AT502369A1

AT502369A1 - Verfahren zur detektion organischer verbindungen

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Publication number: AT502369A1
Application number: AT14942005A
Authority: AT
Original assignee: Bonn Guenther Dr; Austria Wirtschaftsserv Gmbh
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2005-09-12
Publication date: 2007-03-15
Also published as: WO2007030849A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion organischer Verbindungen, insbesondere Peptide oder Proteine, aus biologischen Probenlösungen, umfassend die Schritte
Inkubation der biologischen Probenlösungen mit wenigstens einer Sorte an der Oberfläche chemisch funktionalisierter, im Wesentlichen kugelförmiger Zellulose (Beads),
Abscheiden der in Lösung verbleibenden Substanzen von den inkubierten, funktionanlisierten Zellulose Beads, vorzugsweise durch Zentrifugieren,

Aufbringen der inkubierten, funktionanlisierten Zellulose Beads auf einen assenspektrometer Probenträger (Target) und
Analysieren der an die Zellulose Beads gebundenen organischen Verbindungen mittels Matrix Assisted Laser Desorptions-/lonisation-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS).
Die Detektion bzw.

qualitative, quantitative und/oder semiquantitative Analyse bestimmter organischer Verbindungen aus biologischen Proben ist ein wesentlicher Schritt zur Kontrolle des Metabolismus und in weiterer Folge zur Ermittlung des allgemeinen Gesundheitszustandes oder zur Früherkennung bzw. Diagnose von bestimmten Erkrankungen. Dabei misst man häufig sogenannte Biomarker (z.B. hochmolekulare, biochemische, makromolekulare Verbindungen, wie z.B. Polypeptide, Ribonucleinsäuren, Kohlehydrate, Lipide usw., manchmal aber auch niedermolekulare, einfache Moleküle), die bei erhöhter oder verringerter Konzentration einen Hinweis auf eine vorliegende Störung im Metabolismus liefern können. In weiterer Folge werden alle derartigen Verbindungen mit dem Überbegriff organische Verbindungen zusammengefasst.

Insbesondere bei der Früherkennung von Krebserkrankungen, aber auch im Verlauf von anderen Erkrankungen, wie z.B. viralen oder bakteriellen Infektionen, ist die Messung von derartigen "Biomarkern" (organische Verbindungen) erforderlich. Die eigentliche Schwierigkeit liegt darin, dass in den biologischen Proben eine Vielzahl von verschiedenen organischen und anorganischen Verbindungen, Ionen usw. vorliegen. Zu untersuchen gilt es aber ein bestimmtes oder eine Gruppe von bestimmten Molekülen, organischen Verbindungen und/oder deren Metaboliten qualitativ, quantitativ oder semiquantitativ zu bestimmen. Herkömmliche biochemische Verfahren, wie z.B. ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) oder RIA (radio immuno
57034 38/hn assay) sind extrem aufwändig, da sie beispielsweise Antikörpern, z.

T. sogar monoklonalen Antikörpern gegen die zu bestimmende organische Verbindung erfordern. Auch chromatographische Trennverfahren sind häufig extrem aufwändig, teuer und teilweise zu wenig effektiv. Typischerweise werden derzeit vor allem Gelelektrophoreseverfahren angewendet (z.B. SDS-Polyacrylamid-Geleleketrophorese oder Agarose-Gelelektrophorese), wobei einfache eindimensionale Gelelektrophoreseverfahren relativ ungenau sind und die quantitative Bestimmung trotzdem aufwändig und relativ schlecht reproduzierbar ist.

Während herkömmliche eindimensionale Gelelektrophoreseverfahren lediglich eine Auftrennung der organischen Verbindungen nach der Molekülmasse durchführen, wird bei zweidimensionalen Elektrophoreseverfahren, neben dem Auftrennen nach unterschiedlicher Masse auch noch eine Auftrennung nach unterschiedlicher Ladungungsverteilung im Molekül mittels isoelektrischer Fokussierung durchführt. Zweidimensionalen Elektrophoreseverfahren sind ebenfalls sehr aufwändig und nur von geübtem Personal durchführbar.

Darüber hinaus sind solche Verfahren relativ zeitaufwändig und man kann bei zweidimensionalen Gelelektrophoreseverfahren immer nur eine Einzelprobe pro Gel analysieren, was den Platzbedarf und auch den Aufwand und Materialbedarf deutlich erhöht.
Seit der Entwicklung des sogenannten MALDI-Verfahrens (matrix-assisted laser desorption ionisation) insbesondere mit der Koppelung "Time of flight" (also Flugzeit) Massenspektrometrie durch Hillenkamp und seine Mitarbeiter im Jahr 1988 war es möglich, massenspektrometrische Verfahren zur Analyse hochmolekularer organischer Verbindungen einzusetzen.

Erst die Einführung einer chemischen Matrix ermöglichte es grössere biologische oder organische Moleküle - durch Anregung der Matrix und der darin eingebetteten und zu untersuchenden Moleküle - mit einem Laser derartig zu ionisieren, dass eine systematische und reproduzierbare Analyse mittels Massenspektrometrie möglich war.
In weiterer Folge kam es zu zahlreichen Weiterentwicklungen des MALDI-Verfahrens. Insbesondere in der EP 0 700 521 wird eine Technik vorgestellt, bei der auf einen Massenspektrometer-Probenträger, der funktionalisiert wurde, eine Lösung aufgebracht wird, sodass die zu untersuchenden organischen Verbindungen an die Funktionalität der Oberfläche binden können. Die nicht gebundenen Substanzen werden weggewaschen und anschliessend wird eine Matrix auf den Probenträger aufgebracht.

