DE102018130134A1

DE102018130134A1 - Verfahren zum Nachweis von Analyten in Proben

Info

Publication number: DE102018130134A1
Application number: DE102018130134.0A
Authority: DE
Inventors: Gerhard Rödel; Kai Ostermann; Julia Döring; Christian Dahmann; Tilo Pompe; David Rettke; Steve Martin
Original assignee: Technische Universitaet Dresden; Universitaet Leipzig
Current assignee: Technische Universitaet Dresden; Universitaet Leipzig
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-05-28
Also published as: WO2020109047A3; US20220026421A1; WO2020109047A2; EP3887825A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Oberfläche, einen Partikel sowie ein Kit zum Nachweis von niedermolekularen Analyten, wie etwa Pflanzenschutzmitteln in Proben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat durch protein-funktionalisierte Oberflächen und funktionalisierten Partikeln mittels Reflexionsinterferenzkontrast-Mikroskopie (RICM).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Oberfläche, einen Partikel sowie ein Kit zum Nachweis von niedermolekularen Analyten, wie etwa Pflanzenschutzmitteln, in Proben.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat durch protein-funktionalisierte Oberflächen und funktionalisierte Partikel mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie (RICM).
Der Nachweis von niedermolekularen Analyten gestaltet sich aktuell aufwändig. Insbesondere der Nachweis von Pflanzenschutzmitteln in Trinkwasser, Nahrungsmitteln und Bodenproben und deren gesundheitliche Auswirkungen sind aktuell von hohem Interesse. Problematisch erscheint dabei vor allem die Verunreinigung von Nahrungsmitteln inklusive Trinkwasser mit Glyphosat.
Die Detektion von Verunreinigungen mit Pflanzenschutzmitteln in Lebensmitteln erfolgt nach der Multimethode DFG S19, wobei zur Probenvorbereitung verschiedene Extraktionsschritte erfolgen und nachfolgend die labortechnische Analyse mittels LC-MS oder GC-MS erfolgt.
Weiterhin ist aus der EP2 752 664 A1 ein Verfahren zur Detektion von Analyten bekannt. Dabei erfolgt die Immobilisierung eines Analyten an Hydrogelpartikel, welche nachfolgend mit einem auf einer Oberfläche immobilisierten Liganden interagieren. Abhängig vom Grad der Interaktion erfolgt eine Deformierung der Hydrogelpartikel durch Anlagerung an die Oberfläche, sodass die Deformierung mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie erfolgt. Dadurch kann eine Detektion bzw. Charakterisierung des Analyten erfolgen.
Im Stand der Technik sind zudem verschiedene Verfahren zur Bestimmung von Glyphosat bekannt.
So offenbart die CN102207495A ein Verfahren zur Bestimmung des Glyphosat-Gehalts in Bodenproben mittels HPLC.
Auch die WO2008118899 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Glyphosat mittels LC/GC gekoppeltem MS. Alternativ werden auch Nachweismethoden mittels Biolumineszenz ( WO2010104861A1 ) und ELISA ( WO2000014538A1 ) beschrieben.
Die WO2018057647 A1 beschreibt einen Assay für einen Biochip, bei dem Pestizide auf einer Sensorplattform detektiert werden können. Der Nachweis basiert dabei auf der Amplifikation von korrespondierenden Nukleinsäuren, was zu deutlich langen Analysezeiten im Bereich mehrerer Stunden führt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten anzugeben, welches die Nachteile im Stand der Technik überwindet.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zum Nachweis von Analyten vorgeschlagen, umfassend die Schritte:

- Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner,
- Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert
- Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Kompetitor, wobei der Kompetitor an einen Partikel immobilisiert ist und mit dem Analytbindungspartner interagiert,
- Detektion der an den Analytbindungspartner gebundenen Kompetitoren.

Unter niedermolekularen Analyten werden Stoffe oder Moleküle mit einer Molmasse von <800 g/mol verstanden.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten vor der Kontaktierung mit dem Partikel für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, vorzugsweise 1 bis 20 min, besonders bevorzugt 1 bis 10 min, ganz besonders bevorzugt 1 bis 7 min.
In einer alternativen Ausführungsform erfolgt eine gleichzeitige Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten und dem Partikel.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein funktionalisierter Partikel, wobei die Oberfläche des Partikels eine Funktionalisierung aufweist. Die Funktionalisierung dient dabei der Anbindung des Kompetitors. Beispielsweise kann die Funktionalisierung durch chemische Gruppen erfolgen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein Hydrogelpartikel.
