DE10252245A1

DE10252245A1 - Verfahren zur Expression und Sekretion von Proteinen mittels der nicht-konventionellen Hefe Zygosaccharomyces bailii

Info

Publication number: DE10252245A1
Application number: DE10252245A
Authority: DE
Inventors: Minoska Valli; Paola Branduardi; Lilia Alberghina; Danilo Porro
Original assignee: DANILO PORRO UNI DEGLI STUDI D; Universita degli Studi di Milano
Current assignee: DANILO PORRO UNI DEGLI STUDI D; Universita degli Studi di Milano
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2004-05-27
Also published as: EP1558722B1; DE60320573T2; DE60320573D1; AU2003283362A1; ATE393210T1; WO2004042036A3; US20070065905A1; EP1558722A2; WO2004042036A2

Abstract

Hierin wird ein Verfahren für die Herstellung von Proteinen offenbart. Das Protein wird von einer Hefe, die zur Art Zygosaccharomyces bailii gehört, exprimiert. Die Hefe sekretiert das Protein in das Kulturmedium, woraus es isoliert wird, wodurch das Reinigungsverfahren vereinfacht wird. Vorzugsweise wird die Hefe in chemisch definiertem Medium kultivier, wodurch der Reinigungsprozess weiterhin maßgeblich vereinfacht wird.