Lösungsmittel werden eingedampft, bis es zu einer Kristallisation der Matrix kommt, in die das zu untersuchende Molekül eingebettet ist. Daraufhin wird mit einem Laser die Oberfläche der Matrix beschossen, und ionisierte Molekülteile lösen sich aus der Matrix und können von einem Massenspektrometer detektiert werden. In der US 6,225,047 wird erstmals auch ein Verfahren nahegelegt, bei dem die zu analysierende Probe mittels funktionalisierten im Wesentlichen sphärischen makroskopischen Teilchen (z. B. Kügelchen oder Ellipsoide), zusammengefasst als sogenannte Beads, beispielsweise Zellulose-Beads, inkubiert wird. Anschliessend werden die Kügelchen abzentrifugiert und der Überstand der Lösung wird verworfen.

Die Kügelchen können daraufhin auf einen (meist funktionalisierten, d.h. derivatisierten) Massenspektrometer-Probenträger aufgebracht werden und durch Aufbringen einer Matrix wird das herkömmliche MALDI-Verfahren angewendet.
Die bisher bekannten Verfahren weisen den Nachteil auf, dass sie aufwändig und damit kosten intensiv sind und zum Teil in bestimmten Massenbereichen keine zufriedenstellende Auflösung im Massenspektrum zeigen oder nicht reproduzierbar sind.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung mit verbesserten Eigenschaften zu schaffen.
Erfindungsgemäss wird dies dadurch erreicht, dass die funktionalisierten Zellulose-Beads einen mittleren Durchmesser von < 20 [mu]m aufweisen, vorzugsweise von etwa 8-10 [mu]m.
Der Erfindung liegt die überraschende Kenntnis zugrunde,

dass funktionalisierte ZelluloseBeads mit einem mittleren Durchmesser von < 20 [mu]m, vorzugsweise 8-10 [mu]m, besonders gute Trenn- und Analyseneigenschaften im MALDI-TOF MS aufweisen, und zwar insbesondere in einem Massenbereich der zu untersuchenden Verbindungen von etwa 500 Da bis etwa 80 kDa (entspricht also 500 g/mol - 80.000 g/mol). Bisher war es üblich, zur Aufreinigung oder Abtrennung von hochmolekularen organischen Verbindungen, beispielsweise Enzymen aus einer Lösung, Zellulose-Beads zu verwenden, die einen mittleren Durchmesser von etwa 500 - 1500 [mu]m aufweisen. Solche Zellulose-Beads sind beispielsweise von Chen und Zhao erstmals charakterisiert worden (Biotechnology and Bioengineering, 8 (1976) 1507-1516 und Biotechnology and Bioengineering, 19 (1976), 1463-1473).

Die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Zellulose-Beads eignen sich gut zur Immobilisierung bzw. zur Bindung von Proteinen, wie z.B. Enzymen. Allerdings hat sich bei der Verwendung derartiger Beads im MALDI-Prozess herausgestellt, dass bei direktem Aufbringen derartig inkubierter Beads auf dem Massenspektrometer-Probenträger nur eine sehr schlechte Auftrennung im oben erwähnten Massenbereich stattfindet. Auch die Signalintensität hat sich als gering erwiesen und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse war nicht sehr gut.
Am Thüringer Institut für Textil- und Kunststoffforschung e.V. wurde von F.

Meister im Rahmen eines Projektes mit dem Titel "Verfahrensentwicklung zur Herstellung von sphärischen makroporösen Zellulose-Partikeln für den Einsatz in Medizin, Biotechnologie und Pharmazie" Zellulosepartikel mit einem mittleren Durchmesser von etwa 100 - 1000 [mu]m untersucht. Diese weisen besonders günstige physikalische und chemische Eigenschaften auf. Wie in weiterer Folge gezeigt werden wird, eigenen sich Partikel mit einem mittleren Durchmesser von > 20 [mu]m nur schlecht für den Einsatz im MALDI-TOF MS. Vermutlich sind die bisher zur Immobilisierung von Proteinen eingesetzten Zellulose-Beads zu gross oder die Ionisierung der organischen Verbindungen kann im MALDI-TOF MS nicht ausreichend erfolgen.
Als besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn die Zellulose-Beads porös sind.

Insbesondere sollten die Zellulose-Beads eine spezifische Oberfläche von 1m<2>/g bis 30m<2>/g, vorzugsweise von etwa 9,7m<2>/g aufweisen. Durch die Porosität der Zellulose-Beads wird die Oberfläche deutlich erhöht und es ist eine grössere Fläche zur Adsorption von makromolekularen organischen Verbindungen gegeben. Je grösser die Porosität, umso grösser die Oberfläche der Zellulose-Beads. Aufgrund des grossen Durchmessers der Makromoleküle soll die mittlere spezifische Oberfläche jedoch nicht zu gross werden (was z.B. einer grossen Anzahl kleiner Poren entsprechen würde), da in zu kleinen Poren Makromoleküle nicht mehr ausreichend binden bzw.

Makromoleküle, sterisch bedingt, nicht mehr in die Poren eindringen können.
Besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn der mittlere Porendurchmesser der ZelluloseBeads etwa 0,2 [mu]m bis 1 [mu]m, bevorzugt etwa 0,3 [mu]m bis 0,4 [mu]m, beträgt. In diesem Durchmesserbereich der Poren können Moleküle der oben genannten Grössen besonders gut adsorbieren. Bei einer Porengrösse von etwa 0,1 [mu]m, wie es von Chen und Zhao beschrieben wird, ist die Fähigkeit der Zellulose-Teilchen Makromoleküle zu adsorbieren, deutlich schlechter. Die Grösse der Poren und damit die Adsorptionsfähigkeit für Biomoleküle bzw. allgemein für organische Verbindungen hängt also vom Verhältnis des Durchmessers des zu adsorbierenden Moleküls zur Porengrösse ab.

