DE10297736T5

DE10297736T5 - Arzneimittel zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose

Info

Publication number: DE10297736T5
Application number: DE10297736T
Authority: DE
Inventors: Yiming Tsai
Original assignee: SAGITTARIUS LIFE SCIENCE CORP LINKOU HSIANG; Sagittarius Life Science Corp
Current assignee: SAGITTARIUS LIFE SCIENCE CORP LINKOU HSIANG; Sagittarius Life Science Corp
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2005-05-25
Also published as: AU2002323823A1; CN1457822A; US7459173B2; CN1245202C; JP2005533020A; WO2003094940A1; US20060093619A1; JP4332659B2

Abstract

Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem Verhältnis von 0,1–1:2–20:1–5:0,1–1:0,1–1:0,1–1.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arzneimittel zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose. Insbesondere bezieht sie sich auf eine Zusammensetzung von chinesischen Kräutern, deren Herstellungsverfahren und Verwendungen. Die Effektivität und Sicherheit der vorliegenden Erfindung bei Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose ist nachgewiesen durch in-vitro- und in-vivo-Studien an Säugetieren.
Stand der Technik
Osteoporose ist eine verheerende Krankheit, die alle Bevölkerungen und Altersgruppen betrifft. Die Verbreitungsrate nimmt mit dem Alter zu. Im Allgemeinen werden die porösen Knochen dünn, brüchig und leicht brechbar, besonders an Handgelenk (Carpus), Oberschenkelknochen (Femur), und Wirbeln (Vertebrae). Die auffälligsten Symptome der Osteoporose sind Druckbrüche der Wirbel, welche zu Rückenschmerzen, Verminderung der Körpergröße und Kyphose führen. Die Knochendichte (Bone Mineral Density, BMD) erreicht ihr Maximum im Menschen bei 35–40 Jahren. Bei Frauen im Alter von 50 Jahren während der Menopause ist ein Verlust von Knochenmineralien bei einer Rate von 1–3% pro Jahr und die Knochen werden porös. Die Verbreitung von Osteoporose bei Frauen ist doppelt so hoch wie bei Männern.
Der Wirkmechanismus von gegenwärtig erhältlichen Therapeutika, beispielsweise Bisphosphonate, spezifische Östrogenrezeptormodulatoren, Kalzitonin und Östrogen hemmt meistens die Aktivität von Osteoklasten. Parathyroidhormone sind die einzigen, welche die Stimulation von Osteoblasten bewirken. Es gibt viele unerwünschte Effekte und ihre langfristige Sicherheit ist nicht eindeutig. Unglücklicherweise müssen Osteoporosepatienten diese Arzneimittel sehr langfristig einnehmen. Unter diesen Arzneimitteln sind Kalzitonin und Paratyhroidhormone vom Peptid-Typ. Sie müssen durch tägliche Injektionen oder Inhalationen verabreicht werden, welche für Patienten nicht benutzerfreundlich sind.
Der weltweite Trend zur natürlichen Gesundheitsversorgung ist bei Osteoporose begrenzt auf eine stark kalziumhaltige Diät aus Milch, Molkereiprodukten, Fisch, Soja und grünen Blättern und auf gewichthebende Leibesübungen. Im Stand der Technik sind manche natürliche Nahrungsmittel oder Kräuter gelehrt, welche Effekte bei der Prävention oder Behandlung von Osteoporose haben. Beispielsweise berichtet Diane Feskanich, dass Frauen, welche eine Einheit Salat pro Tag zu sich nahmen, eine um 45% verringerte Wahrscheinlichkeit hatten, eine Femurfraktur zu erleiden, als Frauen, welche weniger als eine Einheit pro Woche zu sich nahmen. Die Autoren legten nahe, dass im Salat enthaltenes Vitamin K der aktive Wirkstoff war (Am. J. Clin. Nutr. 69: 74–79, 1999). Die vorliegende Erfindung weist Salatsamen auf und die Zusammensetzung enthält kein Vitamin K. L. Cui. und Y.F. Ma berichtet, dass die orale Gabe eines Wasserextrakts aus Epimedium Sagittatum Maxim, Astragalus Mimbranaecus, und Rhizoma Attractylodis Macrocephalae bei 1,0 g pro Kilo an Ratten, deren Eierstöcke entfernt wurden, in der Lage war, Mineralienverlust zu verhindern und die Knochenmasse zu erhöhen (J. Bone and Mineral Res. 14 (Supplement 1): S283, 1999). Die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von den erwähnten Veröffentlichungen und die vorliegende Erfindung zeigt bessere Effekte bei der Steigerung von BMD als die erwähnten Veröffentlichungen.
Hu X. Beschreibt im chinesischen Patent Nr. CN1099294, 1995, dass ein Pulver, welches Gypsum Fibrosum, Cinnanomi Ramulus, Citri Tankan Exocarpium, Ephedrae Herba, Paeoniae Radix, Ponciri Trifoliatae Fructus, Rhizoma Chuanxiong, Poria, Mutan Cortex, Rhizoma Pinelliae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Magnoliae Cortex, Scutellariae Radix, Citri Reticulatae Pericarpium, Perillae Fructus, Codonopsis Pilosulae Radix, Angelicae Sinensis Radix, Bupleuri Radix, Aconiti Lateralis Preparata Radix, Semen Juglandis enthielt, anti-inflammatorische Aktivität im Knochenmark zeigte und Osteomyelitis und Hy perosteogenie verbesserte. Die Zusammensetzung dieses zwanzig Kräuter enthaltenden Präparates unterscheidet sich von der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung und der Anspruch der erwähnten Veröffentlichung richtete sich auf anti-inflammatorische Aktivität, nicht auf das Verhindern und Behandeln von Knochenfraktur und Osteoporose, wie bei der vorliegenden Erfindung. Lui H. veröffentlichte im chinesischen Patent Nr. CN 1079160, 1993, das Pulver, welches Aquilariae Resinatum Lignum, Flos Carthami, Auxlandiae Radix, Rhizoma Chuanxiong, Cinnamoni Ramulus, Eupolyphaga Seu Steleophaga, Rhizoma Drynariae, Semen Strychni, Achyranthis Bidentatae Radix, Semen Cucumis, Herba Abri, Rhizoma Rhei, Pyritum, Borneolum und Sanguis Draconi enthielt, die Funktionen der Niere verbesserte und in der Lage war, Defekte bei der Knochen- und Knorpelbildung zu behandeln. Die Zusammensetzung dieses achtzehn Kräuter enthaltenden Präparats unterscheidet sich jedoch von der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, und diese Veröffentlichung enthält keine gut kontrollierte Studie, um ihre Effizienz bei der Heilung von Knochenfrakturen und Osteoporose zu unterstützen. Masako Shiyouji et. al. veröffentlichten im japanischen Patent Nr. JP 4266820 , 1992 dass langkettige, gesättigte Alkohole mit 22 bis 38 Kohlenstoffatomen in der Lage waren, Verlust an Knochenmineralien zu verhindern und Knochenbildung zu unterstützen; in dem genannten Patent wurde die Zusammensetzung jedoch aus Weizenkeimöl oder Reiskleieöl durch Alkohol extrahiert, welche sich von der vorliegenden Erfindung unterschied. Die vorliegende Erfindung bestand aus Samen von Fructus Oryzae ohne die Kleie, und nicht aus Weizenkeimöl oder Reiskleieöl. Weiterer Stand der Technik mit Zusammensetzungen, welche sich von der vorliegenden Erfindung unterscheiden, z.B. chinesische Patente Nr. CN 1195697, CN 126696, CN 1180530, CN 1287853, CN 118958, CN 1071843, CN 1219428, CN 1245711, CN 1312096, CN 1113440, CN 1083727 und CN 1277848, beanspruchten ihre Brauchbarkeit bei der Behandlung von Knochenfrakturen basierend auf Theorien der chinesischen Medizin ohne experimentelle Daten oder gut kontrollierte Studien zum Nachweis der Effektivität dessen, was sie beanspruchten. Die vorliegende Erfindung, mit einer Zusammensetzung, welche sich allen genannten Patenten und Veröffentlichungen unterscheidet, weist ihre Effizienz bei Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose sowohl durch in-vitro als auch in-vivo-Studien nach. Die vorliegen de Erfindung bietet eine neue Zusammensetzung einer neuen Kräuterkombination, welche in der Lage ist, Knochenfraktur und Osteoporose durch ein natürliches therapeutisches Verfahren vorzubeugen und zu behandeln.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zur Behebung der Nachteile des Standes der Technik schafft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine neue Kräuterzusammensetzung zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Kräuterzusammensetzung zur Prävention und Behandlung von Knochenfraktur und Osteoporose zu schaffen. Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Verwendung einer neuen Kräuterzusammensetzung zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose zu schaffen, und ein Verfahren zur Anwendung einer neuen Kräuterzusammensetzung für die Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose.
Die vorliegende Erfindung schafft eine Kräuterzusammensetzung aus Semen lactutcae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem Verhältnis von 0,1–1 : 2–20 : 1–5 : 0,1–1 : 0,1–1 : 0,1–1 : 0,1–1. Das bevorzugte Verhältnis ist 0,5 : 5 : 2 : 0,5 : 0,25 : 0,5.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Lignum aquilariae resinatum Harz sein, welches Lignum aquilariae resinatum enthält, und Resina boswelliae carterii kann Harz sein, welches Resina boswelliae carterii enthält. Durch Anwendung pharmazeutisch verwendbarer Exzipienten, Träger oder Verdünnungsmitteln kann die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Darreichungsformen formuliert werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Pastille, Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalationsmittel.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Verfahren zum Herstellen einer Kräuterzusammensetzung. Die Verfahren umfassen die folgenden Schritte:

(1.) Extraktion von Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae.
(2.) Mischen der effektiven Menge des Extraktes mit pharmazeutisch verwendbaren Trägern, Exzipienten oder Verdünnungsmitteln, zur Herstellung der erwünschten Darreichungsformen.

Die Kräuterzusammensetzung der genannten Verfahren wird gebildet aus Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem Verhältnis von 0,1–1 : 2–20 : 1–5 : 0,1–1: 0,1–1 : 0,1–1. Das bevorzugtere Verhältnis ist 0,5 : 5 : 2 : 0,5 : 0,5 : 0,5.
Lignum aquilariae resinatum kann Harz sein, welches Lignum aquilariae resinatum enthält und Resina boswelliae carterii kann Harz sein, welches Resina boswelliae carterii enthält Durch Verwenden des genannten Verfahrens mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln kann die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu verschiedenen Darreichungsformen formuliert werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf, Pastille, Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalationsmittel. Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose durch Darreichen einer effektiven Dosis der vorliegenden Kräuterzusammensetzung durch orale, intramuskuläre, intravenöse, mukusale oder topische Darreichungen.
Insbesondere ist die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung brauchbar zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose. Die Kräuterzusammensetzung ist gebildet aus verschiedenen Verhältnissen von Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae. Die Kräuter können gesamte Pflanzen oder spezifische Teile der Pflanzen sein. Semen lactucae sativae ist der getrocknete Samen von der Pflanzenfamilie von Lactuca sativa L. Lignum aquilariae resinatum sind die Harz enthaltenden Stämme der Pflanzenfamilie Aquilaria agallocha Roxb. oder Aquilaria sinensis Gilg. der Familie der Thymilaeaceaen. Fructus oryzae ist die Frucht von Oryza sativa L. aus der Gramineaen Familie der Pflanzen, Resina boswelliae carterii ist das Harz von Boswellia carterii Birdw. der Burseraceaen-Pflanzenfamilie, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae ist das getrocknete Rhizom der gemeinsamen Pflanzenfamilie Atractylodis Macrocephalaen und Semen Cuscutae ist der getrocknete Samen von Cuscuta chinensis L., Cuscuta australis R. Br., oder Cuscuta japonica der Pflanzenfamilie der Convolvulaceaen.
Die vorliegende Erfindung mit der Zusammensetzung aus Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae im Gewichtsverhältnis von 0,1–2 : 2–20 : 1–5 : 0,1–1 : 0,1–1 : 0,1–1. Das bevorzugte Verhältnis ist 0,5–5 : 2 : 0,5 : 0,5 : 0,5. Das bevorzugte Lignum aquilariae resinatum ist der harzhaltige Stamm von Aquilaria agallocha Roxb. Das bevorzugte Resina boswelliae carterii ist das gelatineartige Harz der Baumrinde von Boswellia Carterii Bridw.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Kräuterzusammensetzung, aufweisend die folgenden Schritte:

1. Extrahieren von Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in den erwähnten Verhältnissen.
2. Mischen der effektiven Mengen des Extraktes mit pharmazeutisch brauchbaren Trägern, Exzipienten oder Verdünnungsmitteln zur Herstellung der gewünschten Darreichungsformen, welche aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Die Dosierungsformen umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Pastille, Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalationsmittel.
Gemäß des anderen Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren geschaffen zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose durch Darreichung einer effektiven Dosis der Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Sie kann oral, intramuskulär, intravenös, mukusal oder topisch dargereicht werden, z.B. durch orale Darreichung von Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Flüssigkeit, Emulsion oder topischer Darreichung von Salbe oder Lotion zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose.
Die biologischen Aktivitäten der vorliegenden Erfindung umfassen Stimulation der Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Stimulation der Osteoblastenproliferation, Unterstützung der Knochenfrakturheilung im Hasen, Behandlung von Osteoporose bei Ratten, deren Eierstöcke entfernt wurden, analgesischer Effekt in durch Essigsäure induziertem Schmerz an Mäusen, Unterstützung der Bewegungsaktivität in belastet schwimmenden Mäusen, Studien der oralen akuten Toxizität und oralen chronischen Toxizität werden im Folgenden diskutiert.
Gezeigt durch Experiment 1, die Stimulation der BMP-2 Expression durch Pulver A und B aus Beispiel 1 und 2 der vorliegenden Erfindung, 0,3% gemahlenes Pulver A aus Beispiel 1 erhöht die Expression von BMP-2 um 70,2%; 0,3% von Extraktpulver B von Beispiel 2 erhöht die Expression von BMP-2 um 125,5%.
Experiment 2 zeigt die Stimulation der Osteoblastenproliferation der vorliegenden Erfindung, das Extraktpulver C von Beispiel 3 stimulierte die Proliferation von Osteoblasten dosisabhängig.
Experiment 3 zeigt die Unterstützung der Heilung von Knochenfrakturen in Hasen, die Pille von Beispiel 4 stimulierte die Heilungsrate von Knochenfrakturen im Hasen. Im frühen Heilungsstadium unterstützte die Pille von Beispiel 4 das Entfernen von Blutklumpen, Osteoblastenproliferation und Differentiation und die Bildung von Knochenbälkchen. Im mittleren Heilungsstadium unterstützte die Pille von Beispiel 4 die Reifung und Mineralisierung von Knochenbälkchen (Trabeculae) und Knochencallusbildung. Im späten Heilungszustand unterstützte die Pille von Beispiel 4 das Umformen des Knochens und Wiedervereinigung des Knochenmarkkanals.
Experiment 4 zeigt die Behandlung und Prävention von Osteoporose in ovariektomisierten Ratten, das Extraktpulver C von Beispiel 3 unterstützte die Knochenbildung in ovariektomisierten osteoporotischen Ratten. Es stimulierte die Differenzierung von Osteoblasten, Osteoidbildung und Mineralablagerung. Beispielsweise wurde von 3 bis 70 Tage dosiert, die Knochenmetabolismusparameter trabeculares Knochenvolumen (Trabecular Bone Volume, TBV), Einzelmarkierung des Tretrazyklinsignals (Single Lable of Tetracycline Signal, STS), doppelte Markierung des Tetrazyklinsignals (Double Lable of Tetracycline Signal, DTS), Knochenwiederaufbauzeit und angepasste mineralische Ablagerungsrate (iMAR) waren vergleichbar mit denen der scheinoperierten (sham-operated) Gruppe.
Experiment 5 zeigt den analgesischen Effekt bei durch Essigsäure induziertem Schmerz in Mäusen durch orale Gabe von 1,0, 2,0 oder 4,0 g Rohmaterialäquivalent/kg von Pulver P von Beispiel 2, wobei die Anzahl an abdominalen Verdrehungen signifikant abnahm, es zeigte, dass die vorliegende Erfindung einen analgesischen Effekt hat.
Experiment 6 zeigt die Unterstützung von Bewegungsaffinität von unter Belastung schwimmenden Mäusen durch orale Gabe von 0,5, 1,0, 2,0 oder 4,0 g Rohmaterialäquivalent/kg Pulver B von Beispiel 2, wobei die Schwimmzeit der mit Gewicht belasteten Mäuse signifikant zunahm. Es zeigte, dass die vorliegende Erfindung einen Bewegungsaktivität unterstützenden Effekt hat.
Experiment 7 zeigt die orale akute Toxizität an Ratten, das Körpergewicht und die Vitalzeichen der behandelten Gruppe waren vergleichbar mit denen der Kontrollgruppe in sowohl männlichen als auch weiblichen Ratten während der vierzehntägigen Beobachtungsperiode. Bei der Leichenschau wurden keine sichtbaren Lesionen in beiden Gruppen festgestellt.
Bei einer Dosis von 5000mg/kg verursachte das Pulver C der Probe 3 keine erkennbaren pharmakotoxischen Effekte. Die vorliegende Erfindung kann praktisch als nicht-toxisch angesehen werden.
Experiment 8 zeigt die orale chronische Toxizität in Ratten, die Vitalzeichen, Erscheinungsbild, Ausscheidungen und Nahrungsaufnahme waren normal. Das Körpergewicht, Hämatologie, Blutzusammensetzung und Gewichtsindex der ganzen Organe unterschieden sich nicht zwischen der mit der Erfindung behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe. Es gab keine pathologischen Veränderungen bei der histologischen Analyse von großen Organen einschließlich Herz, Leber, Milz, Niere, Blase, Lunge, Magen, Duodenum, Ileum, Colon, Pankreas, Uterus, Eierstöcke, Testis, Epididymus, Prostata, Hirn, Hypophyse, Schilddrüse, Nebenniere, Thymus, Lymphknoten und Knochenmark in der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe. Bei einer 106-fachen Dosis der für Menschen vorgeschlagenen Dosis bei Verwendung des Pulvers B von Probe 2 über 3 Monate wurden keine Toxizitäten bei der vorliegenden Erfindung festgestellt.
In Zusammenfassung der erwähnten biologischen Daten ist die vorliegende Erfindung eine nicht-toxische BMP-2 expressionsstimulierende und Osteoblasten-profilerationsstimulierende Zusammensetzung. Sie zeigt auch analgesische und bewegungsverbessernde Effekte. Die vorliegende Erfindung unterstützt die Heilung von Knochenfrakturen und Behandlung von Osteoporose. Die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist brauchbar zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose.
Beschreibung der Figuren
1 Knochenfraktur-Kontrollgruppe: 23 Tage nach Operation, 40× Vergrößerung, Masson-Färbung.
2 Knochenfrakturperle von mit Beispiel 4 behandelter Gruppe: 23 Tage nach Operation. 40× Vergrößerung, Masson-Färbung.
3 Knochenfraktur-Kontrollgruppe: 30 Tage nach Operation. 100× Vergrößerung, Fluoreszenzfärbung.
4 Knochenfrakturperle der mit Beispiel 4 behandelten Gruppe: 30 Tage nach Operation. 100× Vergrößerung, Fluoreszenzfärbung.
5 Schein-operierte Kontrollgruppe mit Osteoporose/Ovariektomie: 30 Tage nach Ovariektomie. 40× Vergrößerung, von Kossa-Färbung.
6 Osteoporose-Ovariektomiegruppe: 30 Tage nach Ovariektomie. 40× Vergrößerung, von Kossa-Färbung.
7 scheinoperierte Kontrollgruppe, Osteoporose/Ovariektomie: 100 Tage nach Scheinoperation. Struktur der Knochenbälkchen unter den Epiphysen am distalen Ende des Femurs.
8 Osteoporose/Ovariektomie-Gruppe: 100 Tage nach Ovariektomie. Struktur von Knochenbälkchen unter Epiphysen am distalen Ende des Femurs.
9 Osteoporose/Ovariektomie-Gruppe 70 Tage mit Pulver C behandelt: 100 Tage nach Ovariektomie und Dosierung für die letzten 70 Tage. Struktur der Knochenbälkchen unter Epiphysen am distalen Ende des Femurs.
Zubereitung der vorliegenden Erfindung
Beispiel 1, Zubereitung von Pulver A
2000g Lignum aquilariae resinatum, 800g Fructus oryzae, 200g Resina boswelliae carterii, 200g Semen lactucae sativae, 100g Rhizoma atractylodis macrocephalae und 200g Semen cuscutae wurden einzeln zu Pulver gemahlen. Die Pulver wurden sorgfältig gemixt und durch ein Sieb mit 100 mesh gesiebt.
Beispiel 2, Zubereitung von Pulver B
Schritt 1. 400g Lignum aquilariae resinatum und 267g Fructus oryzae werden einzeln zu Pulver gemahlen und durch ein Sieb mit 60 mesh gesiebt.
Schritt 2. 533g Fructus oryzae, 200 Resina boswelliae carterii, 1600g Lignum aquilariae resinatum, 200g Semen lactucae sativae, 100g Rhizoma atractylodis macrocephalae und 200g Semen cuscutae wurden in deionisiertem Wasser gequollen und für 2,5 Stunden auf 100° C erhitzt. Das extrahierte Fluid wurde abgesammelt, durch ein Sieb mit 100 mesh gesiebt und im Rotationsverdampfer verdampft. Das konzentrierte Extraktfluid wurde dann mit dem Pulver aus Schritt 1 gemischt und zu Granulat gemacht.
Schritt 3. Das Granulat wurde im Ofen bei 60°C bei vier Stunden platziert, bis der Wassergehalt weniger als 9% war. Das getrocknete Granulat durch ein Sieb mit 200 mesh gesiebt.
Beispiel 3, Herstellung von Pulver C
2000g Lignum aquilariae resinatum, 800g Fructus oryzae, 200g Resina boswelliae caterii, 200g Lactucae sativae, 100g Rhizoma atractylodis macrocepha lae und 200g Semen cuscutae wurden in deionisiertem Wasser gequollen und für 2,5 Stunden auf 100°C erhitzt. Das extrahierte Fluid wurde abgesammelt, durch ein Sieb mit 100 mesh gesiebt, und zu einem Pulver sprühgetrocknet.
Beispiel 4, Herstellung einer Pille
Das in Beispiel 1 hergestellte Pulver wurde 1:1 mit erwärmtem Honig gemischt und zu Pillen gemacht.
Beispiel 5, Herstellung einer Kapsel
Die in Beispielen 2 und 3 hergestellten Pulver wurden mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt, gesiebt und in Kapseln verpackt.
Beispiel 6, Herstellung einer Tablette
Die in Beispielen 2 oder 3 hergestellten Pulver wurden mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt, gesiebt und zu Tabletten gemacht. Es kann auch zu Granulat gemacht werden durch die bekannten pharmazeutischen Verfahren und dann zu Tabletten gemacht werden.
Beispiel 7 Herstellung einer oralen flüssigen Dosierungsform
Die in Beispielen 2 oder 3 hergestellten Pulver wurden mit pharmazeutisch brauchbaren Emulsionsmitteln und deionisiertem Wasser zu einer oralen flüssigen Dosierungsform gemischt.
Biologische Aktivitätsversuche
Die Ergebnisse der biologischen Studien der vorliegenden Erfindung umfassten die Stimulation der BMP-2 Expression, Stimulation der Osteoblastenproliferation, Unterstützung der Knochenbruchheilung in Hasen, Behandlung und Prä vention von Osteoporose im ovariektomisierten Ratten, analgesischer Effekt von durch Essigsäure induziertem Schmerz in Mäusen, Unterstützung der Bewegungsaktivität von unter Belastung schwimmenden Mäusen, orale akute Toxizität, orale chronische Toxizität in Ratten, im Folgenden detailliert beschrieben.
Die in den Studien verwendeten Präparate:

1. Stimulation der BMP-2 Expression: Pulver A wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, Pulver B wurde wie in Beispiel 2 hergestellt.
2. Stimulation der Osteoblastenproliferation: Pulver C wurde wie in Beispiel 3 hergestellt.
3. Unterstützung der Knochenfrakturheilung in Hasen: Pillen wurden wie in Beispiel 4 hergestellt.
4. Behandlung und Prävention von Osteoporose in ovariektomisierten Ratten: Pulver C wurde wie in Beispiel 3 hergestellt.
5. Analgesischer Effekt von durch Essigsäure induziertem Schmerz in Mäusen: Pulver B wurde wie in Beispiel 2 hergestellt.
6. Unterstützung der Bewegungsaktivität von unter Belastung schwimmenden Mäusen: Pulver wurde wie in Beispiel 2 hergestellt.
7. Oral akute Toxizität in Ratten: Pulver C wurde wie in Beispiel 3 hergestellt.
8. Orale chronische Toxizität in Ratten: Pulver B wurde wie in Beispiel 2 hergestellt.

Experiment 1, in-vitro-Versuch: Stimulation der BMP-2 Expression der vorliegenden Erfindung.

Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 1999, 286: 1946–1949.
Compact and simvastatin, but not pravastatin, induce bone morphogenetic protein-2 in human osteosarcoma cells. Biochem. Biophy. Res. Commun., 2000, 271 (3): 688–692.
In vitro and in vivo studies of bone morphogenetic protein-2 expressing adenoviral vector. J. Bone Joint Surg. Am., 2001, 83A suppl. 1 (Pt 2): S. 99–104.

Ein Luziferase Reporter Vektor, welcher die 5' flankierende Promoterregion des BMP-2 Gens enthielt, wurde konstruiert und in Osteoblasten tansfiziert. Mit Hilfe der durch die enzymatische Aktivität der Luzifere emittierten Fluoreszenz nach Zugabe des Substrats Luziferen konnte Expressionsniveau von BMP-2 bestimmt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
Wie in Tabelle 2 gezeigt, enthielten Pulver A und Pulver B keine Luziferase Aktivität. Wie in Tabelle 1 gezeigt, erhöhte 0,3% Pulver A die Expression von BMP-2 um 70,2%, während 0,3% Pulver B die Expression von BMP-2 um 125,5% erhöhten.
Experiment 2, in-vitro-Versuch: Stimulation der Osteoblastenproliferation der vorliegenden Erfindung.
Literaturstellen

Menadion-induced cytotoxicity to rat osteoblasts. Cell Mal. Life Sc. 1997, 53:967–976.

Die Schädeldecken von neonatalen Wistar Ratten wurden seriell verdaut mit 0,2% Typ I Collagenase (Sigma) bei 37° bei jeweils 30 Minuten. Die zwischen Verdauung 3 bis 5 freigesetzten Zellen wurden gesammelt und in Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) (Gibco) gehalten, welches 10% fetales Kälberserum (FCS), 100g Einheiten/ml Penicillin G, 100μg/ml Streptomycin enthält, in feuchter Atmosphäre mit 5% CO₂ bei 37°C. 1×10⁴ Zellen wurden in jedes Loch einer 96 Loch Multilochplatte (Nunc) plattiert. Nach 48 Stunden wurden 0,1, 1, 10, 100, bzw. 1000 μg/ml des in Beispiel 3 hergestellten Pulvers hinzugefügt. Die Zellen wurden für weitere drei Tage gehalten und 100 μl der Endkonzentration von 0,5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurden hinzugefügt und für vier Stunden bei 37° intubiert. Am Ende der Inkubation wurde der Überstand abgesattelt und 100 μl von Isopropanol mit 0,04 N Salzsäure wurden hinzugefügt. Das gelöste Formazan wurde bei 570 nm bei einem ELISA-Lesegerät (enzyme-linked immunsorbant assay) gemessen. Der Wachstumsanteil wurde durch die folgende Formel berechnet: Wachstumsrate = [(M.O.D. mit hinzugefügter Zusammensetzung – M.O.D. ohne hinzugefügte Zusammensetzung)/M.O.D. ohne hinzugefügte Zusammensetzung] × 100M.O.D.: Mittlere Optische Dichte, S.D.: standard deviation, Standardabweichung.
Wie in Tabelle 3 gezeigt war die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Lage die Proliferation von Osteoblasten bei 24 und 72 Stunden Inkubation zu stimulieren. Die Wachstumsrate bei 72 Stunden war geringer als bei 24 Stunden, möglicherweise aufgrund des Verbrauchs von Nährstoffen und der Ansammlung von Metabolites.
Experiment 3 in-vivo-Versuch: Unterstützung der Heilung von Knochenfrakturen in Hasen
Literaturstellen

An experimental study of dan sehnig impriving the mandibular bone fracture healing. Chinese J. Stomatologie, 1992, 27(4); 215–216.
Effect of Nikotin on the rate and strength of long bone fracture healing. Clin. Orthop. & related Res. 1998, 353:231–237.

