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Die Erfindung betrifft eine für ein Proteinkinase
A-Ankerprotein kodierende Nukleinsäuresequenz, eine Verwendung
dieser Nukleinsäuresequenz
in einem Fusionsprotein und ein Verfahren zur Bestimmung der Wechselwirkung
des Proteinkinase A-Ankerproteins mit regulatorischen Untereinheiten
der Proteinkinase A sowie ein Verfahren zur Identifikation zellpermeabler
Substanzen.
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Die biologische Wirkung von Hormonen
und Neurotransmittern wird über
die Aktivierung von Signalkaskaden, welche den Phosphorylierungsstatus
von Effektorproteinen verändern,
vermittelt. An diesem reversiblen Prozess sind zwei Klassen von
Enzymen beteiligt: Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen. Die
Phosphorylierung erfolgt durch Kinasen, welche die Übertragung
der endständigen
Phosphatgruppe von ATP auf spezifische Serin- oder Threoninreste
katalysieren, die Dephosphorylierung wird durch Phosphoproteinphosphatasen
vermittelt. Ein Mechanismus zur Kontrolle und Regulation dieser
Enzymaktivitäten
ist die Kompartimentierung dieser Enzyme durch die Assoziation mit
Ankerproteinen, die in der Nähe
ihrer Substrate lokalisiert sind. Die Proteinkinase A (PKA) ist
eine der multifunktionellen Kinasen mit einer breiten Substratspezifität, welche
durch die so genannten protein kinase A anchoring proteins (AKAPs)
an subzellulären
Strukturen verankert wird.
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Bei vielen wichtigen zellulären Prozessen
wie Kontraktion, Sekretion, Stoffwechsel, Gentranskription, Zellwachstum
und -teilung erfolgt die Weiterleitung extrazellulärer Signale über G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren, das G-Protein GS, Aktivierung
einer Adenylzyklase und Bildung des second-messenger zyklischen
Adenosinmonophosphats (CAMP}. Die Effekte von cAMP werden durch
die cAMP-abhängige
PKA vermittelt.
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Die Untereinheiten der PKA werden
beim Menschen von sieben verschiedenen Genen, welche auf unterschiedlichen
Chromosomen lokalisiert sind, kodiert. Drei Gene kodieren für die Isoformen
der katalytischen Untereinheit Cα,
Cβ und Cγ und vier
Gene für
die Isoformen der regulatorischen Untereinheit RIα, RIβ, RIIα und RIIβ.
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Die regulatorischen Untereinheiten
zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster. Während RIα und RIIα ubiquitär in den
Geweben vorkommen, ist die regulatorische Untereinheit RIβ in erster
Linie im Gehirn zu finden.
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Die Assoziation der RII-Untereinheiten
mit intrazellulären
Kompartimenten wird durch AKAPs vermittelt. Bei den Ankerproteinen
handelt es sich um eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, die
durch die Interaktion mit Typ I bzw. Typ II der regulatorischen
Untereinheiten (RI bzw. RII) des PKA-Holoenzyms charakterisiert
sind. Die ersten Ankerproteine wurden bei der affinitätschromatographischen
Reinigung der R-Untereinheiten über
cAMP-Sepharose isoliert. Diese assoziierten Proteine zeigten auch
nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran eine RII-Bindung. Auf
dieser Beobachtung beruht auch die bisherige Methode (RII-overlay)
zur Detektion von AKAPs. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten
Western Blot, bei dem statt eines primären Antikörpers radioaktiv markierte
RII-Untereinheiten als Sonde eingesetzt werden.
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Zur funktionellen Bedeutung der RI-AKAP-Interaktion
ist noch wenig bekannt. Auch wenn RIα hauptsächlich zytosolisch lokalisiert
ist, zeigen verschiedene Studien eine Verankerung in vivo. Dabei
scheint die dynamische Verankerung der RI-Untereinheiten im Gegensatz
zur statischen Verankerung der RII-Untereinheiten von entscheidender
Bedeutung für
die Zelle zu sein. So wurde die Assoziation der RI-Untereinheiten mit
der Plasmamembran von Erythrozyten und aktivierten T-Lymphozyten
beschrieben. Bei der cAMP-vermittelten Inhibition der T-Zell-Proliferation
durch die PKA Typ I könnte
die Lokalisation des Enzyms möglicherweise
auch durch AKAPs vermittelt werden. In knockout-Mäusen, die
im Skelettmuskelgewebe keine regulatorischen Untereinheiten Typ
II exprimieren, binden die RIa-Untereinheiten an ein mit Kalziumkanälen assoziiertes AKAP
und erhalten so die normale, cAMP-abhängige Kanalleitfähigkeit
durch die korrekte Verfügbarkeit
der katalytischen Untereinheiten der PKA.
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In vivo konnte weiterhin gezeigt
werden, dass die katalytischen Untereinheiten in der Zelle bevorzugt mit
den RII-Untereinheiten assoziieren und Typ I-PKA-Holoenzym gebildet
wird, wenn die Menge der freien katalytischen Untereinheiten die
Menge der freien RII-Untereinheiten übersteigt.
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Die Spezifität in der PKA-Verankerung wird
durch die targeting-Domäne
erreicht, ein Strukturmotiv, das im Gegensatz zu der anchoring-Domäne weder
in der Sequenz noch in der Struktur der AKAPs konserviert ist. So
werden AKAPs durch Protein-Protein-Interaktionen an strukturelle
Elemente in der Zelle und durch Protein-Lipid-Interaktionen an Membranen
verankert.
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In der Literatur sind verschiedene
AKAPs beschrieben, die mit unterschiedlichen zellulären Kompartimenten
assoziieren, so zum Beispiel mit den Zentrosomen, den Mitochondrien,
dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat, der Plasma-
und Kernmembran und mit Vesikeln.
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Die genauen Mechanismen der Verankerung
sind bisher nur für
einige AKAPs bekannt. So wird das herzmuskelspezifische Ankerprotein
mAKAP durch eine Region mit drei spektrinartigen Wiederholungssequenzen
an der perinukleären
Membran der Kardiomyozyten verankert. Zwei Isoformen der AKAP15/18
werden durch Lipidmodifikationen (Myristoylierung und Palmitoylierung)
an der Plasmamembran verankert. Drei polybasische Regionen in der
targeting-Domäne
des AKAP79 sind an der Lokalisation des Proteins an der inneren
postsynaptischen Membran (PSD, postsynaptic density) beteiligt.
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Die AKAPs wurden zuerst durch die
Interaktion mit der PKA charakterisiert. Einige dieser Proteine
können
jedoch auch andere an der Signaltransduktion beteiligte Enzyme binden.