Selbstverständlich kann die Struktur von beispielsweise Proteinen oder Polypeptiden sowohl eher faserförmig als auch eher kugelförmig sein. Bei einer beispielsweise eher kugelförmigen dreidimensionalen (= tertiären) Struktur eines Proteins kann man im angegebenen Massenbereich (0,5 kDa bis etwa 80 kDa) mit einem Durchmesser bis zu einige Nanometer rechnen (bspw. ca. 5-7 nm für Albumin). Folglich hat es sich als günstig herausgestellt, wenn der Porendurchmesser der Zellulose-Beads etwa 50 bis 500, vorzugsweise etwa hundertmal grösser ist als der Moleküldurchmesser der zu untersuchenden organischen Verbindungen.
Zellulose weist an sich an chemischer Funktionalität nur freie OH-Gruppen auf.

Da diese OH-Gruppen nur eine eingeschränkte Fähigkeit haben, Proteine oder andere Makromoleküle zu binden, z.B. durch Wasserstoffbrückenbindungen, ist es günstig, wenn die Zellulose an der Oberfläche funktionalisiert ist, d.h. man bindet kovalent an die Zellulose (= man derivatisiert die Zellulose) andere chemische Gruppen, die in weiterer Folge als chemische Funktionalisierung bezeichnet werden und unterschiedliche chemische Gruppen umfasst. Günstig ist es beispielsweise, wenn diese chemische Funktionalisierung in der Lage ist, Komplexbindungen mit dem Makromolekül einzugehen. Günstig hat es sich daher erwiesen, wenn die funktionalisierten Zellulose Beads mit Metallionen, vorzugsweise zwei- oder mehrwertigen Metallionen, beladen sind.

Durch die Beladung mit Metallionen können insbesondere Komplexbindungen mit freien OH-Gruppen, NH-Gruppen, SH-Gruppen, Ethergruppen oder Carboxylgruppen gebildet werden. Dabei hat es sich als günstig herausgestellt, wenn die Metallionen aus der Gruppe Fe<2+>, Fe<3+>, Al<3+>, Bi<3*>, Cu\ Cu<2>\ Mn<2*>, Ca<2+>, Mg<2+>, Zn<2+>, Cd<2+>, Au<2+>, Pd<2+>, Cr stammen. In der bevorzugten Variante werden Cu<2+>lonen verwendet.
Ein besonderer Vorteil in der Verwendung von funktionalisierten Zellulose-Beads liegt darin, dass die Immobilisierung der organischen Verbindungen in Suspension ertolgt. Dadurch ist eine besonders leichte Abtrennung der in Lösung verbleibenden organischen Verbindungen, von jenen die an die Zellulose-Beads binden, möglich, bspw. durch Zentrifugieren.

Der Rückstand nach einem Zentrifugationsschritt (unter milden Zentrifugationsbedingungen) bildet eine Art Suspension, in der die Zellulose-Beads mit gebundenen organischen Verbindungen vorliegen. Diese werden anschliessend auf den MassenspektrometerProbenträger aufgebracht, beispielsweise aufpipettiert. Dabei hat es sich als besonders günstig herausgestellt, wenn der Massenspektrometer-Probenträger frei von Funktionalitäten ist. Frei von Funktionalitäten bedeutet hier, dass die Oberfläche nicht durch einen zusätzlichen Derivatisierungsschritt chemisch verändert wird. Die Funktionalisierung des Massenspektrometer-Probenträgers ist besonders aufwändig und kostenintensiv, dies ist aber beim Stand der Technik oft erforderlich. Das Arbeiten in "Suspension" verringert daher die Kosten des Verfahrens deutlich.

Ein Hauptvorteil an diesem Verfahren liegt also darin, dass die Funktionalitäten zur Bindung der organischen Verbindungen nicht mehr durch komplexe Derivatisierungsverfahren auf den Massenspektrometer-Probenträger angekoppelt werden müssen, sondern dass die Derivatisierung der Beads einfach in Lösung oder Suspension erfolgen kann. Der Massenspektrometer-Probenträger muss also nicht weiter funktionalisiert werden.
Dabei hat es sich auch als günstig erwiesen, wenn der Massenspektrometer Probenträger aus leitfähigem Material, vorzugsweise aus rostfreiem Stahl, Titan oder Graphit besteht. Selbstverständlich kann zur weiteren Verbesserung der Auftrennung des Verfahrens ein derivatisierter Massenspektrometer-Probenträger verwendet werden.
Nach Aufbringen der inkubierten Zellulose-Beads auf den Massenspektrometer-Probenträger wird eine Matrix aufgebracht und kristallisiert.

Bei diesem Verfahren hat es sich bewährt, wenn als Matrix hauptsächlich Sinapinsäure und/oder [alpha]-Cyano-4-hydroxyzimtsäure verwendet wird. Die Matrix wird beispielsweise als Lösung aufpipettiert, und das, vorzugsweise flüchtige, Lösungsmittel wird vor dem lonisationsschritt verdampft. Daneben können aber auch andere aus der Literatur bekannten Matrixsubstanzen verwendet werden.
Dieses Verfahren ist besonders geeignet, wenn die organischen Verbindungen eine Masse von 500 Da bis 80 kDa, vorzugsweise von 2 kDa bis 20 kDa aufweisen. Insbesondere in diesem Massenbereich ist die Auftrennung der einzelnen Verbindungen besonders gut.
Die biologischen Proben können aus unterschiedlichen Bereichen gewonnen werden.