Description

Die Massenproduktion von Proteinen durch technisch veränderte Organismen (rekombinant, mutagenisiert, ...) stellt eine Alternative zur Extraktion der Proteine aus natürlichen Quellen dar. Natürliche Quellen von Proteinen sind oft begrenzt und die Konzentration der gewünschten Produkte ist üblicherweise niedrig, so dass eine Extraktion oft kostenintensiv oder sogar unmöglich ist. Im übrigen birgt die Extraktion die Gefahr von giftigen oder infektiösen Verunreinigungen, abhängig von der natürlichen Quelle des Proteins.
Mit dem Auskommen des molekularen Klonierens Mitte der 70-iger Jahre wurde es möglich, fremde Proteine in neuen Wirtsorganismen herzustellen. Rekombinante DNA-Technologien (rDNA) (Genetic-, Protein- und Metabolic-Engineering) erlaubt die Herstellung einer großen Auswahl an Peptiden und Proteinen mittels natürlicherweise nicht produzierenden Zellen.
Tatsächlich waren die ersten Biotech-Produkte auf dem Weltmarkt, die mittels rDNA-Technik hergestellt wurden, pharmazeutische Produkte (z. B. Insulin, Interferone, Erythropoietin, Vakzin gegen Hepatitis B) und industrielle Enzyme (z. B. für die Behandlung von Nahrungsmitteln, Futtermitteln, Waschmitteln, Papier oder Zellstoff sowie für die Medizin).
Der weltweite Absatz der Top-20 rekombinanten, pharmazeutischen Produkte betrug im Jahre 2000 etwa 13 Milliarden Euro, während der weltweite Markt für industrielle Enzyme ungefähr 2 Milliarden Euro betrug und voraussichtlich ungefähr 8 Milliarden Euro im Jahre 2008 erreichen wird.
Im Wesentlichen stellen Mikroorganismen sowie kultivierte Zellen höherer Organismen (wie Säugetiere, Insekten oder Pflanzen) die denkbaren Wirte für die Herstellung heterologer sowie homologer Proteine dar.
Mehrere Verfahren für die Herstellung von Proteinen unter Verwendung von Säugerzellkulturen wurden entwickelt und viele auf derartige Weise hergestellte Proteine sind auf dem Markt, darunter verschiedene Vakzine, monoklonale Antikörper, Interferone, Blutfaktoren, Urokinase, tPA, Hormone sowie Wachstumsfaktoren.
Der Hauptvorteil von Säugerzellkultur basierten Expressionssystemen ist die Fähigkeit der Säugerzellen, die Proteine auf die richtige Art und Weise zu prozessieren (korrekte Faltung, adäquate post-translationale Modifizierungen, korrekte Glycosylierung, spezifische proteolytische Aktivitäten etc.) Ein von ursprünglich von einem Säugetier (Mensch) abstammender rekombinanter DNA exprimiertes, kloniertes Protein wird üblicherweise korrekt prozessiert und gefaltet und häufig ins Medium sekretiert, was eine schnelle Gewinnung und Reinigung ermöglicht.
Andererseits sind die Produktionskosten häufig sehr hoch auf Grund eines niedrigen Expressionslevels, der Kosten der Mediumskomponenten, sehr geringer Wachstumsraten und anspruchsvoller Kulturbedingungen. Im Weiteren birgt die Produktion in Säugetierzellen die Gefahr giftiger oder infektiöser Verunreinigungen des Produktes.
Mikroorganismen (prokaryotisch, als auch eukaryotisch) sind vorteilhafte Wirte für die Herstellung von Proteinen auf Grund hoher Wachstumsraten und im Allgemeinen einfacher genetischer Manipulierbarkeit. Allerdings fehlt insbesondere bakteriellen Wirtsorganismen die Fähigkeit zur korrekten Protein-Prozessierung und in vielen Fällen werden heterolog produzierte Proteine in sog. „inclusion bodies" innerhalb der bakteriellen Zellen akkumuliert, woraufhin die Proteine verloren sind, weil ihre enzymatische Aktivität in den meisten Fällen nicht rekonstituiert werden kann. Aufgrund ihrer fehlerhaften Struktur ist eine Verwendung derartiger Proteine für die Behandlung von Menschen von vornherein ausgeschlossen.
Hefezellen als Wirtsorganismen vereinen die Vorteile von einzelligen Organismen (leichte genetische Manipulierbarkeit und Wachstum) mit der Fähigkeit zur Protein-Prozessierung wie sie für eukaryotische Organismen typisch ist (Proteinfaltung, Zusammenfügung und post-translationale Modifikationen), zusätzlich zum Fehlen von Endotoxinen sowie oncogener oder viraler DNA.
Seit Beginn der frühen 80-iger Jahre ist der größte Teil mittels Hefe hergestellter rekombinanter Proteine in Saccharomyces cerevisiae exprimiert worden (Hitzemann, R. A. et al., 1981, Nature 293, 717 – 22). Diese Auswahl wurde bedingt durch die Vertrautheit der Molekularbiologen mit dieser Hefe und dem akkumulierten Wissen über ihre Genetik und Physiologie. Im Weiteren besitzt S. cerevisiae GRAS-Status („generally regarded as safe"). Allerdings ist diese Hefe kein optimaler Wirt für die Herstellung fremder Proteine in großem Umfang, insbesondere aufgrund ihrer Ansprüche an die Fermentation. Im Speziellen zeigt das Wachstum von S. cerevisiae einen sehr ausgeprägten „Crabtree-Effekt", d. h. Fed-batch-Kultur ist notwendig, um hohe Zelldichten zu erreichen (siehe beispielsweise Porro, D., et al., 1991, Res. Microbiol. 142, 535–9). Im Weiteren ist diese Hefe vergleichsweise empfindlich betreffend ihre Kulturbedingungen, wie z. B. pH-Wert und Temperatur. Daher ist ihre Kultur kompliziert und erfordert eine hoch entwickelte Ausrüstung. Zusätzlich sind Proteine, die mittels S. cerevisiae hergestellt wurden, oft hyper-glycosyliert und häufig wird eine Retention der Produkte im periplasmatischen Raum beobachtet (Reiser, J. et al., 1990, Adv. Biochem. Eng./Biophys. 43, 75–102 und Romanos, M. A. et al., 1992, Yeast 8, 423–88). Im Weiteren wird auf Grund der teilweisen Retention der Proteine in S. cerevisiae häufig ein Anteil der Proteine abgebaut. Diese Abbauprodukte sind im Allgemeinen sehr schwer vom gewünschten Produkt zu entfernen.
Nachteile wie diese haben zr Suche nach alternativen Wirten geführt, so wurde die Entwicklung von Expressionssystemen in den sog. nicht-konventionellen Hefen begonnen, unter Ausnutzung der ausgeprägten Biodiversität unter den Hefen. Bekannte Beispiele sind Hansenula polymorpha (Buckholz, R. G. et al., 1991, Bio/Technology 9, 1067–72); Pichia pastoris (Fleer, R., 1992, Curr. Opin. Biotechnol. 3, 486–96); Kluyveromyces lactis (Gellissen, G. et al., 1997, Gene 190, 87–97); Yarrowia lipolytica (Muller, S. et al., 1998, Yeast 14, 1267–83) unter anderen.
Eine weitere in dieser Hinsicht erforschte Hefe-Gattung ist Zygosaccharomyces. Elf Arten, die evolutionär verwandt zu S. cerevisiae und nicht weit von K. lactis zu sein scheinen, wurden bisher klassifiziert (James S. A. et al., 1994, Yeast 10, 871–81, Steels, H., et al., 1999, Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 319–27 und Kurtzmann, C. P., et al., 2001, FEMS Yeast Research 1, 133–8). Für industrielle Anwendungen sind einige der Zygosaccharomyces Arten auf Grund einer außergewöhnlichen Resistenz gegenüber verschiedenen Stressfaktoren potentiell interessant. So ist beispielsweise Z. rouxii als Salz-tolerant (osmophil) bekannt und Z. bailii kann hohe Zuckerkonzentrationen und saure Umgebungen, sowie relativ hohe Wachstumstemperaturen tolerieren (Makdesi, A. K. et al., 1996, Int. J. Food Microbiol. 33, 169–81 und Sousa, M. J. et al., 1996, Appl. Environm. Microbiol. 62, 3152–7).
Allerdings sind die zugänglichen Daten in Bezug auf die Molekularbiologie dieser Hefen sehr dürftig. Während Expression und Sekretion eines heterologen Proteins in Z. rouxii erreicht werden konnte (Ogawa, Y. et al., 1990, Agric. Biol. Chem. 54, 2521–9), wurden für Z. bailii nur die ersten molekularen Werkzeuge zur Transformation dieser Hefe und zur intrazellulären Expression heterologer Proteine entwickelt (WO 00/41477). Nachdem die Aufreinigung intrazellulärer Proteine sehr aufwendig ist, verbleibt die Verwendbarkeit dieses Wirtsorganismus für industrielle Produktionsprozesse sehr beschränkt. Im Übrigen werden häufig viele der spezifischen Vorteile dieser nicht-konventionellen Hefen in Bezug auf ihre Ansprüche an die Kultur, durch unerwartete negative Eigenschaften oder unlösbare Probleme in ihrer Handhabbarkeit zu Nichte gemacht. In vielen Fällen sind keine brauchbaren Verfahren zur Transformation der Organismen oder zur Expression heterologer Gene bekannt oder deren Entwicklung scheitert aufgrund ungünstiger natürlicher Eigenschaften der fraglichen Organismen. Die sekretorischen Fähigkeiten bürden der Herstellung von Proteinen im industriellen Maßstab weitere Probleme auf. So verkompliziert sich die Isolation des Produktes maßgeblich, wenn der Organismus keine effiziente Sekretion des gewünschten Proteins erlaubt. Zusätzlich sind einige sehr interessante Produkte wie Interleukin 1-β äußerst giftig für die Zellen, solange sie intrazellulär lokalisiert sind (Fleer, R. et al., 1991, Gene 107, 285–95). Die Herstellung derartiger Proteine ist daher nur möglich, wenn der Wirtsorganismus über ein sehr wirksames sekretorisches System verfügt, das ausgenutzt werden kann.
Weitere Probleme rühren von der potentiell anderen Codon-usage oder einer anderen Codon-Häufigkeit her, die die Expression heterologer Gene in solchen Organismen massiv beeinträchtigen können.
In Anbetracht des Standes der Technik war es nun Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein neues, einfaches und wirtschaftliches Verfahren für die Herstellung von Proteinen zur Verfügung zu stellen. Abgesehen von der Kosteneffizienz sollte das Verfahren einfach durchzuführen sein und die Herstellung hoch reiner Proteine in hoher Ausbeute ermöglichen.
Gelöst werden diese sowie weitere, nicht explizit genannten Aufgaben, die jedoch aus den hierin einleitend diskutierten Zusammenhängen ohne weiteres ableitbar oder erschließbar sind, durch den Gegenstand, der in den Ansprüchen der vorliegenden Erfindung definiert ist.
Ein vorteilhaftes Verfahren für die Herstellung von Proteinen wird durch das in Anspruch 1 definierte Verfahren zur Verfügung gestellt. Dieses Verfahren umfaßt das Kultivieren eines Zygosaccharomyces bailii Stammes, Expression des Proteins, Sekretion und anschließende Isolation des Proteins. Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft dadurch, dass Z. bailii mit hoher Ausbeute in chemisch definiertem Medium ohne die Zugabe komplexer Bestandteile, die mühsam vom produzierten Protein wieder abgetrennt werden müssen, kultiviert werden kann. Überraschenderweise ist die sekretorische Kapazität dieser Hefe in chemisch definiertem Medium maßgeblich höher als die sekretorische Kapazität von S. cerevisiae unter identischen Bedingungen.
Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die überraschende Tatsache, dass das von Z. bailii produzierte Protein, nicht nur bereitwillig, sondern auch praktisch zur Gänze sekretiert wird, was für S. cerevisiae unter identischen Bedingungen nicht der Fall ist. Aufgrund der effizienten Sekretion des gewünschten Proteins durch Z. bailii, kommt es auch nicht zu einem Abbau des Proteins. Daher wird die Reinigung des Produktes maßgeblich vereinfacht.
Weitere bedeutende Vorteile von Z. bailii als Wirtsorganismus für die Proteinherstellung und insbesondere für die Herstellung von heterologen Proteinen sind eine natürlicherweise günstige Codon-usage, wie aus den hierin dargestellten Beispielen abgeleitet werden kann, und die vergleichsweise niedrigen Ansprüche an die Kulturbedingungen. Dies beruht im Speziellen auf die hohe Säure- und Temperaturtoleranz, sowie dem schwach ausgeprägten Crabtree-Effekt, der eine Kultur mit bereits anfänglich hohen Zuckerkonzentrationen (d. h. Batch- anstatt Fed-batch-Kultur) und das Weglassen hoch komplizierter Regulierungsmechanismen der Kulturbedingungen wie Temperatur oder pH ermöglicht. Dementsprechend erlaubt dieses Verfahren eine kosteneffiziente Herstellung von Proteinen in einfacher An und Weise, wobei selbst in industriellem Maßstab Proteine hoher Reinheit erhalten werden können.
Der Ausdruck „Expression" eines Proteins durch eine Wirtszelle ist dem Fachmann gut bekannt. Üblicherweise umfasst die Expression eines Proteins die Transkription einer DNA-Sequenz in eine mRNA-Sequenz, gefolgt von der Translation der mRNA-Sequenz in ein Protein. Eine detailliertere Beschreibung dieses Prozesses kann beispielsweise in Knippers, R. et al., 1990, Molekulare Genetik, Kapitel 3, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, gefunden werden.
Der Ausdruck „Sekretion" eines Proteins, wie in der Fachwelt bekannt, bedeutet Translokation des produzierten Proteins vom Inneren der Zelle nach außerhalb der Zelle, wobei das Protein im Kulturmedium akkumuliert wird. Eine detailliertere Beschreibung dieses Prozesses kann beispielsweise in Stryer, L., 1991, Biochemie, Kapitel 31, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, New York, gefunden werden.
Das Protein kann jedes in der Fachwelt bekannte Protein sein, für das eine industrielle Herstellungsweise wünschenswert wäre. Beispielsweise kann das Protein im pharmazeutischen Gebiet brauchbar sein, wie u. a. in der Medizin oder als Impfstoff, oder in prä-klinischen oder klinischen Studien (Beispiele sind Wachstumshormone, Tissue-Plasminogen-Activator (tPA), Hepatitis B Impfstoff, Interferone, Erythropoietin). Das hergestellte Protein kann auch in der Industrie verwendbar sein, z. B. in der Nahrungsmittelproduktion (beispielweise β-Galactosidase, Chymosin, Amylasen, Glucoamylasen, Amyloglucosidasen, Invertase) oder in der Textil- oder Papierproduktion (Proteasen, Amylasen, Zellulasen, Lipasen, Katalsen, etc.). Enzyme sind u. a. in Waschmitteln verwendbar (Proteasen, Lipasen und oberflächenaktive Substanzen („surfactants")) und im Übrigen sind ihre Eigenschaften der Stereospezifität in einer großen Anzahl von Biokonversionen nutzbar, wobei eine gewünschte chirale Verbindung erhalten werden kann. Eine weitere vielversprechende Anwendung rekombinanter Enzyme, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, ist die Entwicklung von Biosensoren.
Die sekretierten Proteine können in ihrer Größe (Molekulargewicht) sehr variabel sein. Das hierin beschriebene Verfahren funktioniert sehr gut für sehr kleine Proteine (z. B. IL-1β, 17 kDa, siehe 5), aber auch für relativ große Proteine (z. B. GAA, 67.5 kDA, siehe 8a). Die sekretierten Proteine können Konsensussequenzen für Glycosylierungen enthalten oder auch nicht. Diese Konsensusstellen können natürlicherweise vorkommen, oder durch genetische Manipulation eingeführt worden sein. Abhängig von der angestrebten Verwendung der produzierten Proteine kann es vorteilhaft sein, natürlicherweise vorkommende Konsensusstellen für Glycosylierungen mittels genetischer Manipulation zu entfernen und dabei beispielsweise eine Hyperglycosylierung des Proteins zu verhindern. Es ist auffallend, dass das hierin beschriebene Verfahren zu Proteinen führt, die ihre gewünschten katalytischen Eigenschaften nach der Sekretion erhalten (z. B. GAA, siehe 8a).
In einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Z. bailii Stamm mit einem Vektor transformiert, der eine DNA-Sequenz, die für ein Protein codiert, umfasst, funktionell gebunden an eine Signalsequenz, die zur Sekretion des Proteins führt und weiter funktionell gebunden an einen Promotor, der zur Expression des Proteins führt.
Der Ausdruck „Vektor" bezieht sich auf jedes Agens wie ein Plasmid, Cosmid, Virus, Phage, lineares oder zirkuläres, einzelsträngiges oder doppelsträngiges DNA oder RNA-Molekül, jedweden Ursprungs, das Nukleinsäuresequenzen in eine Wirtszelle einbringen kann. Vorzugsweise kann der Vektor ins Genom integriert oder autonom repliziert werden. Eine derartiger Vektor kann 5'regulatorische Sequenzen oder Promotorregionen und eine DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt derart in eine Zelle einschleusen, dass die DNA-Sequenz in eine funktionelle inRNA transkribiert wird, die translatiert werden kann und dabei exprimiert wird oder nicht. Vorzugsweise ist der Vektor ein extrachromosomales Plasmid. Ein derartiges Plasmid umfasst vorzugsweise autonom replizierende Sequenzen (ARS) und vorzugsweise zusätzlich eine centromerische Sequenz (CEN). Besonders bevorzugt ist das Plasmid, ein 2μ-ähnliches episomales, Multicopy-Plasmid. Ganz besonders bevorzugt ist das Plasmid von einem endogenen episomalen Plasmid aus Z. bailii abgeleitet, wie beispielsweise pSB2 (Utatsu, I. et al., 1987, J. Bacteriol. 169, 5537–45) und ganz besonders bevorzugt von pZB₁ oder pZB₅ (siehe 9).
Das Plasmid pZB₅ wurde aus NCYC 1427 extrahiert und teilweise sequenziert. Dementsprechend umfasst das Plasmid vorzugsweise mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 55, und ganz besonders bevorzugt mindestens 75, und am meisten bevorzugt mindestens 100 Basen von mindestens einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr.: 63, SEQ ID Nr.: 64, SEQ ID Nr.: 65, SEQ ID Nr.: 66, SEQ ID Nr.: 67, SEQ ID Nr.: 68, SEQ ID Nr.: 69, SEQ ID Nr.: 70 oder SEQ ID Nr.: 71.
Hefe Multicopy-Plasmide (auch 2μ oder 2μm ähnliche Plasmide genannt), die aus verschiedenen Hefegattungen oder Arten isoliert wurden, weisen i. A. eine hochkonservierte strukturelle Homologie auf, aber nur eine geringe Sequenzhomologie. Einige regulatorische Elemente wurden als notwendig und ausreichend identifiziert, um ein funktionales Multicopy-Plasmid zu bilden. Diese sind:
die Rekombinase, die die Amplifikation der Plasmide fördert, kodiert durch das FLP Gen. (Blanc H., et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 176, 335–42 und Broach J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–8);
zwei inverted repeats (IR-Sequenzen);
ein einzelner origin of replication (ARS) an der Verküpfungsstelle von einem internal repeat und einer einmaligen Region des Plasmids (Broach J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–8; Brewer B. J. et al., 1987, Cell 51, 463–71; McNeil J. B. et al., 1980, K. Genet. 2, 17–25) und
die regulatorischen Proteine REP1/REP2 (in Z. bailii TFB/TFC genannt), die den Amplifikationsprozess kontrollieren, indem sie die Rekombinaseaktivität in der Zelle durch vermittelte Repression der FLP Genexpression kontrollieren (Broach J. R. et al., 1980, Cell 21, 501–8; Jayaram M. et al., 1983, Cell 34, 95–104).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stammen diese Schlüsselelemente des 2μ Plasmids vorzugsweise von Z. bailii ab, besonders bevorzugt von Z. bailii NCYC 1427 oder ATCC36947. Besonders bevorzugt korrespondieren diese Sequenzen zu SEQ ID Nr.: 71 (IR-ARS), SEQ ID Nr.: 72 (FLP), SEQ ID Nr.: 74 (TFB) und SEQ ID Nr.: 76 (TFC). Die exprimierte Rekombinase und die exprimierten regulatorischen Proteine weisen vorzugsweise die Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr.: 73 (FLP), SEQ ID Nr. 75.: (TFB), bzw. SEQ ID Nr.: 77 (TFC) auf. Vorzugsweise umfasst das Plasmid zusätzlich die homologen upstream Regionen der FLP und TFB/TFC Gene, um eine optimale Kontrolle des Transkriptionslevels zu erhalten.
Besonders bevorzugt ist das Plasmid pEZ₁ (siehe 9).
Vorteilhafterweise umfasst der Vektor einen selektierbaren Marker. Der Ausdruck selektierbarer Marker bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, deren Expression einen Phänotypen verleiht, der es ermöglicht, die Zellen, die diese Nukleinsäuresequenz enthalten, zu identifizieren. Selektierbare Marker umfassen solche, welche eine Resistenz gegenüber giftigen Chemikalien verleihen (= dominante Marker, beispielsweise G418, Hygromycin, Formaldehyd, Phleomecin oder Fluoroacetat, wie reviewed in Van den Berg, M. et al., 1997, Yeast 13, 551–9) oder welche eine Auxotrophie komplementieren (= auxotropher Marker, beispielsweise Uracil, Histidin, Leucin, Tryptophan). Auxotrophe Selektionsmarker können für natürlicherweise auxotrophe Z. bailii Stämme oder auch für Stämme, die durch genetische Manipulation auxotroph gemacht wurden, insbesondere durch (teilweise) Deletion oder Mutagenisierung von essentiellen Genen, z. B. HIS3 (Branduardi, P., 2002, Yeast 19, 1165–70) genutzt werden. Als komplementierende Markersequenzen können homologe Gene von Z. bailii oder heterologe Gene eingesetzt werden. Auxotrophe Marker sind bevorzugt, da dem Medium keine Komponenten zugegeben werden müssen, um den Selektionsdruck während der Kultur aufrecht zu erhalten.