Durch die gleichzeitige Verankerung von Enzymen, die gegensätzliche
Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Kinasen und Phosphatasen, können diese,
auch als scaffolding (gerüstbildende)
Proteine bezeichneten AKAPs ganze Signalkomplexe in der Nähe bestimmter
Substrate lokalisieren und so zur Spezifität und Regulation der zellulären Antwort
auf extrazelluläre
Signale beitragen. AKAP79 war das erste AKAP, für das die Interaktion mit mehreren
Enzymen nachgewiesen werden konnte. Dieses Protein bindet die Proteinkinase
A, die Proteinkinase C und die Protein phosphatase Calcineurin (PP2B),
wobei jedes Enzym in gebundenem Zustand inhibiert ist. Da unterschiedliche
Signale für
die Aktivierung jedes einzelnen Enzyms notwendig sind, können an
dieser Stelle verschiedene second messenger wie cAMP, Kalzium und
Phospholipide zusammentreffen. Weitere Beispiele sind das AKAP220,
welches die PKA und die Proteinphosphatase PP1 an den Peroxisomen
lokalisiert und das AKAP Yotiao, das neben der PKA ebenfalls die
Proteinphosphatase PP1 bindet. Das AKAP CG-NAP bindet nicht nur die
PKA und die Proteinphosphatase PP1, sondern auch noch die Rho-abhängige Kinase
PKN (NGF (nerve growth factor) -aktivierte Proteinkinase) und die
Proteinphosphatase PP2A.
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Auch andere Proteine können mit
AKAPs assoziieren, so bindet Ezrin, ein Mitglied der zytoskelett-assoziierten
ERM-Familie Ezrin, Radixin und Moesin, das als AKAP identifiziert
wurde, an ein Protein (EBP50/NHERF), welches an der Regulation des
Natrium-Protonen-Transportes in der apikalen Membran von Epithelzellen
beteiligt ist. AKAPs vermitteln die Modulation der Leitfähigkeit
der Ionenkanäle
durch die Lokalisation der Proteinkinasen und -phosphatasen in der
Nähe bestimmter
Kanaluntereinheiten, die wahrscheinlich durch Phosphorylierung und
Dephosphorylierung reguliert werden.
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Die Aktivität des NMDA-Rezeptors wird durch
das AKAP Yotiao, welches auch die Proteinphosphatase PP1 bindet,
moduliert. Die in gebundenem Zustand aktive Phosphatase limitiert
die Kanalleitfähigkeit
des NMDA-Rezeptors, bis die PKA durch cAMP aktiviert wird und den
Ionenkanal oder ein assoziiertes Protein phosphoryliert, wodurch
die Leitfähigkeit
rapide ansteigt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass myristoylierte
Ht31-Peptide, die die Interaktion zwischen PKA und AKAP inhibieren,
die cAMP-abhängige Inhibition
der Interleukin 2-Transkription in Jurkat-T-Zellen aufheben und
dass S-Ht31-Peptide die Spermienmotilität einschränken.
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Auch bei den wichtigen komplexen
biologischen Prozessen, wie die durch das Hormon GLP-1 (glucagon-like
peptide)-vermittelte
Insulinsekretion in den (β-Zellen
des Pankreas und in RINm5F-Zellen (klonale (β-Zelllinie der Ratte) sind AKAPs
beteiligt. Die Aktivierung der PKA durch GLP-1 führt zur Phosphorylierung von
L-Typ-Kalziumkanälen
und begünstigt
die Exozytose von Insulin aus sekretorischen Granula. Die Ht31-Peptid-vermittelte
Inhibition der PKA-Verankerung führte
zu einer deutlichen Verringerung der Insulinsekretion. Dabei wurden
weder die cAMP-Bildung noch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten
der PKA durch die Peptide beeinflusst. Weiterhin konnte nach Expression
des wildtypischen AKAP18α in
RINm5F-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, welche AKAP18α nicht exprimierten,
eine Erhöhung
der Insulinsektretion nach GLP-1-Applikation nachgewiesen werden.
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Bisher wurde der Nachweis, dass es
sich bei einem neuen Protein um ein AKAP handelt, durch Kopräzipitation
erbracht. Dazu wurde ein Antikörper
gegen das Kandidatenprotein hergestellt, um es aus Zellen oder Gewebe,
in denen es exprimiert wird, immunzupräzipitieren. Anschließend wurde
das Vorhandensein von regulatorischen und/oder katalytischen PKA-Untereinheiten
im Präzipitat
mittels Western Blot untersucht. Die Anwesenheit der PKA-Untereinheiten
im Präzipitat
spricht dafür,
dass das Kandidatenprotein in vivo als AKAP fungiert. Der Nachweis
kann auch umgekehrt erbracht werden, indem die PKA-Untereinheiten
immunpräzipitiert
werden und anschließend
das AKAP im Präzipitat
nachgewiesen wird.
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Dieser experimentelle Ansatz erlaubt
aber keinen Rückschluss
auf die intrazelluläre
Lokalisation oder auf die in vivo-Situation eines AKAP-PKA-Komplexes.
Es ist außerdem
nicht möglich,
die zeitliche und räumliche
Auflösung
von Interaktionen zu analysieren. Weiterhin ist es derzeit mit den
bekannten Verfahren nicht möglich,
spezifische AKAP-Inhibitoren oder -Aktivatoren zu identifizieren.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher,
neue Nukleinsäuresequenzen,
die für
Strukturen kodieren, zur Verfügung
zu stellen, die in Verfahren eingesetzt werden können, in denen die Interaktion
zwischen AKAP und PKA in vivo detektiert wird, wobei die Rückschlüsse auf
die zelluläre
Lokalisation dieser Interaktion erhalten werden können und
die weiterhin in Verfahren eingesetzt werden können, mit denen membranpermeable
Substanzen, insbesondere Peptide, detektierbar sind.
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Die vorliegende Erfindung löst dieses
technische Problem durch die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe umfassend:
- a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend
eine Nukleotidsequenz ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 oder deren komplementären Nukleotidsequenzen,
- b) ein Nukleinsäuremolekül, welches
mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter
stringenten Bedingungen hybridisiert,
- c) ein Nukleinsäuremolekül umfassend
eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um
zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder
b) funktionsanalog zu sein,
- d) ein Nukleinsäuremolekül, das in
Folge des genetisches Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert
ist und
- e) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer
Nukleotidsequenz nach a) – d),
welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen,
Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu
einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis
d) ist.
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Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
eingesetzt werden können,
um die Interaktion von AKAP und PKA Untereinheiten in vivo zu detektieren,
wobei ein AKAP-PKA-Komplex einem zellulären Kompartiment zugeordnet
werden kann.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz,
die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz
funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40 % homolog. Im Sinne der
Erfindung heißt,
um zu den genannten Nukleinsäuresequenzen
bzw. den mit diesen Nukleinsäuresequenzen
hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die kodierten
homologen Strukturen bei der Interaktion mit PKA-Untereinheiten
Merkmale aufweisen, die Rückschlüsse auf
die in vivo Situation und die zelluläre Lokalisation zulassen sowie
auf die Identifizierung spezifischer AKAP-Inhibitoren.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül mindestens
60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt
90 % Homologie zu dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül auf.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische
DNA und/oder eine RNA; besonders bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA.
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Die Erfindung betrifft auch einen
Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor
umfasst. Die Erfindung betrifft ganz besonders bevorzugt auch ein
Polypeptid, was durch ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert
wird. Ein solches Polypeptid ist bevorzugt eine neue Spleißvariante
des AKAP18 (AKAP18δ).
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Die Erfindung betrifft auch das Polypeptid
bzw. Protein, das durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kodiert wird.