Beispielsweise können die biologischen Probenlösungen aus der Gruppe Blut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Gewebsflüssigkeit, Zellextrakten, Gewebeextrakten, Organextrakten oder Cerebrospinalflüssigkeit stammen.
In einer Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass die Zellulose-Beads wenigstens einen Linker aufweisen, der zwischen Zellulose und der chemischen Funktionalisierung angeordnet ist. Unter einem Linker versteht man eine Verbindung, die kovalent an eine freie OH-Gruppe von Zellulose gebunden wird und beispielsweise eine freie Funktionalität aufweist, die für eine weitere Derivatisierung verwendet werden kann. Es ist aber auch möglich, dass der Linker selbst die chemische Funktionalisierung aufweist, die zur Bindung der organischen Verbindung verwendet wird.

Beispielweise könnte die chemische Funktionalisierung eine freie Carboxylgruppe sein, die ein Metallion bindet, das in weiterer Folge als Komplexbildner für eine organische Verbindung dient. Insgesamt ist also vorgesehen, dass der Linker mindestens eine Bindefunktionalität umfasst. Dabei ist besonders bevorzugt vorgesehen, dass die Bindefunktionalität ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus KohlenstoffBindungen, Epoxiden, Halogenen, Aminogruppen, Hydroxygruppen, Säuregruppen, Säurechloride, Cyanidgruppen, Aldehydgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen, Phosphatgruppen, Metall-komplexierende Gruppen, Antikörper gegen Protein A, Antikörper gegen Protein G, Thioethern, Biotin, Thiolen und Mischungen davon, ist.

Alternativ dazu ist es aber auch möglich, wenn der Linker eine Epoxidgruppe umfasst und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycidyl Methacrylat, Epichlorhydrin, 3,4-Epoxybutyl Acrylat, 2-Methyl-2-Propenyl- Oxirancarbonsäure-Ester, 3-(2-Methyloxiranyl)-2-Propensäure-MethylEster, Dihydro-4-(2-Propenyloxy)-2(3H)-Furanon, 2-Methyl-2-Propensäure-OxiranylmethylEster, Tetrahydro-3-Furanyl-2-Propensäure-Ester, Oxiranylmethyl-2-Butensäure-Ester, 1Methylethenyl-Oxiranessigsäure-Ester, Oxiranylmethyl-3-Butensäure-Ester, (3-
Methyloxiranyl)-Methyl-2-Propensäure-Ester, 3-Oxiranyl-2-Propensäure-Ethyl-Ester, 2Methyl-2-Propenyl-Oxirancarbonsäure-Ester, 2-Oxiranylethyl-2-Propensäure-Ester, 3-(3Butenyl)-Oxirancarbonsäure, 2,3-Epoxy-Buttersäure-Allyl-Ester, 2,3-Epoxypropyl-
Crotonsäure-Ester, Tetrahydro-2-Furanyl-2-Propensäure-Ester, (2-Methyloxiranyl)

-Methyl-2Propensäure-Ester, 2-Methyl-2-Propensäure-3-Oxetanyl-Ester und Mischungen davon, stammt.
In einer weiteren Ausführungsvariante ist vorgesehen, dass der Linker eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, N-Carboxy- ss-Alanin, Asparaginsäure, 2-Amino-2-Methyl-Propandi-Säure, 2Furanessigsäure, 5-Ethyl-3-Hydroxy-4-Methyl-2(5H)-Furanon, Tetrahydro-4-Methylen-3Furanessigsäure, Asparagin-Säure, 2-Butendi-Säure, Methylen-Propandi-Säure und Mischungen davon, stammt.
Darüber hinaus wäre es denkbar, wenn der Linker eine Carbonsäuregruppe enthält und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Butendisäure, Ethylendicarbonsäure und Mischungen davon, stammt und insbesondere auch, wenn der Linker ein Halogen enthält und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Propenylchlorid,

Butenylchlorid, 1 -Brom-Propen, 1 -Chlor-Propen, 2-Brom-Propen, 2-ChlorPropen, 4- Chlor-1 -Buten, 4-Chlor-2-Buten, 3-Chlor-1 -Buten, 2-Methyl-1-Chlor-1 -Propen, 1Chlor-2-Buten, 1-Chlor-1 -Buten, 2-Chlor-3-Methyl-2-Buten, 3-Chlor-2-Methyl-2-Buten, 4Chlor-2-Penten, 2-Chlor-2-Penten, 1-Chlor-1-Penten, 1-Chlor-3-Methyl-1 -Buten, 1-Chlor-2Methyl-1 -Buten, 3-Chlor-2-Penten, 5-Chlor-2-Penten 1,5-Dichlor-2-Penten, 4,4-Dichlor-2Methyl-1 -Buten, 2-Chlor-5-Methyl-3-Hexen, 3-Chlor-4-Methyl-1 -Hexen, 2-Chlor-2-Methyl-3Hexen und Mischungen davon, ist.

Im Folgenden sollen anhand von Ausführungsbeispielen die ausgezeichneten Trenneigenschaften und die hervorragende Aufarbeitbarkeit von erfindungsgemässen funktionalisierten Zellulose-Beads im MALDI-TOF-MS-Prozess gezeigt werden.
Verwendete Materialien: Iminodiessigsäure, Acetonitril (HPLC-Qualität), Sinapinsäure, Glycidyl-methacrylat von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), anonymisierte Blutserenproben stammten von der Medizinischen Universität Innsbruck, Österreich.
Zellulose: 4 Typen von Zellulose wurden untersucht:
Zellulose Typ A (irreguläre Zellulose): Dabei handelt es sich um mikrokristalline Zellulose, wobei die Partikel einen Durchmesser von etwa 20 - 75 [mu]m aufweisen. Die Form der Teilchen ist Undefiniert, das heisst, die Teilchen können unterschiedliche dreidimensionale Strukturen aufweisen.