In Ausführungsformen der Erfindung hat der Partikel einen Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt ein Durchmesser von um 25 µm.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel ein Elastizitätsmodul von 10 bis 100 kPa, besonders bevorzugt von 15 - 50 kPa auf. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
Die Ausführungsformen in Durchmesser und Elastizitätsmodul (hier Youngsche Elastizitätsmodul) der Partikel bestimmen unter anderem die Sensitivität und Zuverlässigkeit des Analyseverfahrens, wobei der Durchmesser durch optische Hellfeldmikroskopie und das Elastizitätsmodul aus Kraft-Abstands-Kurven der Atomkraftmikroskopie (AFM) bestimmt werden können.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel eine Carboxy-Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht 500 Da -8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt um 25 µm, erzeugt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder ein bifunktionaler Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) von 5 - 200 Å, bevorzugt 10 - 50 Å auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker einen Polymerisationsgrad von 1 - 70, bevorzugt 3 -20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 Å; PG = 1 oder Pentaglycin: L=16,3 Å; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Å; PG = 68.
In Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker-Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgebildet zur Interaktion mit dem Analytbindungspartner, wobei der Kompetitor und der Analyt um die Interaktion mit dem Analytbindungspartner konkurrieren.
Dadurch wird eine Kompetition zwischen dem freien Analyten in einer Probe und dem partikelgebundenen Kompetitor erzeugt, wobei sich ein Gleichgewicht in Abhängigkeit der Analytkonzentration einstellt. Je mehr freier Analyt vorhanden ist, desto geringer ist die Bindung der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner. Im Ergebnis verringert sich die Kontaktfläche zwischen Partikel und Oberfläche. Im umgekehrten Fall, wenn wenig Analyt in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist, erfolgt eine erhöhte Bindung der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner, wobei sich die Kontaktfläche zwischen Partikel und Oberfläche vergrößert. In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor mit dem Analyten identisch.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ein Pflanzenschutzmittel ausgewählt aus der Gruppe der Phosphonate, Cyclohexandione, Aryloxyphenoxypropionate, Benzothiadiazole, Phenylpyridazine, Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone, und Phenoxycarbonsäuren.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ein Pflanzenschutzmittel ausgewählt aus der Gruppe der Enzyminhibitoren, welche unter anderem Verbindungen aus der Gruppe der Acetolactat Synthase Inhibitoren, Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat Inhibitoren, Glutamin Synthetase Inhibitoren, Lipid- und Fettsäuresynthese Inhibitoren, Acetyl CoA Carboxylase Inhibitoren, Dihydropteroat Synthase Inhibitoren, Protoporphyrinogen Oxidase Inhibitoren, Cellulose Synthese Inhibitoren, Carotinoid Synthese Inhibitoren, Photosystem II Inhibitoren sowie Auxintransport Inhibitoren umfassen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), ein Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) oder Glyphosat.
Glyphosat (N-(Phosphonomethyl)glycin) ist ein nicht-selektives Blattherbizid (Breitband- oder Totalherbizid) mit systemischer Wirkung, das über jegliche grüne Pflanzenteile aufgenommen wird. Glyphosat wird in der Landwirtschaft gegen einkeim- und zweikeimblättrige Unkräuter im Acker-, Wein- und Obstbau, beim Anbau von Zierpflanzen, auf Wiesen, Weiden und Rasenflächen sowie im Forst verwendet. Die Blätter nehmen Glyphosat durch Diffusion auf und in der Pflanze wird Glyphosat über das Phloem verteilt. Glyphosat wirkt über die Blockade des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), das zur Synthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin über den Shikimatweg in Pflanzen, wie auch in einigen Mikroorganismen, benötigt wird. Durch die Ähnlichkeit des Glyphosats mit dem natürlichen Substrat Phosphoenolpyruvat des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) wird dieses Enzym gehemmt.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung sind sowohl Kompetitor als auch Analyt Glyphosat.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum eines Enzyms ausgewählt aus 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), Glyphosat-N-Acetyltransferase oder Glyphosat-Oxidase auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPs beträgt ca. 10 Å in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt. Die angegebenen Mischungsverhältnisse beziehen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf die Stoffmengen.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5. Durch Variation des Verhältnisses von Fusionsprotein und Hydrophobin auf der Oberfläche kann zusätzlich die Sensitivität gegenüber Glyphosat sehr gezielt eingestellt werden und ermöglicht damit einen Nachweis von Glyphosat über einen weiten Konzentrationsbereich.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glasformkörpersein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche transparent, semitransparent oder opak ausgebildet. Bevorzugt ist die Oberfläche zumindest im Bereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Detektion mittels Quarzkristallmikrowaage (QCM), Oberflächenplasmonenspektroskopie (SPR), Rasterkraftspektroskopie (AFM) oder Impedanzspektroskopie.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Detektion mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie (RICM). Dabei werden die Kontaktradien α von Partikel und Oberfläche sowie die Partikelradien R_HGS mittels einer eigens dafür entwickelten Software automatisiert ermittelt werden. Gemäß Johnson-Kendall-Roberts Modell [2] stehen diese Größen mit der Adhäsionsenergie W_adh in folgendem Zusammenhang: $W_{a d h} = \frac{\frac{4}{3} α^{3} E_{H G S} / (1 - ν^{2})}{6 π R_{H G S}^{2}}$
Die ermittelte Adhäsionsenergie entspricht der Bindungsdichte der partikelgebundenen Kompetitoren an den Analytbindungspartner und erlaubt die Bestimmung der Analytmenge in der Probe.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Oberfläche aufweisend den erfindungsgemäßen Analytbindungspartner, wobei die Oberfläche zumindest im Bereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum eines Enzyms ausgewählt aus 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), Glyphosat-N-Acetyltransferase oder Glyphosat-Oxidase auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPs beträgt ca. 10 Å in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein funktionalisierter Partikel aufweisend einen immobilisierten Kompetitor.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel eine Carboxy-Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht 500 Da -8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt25 µm, erzeugt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein deformierbar ausgebildeter Partikel. Der Partikel weist bevorzugt ein Elastizitätsmodul von 10 bis 100 kPa auf, besonders bevorzugt von 15-50 kPa. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein Hydrogelpartikel.