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Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen
das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die
Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist. Erkennungssubstanzen
im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen
wie Nukleinsäuremolekülen oder
-sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren
Fragmenten Wechselwirken können;
insbesondere so Wechselwirken, dass eine Detektion dieser Strukturen
möglich
ist. Die Erkennungssubstanzen können
insbesondere spezifische Nukleinsäuren sein, die an die genannten
Nukleinsäuremoleküle oder
Polypeptide binden, wie z. B. Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA-Moleküle bzw.
deren Fragmente, aber auch Antikörper,
Fluoreszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide. Es ist selbstverständlich auch
möglich,
dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nukleinsäuren bzw.
Antikörper
sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen
können
in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.
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In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder
ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül.
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Die Antikörper im Sinne der Erfindung
binden die erfindungsgemäßen Polypeptide,
insbesondere AKAP18δ,
spezifisch. Die Antikörper
können
auch modifizierte Antikörper
sein (z. B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). Der
in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl
intakte Moleküle
als auch Antikörper-Fragmente,
wie Fab, F(ab')2 und Fv, die bestimmte Epitop-Determinanten
der Polypeptide binden können.
Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit
des Antikörpers
zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise
erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:
- (1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes
Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines
ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette
und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
- (2) das Fab'-Fragment
eines Antikörper-Moleküls lässt sich
mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion
gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren
Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden
zwei Fab'-Fragmente
erhalten;
- (3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung
eines ganzen Antikörpers
mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist
ein Dimer von zwei Fab'-Fragmenten,
die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
- (4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen
Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren
Kette enthält
und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
- (5) Einzelketten-Antikörper
("SCA"), definiert als
gentechnisch verändertes
Molekül,
das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich
der schweren Kette enthält,
die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch
fusionierten Einzelketten-Molekül
verbunden sind.
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Der in der vorliegenden Erfindung
verwendete Begriff Epitop bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante
auf dem Polypeptid, insbesondere AKAP18δ; Epitop-Determinanten bestehen
normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie
Aminosäuren
oder Zucker-Seitenketten,
und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen
Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale.
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Die Erfindung betrifft auch Vakzine
oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Nukleinsäuremolekül, den Vektor,
die Wirtszelle, das Polypeptid und/oder das Erkennungsmolekül gegebenenfalls
mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfassen. Bei dem pharmazeutisch akzeptablen Träger handelt es sich um an sich
bekannte pharmazeutische Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Bei diesen,
dem Fachmann an sich bekannten Zusatz- und Trägerstoffen, kann es sich auch
um Liposomen bzw. um in der Gentechnik bekannte Strukturen bzw.
Lösungen
und/oder Puffergemische oder um andere Substanzen aus dem Bereich
der Galenik handeln.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
einen Kit, der die Nukleinsäuren,
die Vektoren, die Wirtszelle, das Polypeptid, das Erkennungsmolekül und/oder
die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst. Der Kit kann z. B.
als Diagnosekit oder als Detektionskit verwendet werden, um insbesondere
AKAP-Inhibitoren oder die AKAP-PKA-Interaktion zu detektieren.
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Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren
zur Detektion einer AKAP-PKA-Interaktion umfassend die Schritte
- a) Bereitstellung eines ersten Vektors, insbesondere
eines Plasmids, umfassend ein Nukleinsäuremolekül kodierend (i) ein AKAP, insbesondere
ein AKAP18δ,
und (ii) einen ersten Marker, insbesondere ein fluoreszierendes
Protein,
- b) Bereitstellung eines zweiten Vektors, insbesondere eines
Plasmids, umfassend ein zweites Nukleinsäuremolekül kodierend (i) eine regulatorische
Untereinheit einer Proteinkinase, bevorzugt RIIα, RIIβ, RIα oder RIβ, und (ii) einen zweiten Marker,
insbesondere ein fluoreszierendes Protein,
- c) Einführen
des ersten und zweiten Vektors in eine Zelle, wobei die Zelle transfiziert
wird, und
- d) Durchführen
einer Fluoreszenzresonanzenergietransfer-(FRET)-Messung, wobei die AKAP-PKA-Interaktion
detektiert wird.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
ist es überraschenderweise
möglich,
die AKAP-PKA-Interaktion, bevorzugt eine AKAP18-PKA-, besonders
bevorzugt eine AKAP18δ-PKA-Interaktion,
in einer lebenden Zelle zu visualisieren und somit den AKAP-PKA-Komplex
einem zellulären
Kompartiment zuzuordnen.
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In einem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden zwei Vektoren bzw. Plasmide bereitgestellt, wobei z. B. das
erste Plasmid das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, welches
für AKAP18δ kodiert,
und mindestens ein weiteres Nukleinsäuremolekül umfasst, das für einen
Marker, vorzugsweise für
ein fluoreszierendes Protein kodiert. Das zweite Plasmid umfasst
ebenfalls mindestens zwei Nukleinsäuremoleküle, wobei ein erstes Nukleinsäuremolekül die regulatorische
Untereinheit einer Proteinkinase, vorzugsweise RIIα, kodiert
und ein weiteres Nukleinsäuremolekül einen
zweiten Marker, insbesondere ein zweites fluoreszierendes Fluoreszenzprotein,
kodiert. Das erste und das zweite fluoreszierende Protein können hierbei
insbesondere so ausgewählt
werden, dass sie bei einer ausreichenden räumlichen Nähe zueinander zu einem Fluoreszenzresonanzenergietransfer
(FRET) befähigt
sind. Demgemäß kann es
sich bei dem ersten fluoreszierenden Protein beispielsweise um das
Cyan-fluoreszierende Protein (CFP) und bei dem zweiten fluoreszierenden
Protein um das Yellow-fluoreszierende Protein (YFP) handeln. Dem
Fachmann ist selbstverständlich bekannt,
dass er vielfältige
Moleküle
verwenden kann, um eine messbare Interaktion zwischen Fluoreszenzmarkern
wie z. B. einen Fluoreszenzresonanzenergietransfer zu ermöglichen
oder einen bestehenden Fluoreszenzresonanzenergietransfer so zu
modifizieren, beispielsweise zu inhibieren, dass eine Detektion
einer Wechselwirkung von mindestens zwei Markermolekülen, insbesondere
Fluoreszenzmarkern, möglich
ist. Hierzu ist es erforderlich, dass der erste und zweite Vektor,
die insbesondere Plasmide sind, mindestens eine Struktur aufweisen,
die messbar als Markierung detektiert werden kann. Der Begriff Marker
oder Markierung betrifft im Sinne der Erfindung alle Strukturen
oder Verfahren, die zur Erzeugung eines nachweisbaren, vorzugsweise
quantifizierbaren Signals verwendet werden können, und die insbesondere
an eine Nukleinsäure oder
ein Protein bzw. ein Fragment hiervon gebunden oder wirkverbindbar
sind. Die Marker oder die Markierungen können insbesondere mittels Fluoreszenz
nachweisbare Signale erzeugen. Im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Lehre
wird die Wechselwirkung bzw. eine Modifikation der Wechselwirkung – z. B.