Der Ausdruck „Promotor" oder „Promotorregion" (= „Promotorabschnitt") bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, üblicherweise upstream (5') zu einer kodierenden Sequenz, die die Expression der kodierenden Sequenz kontrolliert, durch Regulation der Herstellung von Boten-RNA (messenger RNA, mRNA), durch die Bereitstellung von Erkennungsstellen („recognition sites") für die RNA-Polymerase und oder andere Faktoren, die notwendig sind für den Beginn der Transkription (Transkriptionsstart) an der korrekten Stelle. Der Promotor kann aus jedem Organismus stammen. Bevorzugterweise stammt der Promotor aus einer Hefe, besonders bevorzugt aus Saccharomyces, Kluyveromyces oder Zygosaccharomyces und ganz besonders bevorzugt aus Zygosaccharomyces bailii. Der Promotor kann konstitutiv, induzierbar, oder reprimierbar sein. Induzierbare Promotoren können – wie jeweils durch den Promotor definiert – durch die Zugabe eines entsprechenden induzierenden Moleküls zum Medium oder einer entsprechenden Änderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie Temperatur oder pH-Wert) induziert werden. Reprimierbare Promotoren können – wie jeweils durch den Promotor definiert – durch die Zugabe eines entsprechenden reprimierenden Moleküls zum Medium oder einer entsprechenden Änderung der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung (wie Temperatur oder pH-Wert) reprimiert werden. Konstitutive Promotoren sind bevorzugt, weil die Verwendung entsprechender reprimierender bzw. induzierender Moleküle oder entsprechende Wechsel der chemischen oder physikalischen Wachstumsumgebung nicht benötigt werden. Vorzugsweise ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe von: Triosephosphat-Isomerase (TPI), Alkoholdehydrogenase 1 (ADH1), Phosphoglyceratkinase (PGK), Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAP), GAL1, GAL10, saure Phosphatase (PHO5), Cytochrome-C-1 (CYC1), kupferbindendes Metallothionein (CUP1) oder α-faktor Mating Pheromone Precursor (mfa1) Promotor oder den hybriden Promotoren GAL/CYC1, wie auch GAL1-10/CYC1, GAP/GAL, PGK/GAL, GAP/ADH2, GAP/PHO5 oder CYC1/GRE, entweder von S. cerevisiae oder Z. bailii, aber vorzugsweise von Z. bailii abstammend. Ganz besonders bevorzugte Promotoren sind die TPI-Promotoren von S. cerevisiae, korrespondierend zu SEQ ID Nr.: 78 und Z. bailii, korrespondierend zu SEQ ID Nr.: 79, aber ganz besonders bevorzugt ist der TPI-Promotor von Z. bailii (SEQ ID Nr.: 79).
Außerdem umfasst der Vektor vorzugsweise eine transkriptionelle Terminatorsequenz, nachfolgend der für das Protein kodierenden Sequenz, um eine effiziente mRNA 3'-Endausbildung zu gewährleisten. Eine derartige Terminatorsequenz stammt vorzugsweise von einer Hefe ab, besonders bevorzugt von Saccharomyces oder Zygosaccharomyces, ganz besonders bevorzugt von S. cerevisiae oder Z. bailii, und ganz besonders bevorzugt von Z. bailii. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Terminatorsequenz umfasst die folgende Tripartite-Consensussequenz: TAG..(T-reich)..TA(T)GT..(AT-reich)..TTT. Ein anderes bevorzugtes Beispiel umfasst das Sequenzmotiv TTTTTATA.
Weiters umfasst der Vektor eine Signalsequenz (= Leader-Sequenz; die im Zuge der Expression zu einem Signalpeptid oder Leader-Peptid translatiert wird). Solche Sequenzen leiten die exprimierten Proteine vom Cytosol ins Kulturmedium. In anderen Worten verursachen Signalsequenzen die Sekretion der Proteine und ihre Akkumulation im Medium. Signalsequenzen kodieren üblicherweise für einen zusammenhängenden Abschnitt von Aminosäuren, typischerweise 15 bis 60 Reste lang (bis zu 150), welcher charakteristischerweise eine oder mehrere positiv geladene Aminosäuren umfasst, gefolgt von einem Abschnitt von etwa 5 bis 10 hydrophoben Aminosäuren, welche durch nicht-hydrophobe Reste unterbrochen sein können oder nicht. Vorzugsweise umfasst das Signalpeptid 15 bis 45 Aminosäuren, besonders bevorzugt 15 bis 30 Aminosäuren. Auch wenn die Aminosäuresequenz sehr variabel ist, sind die Signalpeptide aller Proteine, die dasselbe Ziel in einem Organismus haben, funktionell austauschbar: physikalische Eigenschaften, wie Hydrophobizität oder das Muster geladener Aminosäuren scheint oft für den Signalerkennungsprozess wichtiger zu sein als die exakte Aminosäuresequenz.
Vorzugsweise ist die für das Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von: SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 3, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 9, SEQ ID Nr.: 11, SEQ ID Nr.: 13, SEQ ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 27, SEQ ID Nr.: 29, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 33, SEQ ID Nr.: 35, SEQ ID Nr.: 37, SEQ ID Nr.: 39, SEQ ID Nr.: 41, SEQ ID Nr.: 43, SEQ ID Nr.: 45, SEQ ID Nr.: 47, SEQ ID Nr.: 49, SEQ ID Nr.: 51, SEQ ID Nr.: 53, SEQ ID Nr.: 55, SEQ ID Nr.: 57, SEQ ID Nr.: 59, SEQ ID Nr.: 61, ganz besonders bevorzugt ist die Aminosäuresequenz des Signalpeptids ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 2, SEQ ID Nr.: 4, SEQ ID Nr.: 6, SEQ ID Nr.: 8, SEQ ID Nr.: 10, SEQ ID Nr.: 12, SEQ ID Nr.: 14, SEQ ID Nr.: 16, SEQ ID Nr.: 18, SEQ ID Nr.: 20, SEQ ID Nr.: 22, SEQ ID Nr.: 24, SEQ ID Nr.: 26, SEQ ID Nr.: 28, SEQ ID Nr.: 30, SEQ ID Nr.: 32, SEQ ID Nr.: 34, SEQ ID Nr.: 36, SEQ ID Nr.: 38, SEQ ID Nr.: 40, SEQ ID Nr.: 42, SEQ ID Nr.: 44, SEQ ID Nr.: 46, SEQ ID Nr.: 48, SEQ ID Nr.: 50, SEQ ID Nr.: 52, SEQ ID Nr.: 54, SEQ ID Nr.: 56, SEQ ID Nr.: 58, SEQ ID Nr.: 60, SEQ ID Nr.: 62.
Ganz besonders bevorzugt sind die DNA-Sequenzen, die für das Signalpeptid kodieren, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 3, SEQ ID Nr.: 21 oder SEQ ID Nr.: 35, dementsprechend sind die Aminosäuresequenzen des Signalpeptids bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID Nr.: 2, SEQ ID Nr.: 4, SEQ ID Nr.: 22 oder SEQ ID Nr.: 36.
Das Signalpeptid wird bevorzugterweise vom synthetisierten Protein entfernt. Dies kann durch die Aktivität einer spezialisierten Signalpeptidase hergerufen werden. Die Signalpeptidase kann homologen oder heterologen Ursprungs sein. D. h., das Signalpeptid umfasst bevorzugterweise eine „processing site" oder „cleavage site", die die Erkennung durch eine spezifische Endopeptidase ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Z. bailii Stamm mit einem Vektor transformiert, der eine für ein Protein kodierende DNA-Sequenz funktionell verknüpft mit der prä-Signalsequenz (16 aa) der α-Untereinheit des K1-Killertoxins von K. lactis (Stark M. J. et al., 1986, EMBO J. 5, 1995-2002, SEQ ID Nr. 35 (DNA) und SEQ ID Nr. 36 (Peptid)) und weiterhin funktionell verknüpft mit dem TPI-Promotor aus S. cerevisiae umfasst. Besonders bevorzugt ist der Vektor pZ₃k1(1b).
Ganz besonders bevorzugt ist der Z. bailii Stamm mit einem Vektor, umfassend die für das Protein kodierende DNA-Sequenz, funktionell verknüpft mit der Signalsequenz des K1 Killertoxins von K. lactis und weiterhin funktionell verknüpft mit dem TPI Promotor von Z. bailii, transformiert. Ganz besonders bevorzugt ist besagter Vektor von pZ₃bT abgeleitet (4a).
In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist der Z. bailii Stamm mit einem Vektor transformiert, der die für das Protein kodierende DNA-Sequenz funktionell verknüpft mit der Signalsequenz des präpro-α-Faktors von S. cerevisiae und weiter funktionell verknüpft mit dem TPI Promotor von S. cerevisiae umfasst. Vorzugsweise ist der Vektor pZ₃ppα (1c). Besonders bevorzugt ist der Z. bailii Stamm transformiert mit einem Vektor, der eine DNA-Sequenz kodierend für das Protein, funktionell verknüpft mit einer Signalsequenz des prä-pro-α-Faktors von S. cerevisiae und weiter funktionell verknüpft mit dem TPI Promotor von Z. bailii umfasst. Ganz besonders bevorzugt ist besagter Vektor von pZ₃bT (4a) abgeleitet.
Die für das Protein kodierende DNA-Sequenz kann aus tierischen, bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder viralen Quellen stammen. Ganz besonders bevorzugt von Metazoen, Säugern oder Pilzen. Das exprimierte Protein kann daher homolog oder heterolog zu Z. bailii sein.
Jede Hefe, die zur An Z. bailii gehört, kann für die Herstellung von Proteinen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Z. bailii Stamm transformiert. „Transformation" bezieht sich auf ein Verfahren, eine exogene Nukleinsäuresequenz (homologen und/oder heterologen Ursprungs, rekombinant oder nicht) in eine Zelle einzubringen, in welcher diese exogene Nukleinsäure in ein Chromosom integriert wird, oder zur autonomen Replikation fähig ist. Eine Zelle, die eine Transformation durchgemacht hat oder ein Abkömmling einer solchen Zelle ist „transformiert" oder „rekombinant". Wenn die exogene Nukleinsäure eine für ein Protein kodierende Region umfasst, und das Protein in der transformierten Hefe produziert wird, ist eine solche Hefe funktionell transformiert. Bevorzugte Verfahren, um Z. bailii zu transformieren, umfassen die Elektroporation, wie beschrieben in der WO 00/41477, oder ein chemisches Verfahren wie die LiAc/PEG/ssDNA Methode nach Agatep, R. et al., 1998, Technical Tipps Online (http://tto.trends.com).
Bevorzugterweise ist der Z. bailii Stamm, der transformiert wird, ausgewählt aus der Gruppe von ATCC 36947, ATCC 60483, ATCC 8766, FRR 1292, ISA 1307, NCYC 128, NCYC 563, NCYC 1416, NCYC 1427, NCYC 1766, NRRL Y-2227, NRRL Y-2228, NRRL Y-7239, NRRL Y-7254, NRRL Y-7255, NRRL Y-7256, NRRT, Y-7257, NRRL Y-7258, NRRL Y-7259, NRRL Y-7260, NRRL Y-7261, NRRL Y-27164; besonders bevorzugt sind ATCC 36947, ATCC 60483, ATCC 8766 und NCYC 1427.