In Ausführungsformen der Erfindung hat der Partikel einen Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt ein Durchmesser von um 25 µm.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), ein Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) oder Glyphosat. Bevorzugt ist der Kompetitor Glyphosat.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors, etwa Glyphosat, über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder ein bifunktionaler Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) von 5 - 200 Å, bevorzugt 10 - 50 Å auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker einen Polymerisationsgrad von 1 - 70, bevorzugt 3 -20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 Å; PG = 1 oder Pentaglycin: L= 16,3 Å; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Å; PG = 68.
In Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen der Erfindung ist die Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker-Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit umfassend:

- zumindest einen immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner zur Interkation mit einem Analyten ausgebildet und auf einer Oberfläche immobilisiert ist oder
- einen Analytbindungspartner und ein Hydrophobin, sowie
- zumindest einen Partikel, aufweisend einen immobilisierten Kompetitor.

In Ausführungsformen werden der im Kit enthaltene Analytbindungspartner sowie das Hydrophobin vorteilhaft zur Immobilisierung im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt im Verhältnis 1:5 gemischt und auf einer Oberfläche immobilisiert. Dabei stabilisiert das Hydrophobin die Oberfläche während der Analytbindungspartner zur Interaktion mit dem Analyten ausgebildet ist.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgebildet zur Interaktion mit dem Analytbindungspartner, wobei der Kompetitor und der Analyt um die Interaktion mit dem Analytbindungspartner konkurrieren.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor ausgewählt aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin (Huangcaoling), ein Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) oder Glyphosat. Bevorzugt ist der Kompetitor Glyphosat.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel ein funktionalisierter Partikel, wobei die Oberfläche des Partikels eine Funktionalisierung aufweist. Die Funktionalisierung dient dabei der Anbindung des Kompetitors.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel eine Carboxy-Funktionalisierung auf. Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel, insbesondere der Hydrogel-Mikropartikel, erfolgte gemäß der von Pussak et al. (Pussak, et al., 2012) beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat mit anschließender radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren, Crotonsäuremonomeren oder weiteren Alkenderivaten mit funktionellen Gruppen wie etwa Aminen zur Einführung der Carboxyl-, Amino- oder anderen funktionellen Gruppen.
In Ausführungsformen erfolgt die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Partikel mikrofluidisch mittels photoinitiierter radikalischer Vernetzung von Polyethylenglykol-Diacrylamid oder Polyethylenglykol-Diacrylat (bevorzugtes Molekulargewicht 500 Da -8.000 Da, besonders bevorzugt um 4.000 Da) mit anschließender photoinitiierter radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen, wobei monodisperse Partikel mit einem Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt 25 µm, erzeugt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert. Dabei wird der Linker an die funktionalisierte Partikeloberfläche angebunden.
Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Kompetitors, etwa Glyphosat, über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Verfahrens beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors variiert und somit der Arbeitsbereich des Verfahrens eingestellt werden.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Linker ausgewählt aus den Gruppen der homo- und heterobifunktionalen Linker und umfasst exemplarisch Ethylendiamin, Oligo- und Polyethylenglykolbisamine, Peptide wie Pentaglycin und Aminosäuren oder ein bifunktionaler Linker mit weiteren Gruppen wie etwa Thiolen oder Aziden.
In Ausführungsformen der Erfindung enthalten die Linker Schutzgruppen. In Ausführungsformen der Erfindung ist Schutzgruppe ausgewählt aus Fluorenylmethoxycarbonyl-, tert-Butyloxycarbonyl- oder tert-Butyl-Schutzgruppen. Auf diese Weise wird vorteilhaft sichergestellt, dass keine unerwünschte Polymerisierung der Linker-Moleküle oder Quervernetzung der Partikel eintritt.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) und einen Polymerisationsgrad (PG) auf. In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker eine Konturlänge (L) von 5 - 200 Å, bevorzugt 10 - 50 Å auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Linker einen Polymerisationsgrad von 1 - 70, bevorzugt 3 -20 auf.
