DE102006009709A1 - Mikromechanisches Nachweisverfahren für Mikroorganismen, Bakterien, Wirtszellen, Bakteriophagen oder Viren, geeignet auch für biologische Kampfstoffe und zur Abwehr bioterroristischer Gefährdung - Google Patents

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Abstract

Die Beschichtung eines Cantilevers mit Bakteriophagen-Partikeln oder Bakteriophagen-Proteinen, die Bakterien binden können, wird vorgeschlagen. Zur Verwendung zum Nachweis biologischer Kampfstoffe oder zur Bioterrorismus-Abwehr bieten sich z. B. folgende Wirt-Virus-Paare an: Bacillus anthracis (Milzbrand) und Bakteriophage Gamma, Yersinia pestis (Pest) und Bakteriophage phiA1122, Francisella tularensis (Tularämie) und Bakteriophage PRD1.

Description

  • Der Stand der Technik beschreibt in der DE 100 36 931 B4 die Bindung von Bakteriophagen-Proteinen an Festphasen, um Bakterien zu fischen und ohne Kultivierung nachzuweisen, sowie in der DE 102 09 245 B4 Cantilever, also mikromechanische Federbalken, die eine Nährbodenschicht für Bakterien tragen. Ji, H. F. et al., Expert. Rev. Mol. Diagn. 4, 859-66 (2004), beschreiben Cantilever, die Antikörper gegen Francisella tularensis und gegen Ricin tragen. Liu, W. et al., PNAS 100, 13621-25 (2003) beschreiben Cantilever, die Substrate für Botulismus-Toxin tragen. Die WO 2005/049791 A2 beschreibt durch Phage-Display erhaltene Peptide, die spezifisch an Francisella tularensis binden.
    •
  • Aufgabe ist der spezifische, schnelle Nachweis von biologischen Kampfstoffen, von Mikroorganismen, Bakterien, Wirtszellen, Bakteriophagen oder Viren ohne Kultivierung.
  • Als erste Ausführungsform zur Lösung der Aufgabe wird als Prinzip die Beschichtung eines Cantilevers mit Bakteriophagen-Partikeln oder mit Bakteriophagen-Proteinen, die Bakterien binden können vorgeschlagen. Gelangen Bakterien auf diese Beschichtung, werden sie an die Partikel oder Proteine gebunden, wodurch sich z. B. die Resonanzfrequenz des Cantilevers ändert, was detektiert werden kann.
  • Zur Verwendung zum Nachweis biologischer Kampfstoffe oder zur Bioterrorismus-Abwehr bieten sich z. B. folgende Wirt-Virus-Paare an:
    Bacillus anthracis (Milzbrand) und Bakteriophage Gamma,
    Yersinia pestis (Pest) und Bakteriophage phi A 1122,
    Francisella tularensis (Tularämie) und Bakteriophage PRD1.
  • Es werden Proteine dieser oder anderer Bakteriophagen oder Viren oder ganze Bakteriophagen oder Virus-Partikel oder deren Fragmente, zusammenfassend bezeichnet als biologische Partikel, eingesetzt. Antikörper, deren Fragmente oder gentechnisch erzeugte Derivate einschließlich Phage-Display-Antikörper-Bibliotheken werden nicht verwendet oder gelehrt.
  • Die einzusetzenden Proteine oder deren Fragmente oder die biologischen Partikel sind an einer Wirt-Virus-Erkennung beteiligt.
  • Die Bindung der Proteine oder biologischen Partikel an die Cantilever-Oberfläche kann kovalent oder nicht kovalent erfolgen.
  • Die Isolierung und Reinigung der Bakteriophagen-Partikel ist dem Fachmann aus der DE 100 36 931 B4 geläufig. Die Kopplung der biologischen Partikel oder Proteine an die Cantilever-Oberfläche wird gemäß der aus dem Stand der Technik, z. B. Ji et al., bekannten Kopplung von Antikörpern an Cantilever-Oberflächen durchgeführt.
  • Die Messung der Adsorption von Bakterien auf dem Cantilever erfolgt wie in Gfeller et al., Appl. Environ. Microbiol. (2005) 71 (5) 2626-31 beschrieben. Weitere Meßverfahren bei Cantilevern sind in der DE 102 09 245 B4 beschrieben.
  • Eine weitere Ausführungsform ist die Beschichtung eines Cantilevers mit einem Protein eines Virus allgemein, das zur Erkennung eines Wirtes dient und mit einem Protein des Wirtes z. B. einem Zelloberflächen-Rezeptor wechselwirkt. Mit dieser Vorrichtung können allgemein Wirtszellen detektiert werden.
  • Umgekehrt ist noch eine weitere Ausführungsform die Beschichtung eines Cantilevers mit einem Protein einer Wirtszelle, ausgenommen Antikörper, z. B. einem Zelloberflächen-Rezeptor-Protein, das zur Erkennung eines Virus oder eines Bakteriophagen dient und mit einem Protein der Virushülle wechselwirkt. Mit dieser Vorrichtung können Viren oder Bakteriophagen detektiert werden.
    •
  • Prophetische Beispiele
  • Beispiel 1
  • Cantilever
    • a) zum Nachweis von Bacillus anthracis tragen Partikel oder Rezeptor-Proteine z. B. des Bakteriophagen Gamma,
    • b) zum Nachweis von Yersinia pestis tragen Partikel oder Rezeptor-Proteine z. B. des Bakteriophagen phiA 1122,
    • c) zum Nachweis von Francisella tularensis tragen Partikel oder Rezeptor-Proteine z. B. des Bakteriophagen PRD1, und
    • d) zum Pockenvirus-Nachweis tragen z. B. den menschlichen VV-Rezeptor.
  • Die Probe kann eine Flüssigkeit mit suspendierten Bakterien sein, z. B. Trinkwasser; oder ein Gasstrom, der Bakterien trägt, z. B Atemluft, wird über den Cantilever geleitet.
  • Beispiel 2
  • Das HIV-Protein gp120 wechselwirkt spezifisch mit dem menschlichen Protein CD4 bei der Zell-Virus-Erkennung. Das HIV-Protein gp120 ist daher als Wirkstoff-Target im Gespräch. Ein Cantilever mit CD4 dient zum Nachweis von HIV, ein Cantilever mit gp120 bindet spezifisch menschliche Zellen, die CD4 tragen.
  • Weitere Proteine zur Beschichtung von Cantilevern zum Nachweis von HIV sind DC-SIGN und L-SIGN. DC-SIGN bindet auch das Ebolavirus-Protein GP1.