Dieser Typ von Zellulose stammt ebenfalls von Sigma Aldrich.
Zellulose Typ B: Dabei handelt es sich um sphärische Zellulose, die hergestellt wurde nach den Vorschriften von Chen und Zhao. Anschliessend wurden die so hergestellten Zellulosepartikel mit flüssigem Stickstoff gefroren und zerkleinert. Die so hergestellten Zellulosepartikel waren im Wesentlichen sphärisch und wiesen einen Durchmesser von 20 30 [mu]m auf.
Zellulose Typ C: Dabei handelt es sich um sphärische Zellulose, also um Zellulose-Beads, die bereits mit Triacetat (Triacetatzellulose) funktionalisiert sind und die etwa einen Partikeldurchmesser von 6 - 8 [mu]m aufweisen. Der mittlere Porendurchmesser der Teilchen beträgt etwa 0,19 [mu]m.

Die Partikel stammen von der Firma Chisso Corporation, Japan und wurden vor Gebrauch renaturiert, d.h. das Triacetat wurde hydrolytisch abgespalten.
Zellulose-Typ D: Dabei handelt es sich um erfindungsgemässe Zellulose-Beads bzw. sphärische Zellulose mit besonders guten Eigenschaften, wobei der mittlere Durchmesser der Partikel etwa 8 - 10 [mu]m beträgt und der mittlere Porendurchmesser etwa 0,34 [mu]m beträgt. Die Partikel stammen ebenfalls von der Firma Chisso Corporation, Japan.
Herstellung von IDA-Cu<+>-Zellulose:
Zur Derivatisierung bzw. Funktionalisierung von Zellulose wurden 5 g der jeweiligen Typen
A, B, C oder D unter starkem Rühren in 230 ml Wasser für 2 Minuten dispergiert.

Die so er haltene Suspension an Zellulose wurde mit 328 mM monomerem Glycidyl-methacrylat, 6,5 mM Ammoniumpersulfat und 8,6 mM Natriumthiosulfat als Redoxkatalysator versetzt und für
2 Stunden bei 70[deg.]C polymerisiert. Nach Polymerisation wurde die Aufpfropfreaktion durchgeführt, indem die Temperatur auf etwa 80[deg.]C erhöht wurde und die Reaktion weitere 2 Stunden verlief. Die so erhaltene Suspension wurde abfiltriert und mit deionisiertem Wasser mehrfach gewaschen. Der Rückstand an derivatisierter Zellulose wurde in 113 mM Iminodiessigsäure dispergiert, indem Iminodiessigsäure in 200 ml in einer 2 molaren Natriumcarbonat aufgelöst wurden, gefolgt von der Zugabe von 86 mM Natriumchlorid. Die gesamte Suspension wurde für 5 Stunden bei 75[deg.]C unter starkem Rühren reagieren gelassen.

Das Endprodukte wurde bei angelegtem Vakuum filtriert, mit deionisiertem Wasser gewaschen und mit Cu<2+>-lonen gesättigt, durch Inkubation für 2 Stunden der derivatisierten Zellulose mit einer 50 mM Cu<2+>-Lösung bei etwa 23[deg.]C. Als Cu<2+>-Lösung kommt beispielsweise CuSO4in Frage.
Blutserumproben-Vorbereitung:
40 [mu]l Blutserum wurden mit 30 [mu]l 8 M Harnstoff, enthaltend 1% 3-[3-(Cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propansulfat (CHAPS) in phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) behandelt, indem für etwa 5 Minuten die so inkubierte Blutserumlösung geschüttelt wurde. Danach wurden 100 [mu]l einer 1 M Harnstofflösung mit 0,125% CHAPS zugegeben und die Lösung wurde kurz geschüttelt.

Anschliessend wurde die so erhaltene Lösung 1:5 in PBS verdünnt und bei 4[deg.]C für ca. 10 Minuten am Vortex geschüttelt.
IDA-Cu<2+>-Zellulose:
3 [mu]g der suspendierten IDA-Cu<2+>-Zellulose wurden in ein 0,5 ml Zentrifugenröhrchen gefüllt und mit 50 mM Natriumacetatpuffer bei Raumtemperatur aktiviert und anschliessend bei 13.000 Umdrehungen/min für ca. 1 Minute zentrifugiert. Nach dem Zentrifugationsschritt wurde der Überstand weggeschüttet und der Rückstand zweimal mit 200 [mu]l PBS-Puffer equilibriert.
Probenanalyse mittels IDA-Cu<2+>-Zellulose:
Von der zuvor bereiteten Serumlösung wurden 400 [mu]l zu der equilibrierten IDA-Cu<2+>Zellulosesuspension gegeben. Die so erhaltene Suspensionsmischung wurde auf einem Plattform-Schüttelgerät bei 1500 Umdrehungen/min für ca. 2 Stunden bei 30[deg.]C inkubiert.

Um das ungebundene Material von der IDA-Cu<2+>-Zellulose zu entfernen, wurde diese dreimal mit 200 [mu]l PBS-Puffer gewaschen und anschliessend mit 200 [mu]l ionisiertem Wasser gewaschen. 1 [mu]l dieser so erhaltenen Suspensionsmischung wurde auf einem rostfreien Massenspektrometer-Probenträger aufpipettiert gefolgt von der Zugabe von 1 [mu]l gesättigter Sinapinsäure in 50% Acetonnitril und 0,1% Trifluoressigsäure. Anschliessend erfolgt ein Trocknungsschritt dieser Matrixlösung an der Luft.
MALDI-TOF-MS Analyse:
Die an die derivatisierte Zellulose gebundenen Makromoleküle, insbesondere Proteine, wurden mittels MALDI-TOF-MS analysiert (auf einem Ultraflex-MALDI-TOF-MS-Gerät von Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland). Alle Proben wurden im sogenannten Linearmodus gemessen und die Spannung des Detektors wurde auf 1623 Volt gesetzt.