Beispielhaft geeignete Linker sind Ethylendiamin: L=5,3 A; PG = 1 oder Pentaglycin: L=16,3 Å; PG = 5 oder PEG-Bisamin 3000: L=191 Å; PG = 68.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Partikel eine Hydrogelpartikel.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Partikelgröße ein Durchmesser von 10 bis 100 µm, besonders bevorzugt um 25 µm.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Partikel ein Elastizitätsmodul von 5 bis 100 kPa, besonders bevorzugt 15-50 kPa auf. So wird vorteilhaft eine hohe Sensitivität sichergestellt. Gleichzeitig wird so eine ungleichmäßige Deformation der Partikel ausgeschlossen.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche im Wesentlichen planar ausgebildet. Beispielsweise kann die Oberfläche ein Glasformkörpersein z. B. ein Objektträger, Deckgläschen, Siliziumwafer oder ähnliches.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Oberfläche transparent, semitransparent oder opak ausgebildet.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner als Fusionsprotein ausgebildet. Dabei weist das Fusionsprotein beispielsweise verschiedene Proteindomänen auf, welche unterschiedliche Funktionalitäten aufweisen.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, aufweisend eine Analytbindungsstelle. Die Analytbindungsstelle dient der Anbindung des Analyten an den Analytbindungspartner.
In Ausführungsformen der Erfindung ist die Analytbindungsstelle als Bindungstasche eines Enzyms ausgebildet oder eine allosterische Bindungsstelle für den Analyten.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum eines Enzyms ausgewählt aus 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS), Glyphosat-N-Acetyltransferase oder Glyphosat-Oxidase auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner als Analytbindungsstelle das aktive Zentrum des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) auf. Die Distanz der Bindungstasche zu Proteinoberfläche in der EPSPs beträgt ca. 10 A in geschlossener Konformation.
In Ausführungsformen der Erfindung umfasst der Analytbindungspartner eine Proteindomäne, ausgewählt aus Hydrophobinen, ECM-Proteinen, S-Layer Proteinen, Peptidlinkern, und Protein-Tags. Dadurch wird eine gerichtete Immobilisierung an die Oberfläche ermöglicht, wobei zumindest eine Proteindomäne die Anbindung vermittelt und eine weitere Proteindomäne eine weitere Funktionalität aufweist. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne auf.
In Ausführungsformen der Erfindung weist der Analytbindungspartner eine Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa auf. Bevorzugt weist der Analytbindungspartner die SEQ. ID. No. 5 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung ist der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne. Dabei ermöglicht die Hydrophobin-Domäne die Immobilisierung des Analytbindungspartners auf der Oberfläche. In Ausführungsformen der Erfindung weist das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 auf.
In Ausführungsformen der Erfindung wird der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.
In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne (SEQ ID No. 6) und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa (SEQ ID No. 5) im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der erfindungsgemäßen Oberfläche, des erfindungsgemäßen Partikels und des erfindungsgemäßen Kits zum Nachweis von Analyten in Proben, wie etwa Gewässer-, Lebensmittel-, Boden-, Trink- und Abwasserproben.
Zur Realisierung der Erfindung ist es auch zweckmäßig, die vorbeschriebenen Ausführungsformen und einzelne Merkmale der Ansprüche zu kombinieren.
Figurenliste
Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den nachfolgenden schematischen Zeichnungen und Ausführungsbeispielen, anhand derer die Erfindung beispielhaft näher erläutert werden soll, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Dabei zeigt:

1: die schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens beruhend auf der kompetitiven Bindung von Partikel-gebundenem und löslichem Glyphosat an der Protein-funktionalisierten Oberfläche,
2: Die Abhängigkeit der Adhäsionsenergie zwischen Partikel und Oberfläche von der Konzentration an Glyphosat in Lösung sowie löslichem Glufosinat als Negativkontrolle,
3: Die Abhängigkeit der Nachweisgrenze und des Arbeitsbereiches des Verfahrens von der Beschichtung der Partikel.

Das Prinzip der Nachweismethode ist in 1 dargestellt. Die immobilisierten Enzyme der Oberfläche wechselwirken attraktiv mit dem Partikel-gebundenen Kompetitor, in dessen Folge sich eine charakteristische Kontaktfläche zwischen Oberfläche und Partikel ausprägt. Der gelöste Analyt konkurriert mit dem Kompetitor um die Bindungsstellen auf der Oberfläche. In Abhängigkeit der Konzentration des Analyten verringert sich dadurch die Kontaktfläche. Ab einer bestimmten Konzentration adhärieren die Partikel nicht auf der Oberfläche. Die Bestimmung von Kontakt- und Partikelradius zur Ermittlung der Adhäsionsenergie erfolgt mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie.
Zum Nachweis der Spezifität der Methode wurden in 2 RCA-gereinigte Glasoberflächen mit einer geeigneten Mischung des Hydrophobins Ccg2 und dessen Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beschichtet. Anschließend wurden die Oberflächen wahlweise mit 10 mM Glyphosat- oder Glufosinat-Lösungen und danach mit Linkerfunktionalisierten Partikeln ohne oder mit Glyphosat-Beschichtung inkubiert. Die aus den jeweiligen Bedingungen resultierenden Adhäsionsenergien wurden anhand eines repräsentativen Datensatzes dargestellt.