40 Hasen mit einem Körpergewicht von 1,5 bis 2 Kg, Hälfte männlich und Hälfte weiblich, wurden eine Woche in Quarantäne gehalten. Der Vorderarm wurde unter sterilen Bedingungen freigelegt, nachdem die Tiere betäubt wurden. Bei ca. einem Drittel des Radius wurde eine 2mm transverse Fraktur durch elektrische Säge erzeugt. Die Wunde wurde vernäht. Die Hasen wurden zu 5, 12, 17, 23 und 30 Tagen gruppiert. Jede Gruppe enthielt 8 Hasen, 5 behandelte und 3 Kontrolltiere. Die Kontrolltiere erhielten Standardhasenfutter, und die Behandelten enthielten die Pille, wie in Beispiel 4 hergestellt, zusätzlich zu dem Standardhasenfutter mit einer Dosis von 2g Beispiel 4, BID. Die Hasen wurden bei frühen (5–12 Tage), mittleren (17–23 Tage) und späten (23–30 Tage) Stufen der Heilung geopfert. Röntgenradiographie und Histopathologie wurden analysiert.
Die Ergebnisse waren wie folgt:

(a). Körperbewegungsbeobachtung: Die experimentelle Gruppe erholte sich schneller als die Kontrollgruppe. Der Vorderarm der mit Pillen behandelten Gruppe konnte das Körpergewicht früher tragen als die Kontrollgruppe.
(b). Röntgenradiographie: Die Heilungsbedingungen der Brüche in der mit Pillen behandelten Gruppe waren besser als in der Kontrollgruppe zu allen beobachteten Zeiten.
(c). Histopathologische Beobachtungen: (c-i). 5 Tage nach Operation: In der Kontrollgruppe gab es Klumpen und Nekrose an den gebrochenen Enden; es gab keine signifikanten Veränderungen im Periosteum und Endoosteum. In der mit der Pille der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe gab es Klumpen und Nekrose an den gebrochenen Enden; es gab Invasion von Blutgefäßen; es gab Osteoblastenproliferation im Periosteum und neue Kapitalbildung im Endoosteum. (c-ii). 12 Tage nach Operation: in der Kontrollgruppe gab es anhaltende Verklappungen und Nekrose; etwas Fibrokallusbildung; etwas biologische Aktivität im Periosteum, etwas Hyalinkallusbildung in einem begrenzten Bereich. In der mit der Pille der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe gab es an den Frakturenden Fibrokallusbildung; es gab beträchtliche Ne-Osteogenese im Periosteum am Promillen Ende der Fraktur; es gab auch etwas Knochenkallusbildung. (c-iii). 17 Tage nach Operation: In der Kontrollgruppe gab es eine große Menge an Hyalinkallus; der Knochenmarkkanal wurde durch den Kallus nicht vollständig abgedichtet. In der mit der Pille der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe gab es beträchtliche Ne-Osteogenese an den Frakturenden; Mineralisierung fand statt; der Knochenmarkkanal wurde durch den Kallus abgedichtet; Blutgefäße waren präsent. (c-iv). 23 Tage nach Operation: in der Kontrollgruppe gab es größtenteils, aber nicht vollständig, Knochenbaus an den Frakturenden, aber es gab etwas Hyalinkallus in den Spalten der Frakturenden, wie in 1 gezeigt. In der mit der Pille der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe waren die Frakturenden durch Knochenbaus völlig verheilt. Es gab beträchtliche Umformung des äußeren Knochenbaus und um die Knochenbälkchen herum viele Blutgefäße, wie in 2 gezeigt. Bei stärker Vergrößerung zeigte der Knochenbaus an den Enden des abgedichteten Knochenmarkkanals Knochenresorption und Umformungsaktivität. (c-v). 30 Tage nach Operation: Wie in 4 gezeigt war bei der mit Pillen der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe der Knochenbaus an den Frakturenden reif; das Periosteum von Kallus und gebrochenen Enden war gut miteinander verbunden; die Epiphysen an den Frakturenden zeigen Knochenumformung; Tetrazyklin: Färbung war ersichtlich. Es war klinisch geheilt. Wie in 3 gezeigt war bei der Kontrollgruppe der Knochenbaus an den Frakturenden noch nicht; es gab etwas Hyalincalzifizierung; die Epiphysen an den Frakturenden zeigten nicht beträchtliches Knochenumformen; Kallus und Frakturenden waren nicht gut verbunden; die Tetrazyklinfärbung war meistens einzeln.

In Zusammenfassung der Ergebnisse zeigte die mit der Pille der vorliegenden Erfindung behandelte Gruppe eine beträchtliche Erleichterung der Heilung der Knochenfraktur im Hasenmodell. Im frühen Stadium unterstützte die vorliegende Erfindung die Aktivierung von Verklappungen an den Frakturenden, stimulierte Osteoblastenproliferation und Differenzierung, unterstützte Trapekularbildung; bei der mittleren Stufe unterstützte die vorliegende Erfindung die Trapekularreifung und Mineralisierung, die Knochenkallusbildung; im späten Stadium unterstützte die Erfindung die Knochenumformung, und erleichterte die Wiedervereinigung des Knochenmarkkanals.
Experiment 4, in-vivo Versuch: Behandlung und Prävention von Osteoporose in ovariektomisierten Ratten
Literaturstellen

Effect of ovarictomy and calcium deficiency on the ultrasound velocity, mineral density and strength in the rat femur. Clin. Biomech., 1998, 13(7): 480–484.
The use of estrogen, DHEA, and diosgenin in a sustained delivery setting as a novel treatment approach for osteoporosis in the ovarictomized adult rat model. Biomed. Sc., 2001, 37:281–286.
Study of nylestriol effect on bone histomorphometric parameters in ovariectomized rats. Zhonghua Fu Chan GE Az ZH, 1999, 34(2): 86–89.

