DE10252239A1

DE10252239A1 - Verfahren zum Drucken von Biomolekülen

Info

Publication number: DE10252239A1
Application number: DE2002152239
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth
Original assignee: TDK Micronas GmbH
Current assignee: Endress and Hauser Conducta GmbH and Co KG
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2022-11-08
Also published as: DE10252239B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Aufbringen von Biomolekülen auf feste, halbfeste oder gelartige Oberflächen unter Verwendung einer die Biomoleküle enthaltenden wässrigen Zusammensetzung, welche mindestens ein nicht-reduzierendes Disaccarid umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Biotechnologie. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Aufbringen von Biomolekülen auf feste, halbfeste oder gelartige Oberflächen.
Bereits seit mehreren Jahrzehnten werden Biomoleküle wie insbesondere Nukleinsäuren auf Träger aufgebracht, um sie selbst oder geeignete Bindungspartner untersuchen zu können. Während der Vorgang des Aufbringens lange Zeit mittels Pipette oder vergleichbarer Geräte erfolgte, hat insbesondere die Entwicklung miniaturisierter Systeme und automatisierter Verfahren dazu geführt, dass gerade bei Multiplex-Anwendungen wie der Herstellung von Biomolekülarrays, bei denen Biomoleküle in einer präzisen, rasterartigen Anordnung immobilisiert werden, immer kleinere Volumina einer gewünschten Zusammensetzung auf geeignete Oberflächen aufgebracht werden müssen. Die Zuverlässigkeit und Standardisier- sowie Reproduzierbarkeit solcher Systeme lässt jedoch häufig zu wünschen übrig.
Zum einen werden zum Drucken der Biomoleküle Puffersysteme verwendet, die chemisch reaktiv sind und mit den häufig funktionalisierten Oberflächen unerwünschte Reaktionen eingehen. Da zumeist eine kovalente Kopplung von Biomolekülen an Oberflächen angestrebt wird, damit diese auch bei anschließenden Behandlungsschritten an ihren definierten Positionen verbleiben, ist die Auswahl eines geeigneten Druckpuffers von entscheidender Bedeutung für die Bonität des beabsichtigten Untersuchungsergebnisses. Bei sog. Biochips aus Glas werden z.B. Nukleinsäuresonden häufig mittels auf dem Chip befindlicher aminoreaktiver Gruppen in einer nukleophilen Reaktion gebunden. Da die zumeist eingesetzten Puffer ebenfalls nukleophile Eigenschaften aufweisen, kann es zu einer kompetitiven Hemmung der vorgesehenen Kopplungsereignisse kommen, die angesichts der hohen Erwartungen an die Spezifität und Sensitivität derartiger Systeme nicht hingenommen werden kann. Hinzu kommt, dass die Dosiereigenschaften herkömmlicher Zusammensetzungen aufgrund einer zu geringen Viskosität nicht als optimal bezeichnet werden können. Ferner lassen sich bestimmte Biomoleküle (z.B. Insulin) nur schlecht oder gar nicht in den Puffern des Standes der Technik lösen, weshalb eine quantitativ und qualitativ gleichbleibende Druckqualität häufig nicht realisiert werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt daher in der Bereitstellung eines Verfahrens zum Aufbringen bzw. Drucken von Biomolekülen auf Oberflächen, mit dem die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwunden werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das Verfahren gemäß Hauptanspruch gelöst. Besondere Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen dargestellt.
Die vorliegend verwendeten Begriffe „biologische Moleküle" und „Biomoleküle" umfassen jedwede Substanzen und Verbindungen im wesentlichen biologischen Ursprungs, die über Eigenschaften verfügen, welche im Rahmen wissenschaftlicher, diagnostischer und/oder pharmazeutischer Anwendungen relevant sind. Umfasst sind nicht nur native Moleküle, wie sie aus natürlichen Quellen isoliert werden können, sondern auch davon abgeleitete Formen, Fragmente und Derivate, sowie rekombinante Formen und artifizielle Moleküle, sofern sie mindestens eine Eigenschaft der nativen Moleküle aufweisen. Bevorzugte Biomoleküle sind solche, die für analytische, diagnostische und/oder pharmazeutische Zwecke eingesetzt werden können, wie Nukleinsäuren und deren Derivate (DNA, RNA, PNA, LNA, Ribozyme, Oligonukleotide, Plasmide, Chromosomen), Peptide und Proteine (Enzyme, Rezeptorproteine, Proteinkomplexe, Peptidhormone, Antikörper) sowie biologisch aktive Fragmente derselben, Kohlenhydrate und deren Derivate wie insbesondere glykosylierte Proteine und Glykoside, und Fette, Fettsäuren und Lipide.