Claims (9)

  1. Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen oder Bakterien ohne Kultivierungsschritt, umfassend die Schritte a) ein Cantilever oder Federbalken wird mit einer Beschichtung versehen, enthaltend oder aufweisend Bakteriophagen-Partikel oder Bakteriophagen-Rezeptorproteine oder Bakteriophagen-Adhäsine oder Fragmente aller Vorgenannten, die wirtsspezifisch die nachzuweisenden Mikroorganismen oder Bakterien binden, ausgenommen Antikörper, deren Fragmente und gentechnisch erzeugten Derivate, und b) nach Zugabe der zu untersuchenden Probe wird die Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers oder Federbalkens gemessen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Bacillus anthracis und/oder Yersinia pestis und/oder Francisella tularensis nachgewiesen werden.
  3. Verfahren zum Nachweis von Wirtszellen ohne Kultivierungsschritt, unfassend die Schritte a) ein Cantilever oder Federbalken wird mit einer Beschichtung versehen, enthaltend oder aufweisend Virus-Partikel oder Virus-Rezeptorproteine oder Virus-Adhäsine oder Fragmente aller Vorgenannten, die spezifisch die nachzuweisenden Wirtszellen binden, ausgenommen Antikörper, deren Fragmente und gentechnisch erzeugten Derivate, und b) nach Zugabe der zu untersuchenden Probe wird die Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers oder Federbalkens gemessen.
  4. Verfahren zum Nachweis von Viren oder Bakteriophagen ohne Kultivierungsschritt, umfassend die Schritte a) ein Cantilever oder Federbalken wird mit einer Beschichtung versehen, enthaltend oder aufweisend Wirtszellen-Partikel oder Wirtszellen-Rezeptorproteine oder Fragmente aller Vorgenannten, die spezifisch die nachzuweisenden Viren oder Bakteriophagen binden, ausgenommen Antikörper, deren Fragmente und gentechnisch erzeugten Derivate, und b) nach Zugabe der zu untersuchenden Probe wird die Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers oder Federbalkens gemessen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei Pockenviren, Ebolaviren und/oder HIV nachgewiesen werden.
  6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen, Bakterien, Wirtszellen, Viren und/oder Bakteriophagen in einer Flüssigkeit, z. B. Trinkwasser oder in einem Gas, z. B. Atemluft enthalten sind.
  7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche.
  8. Vorrichtung bestehend aus einem Cantilever und kovalent oder nicht-kovalent gebundenen biologischen Partikeln, Proteinen und Fragmenten aller Vorgenannten, die an einer Wirt-Virus-Erkennung teilnehmen, ausgenommen Antikörper, deren Fragmente und gentechnisch erzeugten Derderivate, und ausgenommen Protein- oder Peptid-Substrate für proteolytische Toxine oder diese Toxine selbst oder Fragmente aller Vorgenannten.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, wobei auf der Oberfläche des Cantilevers folgende Proteine gebunden sind: a) Menschliches CD4-Rezeptorprotein oder dessen Fragmente, b) Menschliches DC-SIGN und oder L-SIGN oder dessen Fragmente, c) gp120 des HIV oder dessen Fragmente, d) biologische Partikel oder Proteine oder deren Fragmente des Bakteriophagen Gamma, e) biologische Partikel oder Proteine oder deren Fragmente des Bakteriophagen phiA1122, f) biologische Partikel oder Proteine oder deren Fragmente des Bakteriophagen PRD1, und/oder g) menschliches VV-Rezeptorprotein oder dessen Fragmente.
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