Die Daten wurden gesammelt, indem 120 Laserschüsse gemitteit wurden. Die Analyse erfolgte im Massenbereich von 2000 Da bis 10.000 Da. Die Validierung aller erhaltenen Daten inklusive Basisliniensubtraktion der TOF-Daten, externe Kalibrierung mittels dem Protein I Standard (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) und die weitere Datenverarbeitung wurden mit der Software-Flexanalysis 2.0 durchgeführt. Für die Datenaquirierung wurde die SoftwareFlexkontroll 2.0 verwendet.
In Fig. 1 ist das Ergebnis der so untersuchten vier verschiedenen Zellulosetypen (A, B, C, D) graphisch dargestellt. Auf der Abszisse ist das Masse zu Ladungsverhältnis (M/Z) der ionisierten Moleküle erkennbar, und zwar in einem Massebereich von 2000 Da bis 10.000 Da.

Die Ordinate beschreibt die Signalgrösse der massenspektrometrischen Analyse nach MALDI-TOF-MS, wobei primär das relative Ergebnis der Signalhöhen zueinander zu beachten ist. Es ist gut erkennbar, dass insbesondere beim Zellulose-Typ D in beinahe allen Massenbereichen eine besonders gute Auftrennung erfolgt, insbesondere im Bereich 4000 5000 Da und 7000 - 9000 Da. Die Ergebnisse waren auch noch mit drei Wochen lang gelagerten Proben praktisch identisch. Auch die sphärischen funktionalisierten ZelluloseBeads vom Typ B lieferten noch gute Ergebnisse bei der massenspektrometrischen Analyse, wenngleich die Signalintensität bereits geringer war als beim Typ A. Primär zurückzuführen ist dies auf die verschlechterte Oberflächenzugänglichkeit der organischen Verbindungen auf den funktionalisierten Zellulose-Beads.

Die Oberflächenzugänglichkeit und damit die Adsorptionsfähigkeit der organischen Verbindungen an den funktionalisierten ZelluloseBeads hängt einerseits vom mittleren Porendurchmesser und andererseits von der Partikelgrösse der Zellulose-Beads ab. Die Untersuchungen ergaben, dass der günstigste Porendurchmesserbereich bei etwa 0,34 [mu]m liegt. Vor allen Dingen aber ist auch die Partikelgrösse entscheidend, wobei sich hier herausgestellt hat, dass eine Partikelgrösse zwischen 8 und 10 [mu]m besonders gut geeignet ist. Diese Partikel lassen sich leicht verarbeiten, sowohl bei der Derivatisierung als auch beim anschliessenden Aufpipettieren auf den Massenspektrometer-Probenträger.

Insbesondere die grösseren Partikel (Typ B und Typ A) waren in ihrer Handhabbarkeit beim Pipettieren und beim Aufarbeiten deutlich schwieriger.
Bei der sphärischen Zellulose vom Typ B ist die Auftrennung in allen Massenbereichen bereits so schlecht, dass eine eindeutige Aussage zur Ermittlung des Vorhandenseins bestimmter Biomarker nicht mehr sinnvoll möglich ist. Die Zellulose vom Typ A liefert bereits derart ungenaue Ergebnisse, dass die wichtigsten Signale allenfalls als verstärktes Hintergrundrauschen erkennbar sind.
Fig. 2 zählt noch einmal schematisch die wichtigen Schritte (A) der Zellulose-Derivatisierung anhand eines Beispiels auf: Erster Schritt die freien OH-Gruppen der Zellulose (nicht derivatisiert) werden mit Glycidyl-methacrylat versetzt. Dadurch entsteht, wie in Schritt 2 gezeigt, Zellulose mit Glycidyl-methacrylat gebunden und einer freien Epoxidgruppe.

Anschliessend wird die so derivatisierte Zellulose mit Iminodiessigsäure (IDA) und Na2CO3versetzt. Im letzten Schritt wird noch Cu<2+>zugesetzt, wodurch die Carboxylatgruppen das Cu<2+>komplexieren und z.B. mit Proteinen einen vierzähligen Komplex eingehen können.
In Fig. 3 wird die Probenvorbereitung gezeigt, wo zuerst derivatisierte Zellulose-Beads mit den Blutserumproben versetzt werden. In Schritt 2 erfolgt die Inkubation und das Binden der organischen Verbindungen an die funktionalisierten Zellulose-Beads, anschliessend erfolgt in Schritt 3 ein Wasch- und Zentrifugationsschritt. In Schritt 4 wird die Probe (also die ZelluloseBeads mit den gebundenen organischen Verbindungen in Form einer Suspension) auf den Massenspektrometer-Probenträger aufpipettiert. Nach Zugabe der Matrix (hier nicht gezeigt) wird eine direkte Analyse der Teilchen mittels MALDI-TOF-MS durchgeführt.

(Schritt 5)
Innsbruck, am 8. September 2005 Für Dr. Günther Bonn und Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung: Die Vertreter:
Patentanwälte
Dr.DJL E[eta]Aeibert Hofmger
Magbc. Raul N. Torggler
Dr. Dipr[pound]w9 s*<y>»j.<»>'<!l11>rt[upsilon]finger

Claims

1. Verfahren zur Detektion organischer Verbindungen, insbesondere Peptide oder Proteine, aus biologischen Probenlösungen, umfassend die Schritte

Inkubation der biologischen Probenlösungen mit wenigstens einer Sorte an der Oberfläche chemisch funktionalisierter, im Wesentlichen kugelförmiger Zellulose (Beads),

Abscheiden der in Lösung verbleibenden Substanzen von den inkubierten, funktionanlisierten Zellulose Beads, vorzugsweise durch Zentrifugieren,

Aufbringen der inkubierten, funktionanlisierten Zellulose Beads auf einen Massenspektrometer Probenträger (Target) und

Analysieren der an die Zellulose Beads gebundenen organischen Verbindungen mittels Matrix Assisted Laser Desorptions-/lonisation-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS),

dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierten Zellulose-Beads einen mittleren Durchmesser von < 20 [mu]m aufweisen, vorzugsweise von etwa 8-10 [mu]m.