Für den Fachmann ist klar, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren auch auf zelluläre Gewebe und vollständige Zellen sowie Teile derselben (Organellen, Membranen und Membranfragmente etc.) anwenden lässt, sofern sie Träger der obigen Biomoleküle sind. Deshalb sind Gewebe, Zellen und Teile derselben grundsätzlich vom Begriff „Biomoleküle" umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Aufbringen von Biomolekülen auf eine Oberfläche in an sich bekannter Weise erfolgt unter Verwendung einer die Biomoleküle enthaltenden wässrigen Zusammensetzung, welche mindestens ein nicht-reduzierendes Disaccharid umfasst.
Erfindungsgemäß hat sich herausgestellt, dass die Anwesenheit mindestens eines nicht-reduzierenden Disaccharids in der Zusammensetzung bzw. im Druckpuffer eine Reihe von Vorteilen bietet. Zum einen ist bekannt, dass nicht-reduzierende Zucker wie z.B. Trehalose Biomoleküle stabilisieren und damit konservieren können, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Zucker in der Lage sind, Wassermoleküle zu ersetzen bzw. funktional zu substituieren.
Im Stand der Technik wird die Verwendung von Trehalose bei der Herstellung von mit Antikörpern beschichteten Mikrotiterplatten beschrieben, um diese normalerweise sehr schnell denaturierenden Proteinspecies zu stabilisieren (v. K. Nguyen et al., Protection of immunoreactivity of dry immobilized proteins on microtitration plates in ELISA: application for detection of autoantibodies in Myasthenia gravis, J. of Biotechnology, 72, S. 115 bis 125 (1999)). Hierzu wurden Mikrotiterplatten mit darauf immobilisierten Antikörpern mit einem Rinderserumalbumin (BSA) und Trehalose enthaltenden Film beaufschlagt und anschließend getrocknet. Dieser Artikel zeigt, dass die nativen Eigenschaften von zuvor immobilisierten Biomolekülen durch Aufbringen eines Trehalose/BSA-Films vor deren Trocknung konserviert werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, dass die Gesamtmenge an nicht-reduzierendem Disaccharid in der Zusammensetzung 1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 3 bis 7 Gew.%, und besonders bevorzugt 5 Gew.% beträgt.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das mindestens eine nicht-reduzierende Disaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose (D-Glucopyranosyl-D-glucopyranose), Sucrose (β-D-Fructofuranosyl-α-D-glycopyranosid), sowie Derivaten davon, wobei die Auswahl von Trehalose bevorzugt ist.
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die wässrige Zusammensetzung vorzugsweise ein Puffer ist, d. h. eine wässrige Lösung oder Suspension eines Salz/Säure- bzw. Salz/Base-Gemisches, deren pH-Wert sich bei Zugabe von Säure oder Base nur relativ wenig ändert. Bei biotechnologischen und in vitro Anwendungen werden im sauren pH-Bereich häufig Gemische aus Salzen schwacher Säuren mit starken Basen sowie die zugehörigen freien Säuren (z.B. Gemisch aus Natriumacetat u. Essigsäure) verwendet, während im alkalischen Bereich zumeist Gemische aus Salzen starker Säuren mit schwachen Basen zusammen mit den zugehörigen freien Basen (z.B. Tris-Chlorid und Tris-Base) eingesetzt werden. Dem Fachmann sind diese Systeme bekannt, weshalb er sich ohne weiteres geeignete Puffer zusammenstellen kann, sofern er sie nicht von kommerziellen Anbietern beziehen möchte.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt aus physiologisch/funktioneller Sicht dazu, dass ein Teil des Wassers der Zusammensetzung bzw. des Puffers (z.B. Natriumcitratpuffer) durch mindestens ein nicht-reduzierendes Disaccharid ersetzt wird. Das Disaccharid bewirkt eine Stabilisierung der in der Zusammensetzung befindlichen Biomoleküle und eine Erhöhung der Viskosität der Lösung, ohne dass die oben erwähnten chemischen Konkurrenzreaktionen unterstützt oder ermöglicht werden. Mit der Erhöhung der Viskosität ergibt sich zudem die Möglichkeit der zusätzlichen Verwendung eines Lösungsvermittlers, um normalerweise schwer lösliche Moleküle in Lösung zu bringen. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens betreffen somit die Stabilisierung der nativen Eigenschaften von Biomolekülen, die Sicherstellung einer bevorzugt kovalenten Kopplung der Moleküle an Oberflächen ohne störende Nebenreaktionen, sowie die Erhöhung der Viskosität der aufzubringenden Zusammensetzung, die mit einer verbesserten Löslichkeit für bestimmte Biomoleküle und einer deutlich verbesserten Druckbarkeit einhergeht.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Zusammensetzung ferner mindestens ein nicht-ionisches Tensid, wobei die Gesamtmenge an nicht-ionischem Tensid in der Zusammensetzung 0,001 bis 0,1 Gew.%, vorzugsweise 0,005 bis 0,05 Gew.%, und besonders bevorzugt 0,01 Gew.% beträgt.
Geht man beispielsweise von einem Phosphatpuffer (pH 8,0) oder Natriumcitrat/Natriumchloridpuffer (500 mM, pH 8,0) aus, kann eine im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Zusammensetzung 1 bis 10% Trehalose und 0, 001 bis 0, 1 % Triton X-100 als Tensid enthalten. Triton X-100 ist ein chemisch gesehen weitgehend inertes, nicht-ionisches Tensid, während Trehalose das erfindungsgemäß vorgeschlagene nicht-reduzie rende Disaccharid repräsentiert. Auf der Grundlage eines solchen Puffers erfolgt anschließend die Herstellung der wässrigen Zusammensetzung durch Lösen von Biomolekülen (z.B. DNA oder Peptide) bis zu Endkonzentrationen von etwa 20 μM. Dem Fachmann ist klar, dass höhermolekulare Substanzen (z.B. Plasmide oder Antikörper) entsprechend ihrer speziellen Lösungseigenschaften vorzugsweise in geringeren molaren Konzentrationen eingesetzt werden sollten.
Die zum Aufbringen geeigneten Hilfsmittel unterliegen keinen Beschränkungen und können insbesondere unter Pipetten und automatisierten Vorrichtungen zum Drucken ausgewählt werden.
Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.
Drucken von Peptiden
Zur Herstellung einer erfindungsgemäß geeigneten Zusammensetzung werden Oligopeptide in einem Phosphatpuffer (500 mM, pH 8,0) unter Zugabe von 5 % (Gew./Vol.) Trehalose und 0,01 (Gew./Vol.) Triton X-100 gelöst. Die Peptidkonzentration der gebrauchsfertigen Zusammensetzung wird auf 10 μM eingestellt.
Das anschließende Drucken der Peptide auf eine feste Oberfläche erfolgt mittels einer Nanoliterpipette (z.B. GeSIM^®, erhältlich bei Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf, Deutschland) durch Applikation von Tropfen mit einem Volumen von 1 nl auf einen epoxyfunktionalisierten Objektträger. Geeignete GOPS-funktionalisierte Glasobjektträger können z.B von GeneScan, Freiburg, bezogen werden. Die bedruckten Träger werden nachfolgend für eine Zeitdauer von 2 Stunden bei 40 °C inkubiert. Ungebundene Peptide sowie Salze etc. können anschließend durch Waschen mit einer tensidhaltigen Pufferlösung (z.B. PBS mit 1 % SDS) entfernt werden.

Claims

Verfahren zum Aufbringen von Biomolekülen auf eine Oberfläche unter Verwendung einer die Biomoleküle enthaltenden wässrigen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung mindestens ein nicht-reduzierendes Disaccharid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an nicht-reduzierendem Disaccharid in der Zusammensetzung 1 bis 10 Gew.%, vorzugsweise 3 bis 7 Gew.%, und besonders bevorzugt 5 Gew.% beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine nicht-reduzierende Disaccharid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Trehalose (D-Glucopyranosyl-D-glucopyranose), Sucrose (β-D-Fructofuranosyl-α-D-glycopyranosid), sowie Derivaten davon, wobei die Auswahl von Trehalose bevorzugt ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung ferner mindestens ein nicht-ionisches Tensid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge an nicht-ionischem Tensid in der Zusammensetzung 0,001 bis 0,1 Gew.%, vorzugsweise 0,005 bis 0,05 Gew.%, und besonders bevorzugt 0,01 Gew.% beträgt.