(ATCC: American Type Culture Collection, Manassas VA, USA; FRR: FRR Culture Collection, North Ryde NWS, Australien; ISA: Culture Collection of the Instituto Superior de Agronomia, Lissabon; NCYC: National Collection of Yeast Cultures, Norwich, UK; NRRL: Agricultural Research Service Culture Collection, Peoria IL, USA).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann der Z. bailii Stamm einem Selektionsprozess für bessere Sekretion unterworfen werden. Screening und Isolierung eines derartigen Super-Secreting-Phäntotyps kann vor oder nach der Transformation des entsprechenden Z. bailii Stamms erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die zu GAS1 aus S. cerevisiae homologen Z. bailii Gene identifiziert und deletiert. GAS1 ist ein Beispiel für eines der wenigen Schlüsselmoleküle des verblüffend komplizierten sekretorischen Weges, das identifiziert wurde. Aufgrund einer daraus resultierenden Veränderung des Ausbaus der Zellwandstruktur ist es möglich, durch die Modifikation des GASI-Expressionslevels den gesamten sekretorischen Vorgang in S. cerevisiae zu beeinflussen (Vai, M., et al., 2000, Appl. Environm. Microbiol. 66, 5477-9), tatsächlich konnte gezeigt werden, dass GAS1-Mutanten einen Super-Secreting-Phänotyp aufweisen (Popolo L., et al., 1997, J. Bacteriol. 180, 163-6; Ram A. F. J., et al., 1998, J. Bacteriol. 180, 1418-24).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde der Z. bailii Stamm einem oder mehreren chemische oder physikalische Mutagenese umfassenden Mutagenese-/Selektionszyklen unterworfen, um supersekretierende Mutanten zu erhalten. Vorzugsweise wird die Mutagenese durch Orthovanadat hervorgerufen. Orthovanadat beeinflusst bekannterweise den Glycosylierungsprozess und den Zellwandaufbau in S. cerevisiae (Kanik-Ennulat, C. et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 898-909). Verfahren, die eine Orthovanadat-Mutagenese umfassen, um für im Rahmen der vorliegenden Erfindung brauchbare Zellen mit einem veränderten Zellwandausbau bzw. veränderten sekretorischen Eigenschaften bereitzustellen, sind beispielsweise für S. cerevisiae (Willsky. G. R., et al., 1985, J. Bacteriol. 164, 611-7) und K. lactis (Uccelletti, D., et al., 1999, Res. Microbiol. 150, 5-12; Uccelletti D., et al., 2000, Yeast 16, 1161-71) detailliert offenbart.
Für Hefe geeignete Kulturtechniken und Medien sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise aber nicht ausschließlich wird die Kultur mittels wässriger Fermentation in einem entsprechenden Behältnis durchgeführt. Beispiele für ein typisches Behältnis für eine Hefe-Fermentation umfassen Schüttelkolben oder Bioreaktoren.
Die Kultur wird typischerweise bei einer Temperatur zwischen 20°C und 40°C durchgeführt, bevorzugt zwischen 25°C und 35°C, und ganz besonders bevorzugt zwischen 28°C und 32°C.
Das Medium, in dem der Z. bailii Stamm kultiviert wird, kann jedes Medium sein, das in der Fachwelt als zu diesem Zweck geeignet bekannt ist. Das Medium kann komplexe Bestandteile enthalten oder chemisch definiert sein. Chemisch definierte Medien werden bevorzugt. Das Medium umfasst alle Bestandteile, die für das Wachstum der Hefe notwendig sind. Insbesondere umfasst das Medium eine Kohlenstoffquelle, wie Fructose, Glucose oder andere Kohlenhydrate (wie Saccharose, Lactose, D-Galactose oder pflanzliche Hydrolysate, etc.). Typischerweise umfasst das Medium weiterhin eine organische oder anorganische Stickstoffquelle, und ggf. kann das Medium Makro- oder Mikronährstoffe umfassen, wie Aminosäuren, Purine, Pyrimidine, Corn Steep Liquor, Hefeextrakt, Proteinhydrolysate, wie Pepton, Vitamine (wasserlöslich und/oder wasserunlöslich), wie Vitamine des B-Komplexes; oder anorganische Salze, wie Chloride, Hydrochloride, Phosphate oder Sulfate von Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo oder Zn, etc. Antischaummittel können zugegeben werden, falls notwendig. Weitere Bestandteile, die dem Fachmann als nützlich bei der Kultur oder Fermentation von Hefe bekannt sind, können auch zugefügt werden. Das Medium kann gepuffert sein oder auch nicht. Ein bevorzugtes Medium umfasst Hefeextrakt, Pepton und Glucose (= YPD). Ein besonders bevorzugtes Medium umfasst Hefeextrakt, Pepton und Fructose (= YPF). Ein ganz besonders bevorzugtes Medium umfasst Glucose und Yeast Nitrogen Base (YNB, Difco Laboratories, Detroit, MI #919-15). Ein ganz besonders bevorzugtes Medium umfasst Fructose und YNB.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Medium, das High Fructose Corn Syrup als Kohlenstoffquelle enthält (zum Beispiel Isosweet^® 100 42 % High Fructose (80 % solids) oder Isosweet^® 5500 55 % Fructose von Tate % Lyle PLC oder IsoClear^® 42 % High Fructose Corn Syrup oder IsoClear^® 55 % High Fructose Corn Syrup von Cargill, Inc.).
Die Zusammensetzung bevorzugter Medien für die Batch/Fed-batch Kultur von Z. bailii gemäß der vorliegenden Erfindung lautet wie folgt: Das Medium während der Batch-Phase umfasst 4 % w/V Glucose, 0,5 % w/V (NH₄)₂SO₄, 0,05 % w/V MgSO₄, 0,3 % w/V KHP₂O₄, Vitamine gemäß Verduyn, C., et al., 1992, Yeast 8, 501-17, wobei die schlussendliche Konzentration der Vitamine dreimal so hoch gewählt wurde wie angegeben und Spurenelemente gemäß Verduyn, C., et al., 1992, Yeast 8, 501-17, wobei auch diese Konzentration dreimal so hoch gewählt wurde wie angegeben. Der pH-Wert (pH 5) wurde durch Zugabe von 2 M KOH kontrolliert. Das Fed-Batch-Medium umfasst 50 % w/V Glucose, 15,708 g/l KHP₂O₄, 5 g/l KCl, 5,831 g/l MgSO₄, 1,2 g/l CaCl₂, 1 g/l Hefeextrakt, 0,4447 g/l NaCl, 1 g/l Glutamat, 0,05 g/l ZnSO₄, 0,04 g/l CuSO₄, 0,05 g/l MnCl₂, 0,001 g/l CoCl₂, 0,5 g/l Myoinositol, 0,1 g/l Thiamin-hydrochlorid, 0,02 g/l Pyridoxalhydrochlorid, 0,04 g/l Ca-D(+)Panthotenat, 0,004 g/l d-Biotin, 0,09 g/l Nikotinsäure. Der pH-Wert (pH 5) wurde durch Zugabe von 2M NH₄OH kontrolliert.
Im Falle der Selektion für den dominanten G 418 Marker wurden 200 mg/l G 418 zum entsprechenden Medium zugegeben.
Die Verwendung eines Mediums, dessen Bestandteile an die Bedürfnisse der Organismen angepasst ist, ist bevorzugt. Die Aufreinigung des Proteins wird dergestalt maßgeblich vereinfacht.
Vorzugsweise beträgt der pH-Wert des Mediums zwischen 2 und 9, besonders bevorzugt zwischen 3 und 8 und ganz besonders bevorzugt zwischen 4 und 7. Der pH-Wert kann während des Verlaufs der Fermentation reguliert werden, teilweise reguliert werden oder nicht reguliert werden; dementsprechend kann der pH-Wert während der Fermentation konstant gehalten werden oder variieren. Ein maßgeblicher Vorteil von Z. bailii ist dessen erstaunliche Fähigkeit bei tiefen pH-Werten zu wachsen und Proteine zu exprimieren sowie zu sekretieren. Daher ist der Bedarf für eine strikte pH-Kontrolle bei der Kultur dieser Organismen nicht sehr ausgeprägt.
Die Kultivierung kann Batch-, Fed-Batch- oder in kontinuierlicher Weise erfolgen, wie es dem Fachmann allgemein bekannt ist.
Während des Verlaufs der Fermentation wird das gewünschte Protein exprimiert, richtig prozessiert (d.h. gefaltet, modifiziert, geschnitten, etc.) und sekretiert (= im Medium akkumuliert). Das produzierte Protein kann teilweise in der Hefezelle zurückgehalten werden, bevorzugt ist die Sekretion eines wesentlichen Anteils der Proteinimenge. Ganz besonders bevorzugt ist, dass das Protein zur Gänze sekretiert wird.
Nachdem die Kultur für einen ausreichenden Zeitraum fortgeschritten ist, um die gewünschte Konzentration des Proteins in der Hefe und/oder im Kulturmedium zu herzustellen, wird das Protein isoliert. „Isoliert", wie hierin im Zusammenhang mit dem Protein benutzt, bedeutet, „zu einem Grad höherer Reinheit gebracht, durch Abtrennung des Proteins von zumindest einem anderen Bestandteil der Hefe oder des Mediums". Vorzugsweise ist das Protein mindestens 80% rein, basierend auf dem Gewicht, besonders bevorzugt mindestens 90% rein, basierend auf dem Gewicht, und ganz besonders bevorzugt mindestens 95% rein, basierend auf dem Gewicht. Ein Nachweis der Reinheit kann erhalten werden durch SDS-PAGE, 2D-Elektrophorese, IF, HPLC, Massenspektrometrie, Kapillarelektrophorese oder andere in der Fachwelt bekannte Verfahren.
„Reinheit" bezieht sich auf die Abwesenheit von Verunreinigungen im schlussendlich gereinigten Protein. Typische Verunreinigungen, die vom gewünschten Produkt entfernt werden müssen, sind unter anderem Proteine, Pyrogene, Nukleinsäuren.
Das Protein wird aus dem Kulturmedium isoliert, vorzugsweise ohne die Zellen zu lysieren. Eine derartige Isolierung umfasst die Reinigung des Proteins aus dem Medium. Die Reinigung kann durch in der Fachwelt gut bekannte Techniken erfolgen, wie beispielsweise Filtration (zum Beispiel Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration), Kristallisation oder Präzipitation, Zentrifugation, Extraktion, Chromatografie (zum Beispiel Ionenaustausch-, Affinitäts-, durch hydrophoben Austausch), etc.
Nach Entfernung der Zellen kann das Kulturmedium direkt als Produkt dienen (zum Beispiel als Enzymlösung) ohne weitergehende Reinigung. Die Mediumskomponenten können vor der Kultivierung entsprechend angepasst werden.
Wird das Protein nicht vollständig sekretiert, kann es sowohl aus den Hefezellen als auch aus dem Medium isoliert werden. Verfahren, um Hefezellen zu lysieren, sind in der Fachwelt gut bekannt und umfassen chemische oder enzymatische Behandlung, Behandlung mit Glaskügelchen („Glass Beads"), Sonikation, Gefrier-/Auftauzyklen oder andere Techniken. Das Protein kann von verschiedensten Fraktionen des Hefe-Lysats mittels der entsprechenden Techniken wie unter anderem Filtration (beispielsweise Mikrofiltration, Ultrafiltration, Nanofiltration), Kristallisation oder Präzipitation, Zentrifugation, Extraktion, Chromatografie (zum Beispiel Ionenaustausch-, Affinitäts-, hydrophober Austausch) gereinigt werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Z. bailii-Stamm, der ein heterologes Protein exprimiert und sekretiert.
Dieser Z. bailii-Stamm kann mit einem Vektor, der eine für ein heterologes Protein codierende DNA-Sequenz funktionell verknüpft mit einer Signalsequenz, die zur Sekretion des Proteins führt und weiterhin funktionell verknüpft mit einem Promotor, transformiert sein.
Beschreibung der Abbildungen:
1: Expressionsvektoren (Grundausbau)
Schematische Karten der für die Expression von Proteinen in Z. bailii konstruierten Plasmide:
a: pZ₃, (intrazelluläre Expression), b: pZ₃kl (Expression und Sekretion) und
c: pZ₃ppα (Expression und Sekretion).