als Inhibierung – bevorzugt
in Form einer FRET-Messung detektiert. Selbstverständlich ist
es auch möglich,
mit Hilfe von Radioaktivität,
Kolorimetrie, Gravimetrie, Röntgenbeugung
oder -absorption, Magnetismus oder enzymatischer Aktivität Signale
zu erzeugen, die isoliert gemessen oder im Zusammenhang mit einer
Fluoreszenz bzw. einem Fluoreszenzresonanzergietransfervorgang Signale
erzeugen, inhibieren oder modifizieren, so dass eine Interaktion
von mindestens zwei biologischen Komponenten, vorzugsweise von zwei
Proteinen, besonders bevorzugt zwischen einer Proteinkinase, bevorzugt
PKA, und einem Proteinkinase A-Ankerprotein, bevorzugt AKAP18δ, nachgewiesen
werden kann. Eine Sonde im Sinne der Erfindung ist z. B. eine Nukleinsäure oder
Aminosäuresequenz,
die an einem oder beiden Enden oder intern mindestens eine Markierung
aufweist, wobei die Markierung bevorzugt ein zur Fluoreszenz befähigter Farbstoff
oder Marker oder ein die Fluoreszenz unterdrückender Farbstoff oder Marker
ist. Eine Sonde im Sinne der Erfindung kann daher aber auch eine
Nukleinsäure-
oder Aminosäuresequenz
sein, die mindestens eine Markierung aufweist, die in der Lage ist,
ein nachweisbares Signal zu modifizieren, insbesondere zu inhibieren.
Eine solche Sonde kann beispielsweise eine Quencherstruktur sein,
die die Fluoreszenz beispielsweise eines Markers oder. Farbstoffs,
z. B. eines Reporterfarbstoffs, im Zusammenhang mit einer Interaktion
zwischen zwei Molekülen
so beeinflusst, dass eine messbare Signal änderung erzeugt werden kann.
So kann beispielsweise diese Quencherstruktur so ausgebildet sein,
dass durch die Wechselwirkung mit einem Fluoreszenzfarbstoff kein
Fluoreszenzsignal oder aber kein Energietransfersignal detektierbar
ist, wenn die zur Fluoreszenz befähigte Struktur und die zur
Quenchung befähigte
Struktur die hierfür
erforderliche räumliche
Nähe, beispielsweise
bei einer Interaktion von Proteinase A-Ankerproteinen und Proteinkinasen
aufweisen; in einem solchen System wäre ein Fluoreszenzsignal bzw.
ein nicht-modifiziertes Fluoreszenzsignal so lange detektierbar,
wie es zu einer Interaktion zwischen den markierten Strukturen kommt.
Die Begriffe Quenching, Fluoreszenzresonanzenergietransfersignal
oder einfach Fluoreszenz betreffen demgemäß Strukturen und Verfahren,
durch die, falls ein fluoreszierendes und ein anderes fluoreszierendes
bzw. ein quenchendes Molekül
räumlich
nahe benachbart liegen, bei einer Anregung eines dieser Moleküle ein wesentlicher
Teil der Energie des angeregten Zustandes ohne Strahlung auf den Quencher übertragen
wird oder mit einer messbaren Strahlung an das System abgegeben
wird. Auf den Quencher übertragene
Energie kann beispielsweise ohne Strahlung verloren gehen oder in
einer anderen Emissionswellenlänge
als die des fluoreszierenden Moleküls emittiert werden. Das heißt, die
Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen oder den sie kodierenden
Nukleinsäuren,
insbesondere solchen, die mit der Proteinkinase A und dem Proteinkinase
A-Ankerprotein assoziiert sind, kann entweder durch eine emittierende
Strahlung oder aber durch die strahlungslose Übertragung der Energie auf
einen Quencher detektiert werden.
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Eine praktische Anleitung für die Auswahl
geeigneter Fluoreszenz-Quencher-Paare für bestimmte Sonden ist in der
Literatur verfügbar
und in den nachstehenden Referenzen beispielhaft dargestellt: Pesce
et al., Hrsg., Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York,
1971), White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach
(Marcel Dekker, New York, 1970). Die Literatur enthält auch
Referenzen, die ausführliche Listen
von fluoreszenten und chromogenen Molekülen und deren relevante optische
Eigenschaften für
die Auswahl von Fluoreszenz-Quencher-Paaren bereitstellen; vgl.
z.B. Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,
2. Auflage (Academic Press, New York, 1971), Griffiths, Colour and
Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976),
Bishop, Hrsg., Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972), Haugland,
Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular
Probes, Eugene, 1992). Ferner findet sich in der Literatur eine
ausführliche
Anleitung für
die Derivatisierung von Fluoreszenz- und Quencher-Molekülen für die kovalente
Bindung über
gewöhnliche
reaktive Gruppen, die an ein Oligonukleotid angefügt werden
können;
vgl.
US-PS 3,996,345 ,
US-PS 4,351,760 .
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Beispielhafte Fluoreszenz-Quencher-Paare
können
aus Xanthen-Farbstoffen, einschließlich Fluoresceinen und Rhodamin-Farbstoffen
ausgewählt
werden. Viele geeignete Formen dieser Verbindungen sind kommerziell
erhältlich
und enthalten Substituenten auf ihren Phenylgruppen, die als Bindestelle
oder als Bindefunktionalität
für die
Bindung an ein Oligonukleotid verwendet werden können. Eine weitere Gruppe von
fluoreszenten Verbindungen sind Naphthylamine mit einer Aminogruppe
in der alpha- oder beta-Position. Diese Naphthylamino-Verbindugen
umfassen 1-Dimethylaminonaphthyl-5-sulfonat, 1-Anilino-8-naphthalensulfonat und
2-p-Toluidinyl-6-naphthalensulfonat. Andere Farbstoffe umfassen
3-Phenyl-7-isocyanatocoumarin, Acridine wie 9-Isothiocyanatoacridin-Orange,
N-(p-(2-Benzoxyzolyl)-phenyl)-maleimid,
Benzoxydiazole, Stilbene, Pyrene. Bevorzugte Fluorophore sind weiterhin
SYBR Green, Hex, TET, VIC, JOE, NED, Redmond Red, Alexa Red, Cascade
Blue, Yakima Yellow, Cy3, Cy3.5, Tamra/Cy3, Texas Red, ROX, Cy5,
Cy5.5, Carboxyrhodamine, LC705 und/oder LC640. Als Quencher können beispielsweise
weiterhin eingesetzt werden Tamra, Rhodamin, BHQ1 bis BHQ3, Dansyl,
Dabcyl, ElleQuencher und/oder Methylorange. Bevorzugt kann auch
eine Konjugation der Nukleinsäureproben
mit Minor Grove Binder (MGB) sein. Derartige Strukturen sind beispielsweise in
Kutyavin et al., 2000, Nucleic Acids Research beschrieben und sind
in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen.