52 weibliche Spraque-Dawley-Ratten mit einem Körpergewicht von 200 g wurden in vier Gruppen aufgeteilt: scheinoperierte Kontrollgruppe, ovariektomierte Gruppe, ovariektomierte Gruppe mit Dosierung nach 30 Tagen für die letzten 40 Tage, und ovariektomierte Gruppe mit Dosierung für die letzten 70 Tage.
(4-a). Ovariektomie
Ratten wurden unter Betäubung ovariektomisiert oder scheinoperiert. Nach einem Monat wurden fünf Ratten jeder Gruppe geopfert, um festzustellen, ob Osteoporose etabliert war. Die Ergebnisse zeigten, dass in der scheinoperierten Gruppe die Struktur der Trabeculae unter den Epiphysen der distalen Enden des Femur reif, dicht und gleichmäßig dick wie in 5 gezeigt waren. In der Gruppe 30 Tage nach Ovariektomie war die Struktur der Trabeculae unter den Epiphysen des distalen Endes des Femurs nicht reif, die Verbinden unter den Trabeculae waren schlecht und es gab viele Sackgassen-Enden der Trabeculae und Osteoiden auf der Oberfläche der Trabeculae. Dies demonstrierte Osteoporose mit hohen Aktivitäten an Knochenwiederaufbau und Knochen-Turnover, wie in 6 gezeigt. Es gab beträchtliche Unterschiede in der Struktur der Trabeculae zwischen scheinoperierten Kontrollratten und ovariektomisierten Ratten.
(4-b). Dosierung nach 30 Tagen nach Ovariektomie
30 Tage nach Ovariektomie wurde den Ratten oral 0,12 Pulver C (hergestellt in Beispiel 3) pro Tag gegeben. Nach weiteren 40 Tagen wurden vier Ratten in jeder der vier Gruppen geopfert, und histologische Schnitte wurden hergestellt und untersucht. Die überlebenden Ratten wurden weitere 30 Tage dosiert und am Ende des Versuchs geopfert. Knochenmineraldichte (BMD), Pathohistologie, Knochenhistomorphometrie wurden durchgeführt und analysiert.
(4-c). BMD Messung
Die BMD des rechten Femurs der Ratten wurde gemessen durch Hologic QDR-4500W(S/N 47192).
(4-d). Knochenhistomorphometrie
Schnitte der Trabeculae 1 cm unterhalb der Epiphysen wurden gewählt. Drei Bilder wurden gewählt von Bereichen, welche in Endo-, Meso- und Epi-Bereiche aufgeteilt wurden und gescannt und analysiert wurden durch einen mit MPLAS-500 ausgestatteten Computer. Jede Probe wurde mit Gemisa für Hi stologie, von Kossa für Osteoid und Tetrazyklin für Fluoreszensaufnahmen gefärbt. Histomorphometriestudien umfassten trabeculares Knochenvolumen (TBV), Tetrazyklineinzelsignal (STS), Tetrazyklindoppelsignal (DTS), STS/DTS-Verhältnis, Trabecularosteoidoberfläche (TOS), mittlere Osteodoberflächenbreiten (Mean Osteoid Surface Width MOSW), Mineralisierungszeit, Knochenrekonstruktionszeit, Knochenoberfläche, Knochenresorptionsoberfläche, Mineralienablagerungsrate (MAR), angepasste Mineralienablagerungsrate (iMAR).
(4-e). Die Ergebnisse des Experiments wurden wie folgt beschrieben:
(4-e-i). Dosierung für 40 Tage nach 30 Tagen nach Ovariektomie:
In der ovariektomisierten Gruppe (70 Tage nach Ovariektomie) war die Architektur der Trabeculae unterhalb der Epiphysen des distalen Femurendes sogar noch poröser, dünner und irregulär. Die Osteoide auf der Trabeculaoberfläche waren ersichtlich und Knochenbildung und Wiederaufbau waren aktiv. Es war ein typischer Phenotyp mit hohem Knochenturnover. Dosierung für 40 Tage stellte zwar nicht wieder die Niveaus der scheinoperierten Kontrollen her, im Vergleich zu der ovariektomisierten Gruppe war die Dichtigkeit und Verbindung der Trabeculae signifikant gesteigert.
(4-e-ii). Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie:
In der scheinoperierten Gruppe war die Architektur der Trabeculae unterhalb der Epiphysen des distalen Femurendes reif, dicht, gleichmäßig dick, wie in 7 gezeigt. In der ovariektomisierten Gruppe (100 Tage nach Ovariektomie) war die Architektur der Trabeculae unter den Epiphysen des distalen Femurendes sehr porös, dünn und unregelmäßig dick, mit vielen Sackgassen-Enden der Trabeculae und hoher Menge an Osteoid auf den Trabeculaeoberflächen. Dies war ein Osteoporosephenotyp mit hohem Knochen-Turnover, wie in 8 gezeigt.
Wie in 9 gezeigt war nach Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, die Architektur der Ovariektomie, die Architektur der Trabeculae unterhalb der Epiphysen des distalen Femurendes vergleichbar mit der scheinoperierten Kontrolle. Die Trabeculae waren untereinander verwoben mit dichter und gleichmäßiger Dicke. Das Osteoid auf den Trabeculaoberflächen war ähnlich dem der Kontrollen. Knochenwiederherstellung war nicht aktiv wie in der ovariektomisierten Gruppe.
(4-e-iii).
Wie in Tabelle 4 gezeigt, war die Femur BMD der Gruppe mit 70-tägiger Dosierung auf das Niveau der scheinoperierten Gruppe wiederhergestellt.
(4-e-iv). Histomorphometrie:
Wie in Tabelle 5 gezeigt, waren die Effekte der vorliegenden Erfindung auf Histomorphometrie von Osteoporose wie folgt zusammenzufassen:
TBV: Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, TBV war auf das Niveau der scheinoperierten Gruppe wiederhergestellt.
STS: Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, STS war auf das Niveau der scheinoperierten Gruppe wiederhergestellt.
DTS: Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, DTS war auf das Niveau der scheinoperierten Gruppe wiederhergestellt.
STS/DTS Verhältnis: Das STS/DTS Verhältnis unterschied sich nicht signifikant unter den drei Gruppen.
TOS: TOS war höher in der ovariektomisierten Gruppe als in der scheinoperierten Gruppe; TOS in der Gruppe mit Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, war höher als in der scheinoperierten Gruppe und war ähnlich der ovariektomisierten Gruppe.
MOSW: MOSW in der ovariektomisierten Gruppe und Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, war signifikant breiter als in der scheinoperierten Gruppe.
Mineralisationszeit: Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Gruppen.
Knochenwiederaufbauzeit: Knochenwiederaufbauzeit der scheinoperierten Gruppe und der Gruppe mit Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie war signifikant länger als in der ovariektomisierten Gruppe.
Knochenoberfläche: Die Knochenoberfläche der Ovariektomie-Gruppe und der für 70 Tage dosierten Gruppe, 30 Tage nach Ovariektomie, war signifikant größer als für die scheinoperierte Gruppe.
Knochenresorptionsfläche: Die Knochenresorptionsfläche der Gruppe mit Ovariektomie und Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie war signifikant größer als in der scheinoperierten Gruppe. Die Knochenresorptionsoberfläche der Gruppe mit Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, war signifikant größer als bei der ovariektomisierten Gruppe.
MAR: Die MAR der Gruppen Ovariektomie und Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie war schneller als bei der scheinoperierten Gruppe. MAR der ovariektomisierten Gruppe war schneller als bei der Gruppe mit Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie.
iMAR: iMAR für die Gruppe mit Dosierung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie war geringer als für die ovariektomisierte Gruppe und stellte die Rate der scheinoperierten Gruppe wieder her. Es konnte deutlich gezeigt werden, dass die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung in der Lage war, Knochenbildung und Knochenresorption zu erreichen. Die Kräuterzusammensetzung der vorliegenden Erfindung stimulierte Osteoblastenbildung und Osteoid- und Mineralablagerung in der Matrix. Die Knochen-Metabolismusparameter, TBV, STS, DTS, Knochenwiederaufbauzeit und iMAR wurden bis auf die Niveaus der scheinoperierten Gruppe nach Dosierung des Pulvers D der vorliegenden Erfindung für 70 Tage, 30 Tage nach Ovariektomie, wiederhergestellt.
Experiment 5. In-vivo-Versuch: Analgesischer Effekt von durch Essigsäure induziertem Schmerz in Mäusen.
Literaturstellen

Peripheral and preemptive opiod antinociception in a mouse visceral pain model. Pain, 2001, 89(2-3): 221–227.
Preliminary studies on the analgesic activity of latex of Caloptropris procera. J. Ethnopharmacol. 2000, 73(1-2): 307–311.
Studies on the anti-inflammatory and related pharacological properties of the aqueous extract of Bridelia ferruginea stem bark. J. Ethnopharmacol. 2000, 71(1-2): 153–160.