In 3 wurden zunächst RCA-gereinigte Glasoberflächen mit einer geeigneten Mischung des Hydrophobins Ccg2 und dessen Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beschichtet. Anschließend wurden die Oberflächen mit Glyphosat-Lösungen unterschiedlicher Konzentration und danach mit Glyphosat-beschichteten Partikeln mit Ethylendiamin- oder Pentaglycin-Linker inkubiert. Die aus den jeweiligen Bedingungen resultierenden Adhäsionsenergien wurden anhand eines repräsentativen Datensatzes dargestellt.
Ausführungsbeispiel 1: Quantifizierung von Glyphosat mittels kompetitiver Bindung
Für die Erzeugung einer funktionalisierten Oberfläche wurden Fusionsproteine aus dem Hydrophobin Ccg2 (SEQ ID No. 5) aus Neurospora (N.) crassa und der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase aus Escherichia (E.) coli (EcEPSPS) (SEQ ID No. 4) benötigt. Hierzu wurden die kodierenden Bereiche der jeweiligen Gene, verbunden über die Sequenz für einen flexiblen Glycin-Serin-Linker, in den Expressionsvektor pET28b (Novagen, Deutschland) übertragen. Hierbei liegt die Sequenz des Hydrophobins (SEQ ID No. 2) 5'-seitig und die der EcEPSPS (SEQ ID No. 1) 3'-seitig von der Linkersequenz. Zusätzlich befindet sich 5'-seitig von der Sequenz für das Fusionsprotein die Sequenz für einen (His)₆-Tag, welcher für die Detektion und Reinigung des Fusionsproteins erforderlich ist. Weiterhin wurde für die Oberfläche das Hydrophobin ohne EcEPSPS benötigt. Die Gensequenz wurde dementsprechend ohne den Linker und die EcEPSPS-Sequenz in den Vektor pET28b übertragen. Die auf diese Weise modifizierten Vektoren wurden nach vollständiger Sequenzierung der eingebrachten Sequenzen, in den E. coli Expressionsstamm SHuffle T7 Express lysY (New England Biolabs, USA) übertragen. Dieser Expressionsstamm ist vorteilhaft für die Expression der Hydrophobine, da er zusätzlich für eine Disulfidbrückenisomerase kodiert, welche die korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken der Hydrophobine begünstigt. Diese spielen eine wesentliche Rolle für die korrekte Faltung des Proteins.
Die Proteinexpression wurde durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) zu E. coli-Zellen, welche sich in der exponentiellen Wachstumsphase befanden, gestartet. Nach der Induktion wurden die Zellen für 4 weitere Stunden bei 30°C und 180 Umdrehungen in der Minute inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert und gewaschen, um sie dann für die Proteinreinigung weiter verwenden zu können. Die angewendete Reinigungsmethode ist abhängig von der Löslichkeit der Proteine. Die löslichen Fusionsproteine (SEQ ID No. 6) wurden mittels Nickel-Affinitätschromatografie unter nativen Bedingungen nach Herstellerangaben gereinigt, während die unlöslichen Hydrophobine mittels denaturierender Nickel-Affinitätschromatografie nach Herstellerangaben gereinigt wurden. Die Hydrophobine wurden vor der Dialyse durch Ultrafiltration konzentriert, für die Fusionsproteine war dies nicht nötig. Nach der Reinigung wurden die Hydrophobine gegen einen Redox-Rückfaltepuffer (10mM Glutathion reduziert, 1mM Glutathion oxidiert; pH 5,4) und die Fusionsproteine gegen den Monsanto-Dialysepuffer (10 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 5% (v/v) 99,9% Glycerin, 1mM DTT, pH 7) dialysiert, anschließend im Kühlschrank gelagert und für die Funktionalisierung von Glasoberflächen eingesetzt.
Die Funktionalisierung der Glasoberflächen erfolgte durch langsames Aufpipettieren der Proteinlösung mit anschließender 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur. Anschließend wurden die Oberflächen gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen und 30 Minuten bei RT getrocknet. Die Glasoberflächen wurden vor der Funktionalisierung mit Hilfe einer Piranha-Lösung (7 ml konzentrierte Schwefelsäure, 3 ml 30% H₂O₂) gereinigt.