1 . Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker mindestens eine Bindefunktionalität umfasst.

1 1. Verfahren nach Anspruch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Probenlösungen aus der Gruppe Blut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Gewebsflüssigkeit, Zellextrakten, Gewebeextrakten, Organextrakten oder Cerebrospinalflüssigkeit stammen.

1

Patentansprüche:

(2-Methyloxiranyl)-Methyl-2-Propensäure-Ester, 2-Methyl-2Propensäure-3-Oxetanyl-Ester und Mischungen davon, stammt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads porös sind.

2. Verfahren nach Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads porös sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads eine spezifische Oberfläche von 1m<2>/g bis 30m<2>/g, vorzugsweise von etwa 9,7m<2>/g aufweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Porendurchmesser der Zellulose-Beads etwa 0,2 [mu]m bis 1 [mu]m, bevorzugt etwa 0,3 bis 0,4 [mu]m, beträgt.ACHGERBCHT \

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4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Porendurchmesser der Zellulose-Beads etwa 0,2 [mu]m bis 1 [mu]m, bevorzugt etwa 0,3 bis 0,4 [mu]m, beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierten Zellulose Beads mit Metall-Ionen, vorzugsweise zweiwertigen Metall-Ionen, beladen sind.

5. Verfahren nach Anspmch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionalisierten Zellulose Beads mit Metall-Ionen, vorzugsweise zweiwertigen Metall-Ionen, beladen sind.

57034 38/hn

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metall-Ionen aus der Gruppe Fe<2+>, Fe<3+>, Al<3+>, Bi<3+>, Cu<+>, Cu<2+>, Mn<2+>, Ca<+>, Mg<2+>, Zn<2+>, Cd<2+>, Au<2+>, Pd<2+>, Cr<3*>stammen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Metall-Ionen aus der Gruppe Fe<+>, Fe<3+>, Al<3+>, Bi<3+>, Cu<+>, Cu<2+>, Mn<2+>, Ca<2+>, Mg<2+>, Zn<2+>, Cd<2+>, Au<2+>, Pd<2+>, Cr<3+>stammen.

7. Verfahren nach Anspmch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenspektrometer Probenträger frei von Funktionalitäten ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenspektrometer Probenträger frei von Funktionalitäten ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Massenspektrometer Probenträger aus leitfähigem Material, vorzugsweise aus rostfreiem Stahl, Titan oder Graphit besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass als Matrix hauptsächlich Sinapinsäure und/oder [alpha]-Cyano-4-hydroxyzimtsäure verwendet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, dass die organischen Verbindungen eine Masse von 500 Da bis 80 kDa, vorzugsweise von 2 kDa bis 20 kDa aufweisen.

11. Verfahren nach Anspmch 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Probenlösungen aus der Gruppe Blut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Gewebsflüssigkeit, Zellextrakten, Gewebeextrakten, Organextrakten oder Cerebrospinalflüssigkeit stammen.

12. Verfahren nach Anspmch 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads wenigstens einen Linker aufweisen, der zwischen Zellulose und der chemischen Funktionalisierung angeordnet ist.

12. Verfahren nach Anspruch 1-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads wenigstens einen Linker aufweisen, der zwischen Zellulose und der chemischen Funktionalisierung angeordnet ist.

13. Verfahren nach Anspmch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker selbst die chemische Funktionalisierung aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker selbst die chemische Funktionalisierung aufweist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker mindestens eine Bindefunktionalität umfasst.

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15. Verfahren nach Anspmch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindefunktionalität ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-Bindungen, Epoxiden, Halogenen, Aminogruppen, Hydroxygruppen, Säuregruppen, Säurechloride, Cyanidgruppen, Aldehydgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen, Phosphatgruppen, Metall-komplexierende Gruppen, Antikörper gegen Protein A, Antikörper gegen Protein G, Thioethern, Biotin, Thiolen und Mischungen davon, ist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindefunktionalität ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-Bindungen, Epoxiden, Halogenen, Aminogruppen, Hydroxygruppen, Säuregruppen, Säurechloride, Cyanidgruppen, Aldehydgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen, Phosphatgruppen, Metall-komplexierende Gruppen, Antikörper gegen Protein A, Antikörper gegen Protein G, Thioethern, Biotin, Thiolen und Mischungen davon, ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine Epoxidgruppe umfasst und vorzugsweise ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus Glycidyl Methacrylat, Epichlorhydrin, 3,4-Epoxybutyl Acrylat, 2-Methyl2-Propenyl- Oxirancarbonsäure-Ester, 3-(2-Methyloxiranyl)-2-Propensäure-MethylEster, Dihydro-4-(2-Propenyloxy)-2(3H)-Furanon, 2-Methyl-2-PropensäureOxiranylmethyl-Ester, Tetrahydro-3-Furanyl-2-Propensäure-Ester, Oxiranylmethyl-2Butensäure-Ester, 1 -Methylethenyl-Oxiranessigsäure-Ester, Oxiranylmethyl-3Butensäure-Ester, (3-Methyloxiranyl)-Methyl-2-Propensäure-Ester, 3-Oxiranyl-2Propensäure-Ethyl-Ester, 2-Methyl-2-Propenyl-Oxirancarbonsäure-Ester, 2Oxiranylethyl-2-Propensäure-Ester, 3-(3-Butenyl)-Oxirancarbonsäure, 2,3-EpoxyButtersäure-Allyl-Ester, 2,3-Epoxypropyl-Crotonsäure-Ester, Tetrahydro-2-Furanyl-2Propensäure-Ester,