72 Mäuse des Quen-ming Stamms mit Körpergewicht von 18–22 g, halb männlich und halb weiblich, wurden in sechs Gruppen aufgeteilt. Sie fasteten über Nacht, dann wurde ihnen verabreicht: Kochsalzlösung, 0,2 g pro kg Aspirin, Rohmaterialäquivalent von 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 g (entspricht 0,06, 0,12, 0,24, 0,48 g des Pulvers B)/kg Körpergewicht (wie in Beispiel 2 hergestellt).
Eine Stunde nach Dosierung wurden den Mäusen intraperitunial 0,2 ml einer 0,3%igen Essigsäurelösung injiziert. Die Abdominalverdrehungen in 20 Minuten wurden als Maß für den Analgesie-Effekt festgehalten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Die vorliegende Erfindung zeigt einen signifikanten analgesischen Effekt bei durch Essigsäure induzierten Abdominalverdrehungen in Mäusen. Bei einem Rohmaterialäquivalent von 1,0, 2,0, 4,0 g/kg des Pulvers B gab es eine signifikante Abnahme der Anzahl von Abdominalverdrehungen. Das Rohmaterialäquivalent von 0,5g/kg von Pulver B verringerte die Anzahl von Abdominalverdrehungen, war aber nicht statistisch signifikant. Dies wie darauf hin, dass Pulver C der vorliegenden Erfindung einen schmerzlindernden Effekt hat.
Experiment 6. In-vivo-Versuch. Unterstützung der Bewegungsaktivität von Mäusen bei Schwimmen unter Belastung.
Literaturstellen

The effect of swimming on bone remodeling and composition in young adult rats. Calcif. Tissue Int., 1990, 47(3):173–177.
Effects on exposure to hypobaric-hypoxia on body weight, muscular and hematological characteristics, and work performance in rats. Jpn. J. Physiol., 1997, 47(1): 51–57.
Pharmacological study on Agkistrodon blomhoffii BOIE. V. Anti-fatigue effect of the 50% ethanol extract in acute weight-loaded forced swimming-treated rats. Biol. Pharm. Bull., 1996, 19(1):62–66.

72 Mäuse des Quen-ming Stammes mit einem Körpergewicht von 18–22 g, zur Hälfte männlich und zur Hälfte weiblich, wurden in sechs Gruppen aufgeteilt. Sie fasteten über Nacht, dann wurde ihnen Kochsalzlösung, 3g/kg Ku-Su-Kun bzw. ein Rohmaterial äquivalent von 0,5, 1,0, 2,0, 4,0 g (entspricht 0,06, 0,12, 0,24, bzw. 0,48 g Pulver B)/kg Körpergewicht (wie in Beispiel 2 hergestellt) für drei aufeinander folgende Tage gegeben. Ku-Su-Kun ist eine zugelassene Kräuterzusammensetzung zur Behandlung von Osteoporose in China. Ku-Su-Kun besteht aus Epimedii Herba, Rehmanniae Preparata Radix, Astragali Radix, Salviae Miltiorrhizae Radix, Rhizoma Drynariae.
Eine Stunde nach der letzten Dosierung wurde der Schwanz der Mäuse mit einem Gewicht von 2 g belastet. Die Mäuse wurden dann in einen Wasserbehälter mit Wasser von 15 cm Tiefe bei 25°C verbracht. Als Schwimm-Erschöpfungszeit wurde der Zeitpunkt gemessen, an dem die Nase der Mäuse länger als 10 Sekunden unterhalb der Wasseroberfläche blieb.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Das Pulver B der vorliegenden Erfindung zeigt eine beträchtliche Verstärkung der Bewegungsaktivität. Bei Dosierungen des Rohmaterialäquivalents von 0,5, 1,0, 2,0 bzw. 4,0 g/kg Pulver B war die Zeit bis zur Erschöpfung signifikant verlängert, verglichen mit der Kochsalz kontrolle. Dies wies darauf hin, dass das Pulver B der vorliegenden Erfindung die Bewegungsaktivität verstärkte und einen Anti-Ermüdungseffekt hat.
Experiment 7. In-vivo-Versuch: Orale akute Toxizität in Ratten.
24 Spraque-Dawley-Ratten mit einem Körpergewicht von 200 g, jeweils halb männlich und halb weiblich, wurden mit Hilfe von LIMS in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe bildete die Vehikel-Kontrolle, die andere Gruppe die vorliegende Erfindung mit Pulver C (wie in Beispiel 3 hergestellt, behandelte Gruppe). Pulver C wurde als wässrige Lösung mit einer Konzentration von 250 mg/ml in 1 % Carboxymethylcellulose (CMC) hergestellt. 10 ml/kg der Pulver C Suspension (behandelte Gruppe) der vorliegenden Erfindung bzw. 1 % CMC (Kontrollgruppe) wurde per Gavage mit einem Abstand von 2 Stunden täglich gegeben. Die Ratten wurden zweimal täglich bezüglich Mortalität, Morbidität und klinischen Erscheinungen über 14 Tage beobachtet. Das Körpergewicht wurde einmal pro Woche gemessen.
Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Während der vierzehntägigen Dauer der Untersuchung zeigten sich keine klinisch nachweisbaren behandlungsbezogenen Toxizitäten. Die Körpergewichte bei sowohl männlichen als auch weiblichen Ratten in der behandelten Gruppe waren vergleichbar mit denen der Kontrolle. Bei der Leichenschau gab es keine sichtbaren Lesionen in Organen und Gewichten in beiden Gruppen. Bei einer Dosis von 5000mg/Kg der vorliegenden Erfindung gab es keinen mit der Behandlung verbundenen toxischen Effekt. Dementsprechend wurde die vorliegende Erfindung als (praktisch nicht toxisch) gemäß Loomis klassifiziert (Loomis TA. Essentials of Toxicology. Philadelphia: Lea&rFiebiger, 1978).
Experiment 8. In-vivo-Versuch. Orale chronische Toxizität in Ratten.
6–8 Wochen alte Wistar-Ratten (vom Research Center of Laboratory Animals, China Medical Institute, Zertifikat: SCXR1100-0006) mit einem Körpergewicht von 80–100 g, jeweils zur Hälfte männlich und weiblich, wurden für eine Woche in Quarantäne gehalten.
Methoden

(a). Vehikelkontrollgruppe: 1% CMC.
(b). Mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelte Gruppe: 16g Rohmaterialäquivalent (entspricht 1,92 g Pulver B)/Kg Körpergewicht.
Pulver B (hergestellt wie in Beispiel 2) der vorliegenden Erfindung wurde in 1% CMC bei einer Konzentration von 1,333 g Rohmaterial äquivalent/ml hergestellt. 1,2 ml/100g Körpergewicht wurde einmal täglich durch Gavage gegeben, sechs Tage pro Woche für drei aufeinander folgende Monate.
(c). Tiere: Die Ratten wurden in zwei Gruppe entsprechend Körpergewicht und Geschlecht aufgeteilt. Wasser und Nahrung wurden ad libitum zugeführt. Körpergewicht und Nahrungsaufnahme wurden einmal pro Woche gemessen. Am Ende der drei Monate wurden die Ratten geopfert. Blut wurde zur Analyse von Hämatologie und Blutwerten entnommen. Die Organe wurden gewogen und für histopathologische Untersuchungen aufbereitet.