Die beiden Proteinvarianten wurden benötigt, um für das Verfahren ein optimales Verhältnis zwischen Fusionsprotein (kann Glyphosat binden) und Hydrophobin (zur Stabilisierung der Oberfläche) zu finden. Hierfür wurden die Proteine in verschiedenen Verhältnissen gemischt und die Funktionalität der EcEPSPS auf der Oberfläche mittels eines Nachweises von anorganischem Phosphat bestimmt. Anorganisches Phosphat ist eines der Reaktionsprodukte bei der Reaktion der EPSPS mit ihren Substraten Phosphoenolpyruvat (PEP) und Shikimat-3-phosphat (S3P) und kann daher für den Nachweis der Enzymaktivität genutzt werden. Das Verhältnis von Ccg2 (SEQ ID No. 5) zu Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID No. 6) beeinflusst die Sensitivität und Signalstärke des Assays. Je mehr Fusionsprotein auf der Oberfläche vorhanden ist, desto mehr Glyphosat wird benötigt, um die Bindestellen zu besetzen und damit die Aktivität der Proteine auf der Oberfläche messbar zu hemmen. Dem entsprechend ist eine Oberfläche mit einer hohen Konzentration an Fusionsprotein insensitiverals eine mit wenig Fusionsprotein. Jedoch führt eine zu geringe Konzentration des Fusionsproteins zu einem geringen Signal-Rausch-Verhältnis. Aus diesem Grund wurden verschiedene Belegungsverhältnisse getestet, dabei stellte sich ein Verhältnis von 1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS (SEQ ID NO. 6) zu 5µM Ccg2 (SEQ ID No. 5) als für die Anwendung gut geeignet heraus.
Die Synthese und Carboxy-Funktionalisierung der Hydrogel-Mikropartikel erfolgte gemäß der von Pussak et al. beschriebenen Methode via Emulsions- und radikalischer Fällungspolymerisation von Polyethylenglykol-Diacrylamid mit anschließender radikalischer Propfung von Acrylsäuremonomeren zur Einführung der Carboxylgruppen [1]. Für die nachfolgend erläuterten Methoden wurden Mikropartikel mit Elastizitätsmoduln von 15 kPa und einem mittleren Radius von 20 µm verwendet.
Um eine durch die Anwesenheit des Analyten modulierbare Wechselwirkung zwischen der Oberfläche und den Hydrogelpartikeln oder auch Hydrogelsonden (HGS) zu ermöglichen, wurden die Mikropartikel mit Glyphosat beschichtet. Hierzu wurden, ausgehend von den Carboxyl-funktionalisierten HGS, verschiedene Linker an die Partikel gekoppelt. Das jeweilige Linkermolekül erlaubt dabei die geeignete Immobilisierung des Glyphosats über die Carboxyl- oder die sekundäre Aminogruppe, wobei die Kopplungsgruppe die Funktionalität und Sensitivität des Sensors beeinflusst. Des Weiteren kann über die Länge bzw. den Polymerisationsgrad des Linkers die resultierende Affinität des immobilisierten Kompetitors für das Enzym (EPSPS) variiert und somit der Arbeitsbereich des Sensors eingestellt werden.
Die jeweiligen Kopplungsschritte erfolgten unter Anwendung von Aktivester-Chemie. Exemplarisch diente Ethylendiamin als kurze Linkervariante, welches mittels Benzotriazol-1-yl-oxytri-pyrrolidinophosphonium-hexafluorophosphat (PyBOP) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) an die Mikropartikel gekoppelt wurde. Hierzu wurden die Partikel suspendiert und Wasser in mehreren Waschschritten durch Dimethylformamid (DMF) ersetzt. Die Partikel wurden in 2 ml DMF belassen. Anschließend wurden 146 mg (280 µmol) PyBOP, 18 mg (140 µmol) HOBt und 39 µl (280 µmol) Triethylamin zur Aktivierung der Carboxylgruppen zugesetzt und die Suspension 1 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zusatz von 20 µl (300 µmol) Ethylendiamin und dreistündiger Reaktion wurden die Partikel bei 1844 x g für 10 min zentrifugiert und je 3mal mit DMF, einer 1 : 1 Mischung aus DMF und Wasser sowie reinem Wasser gewaschen. Zur weiteren Beschichtung wurden 4 mg (24 µmol) Glyphosat in 2 ml 100 mM Hepes-Puffer (pH = 7,0) im Ultraschallbad gelöst und 46 mg (240 µmol) 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) sowie 52 mg (240 µmol) N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz (s-NHS) zugesetzt und die Carboxylgruppen für 15 min aktiviert. Die Kopplung des Pestizids an die Amin-funktionalisierten Partikel erfolgte durch Vereinigung von Suspension und Lösung und Reaktion über einen Zeitraum von 1 h. Abschließend wurden die Partikel 3-mal mit einer 100 mM Hepes-Pufferlösung (pH = 7,0) gewaschen.