a) pZ₃: Das Rückgrat des Plasmids ist pYX022, ein S. cerevisiae Expressionsplasmid (R & D Systems, Inc., Wiesbaden, D; die Expressionskassette basiert auf dem konstitutiven S. cerevisiae TPI-Promotor und dem korrespondierenden Poly-A-Signal, wie in der Figur gezeigt). Das ARS/CEN-Fragment von Ycplac33 (Gietz, R. D., et al., 1988, Gene 74, 527-34) gewährleistet die Replikation und Stabilität des Plasmids, während die Kan^R-Kassette aus dem Plasmid pFA6-KanMX4 (Wach, et al., 1994, Yeast 10, 1793-808) die G418-basierte Selektion der Transformanten erlaubt.
b) pZ₃kl: ein pZ₃-Expressionsvektor, der die Signalsequenz des K. lactis K1 Killertoxins (kl) für die Sekretion des interessierenden Proteins umfasst.
c) pZ₃ppα : ein pZ₃-Expressionsvektor, der die prä-pro-Leader-Sequenz des S. cerevisiae Pheromon-α-Faktor (prä-pro-αF), um die Sekretion des interessierenden Proteins zu veranlassen, umfasst.

(Amp = Ampicillinresistenz-Kassette; MCS = multiple cloning site; colE1 ori: E. coli Replikationsorigin)
2: Expressions- und Sekretionsvektoren
Schematische Karten der Plasmide, die für die Expression und Sekretion von humanem IL-1β (Auron, E., et al., 1984, PNAS 81, 7907-11) und GFP (Heim, R., et al., 1996, Curr. Biol. 6, 178-82) in Z. bailii konstruiert wurden.

a) pZ₃klIL-1β: ein pZ₃kl-Vektor, wobei die für humanes IL-1β kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
b) pZ₃ppαIL-1β: ein pZ₃ppα-Vektor, wobei die für humanes IL-1β kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
c) pZ₃ppαGFP: ein pZ₃ppα-Vaktor, wobei die für GFP kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

3: Expressionsvektoren
Schematische Karten der Plasmide, die für die Expression der Arxula adeninivorans Glucoamylase (GAA, Genebank accession no: Z46901, Bui Minh, D., et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 610-9) und der bakteriellen ß-Galaktosidase (vom Plasmid pSV-β-Galaktosidase von Promega, Inc.; Genebank accession no.: X65335) in Z. bailii konstruiert wurden.

a) pZ₃GAA: ein pZ₃-Vektor, wobei die für die Glucoamylase (GAA) kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.
b) pZ₃LacZ: ein pZ₃-Vektor, wobei die für die β-Galaktosidase kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

4: Expressionsvektoren
Schematische Karten der Plasmide, konstruiert für die Expression von Proteinen in Z. bailii, basierend auf dem Z. bailii TPI-Promotor.

a) pZ₃bT: ein pZ₃-Vektor, wobei der S. cerevisiae TPI-Promotor durch den Z. bailii TPI-Promotor substituiert wurde.
b) pZ₃bTLacZ: ein pZ₃bT-Expressionsvektor, wobei die für die β-Galactosidase kodierende Sequenz in die MCS subkloniert wurde.

5: IL-1β-Sekretion

a) Wachstumskinetik in minimalem (YNB) bzw. reichem Medium (YPD) mit 5% (w/V)-Glucose als Kohlenstoffquelle: Das Zellwachstum wurde mittels optischer Dichte (OD 660 nm, Kreise) verfolgt und die verbleibende Glucose (g/l, Quadrate) wurde gemessen. Vergleich zwischen S. cerevisiae (offene Symbole) und Z. bailii (ausgefüllte Symbole).
b) Western Blot-Analyse von Zellextrakten von S. cerevisiae und Z. bailii, die mit dem Plasmid pZ₃klIL-1β transformiert wurden (IL-1β mit der vorangehenden Leader-Sequenz des K.lactis Killertoxins exprimierend) bzw. mit dem entsprechenden leeren Plasmid (pZ₃) als Negativkontrolle. Die erste Spur zeigt eine Positivkontrolle (IL-1β, human, rekombinant (E. coli), Roche Katalog Nr. 1 457 756). Die Proben wurden zu den angegebenen Zeiten den in (a) gezeigten Wachstumskurven entsprechend den angegebenen Kulturen entnommen. Die Proben wurden auf einen OD-Wert von 0,08 abgeglichen. Die geblotteten Membranen wurden mit einem α-IL-1β polyklonalen Antikörper hybridisiert.
c) wie oben, wobei die geladenen Proben die entsprechenden Zellüberstände repräsentieren.
d) wie oben, wobei als Proben gleiche Volumina an Medium geladen wurden (30μl).

6: Die prä-pro-α-Faktor-Signalsequenz führt zur Sekretion von Il-1β und GFP in Z. bailii.

a.) Western Blot Analyse von Zellextrakten (i) und Zellüberständen (ii) von Z. bailii und S. cerevisiae Zellen, die mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β (bzw. dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert sind und auf YPD Medium (2% w/V Glucose) wachsen. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gezogen. Erste Spur: Positivkontrolle (IL-1β, human, rekombinant (E. coli), Roche Katalog Nr. 1 457 756). Die geblotteten Membranen wurden mit einem α-IL-1β polyklonalen Antikörper hybridisiert. Western Blot Analyse von Zellextrakten (iii) und Überständen (iv) von Z. bailii und S. cerevisiae Zellen, die mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β (bzw. dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃) transformiert wurden und auf YNB Medium (5% w/V Glucose) wachsen. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten gezogen. Erste Spur: Positivkontrolle (IL-1β, human, rekombinant (E. coli), Roche Katalog Nr. 1 457 756). Die geblotteten Membranen wurden mit einem α-IL-1β polyklonalen Antikörper hybridisiert.
b.) Western Blot Analyse von Zellextrakten (cells) und Überständen (sup) von Z. bailii Zellen, die mit dem Kontrollplasmid pZ₃ (erste und zweite Spur) bzw. dem Plasmid pZ₃ppαGFP (dritte und vierte Spur) transformiert wurden und auf YNB-Medium (2% w/V Glucose) wachsen. Die geblottete Membran wurde mit einem α-GFP polyklonalen Antikörper hybridisiert. Ein Pfeil markiert das erwartete positive Signal.

7: Batch-Kultur von Z. bailii Zellen, die das Expressionsplasmid pZ₃klIL-1β umfassen, auf chemisch definiertem Medium bei hoher Zuckerkonzentration.

a.) OD der Kultur (ausgefüllte Kreise), Trockenmasse (offene Kreise), Glucoseaufnahme (ausgefüllte Quadrate) und Ethanolproduktion (offene Dreiecke).
b.) Western Blot-Analyse vom Kulturmedium (Spuren 2 bis 5) und Zellextrakten (Spuren 6 bis 9) von Z. bailii Zellen. Die Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten der Wachstumskinetik gezogen und jeweils gleiche Volumina (30μl für den Überstand und 15μl für die Zellextrakte) wurden geladen. Die geblotteten Membranen wurden mit einem α-IL-1β polyklonalen Antikörper hybridisiert. Erste Spur: Positivkontrolle (IL-1β, human, rekombinant (E. coli), Roche Katalog Nr. 1 457 756).