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Erfindungsgemäß kann man zwei Arten von Quencherprozessen
oder Prozessen, die eine Fluoreszenzstrahlung modifizieren, unterscheiden,
einmal die dynamische Fluoreszenzlöschung durch Kollisionsprozesse
und die statische Fluoreszenzlöschung
durch Komplexbildung zwischen dem Fluorophor, das heißt dem Marker
oder der Sonde und den Quencher- oder Löscher-Molekülen des Sonden-Quenchers. Das
Quenching führt
demgemäß zu einer
Erniedrigung der Quantenausbeute, die durch Fluoreszenzanregung
der markierten Sonde detektiert werden kann. Es ist aber beispielsweise
auch möglich,
dass die Sonden bei einer sehr hohen Konzentration, beispielsweise
auf einem bestimmten Nukleinsäureabschnitt,
zum so genannten Selbstquenching neigen, das heißt, dass die einzelnen Moleküle in ihrer
Bewegung so gestört
werden, dass ebenfalls ein Quenchingeffekt – bedingt durch die hohe Sondendichte – auftritt.
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Denn im Sinne der Erfindung kann
z. B. ein separat generiertes Fluoreszenzsignal, ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer
(FRET)-Signal als auch ein "gequenchtes" Signal dazu dienen,
eine AKAP-PKA zu detektieren, bevorzugt ist ein FRET-Signal. Das
FRET-Signal wird insbesondere durch die Verwendung der Fluoreszenzstoffe
CFP und YFP gewonnen.
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Mit den beiden bereitgestellten Plasmiden
wird eine Zelle transfiziert. Die Transfektion in Sinne der Erfindung
kann über
chemische, physikalische und/oder biologische Transfektionsmethoden
vorgenommen werden. Die chemische Transfektion kann beispielsweise
durch den Einsatz von DEAE-Dextran, durch Dendrimere oder durch
die Verwendung von Calciumphosphat vorgenommen werden. Bei der physikalischen
Transfektion ist es beispielsweise möglich, mit Hilfe der Elektroporation
die Membranen der Zellen so zu modifizieren, dass sie die zu transfizierende
Plasmid-DNA aufnehmen. Eine weitere Methode der physikalischen Transfektion
ist beispielsweise die Mikroinjektion oder die Einschleusung von
DNA durch Beschuss mit beispielsweise Goldpartikeln. Methoden der
biologischen Transfektion sind beispielsweise die rezeptorvermittelte
Transfektion, die durch virale Komponenten unterstützte rezeptorvermittelte
Transfektion und die Lipofektion. Dem Fachmann sind verschiedene
Methoden zur Transfektion bekannt. Die Zellen, an denen die Transfektion
vorgenommen werden kann, können
prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein, beispielsweise Bakterien-,
Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugerzellen oder aber auch Organismen
wie transgene Tiere oder Pflanzen. In den eukaryotischen Systemen
sind die Säugerzelllinien
NS0, SP2/0, CHO-K1, CHO dhfr-, COS-1, COS-7, K562, Percy 6 oder
bevorzugt HEK293-Zellen bevorzugt CD8-Zellen, LCCPKl, HeLazellen,
MDCK2-Zellen, MCF7, Fibroblasten, MCF7, NIH3T3.
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Nachdem die Zellen mit beiden Plasmiden
unter den dem Fachmann bekannten Bedingungen kotransfiziert wurden,
werden die beiden Fusionsproteine aus AKAP und erstem fluoreszierenden
Protein und aus der regulatorischen Untereinheit einer Proteinkinase
und dem zweiten fluoreszierenden Protein exprimiert. Sofern die
exprimierten Fusionsproteine interagieren, kann dies auf Grund der
Wechselwirkung der fluoreszierenden Proteine mit der Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Technik,
insbesondere in lebenden Organisrnen, wie in Zellen detektiert werden.
Die Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Technik beruht auf einem
Energietransfer des ersten fluoreszierenden Proteins zu dem zweiten
fluoreszierenden Protein, der jedoch nur dann zustande kommt, wenn
sich beide Fusionsproteine in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Die
Fusionsproteine erreichen diese Nähe insbesondere dann, wenn
das AKAP-Protein direkt an die regulatorische Untereinheit der Proteinkinase
bindet. In diesem Fall kann ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer
nachgewiesen werden.
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Das System kann auch für die Identifikation
von Substanzen genutzt werden, die die Interaktion zwischen AKAP
und regulatorischen Untereinheiten, bevorzugt RIIα, aber auch
RIIβ, RIα und β der PKA,
inhibieren:
Durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann der Fachmann das Verfahren beliebig modifizieren. Insbesondere
ist es möglich,
zu überprüfen, ob
bestimmte Moleküle
die Wechselwirkung von AKAP und PKA, insbesondere AKAP18δ und RIIα, beeinflussen.
Hierzu kann das erfindungsgemäße Verfahren
beispielsweise einmal in Gegenwart und einmal ohne das zu untersuchende
Molekül
durchgeführt
werden, wobei der Vergleich des mit dem und ohne das zu untersuchende
Molekül
durchgeführten
Verfahrens einen Hinweis auf den Inhibitionscharakter des Moleküls gibt.
Sofern z. B. kein FRET-Signal in Gegenwart des Moleküls gemessen
wird, ist dies ein Hinweis darauf, dass das Molekül die Wechselwirkung
zwischen AKAP und PKA inhibiert.
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Dem Fachmann ist bekannt, durch welche
Kontrollversuche er ausschließen
kann, dass das Molekül den
FRET selbst unterdrückt;
weiterhin ist ihm bekannt, wie er detektieren kann, ob das Molekül AKAP, PKA-Untereinheiten
oder deren spezielle Wechselwirkung beeinflusst, vorzugsweise inhibiert.
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Die Identifizierung spezifischer
AKAP-Inhibitoren hat ein großes
therapeutisches Potential. AKAP-PKA-Interaktionen spielen bei verschiedenen
exozytotischen Prozessen eine Rolle, deren Fehlregulation zur Entstehung
von Krankheiten wie Diabetes insipidus, Diabetes mellitus, Bluthochdruck,
Magenulzera oder Schilddrüsenerkrankungen
führt.
Bei der Herzinsuffizienz kommt es zu einer PKA-vermittelten Hyperphosphorylierung
eines Ionenkanals, des Ryanodinrezeptors (Calciumkanal). Substanzen,
die bestimmte AKAP spezifisch inhibieren, könnten als Pharmaka bei diesen
Erkrankungen eingesetzt werden.
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Das Verfahren ist außerdem geeignet,
die Membranpermeabilität
von Peptiden zu erfassen. Bislang gibt es keine Möglichkeit
einen Membrantransfer von Peptiden direkt nachzuweisen bzw. zu quantifizieren. Dies
kann insbesondere erreicht werden, indem ein Konjugat aus dem zu
untersuchenden Molekül,
insbesondere ein Peptid und S-Ht31 bzw. ein Gemisch mit dem Peptid
Ht31 hergestellt wird. Es ist jedoch jede RII-Bindungsdomäne jedes
AKAPs möglich.
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In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird die Zelle mit einem membranpermeablem Peptid
in Kontakt gebracht. Hierbei ist es beispielsweise möglich, dass
die Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Messung einmal ohne Zugabe
des membranpermeablen Peptids und einmal mit Zugabe des membranpermeablen
Peptids durchgeführt
wird, wodurch detektiert werden kann, ob das membranpermeable Peptid
die AKAP-PKA-Interaktion modifiziert, insbesondere unterbindet.
