezifische Eigenschaften dar. Tabelle 4: pH-Optima und relative Aktivität bei pH 10 der Varianten A42, A29 und B1 im Vergleich zur Wildytp-BAA The values obtained also represent enzyme-specific properties. Table 4: pH optima and relative activity at pH 10 of variants A42, A29 and B1 in comparison to wild-type BAA
Hier zeigt sich, daß insbesondere die Variante BAA 42 gegenüber dem Ausgangsmolekül, aber auch gegenüber den anderen Varianten eine deutlich verbesserte Alkaliaktivität aufweist. Dies kann nur auf einen oder beide Austausche in den Positionen 203 und/oder 474, konkret 1203L und K474Q zurückzuführen sein.This shows that in particular the variant BAA 42 opposite the starting molecule, but also opposite the other variants have a significantly improved alkaline activity. This can only be due to one or both exchanges in the positions 203 and / or 474, specifically 1203L and K474Q.
Beschreibung der Figurendescription of the figures
Darin bedeuten:
BAA α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens
BLA α-Amylase aus B. licheniformis
LAMY α-Amylase
aus Bacillus sp. KSM-AP1378
S707 α-Amylase aus Bacillus sp. #707
BStA α-Amylase
aus B. stearothermophilus
TS-23 α-Amylase aus Bacillus sp. TS-23Where:
BAA α-amylase from B. amyloliquefaciens
BLA α-amylase from B. licheniformis
LAMY α-amylase from Bacillus sp. KSM-AP1378
S707 α-amylase from Bacillus sp. # 707
BStA α-amylase from B. stearothermophilus
TS-23 α-amylase from Bacillus sp. TS-23
Der Beginn der maturen Proteine liegt in der Zählung dieses Alignments einheitlich bei Position 41 beziehungsweise 43.The beginning of mature proteins lies in the count this alignment uniformly at positions 41 and 43.
Darin bedeuten:
BAA α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens, Wildtypenzym
BAA_42 α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens, Variante A42
BAA_A29 α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens, Variante A29
BAA_B1 α-Amylase
aus B. amyloliquefaciens, Variante B1Where:
BAA α-amylase from B. amyloliquefaciens, wild-type enzyme
BAA_42 α-amylase from B. amyloliquefaciens, variant A42
BAA_A29 α-amylase from B. amyloliquefaciens, variant A29
BAA_B1 α-amylase from B. amyloliquefaciens, variant B1
Wie in Beispiel 1 dargestellt wurde das Wildtypgen der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) vor der Überführung in einen Expressionsvektor zwischenkloniert, um eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle einzuführen.As shown in Example 1 the wild type gene of α-amylase from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) prior to conversion into an expression vector intermediate cloned to an additional Introduce restriction interface.
Wie in Beispiel 1 dargestellt wurde das Wildtypgen der α-Amylase aus B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) nach der Zwischenklonierung auf diesen Expressionsvektor überführt und dieser einer Error-prone-PCR unterworfen, wodurch die erfindungsgemäßen BAA-Varianten erhalten wurden.As shown in Example 1 the wild type gene of α-amylase from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO. 3) after the intermediate cloning transferred to this expression vector and this is subjected to an error-prone PCR, as a result of which the BAA variants according to the invention were obtained.
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