8: Enzymatische Aktivität von in Z. bailii Zellen heterolog exprimierten Enzymen

a.) Bestimmung der A. adeninivorans Glucoamylaseaktivität (mU/OD) im Kulturmedium (YNB, 2% w/V Glucose) von Z. bailii Zellen, die mit dem Plasmid pZ₃GAA (bzw. dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle) transformiert wurden. Drei unabhängige Klone wurden analysiert (Cl. 1, Cl. 3 und Cl. 5).
b.) Bestimmung der β-Galaktosidase-Aktivität (Miller U/OD) in Zellextrakten von Z. bailii Zellen, die mit dem Plasmid pZ₃LacZ (zwei unabhängige Klone) bzw. mit dem Plasmid pZ₃bTLacZ (drei unabhängige Klone) bzw. dem entsprechenden leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert wurden. Die Zellen wuchsen auf YPD-Medium (2% w/V Glucose), zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben gezogen. Das linke Feld zeigt Z. bailii-Stamm ATCC 36947, das rechte Feld zeigt Z. bailii-Stamm ATCC 60483.

9: Konstruktion eines Z. bailii Multicopy-Plasmids.
Schematische Karte der endogenen Plasmide isoliert von Z. bailii ATCC 36947 (als pZB₁ bezeichnet, a) und Z. bailii NCYC 1427 (pZB₅ genannt, b).
Z. bailii Multicopy-Expressionsvektor, der die für eine stabile autonome Replikation in hoher Kopienzahl ausreichenden und notwendigen Gene bzw. Sequenzen enthält. Die Expressionskassette basiert auf dem konstitutiven Z. bailii TPI Promotor und dem Poly-A-Signal, wie in der Abbildung gezeigt.
Als Selektionsmarker dient die Kan^R Kassette.
Beispiele:
sDie folgenden Beispiele werden angeführt, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung darzulegen. Der Fachmann sollte verstehen, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Verfahren von den Erfindern als in der Durchführung der vorliegenden Erfindung gut funktionierend charakterisiert wurden. Sie können daher als bevorzugte Ausführungsformen betrachtet werden. Allerdings sollte der Fachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung verstehen, dass viele Änderungen der spezifischen offenbarten Ausführungsformen möglich sind, wobei immer noch das selbe oder zumindest ein ähnliches Resultat erzielt wird, ohne sich vom Rahmen der Erfindung zu entfernen.
Beispiel 1: Konstruktion der Z. bailii Expressiosplasmide
Das grundlegende S. cerevisiae Expressionsplasmid YX022 (R&D Systems, Inc., Wiesbaden, D) bildet das Rückgrat des neuen Vektors pZ₃ (1a).
Das ARS1-CEN4 Fragment wurde von Ycplac33 (ATCC 87623, Genbank accession no.: X75456 L26353) entnommen. Ycplac33 wurde ClaI-blunt/SpeI geschnitten und das Fragment in pYX022, geöffnet DraIII-blunt/SpeI, kloniert (auf diese Weise wurde das HIS-Gen vollständig aus pYX022 entfernt.
Das derart erhaltene Plasmid wurde KpnI-blunt geöffnet und an dieser Stelle wurde die Kan^R-Kassette aus pFA6-KanMX4 (Wach et al., 1994 Yeast 10, 1793-1808) eingefügt. Das entsprechende Fragment wurde durch Schneiden mit SphI/SacI-blunt erhalten. Dieses kanMx-Modul umfaßt den bekannten kan^r open reading-frame des E. coli transposons Tn903 fusioniert mit den transkriptionellen und tranlationellen Kontrollsequenzen des TEF-Gens des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii (z. B. NRRL Y-1056). Das beschriebene Hybridmodul erlaubt eine effiziente Selektion auf Geneticin (G418) resistente Transformanten.
Die Expressionskassette stammt ursprünglich vom Plasmid pYX022 (siehe Informationen des Anbieters) ab. Sie basiert auf dem konstitutiven S. cerevisiae TPI Promotor und der entsprechenden Poly-A-Sequenz, unterbrochen von der multi cloning site (MCS, wie in der Abbildung gezeigt). Alle anderen in den 1 bis 4 gezeigten Plasmide stammen von pZ₃ ab. Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃k1 (1b) wurde die prä-Signalsequenz (16aa) der α-Untereinheit des K1 killer toxins von K. lactis (Stark M.J. et al., 1986, EMBO J. 5, 1995-2002) funktionell mit dem TPI Promotor des pZ₃ Plasmids verknüpft, um die Sekretion des interessierenden Proteins zu ermöglichen.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppα (1c) wurde die prä-pro-α-Faktor-Signalsequenz in ähnlicher Weise verwendet und funktionell eingefügt. Die Sequenz wurde dem Plasmid pPICZα (Invitrogen BV, Niederlande) entnommen.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃k1IL-1β (2a) wurde die kodierende Sequenz für das Protein bereits mit der K. lactis Killer Toxin Signalsequenz fusioniert entnommen (aus dem Plasmid pCXJ-kan1 (Fleer R, et al., 1991, Gene 107, 285-95), geschnitten: XbaI/EcoRI-blunt) und in das Plasmid pZ₃ (EcoRI-blunt und dephosphoryliert) subkloniert.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppαGFP (2c) wurde das Fragment, umfassend die α-Faktor prä-pro-Leader-Sequenz in Frame mit der GFP kodierenden Sequenz dem Plasmid pPICAGFP1 (HindIII-blunt/BamHI geschnitten) entnommen und in das Plasmid pZ₃ (geöffnet EcoRI-blunt/BamHI und dephosphoryliert) subkloniert. Das Plasmid pPICAGFP1 wurde gemäß Passolunghi, S., et al. durch Einfügung einer PCR amplifizierten GFP Sequenz in-Frame in das Plasmid pPICZαA (Invitrogen BV, Niederlande) konstruiert. Die PCR Methode ist dem Fachmann gut bekannt. Beispielhaft seien Gelfand, D.H., et al.; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press und Dieffenbach, C.W. et al., PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995 zitiert.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃ppαIL-1β (2b) wurde IL-1β PCR amplifiziert mit Plasmid pZ₃k1IL-1β als Template.
Die Oligos für die Amplifikation waren wie folgt:
Primer: DrdI-IL (SEQ ID NO.: 80)
5' AAGAGACTCCAACGTCGCGCACCTGTA 3' Tm: 63°C
Primer: IL C-term (SEQ ID NO.: 81)
5' AGAGGATTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGA 3' Tm: 61 °C
Das folgende Programm wurde für die Amplifikation benutzt:
Auf diese Art und Weise wurde eine DrdI Restriktionsschnittstelle für die Subklonierung der kodierenden Sequenz des IL-1β Proteins in-Frame mit der α-Faktor prä-pro-Leader-Sequenz eingefügt. Das Plasmid pZ₃ppαGFP wurde EcoRI blunt/BamHI geöffnet. Das PCR Fragment wurde DrdI blunt/BamHI geschnitten. Kombination führt zum Plasmid pZ₃ppαIL-1β.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃GAA (3a) wurde die kodierende Sequenz der A. adeninivorans β-Glucoamylase aus dem Plasmid pTS32x-GAA (Bui D.M., et al., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 106-6) mittels BamHI blunt ausgeschnitten und in das Plasmid pZ₃ (EcoRI-blunt geöffnet und dephosphoryliert) eingefügt.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃LacZ (3b) wurde die kodierende Sequenz für die bakterielle β-Galaktosidase vom Plasmid pSV-β-Galactosidase (Promega, Inc.) mittels HindIII blunt/BamHI ausgeschnitten und in das Plasmid pZ₃ (EcoRI blunt/BamHI geöffnet und dephosphoryliert) eingefügt.
Im Plasmid pZ₃bT (4a) wurde der S. cerevisiae TPI Promotor durch den endogenen Z. bailii TPI Promotor ersetzt. Die Sequenz wurde von genomischer DNA des Z. bailii Stamms ISA 1307 PCR-amplifiziert Die Primer wurden entsprechend der Literatur synthetisiert (Merico A., et al., 2001, Yeast 18, 775-80). Der Extraktion der genomischen DNA wurde entsprechend dem von Hoffmann, C.S., et al. (1987, Gene 57, 267-72) publizierten Protokoll durchgeführt.
Die Oligos für die Amplifikation waren wie folgt:
TPIprob5 (SEQ ID NO.: 82)
5' ATCGTATTGCTTCCATTCTTCTTTTGTTA 3' Tm: 59,6°C
TPIprob3 (SEQ ID NO.: 83)
5' TTTGTTATTTGTTATACCGATGTAGTCTC 3' Tm: 59,6°C
Das folgende Programm wurde für die Amplifikation verwendet:
Das PCR Fragment wurde in den Vektor pST-Blue-1 (Novagen, Perfect Blunt Cloning Kit, Katalog Nr. 70191-4) entsprechend dem beigefügten Protokoll subkloniert. Daraus wurde der Promotor mit SnaBI/SacI ausgeschnitten und in pZ₃ (geöffnet AatII blunt/SacI) subkloniert (um den S. cerevisiae TPI Promotor zu entfernen), derart wurde das gewünschte Plasmid erhalten.
Für die Konstruktion des Plasmids pZ₃bTLacZ (4b) wurde die codierende Sequenz für die bakterielle β-Galaktosidase vom Plasmid pSV-β-Galactosidase (Promega, Inc.; Genebank accession no.: X65335) HindIII/BamHI ausgeschnitten und in das Plasmid pZ₃bT (NheI blunt geöffnet und dephosphoryliert) eingefügt.
DNA Manipulation, Transformation und Kultivation von E. coli (DH5α) wurden entsprechend Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook J., et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989). Auch alle anderen molekularbiologischen Protokolle wurden entsprechend diesem Handbuch durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben wurde. Alle Restriktions- bzw. modifizierenden Enzyme, die verwendet wurden, waren von NEB (New England Biolabs, UK) oder Roche Diagnostics.
Beispiel 2: Transformation von Z. bailii
Transformation aller Z. bailii und S. cerevisiae (NRRL Y-30320) Stämme wurden im wesentlichen entsprechend dem LiAc/PEG/ss-DNA Protokoll (Agatep, R., et al., 1998, Transformation of Saccharomyces cerevisiae by the lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol (LiAc/ss-DNA/PEG) Protokoll. Technical Tips Online (http:/tto.trends.com)) durchgeführt. Nach der Transformation ließ man sich die Z. bailii Zellen durch Inkubation von 16 Stunden bei 30°C in YP Medium, umfassend 2% w/V Fructose als Kohlenstoffquelle (YPF) und 1 M Sorbitol, erholen. Die Zellsuspension wurde dann auf selektive YPF Platten mit 200 mg/l G418 (Gibco, BRL, cat. 11811-031) ausplattiert. Einzelne Klone erschienen nach 2 – 3 Tagen bei 30°C. Von diesem Zeitpunkt an wurden die Transformanten entweder in reichem oder in Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und 200 mg/l G418 für die Aufrechterhaltung der Selektion kultiviert. Für S. cerevisiae Zellen kam die selbe Prozedur zur Anwendung außer, dass Glucose die Kohlenstoffquelle während aller Stufen war und die G418 Konzentration auf für unseren Stamm optimale 500 mg/l eingestellt wurde.
Beispiel 3: Expression und Sekretion von Interleukin 1β in Z. bailii
Um die sekretorischen Fähigkeiten der Hefe Z. bailii mit dem gut bekannten Wirt S. cerevisiae zu vergleichen wurden beide Hefen mit dem Plasmid pZ₃k1IL-1β (2a) transformiert (entsprechend Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Minimalmedium (YNB, 1,34% w/V YNB von Difco Laboratories, Detroit, MI #919-15, 5% w/V Glucose, komplementiert mit Histidin, Uracil und Leucin, 5a, linkes Feld) oder in reichem Medium (YPD, 5% w/V Glucose, 2% w/V Peptone, 1% w/V Hefeextrakt, 5a, rechtes Feld) in Schüttelflaschen kultiviert. 5a zeigt die Zelldichte (OD 660nm) und die Glucoseaufnahme während der Wachstumskinetik. Die Glucoseaufnahme wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland (Katalog-Nr.: 716251) entsprechend den Herstellerangaben ermittelt. Während der Kinetik wurden die Proben zu den angegebenen Zeiten gezogen (siehe „Stunden" von 5b, c, d). Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10 min., 10.000 rpm; Kulturvolumen entsprechend 10⁸ Zellen) geerntet. Den Überständen der Proben wurde 1 Volumen 2X Laemmli-Puffer (Laemmli, U.K., 1970, Nature 227, 680-5) zugefügt, sie wurden 3–5 Minuten gekocht und bis zum Auftragen bei –20°C aufbewahrt oder direkt auf ein Polyacrylamidgel geladen.
Die Zellpellets der Proben wurden in 5 ml 20% TCA resuspendiert, zentrifugiert (10 Minuten bei 3000 rpm) und die resultierenden Pellets wurden in 150 μl 5% TCA resuspendiert. Die Proben wurden anschließend während 10 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert und die Pellets in Laemmli Buffer (100 μl) resuspendiert.
Um die Proben zu neutralisieren wurden 50 μl 1M Tris Base zugegeben. Nach 3–5 Minuten bei 99°C waren die Proben zur Ladung auf ein Polyacrylamid-Gel bereit (alternativ Aufbewahrung bei –20°C).
Die Proben wurden auf Standard Polyacrylamid-Gele geladen (SDS-Page, schlußendliche Konzentration des Trenngels: 15 %); nach Auftrennung der Proteine wurden die Gele auf Nitrocellulose Membranen geblottet (1 Stunde, 250 mA, Protan BA 85, Schleicher & Schuell). Immun-Dekoration: nach 1 Stunde (RT) Sättigung in 1x TBS (1,2 g/l Tris Base; 9 g/l NaCL) + 5 % NFM (non fat milk), 0,2% Tween-20, wurden die Membranen über Nacht bei 4°C mit dem primären Antikörper gegen Interleukin (rabbit polyclonal antibody IL-1β(H-153) von Santa Cruz Biotechnology, Inc. cat. n° sc-7884) 1:200 in TBS 1x (1,2 g/l Tris Base; 9 g/l NaCL) + 5% NFM verdünnt, inkubiert.
Nach wiederholtem intensivem Waschen in TBS + 0,2% Tween-20 wurde der sekundäre Antikörper (Antirabbit IG Horseradish Peroxidase-conjugated, Amersham Biosciences, UK cat n° NA934) zugefügt (1:10.000 in 1x TBS + 5% NFM) und für 1 Stunde inkubiert (RT). Die Proteine wurden unter Verwendung von ECL Western Blotting System (Amersham Biosciences, UK) entsprechend dem Protokoll des Herstellers sichtbar gemacht.
Die mittels Western-Blot der Überstände erhaltenen Daten beleuchten die überraschend guten sekretorischen Fähigkeiten von Z. bailii Zellen (siehe 5c) in minimalem sowie in reichem Medium. Bemerkenswerter Weise ist das dem sekretierten Protein entsprechende Signal maßgeblich intensiver verglichen mit dem von S. cerevisiae Zellen erhaltenen Signal, in Übereinstimmung mit dem schwächeren Signal von Z. bailii Zellextrakten (5b).
Außerdem war der Mengenunterschied der sekretierten Proteine in minimalem Medium ausgeprägter als in komplexem Medium (zum Vergleich: 5c, linkes und rechtes Feld). Diese Schlüsse können anhand der Proben, deren OD angeglichen war (5c) oder von denen gleiche Volumina geladen wurden (5d), gezogen werden.
In ähnlicher Weise wurden Z. bailii und S. cerevisiae Zellen mit dem Plasmid pZ₃ppαIL-1β transformiert. In diesem Fall war dasselbe Protein (Interleukin) funktionell mit der Leader-Sequenz des S. cerevisiae α-Faktor-Pheromons verknüpft. Wie vorher beschrieben wurden die Zellen im komplexem (reichem) YPD oder minimalem YNB Medium in Schüttelkolben kultiviert und Proben wurden gezogen und für SDS-PAGE Proteinauftrennung aufbereitet.
Der Western-Blot (6a) legt einmal mehr die überraschende im Vergleich mit S. cerevisiae bessere Sekretion von Z. bailii offen: Die Signale von den Rohextrakten (i für YPD, iii für YNP Medium) sind intensiver im letzteren Stamm, was eine kürzere Retention des Produktes und daher eine effizientere Sekretion durch Z. bailii Zellen nahelegt. Diese Beobachtung ist mit der Tatsache konsistent, dass die Signale, die den in das Medium sekretierten Produkten entsprechen in Z. bailii intensiver sind, als in S. cerevisiae (ii für YPD, iv für YNB Medium; in diesem Falle ist ein positives Signal nur in Z. bailii Proben vorhanden).