Eine kontinuierliche Abnahme des Fluoreszenzresonanzenergietransfer-Signals
während
der Messung bedeutet beispielsweise eine Inhibition der Interaktion zwischen
AKAP und der regulatorischen Untereinheit der Proteinkinase in Gegenwart
des membranpermeablen Peptids. Es ist weiterhin auch möglich, bekannte
membranpermeable Peptide einzusetzen, die die Interaktion zwischen
AKAP und PKA inhibieren, wobei bei den membranpermeablen Peptiden
bestimmte Modifikationen, wie beispielsweise Aminosäuredeletionen
oder Substitutionen, untersucht werden, um einen Hinweis zu erhalten,
welche Aminosäuren
in einem membranpermeablen Peptid essentiell sind, um die AKAP-PKA-Interaktion
zu unterdrücken
bzw. zu fördern.
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Das Neue des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht in der Visualisierung der AKAP-PKA-Interaktion in einer
lebenden Zelle und in der Möglichkeit,
den AKAP-PKA-Komplex einem zellulären Kompartiment zuzuordnen.
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Das Verfahren ist jedoch sehr viel
breiter verwendbar. Es ermöglicht
ein Hochdurchsatzverfahren zur Identifikation und quantitativen
Analyse von Substanzen, die die AKAP-PKA-Interaktion beeinflussen.
Darüber hinaus
kann die Membrangängigkeit
von Peptiden bestimmt werden.
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Die Erfindung betrifft auch die Verwendung
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, des
Vektors, der Wirtszelle, des Polypeptids, des Erkennungsmoleküls, der
pharmazeutischen Zusammensetzung, des Kits und/oder des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Detektion einer AKAP-PKA-Interaktion, einer AKAP- und/oder PKA-Inhibition
und/oder eines membranpermeablen Peptids. Durch die Bereitstellung
der genannten erfindungsgemäßen Strukturen
und Verfahren hat der Fachmann die Möglichkeit, diese in zahlreichen
Bereichen der Grundlagenforschung und Klinik einzusetzen. Es kann
beispielsweise geprüft
werden, ob ein Molekül ein
AKAP- oder PKA-Inhibitor ist. Weiterhin kann geprüft werden,
ob ein Molekül
die Wechselwirkung von AKAP und PKA modifiziert.
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Weiterhin kann detektiert werden,
ob ein Molekül,
insbesondere ein Peptid, membranpermeabel ist.
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Im Folgenden soll die Erfindung anhand
von Beispielen näher
erläutert
werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
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Beispiele
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Es wurde zunächst die cDNA einer neuen Spleißvariante
des Proteinkinase A-Ankerproteins (AKAP) AKAP18 identifiziert und
isoliert (1). Diese Variante wird
als AKAP18δ bezeichnet.
Die AKAP18δ-cDNR wurde
in den kommerziell erhältlichen
Vektor pECFP (BD Biosciences, Clontech Heidelberg) kloniert. Die cDNA
der regulatorischen Untereinheit RIIα der humanen Proteinkinase A,
die von,Prof. Dr. K. Tasken (Universität Oslo) zur Verfügung gestellt
wurde, wurde in den kommerziell erhältlichen Vektor pEYFP (BD Biosciences,
(Clontech, Heidelberg) kloniert. Eukaryotische HEK293-Ze11en (GBF,
Braunschweig) wurden mit den Plasmiden kotransfiziert.
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Die Interaktion der exprimierten
Fusionsproteine AKAP18δ-CFP
und RIIa-YFP wurde mittels der FluoreszenzResonanzEnergieTransfer
(FRET)-Technik in den HEK293-Zellen gemessen (schematische Darstellung
in 3). Die FRET-Signale
beruhen auf einem Energietransfer von CFP zu YFP, der nur zustande kommt,
wenn sich beide Proteine in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (< 10 nM). CFP und
YFP erreichen diese Nähe
nur, wenn AKAP18δ die
RIIα-Untereinheit
direkt bindet. In diesem Fall kann ein FRET nachgewiesen werden.
Die Spezifität
der Interaktion von AKAP18δ und
RIIα kann
dadurch überprüft werden,
dass FRET in Gegenwart des membranpermeablen Peptids S-Ht31, das
die Interaktion zwischen dem AKAP und der RII-Untereinheit verhindert,
gemessen wird. Eine kontinuierliche Abnahme des FRET-Signals während der Messung
bedeutet eine Inhibition der Interaktion zwischen AKAP18δ und RIIα.
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Die Sequenz des Peptids S-Ht31 entspricht
der der PKA-Bindungsdomäne
(RII-Bindungsdomäne)
des AKAP Ht31. Es bildet eine amphipathische Helix aus und bindet
kompetitiv an die regulatorischen PKA-Untereinheiten. Dadurch verhindert
es die Interaktion mit AKAP18δ.
Die Membranpermeabilität
erhält
das Peptid durch die Kopplung an einen Stearatrest am N-Terminus
(Klussmann et al. J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999). Peptide
mit der gleichen Aminosäuresequenz
(Ht31), die keinen Stearatrest tragen und damit nicht membranpermeabel
sind, verändern
das FRET-Signal in dem System nicht. Ebenso verändert Stearat-gekoppeltes S-Ht31-Peptid,
das durch Einfügen
von zwei Prolinen, die die amphipathische Helix stören, das FRET-Signal
nicht.
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Teil der Charakterisierung eines
neu identifizierten AKAP ist der Nachweis, dass es in vivo als AKAP, das
heißt
als PKA-Interaktionspartner, fungiert.. Das erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt es, die Interaktion von AKAP18δ und den RIIα-Untereinheiten der PKA in lebenden
Zellen nachzuweisen. Es ist damit dazu geeignet, den Nachweis zu
erbringen, dass AKAP18δ als
AKAP in vivo fungiert. Gleichzeitig lässt das System Rückschlüsse auf
die intrazelluläre
Lokalisation des AKAP18δ-RIIα-Komplexes
zu.
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AKAP sind eine Familie von über 50 Proteinen,
deren Funktion bislang nicht durch spezifisch interagierende Substanzen
manipuliert werden kann. Das Peptid S-Ht31, mit dem die Bindung
von AKAP18δ und RIIα inhibiert
wurde (s.o.), ist bisher die einzige bekannte Substanz, die eine
AKAP-Funktion beeinflusst. Es inhibiert die AKAP-PKA-Interaktion,
allerdings entkoppelt es die Bindung zwischen jeglichem AKAP und
allen regulatorischen PKA-Untereinheiten. Mit diesem entwickelten
System sollen membranpermeable Peptide sowie niedermolekulare, nichtpeptidische
Substanzen in gezielten Hochdurchsatzuntersuchungen mittels FRET-Messungen
identifiziert werden, die die Interaktion zwischen AKAP18δ und RIIα spezifisch
inhibieren.