Alternativ dazu wurden die Partikel mit einem Pentaglycin-Linker funktionalisiert. Hierzu wurden die Partikel 3-mal mit 2 ml 100 mM MES-puffer (pH = 5,3) gewaschen und der Überstand nach Zentrifugation (10 min, 1844 x g) verworfen. 23 mg (120 µmol) EDC und 26 mg (120 µmol) s-NHS wurden in 1 ml 100 mM MES-puffer (pH = 5,3) gelöst und die Mikropartikel anschließend in der Lösung suspendiert. Nach einstündiger Aktivierung der Carboxylgruppen unter Schütteln wurden10 µl (143 µmol) Mercaptoethanol zur Inaktivierung des überschüssigen EDC zugesetzt und die Suspension für weitere 15 min bei Raumtemperatur belassen. Nach Zentrfugation (10 min, 1844 x g) wurde der Überstand verworfen und 0,2 mg (660 nmol) des Peptids gelöst in 1 ml Hepes-Pufferlösung (100 mM) zugesetzt, wobei die Kopplung des Linkers über Nacht erfolgte. Nach weiteren 3 Waschschritten (100 mM Hepes-Puffer) wurden die Carboxylgruppen gemäß der zuvor beschriebenen Prozedur in den s-NHS-Ester überführt, überschüssiges EDC mittels Mercaptoethanol inaktiviert, die Suspension zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nach Zusatz einer 1 mg / ml 100 mM Hepes-gepufferten Glyphosatlösung (6 µmol) wurde das Reaktionsgemisch über Nacht unter Schütteln bei Raumtemperatur belassen. Abschließend wurden die Partikel 3-mal mit einer 100 mM Hepes-Pufferlösung (pH = 7,0) gewaschen.
Nachdem die Oberfläche, beispielsweise eine Glasoberflächen und die Partikel beschichtet wurden, konnten sie für die Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie (RICM) eingesetzt werden. Hierzu wurden die erfindungsgemäßen Oberflächen an einen 16-Well-Träger CS16-CultureWell™, Grace Biolabs) mit selbstklebender Unterseite und einem Volumen von 400 µl / Well geklebt.
Anschließend wurden je 200 µl / Well Analytlösung (100 mM HEPES-Puffer pH = 7) zugesetzt. Nach 30-minütiger Inkubation der Oberflächen wurden 10 µl / Well der mit Glyphosat funktionalisierten Hydrogelpartikel hinzugefügt und die Oberflächen nach Sedimentation der Hydrogelpartikel mikroskopiert.
Die Aufnahme der radialen Intensitätsprofile der HGS auf der funktionalisierten Oberfläche im Reflexionsinterferenzkontrastverfahren erfolgte mittels Inversmikroskopsystem (Olympus IX 73) mit einem 60 x Immersionsobjektiv (Olympus UPlanSAPO 60x Oil Microscope Objective). Aus den aufgenommenen Profilen konnten anschließend Kontaktradien α von Partikel und Oberfläche sowie die Partikelradien R_HGS mittels einer eigens dafür entwickelten Software automatisiert ermittelt werden. Gemäß Johnson-Kendall-Roberts Modell [2] stehen diese Größen mit der Adhäsionsenergie W_adh in folgendem Zusammenhang: $W_{a d h} = \frac{\frac{4}{3} α^{3} E_{H G S} / (1 - ν^{2})}{6 π R_{H G S}^{2}}$
Mit einem Elastizitätsmodul E_HGS der Partikel von 15 kPa und einer Poissonzahl v von 0,5 kann somit unter Kenntnis des Partikel- und Kontaktradius die korrespondierende Adhäsionsenergie des Systems bestimmt werden.
Die Ergebnisse der Messungen sind beispielhaft in 2 gezeigt. Die Pentaglycinfunktionalisierten Partikel (Negativkontrolle) zeigen lediglich schwache unspezifische Wechselwirkungen mit der Oberfläche, wohingegen Glyphosat-beschichtete HGS stark adhärieren. Bei Anwesenheit hoher Konzentrationen des Analyten bewegt sich der Wert im Bereich der Negativkontrolle. Dies ist auf die Kompetition um Bindungsstellen der EcEPSPS auf der Oberfläche zwischen freiem Glyphosat in der Analytlösung und an den HGS gebundenem Glyphosat zurückzuführen. Des Weiteren verdeutlicht der vernachlässigbare Einfluss strukturell ähnlicher Verbindungen wie Glufosinat auf die Adhäsionsenergie die Selektivität der Methode gegenüber Glyphosat.
3 zeigt exemplarisch die resultierenden Adhäsionsenergien Glyphosat-beschichteter Partikel der Linkervarianten Ethylendiamin und Pentaglycin bei verschiedenen Konzentrationen an löslichem Glyphosat. Mit steigenden Glyphosatkonzentrationen in der Probe sinkt die Adhäsionsenergie der Glyphosat-beschichteten HGS an der funktionalisierten Chip-Oberfläche. Je mehr Glyphosat sich in der Analytlösung befindet, desto stärker ist die Konkurrenz zu gebundenem Glyphosat. Sind viele Bindestellen mit freiem Glyphosat besetzt, können sich die HGS nicht mehr fest an der Oberfläche anlagern, die Kontaktfläche wird kleiner und dementsprechend nimmt die Adhäsionsenergie ab. Die Nachweisgrenze kann dabei unter anderem über den Linker variiert werden. Diese beträgt im gezeigten Beispiel für Ethylendiamin-Glyphosat-beschichtete HGS 10 µM, für Pentaglycin-Glyphosat-beschichtete HGS liegt die Nachweisgrenze unterhalb 1 µM, wobei das Sensorsystem weitere Möglichkeiten zur Einstellung des Arbeitsbereiches bietet. Die Ergebnisse beweisen, dass ein spezifischer Nachweis sowie eine präzise Quantifizierung von Glyphosat mit Hilfe der Erfindung möglich sind.