Ergebnisse
(1). Allgemeine Beobachtung der vitalen Lebenszeichen:
Während der Dauer des Experiments war die Aktivität, das Erscheinungsbild, Ausscheidungen und Nahrungsaufnahme der Ratten normal.
Änderungen des Körpergewichts von männlichen Ratten: Das Körpergewicht der Vehikelkontrollgruppe nahm zu von 121±2,2g (nullte Woche) bis 365±20,0g (zwölfte Woche); das Gewicht der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe nahm von 123±2,7 g (nullte Woche) bis 157,5±23,3 g (zwölfte Woche) zu.
Änderungen des Körpergewichts von weiblichen Ratten: Das Körpergewicht der Vehikelkontrollgruppe nahm von 119±4,2 g (nullte Woche) auf 231±16,4 g (zwölfte Woche) zu; das Gewicht der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe nahm von 117±2,7 g (nullte Woche) auf 220±10,8 g (zwölfte Woche) zu.
Es gab keine signifikanten Unterschiede der Körpergewichtsveränderungen zwischen den Kontrollen und den mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppen.
(2) Hämatologie: Wie in Tabelle 9 gezeigt gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe bezüglich HB, RBC, WBC, PLT und CT.
(3) Blutwerte: Wie in Tabelle 9 gezeigt gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe bezüglich sämtlicher Parameter der Blutwerte.
(4) Effekte auf den Organindex der Ratten: Alle Ratten wurden am Ende der drei Monate geopfert. Die Nassgewichte der Organe wurden gemessen. Die Nassgewichte wurden durch das Körpergewicht geteilt, um den Organgewichtsindex zu erhalten, welcher ausgedrückt wurde als Nassgewicht (Gramm) pro 100g Körpergewicht. Wie in Tabelle 9 gezeigt gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe, die mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelt wurde, bezüglich des Organgewichtsindexes.
5. Histopathologische Untersuchung der Organe:
Die Ratten wurden nach dreimonatiger Dosierung geopfert. Die wichtigen Organe wurden für histopathologische Untersuchungen präpariert, einschließlich Herz, Leber, Milz, Niere, Blase, Lunge, Magen, Duodenum, Ileum, Kolon, Pankreas, Uterus, Eierstöcke, Testis, Epididymis, Prostata, Gehirn, Hypophyse, Schilddrüse, Nebenniere, Thymus, Lymphknoten und Knochenmark. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe bezüglich der Histologie keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und der mit Pulver B der vorliegenden Erfindung behandelten Gruppe bezüglich der Histologie der untersuchten Organe. Durch orale Gabe von sechzehn Gramm Rohmaterial equivalent an Pulver B von Beispiel 2 über drei Monate zeigten die allgemeinen Vitalzeichen, Hemathologie, Blutwerte, und histopathologische Untersuchungen der wichtigen Organe, dass die versuchten Parameter keine Anzeichen von Arzneimittel Toxicitid aufweisen. Diese Dosierung entsprach der hundertsechsfachen für Menschen vorgeschlagenen Menge.
In Zusammenfassung der erwähnten biologischen Versuche wird darauf geschlossen, dass die vorliegende Erfindung eine nicht-toxische Kräuterzusammensetzung ist. Sie kann die BMP-2 Expression und Osteoblasten Prolieferation in Vitro stimulieren. In Vivo hat die vorliegende Erfindung einen analgesischen Effekt und Bewegungsaktivierungseffekt. Sie kann auch die Knochenfrakturheilungen unterstützen und Osteoporose behandeln. Die vorliegende Erfindung ist brauchbar zur Prevention und Behandlung von Knochenfrakturen Osteoporose.
Der Fachmann erkennt, dass andere Ausführungsformen, Verbesserungen, Details und Verwendungen entsprechend dem Sinn und Geist der obigen Offenbarung im Umfang dieser Erfindung gemacht werden können.
Tabelle 1 - Einfluss von Pulver C auf die Promotoraktivität da Knochenwachstumsfaktors 2 (BMP-2)
Tabelle 2 - Messung von Leuchtstoffen und Luziferaseaktivität in PULVER
Tabelle 3 - Einfluss von Pulver C auf Förderung der Osteoblastzunahme
Tabelle 4 - BMD des rechten Oberschenkelknochens von Ratten (70 Tage)
Tabelle 5 - Vergleich der Histomorphometrie der Kontollgruppe, Ovarektomie und Ovarektomie + Dosierung für 70 Tage
Tabelle 6 - Analgesieeffekt bei durch Essigsäure indozierter Abdominalverdrehung in Mäusen (Mittelwert ± SD, n=12)
Tabelle 7 - Bewegungseffekt auf Dauer bis zur Erschöpfung bei belastetem Schwimmen in Mäusen (Durchschnitt ± SD, n=12)
Tabelle 8 - Studie der oralen akuten Toxicität in Ratten-Mortalität, klinische Zeichen und Leichenschau

N/N:

Tote Ratten/beobachtete Ratten.

Nein:

wurde nicht beobachtet.

KLB:

keine Lesionen beobachtet.

Tabelle 9 - Orale chronische Toxizitätsstudie in Ratten – Blut, Blutwerte, Organgewichtsindex (Mittelwert ± SD)

Anmerkung des Übersetzers: Die Fußnoten in Tabelle 1 ist nicht in der chinesischen PCT Anmeldung enthalten, ist aber evtl. Tabelle 1 integriert. Da die englische Übersetzung der chinesischen PCT Anmeldung diese Fußnote enthielt, wurde sie vorsorglich mitübersetzt.

Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose verwendet werden kann. Die Zusammensetzung besteht aus den folgenden Pflanzen, einschließlich chinesischer Arzneimittel und Kräuterheilmittel: Semen lactucae sativae 0,0–1, Lignum aquilariae resinatum 2–20, Fructus oryzae 1–5, Resina boswelliae carterii 0,1–1, Rhizoma atractylodis macrocephalae 0,1–1 und Semen cuscutae 0,1–1. Die gesamten oder spezifische Teile der Pflanzen können verwendet werden, um die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung herzustellen; bevorzugte Pflanzen sind Harz enthaltendes Aquilariae lignum und Harz enthaltendes Boswelliae carterii. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann formuliert werden zu Pastille, Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalat.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung aufweisend Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem Verhältnis von 0,1–1:2–20:1–5:0,1–1:0,1–1:0,1–1.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei welchem das Verhältnis vorzugsweise 0,5:5:2:0,5:0,25:0,5 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Lignum aquilariae resinatum aus Harz enthaltendem Lignum aquilariae resinatum ist
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Resina boswelliae carterii aus Harz enthaltendem Resina boswelliae carterii ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, erhältlich durch Formulierung mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln zu verschiedenen entsprechenden Darreichungsformen durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, erhältlich durch Formulierung mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln zu Pastille, beschichteter Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalationsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, hergestellt durch folgendes Verfahren: (1). Extrakt aus Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae; (2). Mischen einer effektiven Menge des Extraktes mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln zu verschiedenen in der Technik bekannten Darreichungsformen.
Verfahren zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, aufweisend Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem Verhältnis von 0,1–1:2–20:1–5:0,1–1:0,1–1:0,1–1.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 8, aufweisend Semen lactucae sativae, Lignum aquilariae resinatum, Fructus oryzae, Resina boswelliae carterii, Rhizoma atractylodis macrocephalae und Semen cuscutae in einem bevorzugten Verhältnis von 0,5:5:2:0,5:0,25:0,5.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, aufweisend Harz, welches Lignum aquilariae resinatum enthält.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder 9, aufweisend Harz, welches Resina boswelliae carterii enthält.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 7 mit pharmazeutisch brauchbaren Exzipienten, Trägern oder Verdünnungsmitteln zu verschiedenen entsprechenden Darreichungsformen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 12, bei welchem die entsprechenden Darreichungsformen Pastille, Tablette, beschichtete Tablette, Kapsel, Weichkapsel, Granulat, Pulver, Pille, Lösung, Emulsion, Injektionslösung, Injektion, Salbe, Creme, Spray oder Inhalationsmittel sind.
Verfahren zur Prävention und Behandlung von Knochenfrakturen und Osteoporose durch Verabreichung einer effektiven Dosis der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß Anspruch 1 an Patienten.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei die Darreichung oral, durch intramuskuläre Injektion, durch intravenöse Injektion über Mukusalmembranen oder topisch erfolgt.