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Herstellung von Plasmiden,
die für
die Fusionsproteine AKAP18δ-CFP
und RIIα-YFP
kodieren
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Die kodierende Region der von uns
identifizierten AKAP18δ-cDNA
(1; Sequenz AKAP18δ) wurde mittels der Polymerasekettenreaktion
(PCR) amplifiziert. Dazu wurden forward-Primer (Position in AKAP18δ: by 57-76)
mit der Sequenz 5' CTC
GAG CTC RAG CTT CGA ATT CTG ATG GAG CGC CCC GCC GCG GG 3' und reverse-Primer
(Position in AKAP18δ:
by 1095 – 1118)
mit der Sequenz 5' GGC
GAC CGG TGG ATC CCG GGC CCG GTT GTT ATC ACT GCC ATC GCC 3', die eine EcoRI-
bzw. eine BamHI-Restriktionsschnittstelle tragen, eingesetzt. Als
Polymerase wurde der Advantage cDNA polymerase-Mix nach Herstellerangaben eingesetzt.
Der benötigte
10x PCR-Puffer wurde mit dem Advantage cDNA polymerase-Mix mitgeliefert.
Die Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP wurden als dNTP-Mix in
den PCR-Ansatz pipettiert (Reaktionsansatz siehe unten) .
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Die für RIIα kodierende cDNA wurde mittels
PCR aus dem Plasmid amplifiziert. Dazu wurden forward-Primer (Position
in RIIα:
by 190 – 210)
mit der Sequenz 5' TCA
GAT CTC GAG CTC AAG CTT CGA ATT CTG ATG AGC CAC ATC CAG ATC CCG
3' und reverse-Primer
(Position in RIIα:
by 1382 – 1401)
mit der Sequenz 5' GAC
CGG TGG ATC CCG GGC CTG CCC GAG GTT GCC CAG AT 3', die eine XhoI- bzw. eine BamHI-Restriktionsschnittstelle
tragen, eingesetzt. Als Polymerase wurde wieder der Advantage cDNA
polymerase-Mix eingesetzt. Ebenso wurden der oben beschriebene 10x
PCR-Puffer und der dNTP-Mix eingesetzt.
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Die PCR-Reaktionen zur Amplifikation
von AKAP18δ und
RIIα wurden
wie folgt angesetzt:
| DNA | 5 μl |
| dNTP-Mix [10 μM] | 1 μl |
| Forward-Primer [10 μM] | 1 μl |
| Reverse-Primer [10 μM] | 1 μl |
| Advantage cDNA polymerase-Mix (5 Einheiten/μl) | 0,2 μl |
| H2O | 41, 8 μl |
| Gesamtvolumen | 50 μl |
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Das erhaltene AKAP18δ-cDNA-Amplifikat
(Länge:
1061 bp) wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI behandelt,
das erhaltene RIIα-cDNA-Amplifikat
(Länge:
1211 bp) mit den Restriktionsenzymen Xhol und BamHI. Anschließend wurden
die Ansätze
in einem Agarosegel aufgetrennt und die AKAP18δ- bzw. RIIα-Amplifikate mittels der Geneclean-Methode
aus dem Gel eluiert.
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Die AKAP18δ-cDNA wurde in das mit den Restrikzionsenzymen
EcoRI und BamHI geschnittene Plasmid, das für das Cyan Fluoreszierende
Protein (CFP) kodiert (pECFP, BD Biosciences), einkloniert. Die
RIIα-cDNR
wurde in das mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI geschnittene
Plasmid, das für
das Yellow Fluoreszierende Protein (YFP) kodiert (pEYFP, BD Biosciences),
einkloniert. Die erhaltenen Plasmide kodieren somit für die Fusionsproteine
AKAP18δ-CFP
bzw. RIIα-YFP.
Escherichia coli-Bakterien (Stamm JM109) wurden mit der Plasmid-DNA
transformiert. Die in den Bakterien vermehrte Plasmid-DNA wurde
mittels der Qiagen-Midi-Plasmidpräparationsmethode entsprechend
den Herstellerangaben (Qiagen, Hilden) isoliert und mittels Transfektion
in HEK293-Zellen eingeführt
(s.u.).
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HEK293-Zellen (GBF, Braunschweig)
wurden auf Polylysinbeschichteten 30 mm-Deckgläschen in Dulbecco's Minimal Eagle Medium
(DMEM) mit 10 % fötalem
Kälberserum
(FCS) kultiviert, bis eine Konfluenz von 40 – 60 % erreicht war. Die Zellen
wurden mittels der Liptofectamine-Methode (Gibco Invitrogen, Karlsruhe) mit
den AKAP18δ-CFP-
und RIIα-YFP-Plasmiden (1 – 2 μg je DNA)
transient transfiziert (Verhältnis
von AKAP18δ-CFP-:RIIα-YFP-Plasmid-DNA
von 1:4).
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Fluoreszenzresonanzenergietransfer
(FRET)-Messungen HEK293-Zellen wurden transient mit den für RIIα-YFP und
AKAP18δ-CFP
kodierenden Plasmiden kotransfiziert. FRET-Messungen wurden 24 – 48 h nach der
Transfektion an einem Epifluoreszenzmikroskop (Axiovert 200M, Carl
Zeiss, Jena, Deutschland) durchgeführt. Die Daten wurden mittels
der Openlab 2.25 Software (Improvision, Coventry GB) gespeichert.
Die Fluoreszenz wurde bei einer Wellenlänge von 425 für CFP und
488 nm für
YFP angeregt. Die emittierte Fluoreszenz wurde bei Wellenlängen von
480/30 für
CFP und 535/26 nm für
YFP gemessen. FRET von CFP zu YFP wurde durch Anregung von CFP bei
einer Wellenlänge
von 425 nm und der Messung der Emission von YFP bei einer Wellenlänge von 535/26
nm bestimmt. Die unspezifische Hintergrundfluoreszenz wurde in einer
Region ohne Zellen bestimmt und subtrahiert. Da die Einstellungen
am Mikroskop unverändert
blieben, konnte in allen Experimenten ein Verhältnis von 535/480 > 0,6 als positives
FRET-Signal bezeichnet werden.
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Bei FRET-Experimenten müssen falsch-positive
Signale ausgeschlossen werden. Diese sind darauf zurückzuführen, dass
bei der Anregung von CFP auch YFP angeregt wird. Des Weiteren strahlt
die CFP-Emission auch in den Bereich der YFP-Emission hinein. Das
Kontrollexperiment zum Nachweis richtig-positiver FRET-Signale erfolgt
durch ein Akzeptor-Ausbleichungs-Protokoll
(donor recovery after acceptor bleaching). Das Experiment wurde
an einem inversen Epifluoreszenzmikroskop (Axiovert 100, Carl Zeiss,
Jena, Deutschland) durchgeführt.
Hierbei wird bei einer Anregung von 425 nm die Emission bei 480/30
und 535/26 nm mit einer 12 bit CCD-Kamera (Imago, TILL-Photonics,
Martinsried, Deutschland) erfasst. Nach Bestimmung der Basis-Signale
erfolgt dann eine starke Anregung von YFP bei einer Wellenlänge von
488 nm, die zum Verlust des YFP-Emissionssignals führt (acceptor
bleaching). Die Emission von CFP, die bei einer Wellenlänge von 480/30
nm bestimmt wird, steigt sofort an, da FRET unterbrochen wird (donor
recovery). In diesem System musste YFP durch mehrmalige starke Anregung
bei einer Wellenlänge
von 488 nm ausgeblichen werden, da die Lichtquelle nicht energiereich
genug ist. Das Ausbleichen und damit der Verlust des YFP-Emissionssignals geschieht
somit stufenweise. Dadurch steigt die Emission von CFP, die bei
einer Wellenlänge
von 480/30 nm bestimmt wird, kontinuierlich und nicht in einem einzigen
Schritt an. Der Anstieg der CFP-Emission wird daher über einen
Zeitraum von etwa 120 sec nach Beginn der Akzeptorausbleichung gemessen.