Zitierte Nichtpatentliteratur:

[1] D. Pussak, M. Behra, S. Schmidt and L. Hartmann, Soft Matter, 2012, 8, 1664
[2] K.L. Johnson, K. Kendall, A.D. Roberts, Proc. R. Soc. Lond. Ser. A- Math. Phys. Sci., 1971, 324, 301

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 2752664 A1 [0005]
CN 102207495 A [0007]
WO 2008118899 A1 [0008]
WO 2010104861 A1 [0008]
WO 2000014538 A1 [0008]
WO 2018057647 A1 [0009]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

D. Pussak, M. Behra, S. Schmidt and L. Hartmann, Soft Matter, 2012, 8, 1664 [0123]
K.L. Johnson, K. Kendall, A.D. Roberts, Proc. R. Soc. Lond. Ser. A- Math. Phys. Sci., 1971, 324, 301 [0123]

Claims

Verfahren zum Nachweis von Analyten umfassend die Schritte: - Bereitstellen einer Oberfläche mit einem immobilisierten Analytbindungspartner, - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einer Probe enthaltend den Analyten, wobei der Analyt mit dem Analytbindungspartner interagiert, - Kontaktieren des Analytbindungspartners mit einem Kompetitor, wobei der Kompetitor an einen Partikel immobilisiert ist und mit dem Analytbindungspartner interagiert, - Detektion der an den Analytbindungspartner gebundenen Kompetitoren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel ein Hydrogelpartikel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel ein Elastizitätsmodul von 5 kPa bis 100 kPa aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktierung des Analytbindungspartners mit dem Analyten vor der Kontaktierung mit dem Partikel für einen Zeitraum von 1 bis 30 min, vorzugsweise 1 bis 20 min, besonders bevorzugt 1 bis 10 min erfolgt, ganz besonders bevorzugt 1 bis 7 min.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Kompetitor ausgewählt ist aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin, ein Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase oder Glyphosat.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt Glyphosat ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert wird, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Immobilisierung des Analytbindungspartners eine Mischung aus dem Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne mit der SEQ ID No. 6 und der Hydrophobin-Domäne Ccg2 aus Neurospora (N.) crassa mit der SEQ ID No. 5 im Verhältnis 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5, ganz besonders bevorzugt 1:5 erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion mittels Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie erfolgt.
Oberfläche aufweisend einen Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne ist, wobei die Oberfläche zumindest im Bereich von 400 nm bis 600 nm transparent ausgebildet ist.
Oberfläche nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.
Oberfläche nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein ist, welches die SEQ ID No. 6 aufweist.
Partikel aufweisend einen immobilisierten Kompetitor, wobei der Kompetitor über einen Linker an den Partikel immobilisiert ist, wobei der Partikel deformierbar ausgebildet ist.
Partikel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Kompetitor ausgewählt ist aus Phosphoenolpyruvat, Phosametin, ein Substratanaloga des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase oder Glyphosat.
Partikel nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker eine Konturlänge von 5 - 200 Å, bevorzugt 10 - 50 Å auf und/oder einen Polymerisationsgrad von 1 - 70, bevorzugt 3 -20 aufweist.
Kit umfassend: - zumindest einen immobilisierten Analytbindungspartner, wobei der Analytbindungspartner zur Interaktion mit einem Analyten ausgebildet ist und auf einer Oberfläche immobilisiert ist oder - einen Analytbindungspartner und ein Hydrophobin, sowie - zumindest einen Partikel, aufweisend einen immobilisierten Kompetitor nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei der immobilisierte Analytbindungspartner auf einer Oberfläche nach einem der Ansprüche 12 bis 14 immobilisiert ist.
Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner ein Fusionsprotein ist, aufweisend eine Hydrophobin-Domäne und eine 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Domäne.
Kit nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Fusionsprotein die SEQ ID No. 6 aufweist
Kit nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Analytbindungspartner in einer Mischung mit Hydrophobinen auf der Oberfläche immobilisiert ist, wobei die Mischung des Analytbindungspartners mit dem Hydrophobin im Bereich von 1:2 bis 1:10, bevorzugt zwischen 1:3 bis 1:8, besonders bevorzugt um 1:5 liegt.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, einer Oberfläche nach Anspruch 12 bis 14, eines Partikels nach Anspruch 15 bis 17 sowie eines Kits nach einem der Ansprüche 18 bis 21 zum Nachweis von Analyten in Proben.