Es ist nun von großer Bedeutung, dass die Expression und Sekretion und damit die Akkumulierung der heterologen Proteine im Kulturmedium nicht nur bei Austausch der Leader-Sequenz beibehalten werden kann, sondern auch durch Verwendung derselben Leader-Sequenz für ein anderes heterolog exprimiertes Protein. Z. bailii Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃ppαGFP transformiert und in minimalem YNB Medium in Schüttelkolben kultiviert; Proben wurden gezogen und für SDS-PAGE Protein-Auftrennung vorbereitet.
Die Western-Blot Analyse, die – abgesehen vom primären Antikörper (anti-GFP, Clontech, Inc.) und dessen Konzentration (1:500) – wie vorher beschrieben durchgeführt wurde, zeigt eine Bande der erwarteten Dimension ausschließlich im Überstand der GFP heterolog exprimierenden Z. bailii Zellen, nicht aber des Kontrollstammes, der mit dem leeren Plasmid transformiert wurde ( 6b).
Die gezeigten Ergebnisse unterstreichen die Möglichkeit, Z. bailii als Wirt für ein Verfahren zur Expression und Sekretion verschiedener heterologer Proteine zu verwenden, wobei die Sekretion mit heterologen Leader-Sequenzen erzielt werden kann. Bemerkenswerterweise ist die sekretierte Proteinmenge im Vergleich zu S. cerevisiae größer und dieser Unterschied ist besonders ausgeprägt in chemisch definiertem Kulturmedium.
Beispiel 4: Expression und Sekretion von Interleukin 1-β in einer Z. bailii Bioreaktor Batch-Kultur mit hoher Zuckerkonzentration.
Z. bailii Zellen, die mit dem Plasmid pZ3k1IL-1β (2a) transformiert wurden (entsprechend Beispiel 2) und vorhergehend auf Interleukin 1-β Expression in Schüttelkolben-Kulturen untersucht wurden (siehe Beispiel 3) wurden in einem 2 Liter Labor Bioreaktor (Fermentor, Biolafitte & Moritz, Mod. Prelude – Frankreich) in chemisch definiertem Medium mit hohem Glucosegehalt (27% w/V Glucose, 4% w/V (NH₄)₂SO₄, 0,4% w/V MgSO₄, 2,4% w/V KHP₂O₄, Vitamine entsprechend Verduyn, C., et al., 1992, Yeast 8, 501-17, wobei die schlußendliche Konzentration der Vitamine 24x so hoch war wie die dort angegebenen Konzentrationen und Spurenelemente entsprechend Verduyn, C., et al., 1992, Yeast 8, 501 – 17, wobei die schlußendlichen Konzentrationen der Spurenelemente 24x so hoch waren als an der entsprechenden Stelle angegeben im Batch-Verfahren kultiviert.
(Abhängig von der Salztoleranz des Produktionsstammes könnte es in diesem Zusammenhang sinnvoll sein, dem anfänglichen Medium nur eine Teilmenge der Salze mit der Glucose zuzugeben und den Rest der Salze erst nachdem die Bioreaktion (Fermentation) genügend lange fortgeschritten ist, zuzugeben.) Die pH-Kontrolle (Wert: pH 5) wurde durch die Zugabe von 2M KOH durchgeführt. G418 wurde in einer Konzentration von 200 mg/l zugegeben, Antischaummittel wurde zugegeben soweit notwendig. Das Inoculum wurde durch vorherige Kultur der Hefe in Schüttelkolben (mit einem Kopfraum zu Kulturvolumen-Verhältnis von 4) in reichem YPD Medium (siehe oben) + 200 mg/l G418 bereitgestellt. Die Zellen wurden geerntet mit deionisiertem Wasser gewaschen und in das Medium zu einer OD von 1,68 in den Bioreaktor inoculiert.
Die Zellkultur wurde mit 90 1/h Luft durchflutet, die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde durch Variation der Rührergeschwindigkeit auf 40 % Luftsättigung eingestellt. 7a zeigt die Wachstumskinetik (Zelldichte, OD 660 nm) zusammen mit der Glucoseaufnahme, der Ethanolproduktion und der produzierten Biomasse (Trockenmasse g/l). Die Glucoseaufnahme und die Ethanolproduktion wurden unter Verwendung kommerziell erhältlicher enzymatischer Kits bestimmt (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland Katalog Nrn. 716251 und 0176290) entsprechend der Anleitung des Herstellers.
Das zelluläre Trockengewicht (Biomasse) wurde wie vorher beschrieben bestimmt (Rodrigues, F. et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67, 2123-8). Zu den angegebenen Zeiten wurden Proben gezogen und für die SDS-PAGE Protein Auftrennung vorbereitet. Die Western Blot Analyse (durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben) zeigt ein sauberes, sehr starkes, während der Zeit akkumulierendes Signal, das dem sekretierten Produkt entspricht (Spuren 2 bis 5) und bestätigt die minimale Retention der produzierten heterologen Proteine innerhalb der Zellen (Spuren 6 – 9, 7b).
Dieses Beispiel zeigt die überraschende und vorteilhafte Fähigkeit von Z. bailii Zellen, auch bei sehr hohen Zuckerkonzentrationen zu wachsen und heterologe Proteine zu exprimieren und zu sekretieren. Es wurde bereits berichtet, dass S. cerevisiae bei derart hohen Zuckerkonzentrationen nicht mehr oder nur noch sehr schlecht wächst (siehe beispielsweise Porro, D., et al., 1991, Res. Microbiol. 142, 535-9).
Beispiel 5: Expression und Sekretion von Glucoamylase in Z. bailii.
Z. bailii Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃GAA (3) bzw. mit dem leeren Plasmid pZ₃ transformiert (entsprechend Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Schüttelkolben in minimalem YNB Medium mit 2% (w/V) Glucose als Kohlenstoffquelle (+ 0,67% (w/V) YNB und Aminosäuren entsprechend den Angaben des Herstellers) bis zu der Mitte der exponentiellen Phase (auch als „Mid-log" bezeichnet) kultiviert. Die β-Glucoamylase Aktivität wurde wie folgt bestimmt: Nach der Ermittlung der Zelldichte wurden die Zellen geerntet, um den Kulturüberstand zu erhalten. 15 μl/ml 3M NaAc, pH 5,2 und 20 μl/ml 1 % w/V Stärke (Fluka 85642 – high solubility –) wurden zugegeben. Daraufhin wurden die Proben gut gemischt und bei der gewünschten Temperatur inkubiert (bei diesem Experiment 50°C). Zum Zeitpunkt 0 und im Folgenden alle 20 Minuten wurde 1 ml des inkubierten Mediums entnommen, für 2 Minuten auf Eis gekühlt, dann wurden 50 μl Lugollösung (Fluka 62650) zugesetzt, schnell geschüttelt und am Spektrophotometer bei λ580 nm gelesen. Die Steigung der resultierenden Werte entspricht der Glucoamylase Aktivität. 8 zeigt die Glucoamylase Aktivität von 3 unabhängigen Klonen, die GAA exprimieren und einer Negativkontrolle. Die enzymatische Aktivität ist im mU/OD ausgedrückt und ist unter Voraussetzung berechnet, dass 1U einer Veränderung von einer OD-Einheit pro Minute entspricht. Von den in der Abbildung gezeigten Werten, wurde die in der Kontrollprobe gemessene basale Aktivität von Z. bailii abgezogen.
Beispiel 6: Expression von β-Galactosidase (β-gal) in Z. bailii
Z. bailii Zellen wurden mit dem Plasmid pZ₃LacZ (3b) oder mit dem Plasmid pZ₃bTLacZ (4b) oder mit dem leeren Plasmid pZ₃ als Kontrolle transformiert (entsprechend Beispiel 2). Unabhängige Transformanten wurden in Schüttelkolben in YPD Medium (siehe obige Beschreibung) mit 2% w/V Glucose als Kohlenstoffquelle bis zur mid-exp Phase kultiviert.
β-Galactosidase Aktivitätsmessung: Nach der Bestimmung der Zelldichte wurde 1 ml der Kultur in einem Eppendorftube geerntet, für 5 Minuten zentrifugiert (um ein hartes Pellet zu erhalten), der Überstand mit einer Pipette abgenommen (kein Vakuum zu verwenden!) in 1 ml Z Puffer gewaschen [ohne BME (β-Mercaptoethanol); Z Puffer: 16, 1 g/l NaHP₂O₄ x 7H₂O, 5,5 g/l Na₂HPO₄ x H₂O, 0,75 g/l KCL, 0,246 g/l MgSO₄ x 7H₂O], wiederum pelletiert, suspendiert in 150 μl Z Puffer (mit BME, 27 μl/10 ml), 50 μl Chloroform wurden zugegeben, 20 μl 0,1 % SDS und für 15 Minuten kräftig gevortext. 700 μl vorgewärmtes ONPG (o-Nitrophenyl β-D-Galactopyranosid, Sigma N-1127, 1 mg/ml in Z + BME) wurden zugegeben und die Reaktion wurde bei 30°C (20 min bis 3 h) gestartet, wobei die Zeit gemessen wurde. Wenn die Suspension gelb wird, wird die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 M NaCO₃ gestoppt; nach Zentrifugation für 10 min bei maximaler Geschwindigkeit wird die Probe am Spektrophotometer bei λ420 gemessen.
8b zeigt die β-Gal Aktivität von 3 unabhängigen Klonen, die die β-Gal unter der Kontrolle des Z. bailii TPI Promotors exprimieren, 2 unabhängigen Klonen, die die β-Gal unter der Kontrolle des S. cerevisiae TPI Promotors exprimieren und einer Negativkontrolle (siehe Legende der Abbildung für die Markierung der entsprechende Klone).
Die enzymatische Aktivität ist als Miller Unit/OD angegeben und berechnet sich nach der folgenden Formel:
Es ist gut erkennbar, dass die Expression vom endogenen TPI Promotor wesentlich stärker (4 – 5 mal) als vom entsprechenden S. cerevisiae Promotor ist.
Beispiel 7: Isolation eines endogenen Z. bailii Plasmids
Die Z. bailii Stämme ATCC 36947 und NCYC 1427 wurden kultiviert und ihre endogenen Plasmide wurden extrahiert, was die Plasmide pZB₁ und pZB₅ (siehe 9a + b) ergab. Verwendet wurde ein modifiziertes Protokoll nach Lorincz, A., 1985, BRL Focus 6, 11, wobei zum Aufschluß der Zellen Glass-Beads verwendet wurden. Nach der DNA Extraktion wurden die Proben auf ein Agarosegel geladen und die dem Plasmid entsprechende Bande wurde eluiert (Qiagen, QIAquick Gel Extraction Kit Katalog Nr. 28704).
Das von NCYC 1427 extrahierte Plasmid wurde mit EcoRI geschnitten und einige der Fragmente wurden sequenziert. Diese Sequenzen entsprechen SEQ ID Nr.: 63, SEQ ID Nr.: 64, SEQ ID Nr.: 65, SEQ ID Nr.: 66, SEQ ID Nr.: 67, SEQ ID Nr.: 68, SEQ ID Nr.: 69 und SEQ ID Nr.: 70.
Beispiel 8: Sequenzamplifikation der offenen Leseraster und der strukturellen Sequenzen der endogenen Z. bailii Plasmide
Aus den Z. bailii Stämmen ATCC 36947 und NCYC 1427 extrahierte genomische DNA wurde als Template für die Amplifikation der offenen Leseraster und der strukturellen Sequenzen der endogenen Z. bailii Plasmide verwendet.
Die Oligos für die Amplifikation waren die folgenden:
Das folgende Programm wurde für die Amplifikation benutzt:
Die amplifizierten Fragmente wurden sequenziert und entsprechen SEQ ID Nr.: 71 (IR-ARS), SEQ ID Nr.: 72 (FLP), SEQ ID Nr.: 74 (TFB) und SEQ m Nr.: 76 (TFC).
Die kodierenden Sequenzen werden für die Konstruktion eines Expressionsplasmides pEZ₁, entsprechend 9b verwendet.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Proteins umfassend a) Kultivation eines Zygosaccharomyces bailii Stammes, b) Expression und Sekretion des Proteins, c) Isolation des Proteins.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Z. bailii Stamm mit einem Vektor, umfassend eine für das Protein kodierende DNA Sequenz funktionell verknüpft mit einer zur Sekretion des Proteins führenden Signalsequenz und weiter funktionell verknüpft mit einem Promotor, transformiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Vektor ein extra-chromosomales Plasmid ist.
Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Plasmid von einem endogenen episomalen Plasmid aus einem Z. bailii Stamm abstammt.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Plasmid mindestens 35 Basen einer der Sequenzen ausgewählt aus der Liste von SEQ ID Nr.: 63, SEQ ID Nr.: 64, SEQ ID Nr.: 65, SEQ ID Nr.: 66, SEQ ID Nr.: 67, SEQ ID Nr.: 68, SEQ ID Nr.: 69, SEQ ID Nr.: 70 oder SEQ ID Nr.: 71 umfaßt.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 2 – 5, wobei der Promoter ein Triose-Phosphat Isomerase Promoter ist, erhältlich aus Saccharomyces cerevisiae oder Z. bailii, vorzugsweise aus Z. bailii.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 2 – 6, wobei die Signalsequenz ein zusammenhängender Abschnitt von 15 bis 60 Aminosäuren ist, umfassend eine oder mehrere positiv geladene Aminosäuren, gefolgt von einem Abschnitt von 5 bis 10 hydrophoben Aminosäuren, welcher durch nicht-hydrophobe Aminosäuren unterbrochen sein kann oder nicht.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 2 – 6, wobei die Signalsequenz ausgewählt ist aus der Liste von SEQ ID Nr.: 1, SEQ ID Nr.: 3, SEQ ID Nr.: 5, SEQ ID Nr.: 7, SEQ ID Nr.: 9, SEQ ID Nr.: 11, SEQ ID Nr.: 13, SEQ ID Nr.: 15, SEQ ID Nr.: 17, SEQ ID Nr.: 19, SEQ ID Nr.: 21, SEQ ID Nr.: 23, SEQ ID Nr.: 25, SEQ ID Nr.: 27, SEQ ID Nr.: 29, SEQ ID Nr.: 31, SEQ ID Nr.: 33, SEQ ID Nr.: 35, SEQ ID Nr.: 37, SEQ ID Nr.: 39, SEQ ID Nr.: 41, SEQ ID Nr.: 43, SEQ ID Nr.: 45, SEQ ID Nr.: 47, SEQ ID Nr.: 49, SEQ ID Nr.: 51, SEQ ID Nr.: 53, SEQ ID Nr.: 55, SEQ ID Nr.: 57, SEQ ID Nr.: 59, SEQ ID Nr.: 61.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Z. bailii Stamm mit einem Vektor, umfassend die für das Protein kodierende DNA Sequenz funktionell verknüpft mit der prä-Signalequenz der α-Untereinheit des K1 Killertoxins von Kluyveromyces lactis und weiter funktionell verknüpft mit dem Triosephosphat Isomerase Promotor von S. cerevisiae, transformiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Vektor das Plasmid pZ₃kl ist.
Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Z. bailii Stamm mit einem Vektor, umfassen die für das Protein kodierende DNA Sequenz, funktionell verknüpft mit der Signalsequenz des prä-pro-α-Faktors von S. cerevisiae und weiter funktionell verknüpft mit dem Triosephosphat Isomerase Promoter von S. cerevisiae, transformiert ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Vektor das Plasmid pZ₃ppα ist.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 2 – 12, wobei die DNA Sequenz die für das Protein kodiert tierischen, bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder viralen Ursprungs ist.
Das Verfahren nach den Ansprüchen 2 – 13, wobei der Z. bailii Stamm, der transformiert wird, ausgewählt ist aus der Gruppe: ATCC 36947, ATCC 60483, NCYC 1427 oder ATCC 8766.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Z. bailii Stamm einem Selektionsprozess für gesteigerte Sekretion unterworfen wurde.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Z. bailii Stamm in einem chemisch definierten Medium kultiviert wird.
Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Protein aus dem Kulturmedium isoliert wird.
Ein Z. bailii Stamm, der ein heterologes Protein exprimiert und sekretiert.
Der Z. bailii Stamm nach Anspruch 18, wobei die Zellen mit einem Vektor, der eine für das heterologe Protein kodierende DNA Sequenz, funktionell verknüpft mit einer Signalsequenz, die die Sekretion des Proteins verursacht und weiterhin funktional verknüpft mit einem Promoter umfasst, transformiert sind.