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Um die Spezifität des FRET weiter zu untersuchen
und zu testen, ob sich die kotransfizierten HEK293-Zellen dazu eignen,
membranpermeable Substanzen zu identifizieren, die die Interaktion
zwischen RIIα-YFP
und AKAP18δ-CFP
modulieren, wurden die Zellen mit dem membranpermeablen Peptid S-Ht31(100 μM) inkubiert,
das generell AKAP-RII-Interaktionen hemmt. Zur Kontrolle wurden
die Zellen mit dem Peptid S-Ht31-P, das keinen Einfluss auf die
AKAP-RII-Interaktion
hat (Klußmann
et al., J. Biol. Chem. 274, 4934-4938,
1999), inkubiert. FRET-Messungen wurden in Intervallen von 10 min über insgesamt
90 min durchgeführt.
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Ergebnis Zum direkten Nachweis einer
Interaktion von AKAP18δ und
den regulatorischen RIIα-Untereinheiten
der PKA in vivo wurden HEK293 mit Plasmiden kotransfiziert, die
für AKAP18δ-CFP und
RIIα-YFP kodieren. 2 belegt die Koexpression
beider Proteine in den gleichen Zellen. Die Expression von RIIα-YFP wurde
durch Anregung bei 488 nm und Messung der emittierten Fluoreszenz
bei 535/26 nm nachgewiesen ( 2A),
die von AKAP18δ-CFP
durch Anregung der Fluoreszenz bei 425 nm und Messung der emittierten Fluoreszenz
bei 480/30 nm (2B). Beide Fusionsproteine
zeigten eine diffuse, zytosolische Verteilung. Anschließend wurden
FRET-Messungen an den gleichen Zellen durchgeführt. Dazu wird der Donor CFP
bei einer Wellenlänge
von 425 nm angeregt. Hält
sich ein geeigneter Akzeptor in seiner unmittelbaren Nähe auf (Abstand < 10 nm), führt die
Anregung des Donors zu einem teilweisen Energietransfer auf den
Akzeptor YFP, der dann bei einer Wellenlänge von 545 nm fluoresziert
(schematische Darstellung in 3).
Demnach wurden zum Nachweis von FRET die HEK293-Zellen (CFP) bei
einer Wellenlänge
von 425 nm angeregt und es wurde die Emission von YFP bei einer
Wellenlänge
von 535/26 nm gemessen. 2C zeigt eine ähnliche
Verteilung der dargestellten YFP-Emission wie in 2A.
Somit hat ein Energietransfer von CFP nach YFP stattgefunden. 1D zeigt die farbkodierte Darstellung
der berechneten Ratio 535/480 von etwa 1.2 – 1.5 der FRET-Signale in diesen
Zellen.
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Die Spezifität der gemessenen FRET-Signale
wurde mittels des Akzeptor-Ausbleichungs-Protokolls überprüft. 4A beschreibt die Kinetik
der von YFP und CFP emittierten Fluoreszenz. Dargestellt ist das
Verhältnis
von F/Fmax in Abhängigkeit von der Zeit (Zeit
in sec). Fmax entspricht der maximalen Emission
von YFP bzw. CFP. Vor der Akzeptorausbleichung beträgt die F/Fmax
von YFP annähernd
1, die von CFP etwa 0,92. Die Akzeptorausbleichung, beginnend nach
40 sec, führt
zu einer starken Abnahme des Emissionssignals von YFP. Die F/Fmax für
CFP steigt von etwa 0.91 auf etwa 1 an. Aus dem Anstieg der CFP-Emission
um etwa 10 % ergibt sich eine FRET-Effizienz von etwa 10 %. Die
Regressionsanalyse (4B)
bestätigt
diese Beobachtung. Diese Daten zeigen eine direkte Interaktion von
AKAP18δ und
RIIα.
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Um die Spezifität der Interaktion von AKAP18δ und RIIα und damit
des FRET weiter zu untersuchen, aber auch um zu testen, ob sich
die kotransfizierten HEK293-Zellen dazu eignen, membranpermeable
Substanzen zu identifizieren, die die Interaktion von AKAP18δ und RIIα modulieren,
wurden FRET-Messungen in Gegenwart des membranpermeablen Peptids
S-Ht31 durchgeführt.
Dieses Peptid hemmt generell die Interaktion zwischen AKAP und regulatorischen
PKA-Untereinheiten (Klussmann et al., J. Biol. Chem. 274, 4934-4938,
1999; s. schematische Darstellung 5A und
B). 6A zeigt das farbkodierte
FRET-Signal (Verhältnis
535/480) von AKAP18δ zu
RIIα in
zwei HEK293-Zellen. Vor der Zugabe von 5-Ht31 (Zeitpunkt 0 min)
betrug die Ratio 535/480 etwa 1.3. Eine Abnahme des Verhältnisses
535/480 (weniger rot) korreliert direkt mit der Abnahme der Interaktion
von CFP und YFP. Die Zugabe von S-Ht31 (100 μM, nach Zeitpunkt 0) induzierte
eine Abnahme des Verhältnisses
535/480 nm um über
50% innerhalb von 80 min. Der Mittelwert des Verhältnisses
betrug etwa 0.35. 6B zeigt
Zellen, die mit dem wirkungslosen Kontrollpeptid S-Ht31-P inkubiert
wurden, das keinen Einfluss auf die AKAP-RII-Interaktion hat. Hier ändert sich
das farbkodierte FRET-Signal kaum. 6C zeigt
eine Zusammenfassung der erhaltenen Daten aus 6A und B.
Dargestellt ist die Veränderung
des FRET-Signals (in %) in Abhängigkeit
von der Zeit. Die Graphik zeigt die an den Zellen beobachtete Veränderung
des FRET-Signals in Gegenwart von S-Ht31 oder S-Ht31-P.
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Diese Ergebnisse zeigen, dass HEK293-Zellen,
die AKAP18δ-CFP
und RIIα-YFP
koexprimieren, ein geeignetes System zur Identifizierung membranpermeabler
Substanzen darstellen, die die Interaktion zwischen diesem AKAP
und RIIa inhibieren.
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AKAP bindet regulatorische PKA-Untereinheiten über ein
konserviertes Strukturmotiv (amphipathische Helix). Daher kann eine
Interaktion jedes AKAP mit einer regulatorischen PKA-Untereinheit
in diesem System mittels FRET bestimmt werden. Diese Möglichkeit
bedeutet, dass das System für
die Suche nach spezifischen, membranpermeablen Inhibitoren für jede AKAP-PKA-Interaktion
nutzbar ist.