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine Epoxidgruppe umfasst und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycidyl Methacrylat, Epichlorhydrin, 3,4-Epoxybutyl Acrylat, 2-Methyl2-Propenyl- Oxirancarbonsäure-Ester, 3-(2-Methyloxiranyl)-2-Propensäure-MethylEster, Dihydro-4-(2-Propenyloxy)-2(3H)-Furanon, 2-Methyl-2-PropensäureOxiranylmethyl-Ester, Tetrahydro-3-Furanyl-2-Propensäure-Ester, Oxiranylmethyl-2Butensäure-Ester, 1 -Methylethenyl-Oxiranessigsäure-Ester, Oxiranylmethyl-3Butensäure-Ester, (3-Methyloxiranyl)-Methyl-2-Propensäure-Ester, 3-Oxiranyl-2Propensäure-Ethyl-Ester, 2-Methyl-2-Propenyl-Oxirancarbonsäure-Ester, 2Oxiranylethyl-2-Propensäure-Ester, 3-(3-Butenyl)-Oxirancarbonsäure, 2,3-EpoxyButtersäure-Allyl-Ester, 2,3-Epoxypropyl-Crotonsäure-Ester, Tetrahydro-2-Furanyl-2Propensäure-Ester,

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine chemische Gmppe ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, N-Carboxy- ss-Alanin, Asparaginsäure, 2-Amino-2Methyl-Propandi-Säure, 2-Furanessigsäure, 5-Ethyl-3-Hydroxy-4-Methyl-2(5H)Furanon, Tetrahydro-4-Methylen-3-Furanessigsäure, Asparagin-Säure, 2-ButendiSäure, Methylen-Propandi-Säure und Mischungen davon, enthält.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine chemische Gruppe ausgewählt aus der Gmppe, bestehend aus Iminodiessigsäure, Nitrilotriessigsäure, N-Carboxy- ss-Alanin, Asparaginsäure, 2-Amino-2Methyl-Propandi-Säure, 2-Furanessigsäure, 5-Ethyl-3-Hydroxy-4-Methyl-2(5H)Furanon, Tetrahydro-4-Methylen-3-Furanessigsäure, Asparagin-Säure, 2-ButendiSäure, Methylen-Propandi-Säure und Mischungen davon, enthält.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellulose Beads über Epichlorhydrin und/oder Glycidylmethacrylat, als Linker, mit Iminodiessigsäure modifiziert sind.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine Carbonsäuregruppe enthält und vorzugsweise aus der Gmppe bestehend aus 2-Butendisäure, Ethylendicarbonsäure und Mischungen davoi stammt.

NACHGEREICHT

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine Carbonsäuregruppe enthält und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 2-Butendisäure, Ethylendicarbonsäure und Mischungen davon, stammt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ein Halogen enthält und vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Propenylchlorid, Butenylchlorid, 1 -Brom-Propen, 1 -Chlor-Propen, 2-BromPropen, 2-Chlor-Propen, 4- Chlor-1 -Buten, 4-Chlor-2-Buten, 3-Chlor-1 -Buten, 2-Methyl-1-Chlor-1 -Propen, 1-Chlor-2-Buten, 1-Chlor-1 -Buten, 2-Chlor-3-Methyl-2Buten, 3-Chlor-2-Methyl-2-Buten, 4-Chlor-2-Penten, 2-Chlor-2-Penten, 1-Chlor-1Penten, 1-Chlor-3-Methyl-1 -Buten, 1-Chlor-2-Methyl-1 -Buten, 3-Chlor-2-Penten, 5Chlor-2-Penten 1,5-Dichlor-2-Penten, 4,4-Dichlor-2-Methyl-1 -Buten, 2-Chlor-5Methyl-3-Hexen, 3-Chlor-4-Methyl-1 -Hexen, 2-Chlor-2-Methyl-3-Hexen und Mischungen davon, ist.

Innsbruck, am 8. September 2005

Für Dr. Günther Bonn und Austria Wirtschaftsservice Gesellschaft mit beschränkter Haftung: Die Vertreter:

Dr. Dip

Patentanwälte Dr.DA Engelbert Hofmger Magfcr. Raul N. Torggler . Dip JfKftg ptephärT[Eta]Ofinger

Patentansprüche:

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker ein Halogen enthält und vorzugsweise ausgewählt aus der Gmppe bestehend aus Propenylchlorid, Butenylchlorid, 1 -Brom-Propen, 1 -Chlor-Propen, 2-BromPropen, 2-Chlor-Propen, 4- Chlor-1 -Buten, 4-Chlor-2-Buten, 3-Chlor-1 -Buten, 2-Methyl-1-Chlor-1 -Propen, 1-Chlor-2-Buten, 1-Chlor-1 -Buten, 2-Chlor-3-Methyl-2Buten, 3-Chlor-2-Methyl-2-Buten, 4-Chlor-2-Penten, 2-Chlor-2-Penten, 1-Chlor-1Penten, 1-Chlor-3-Methyl-1 -Buten, 1-Chlor-2-Methyl-1 -Buten, 3-Chlor-2-Penten, 5Chlor-2-Penten 1 ,5-Dichlor-2-Penten, 4,4-Dichlor-2-Methyl-1-Buten, 2-Chlor-5Methyl-3-Hexen, 3-Chlor-4-Methyl-1 -Hexen, 2-Chlor-2-Methyl-3-Hexen und Mischungen davon, ist.

Innsbruck, am 10. Juli 2006

NACHGEREICHT