DE1023467B - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch eine Umlagerungsreaktion.

Alle bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Peptiden beruhen auf einer sukzessiven Verknüpfung von Carboxyl- und Aminogruppen, wobei die Bildung der Peptidbindung nach der einen oder anderen der folgenden Reaktionstypen erfolgen kann:

a) Das reaktionsfähige Säurederivat einer am Stickstoff geschützten Aminosäure reagiert mit der freien Aminogruppe einer zweiten Aminosäure oder zweckmäßiger deren Ester:

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Anmelder:
CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität:
Schweiz vom 5. Juli 1955

R—NHCHCO—X + H₂NCHCO - R'

Dr. Max Brenner, Riehen, Basel (Schweiz),
ist als Erfinder genannt worden

R NHCHCO NHCHCO — R, [1956]), verlaufen intermediär über die eine der obigen

Reaktionstypen.

b) Eine N-substituierte Aminosäure setzt sich mit Obschon die seit langem bekannten und die erst

einem am Stickstoff aktivierten Derivat einer zweiten 25 während der letzten Jahre aufgefundenen Möglichkeiten

Aminosäure um:

R—NHCHCO + X —NHCHCO—R'

R,

R—NHCHCO —NHCHCO—R'

zur Herstellung von Peptiden zu Erfolgen geführt haben, sind doch immer wieder Unzulänglichkeiten aufgetreten, die durch das Prinzip der sukzessiven Verknüpfung von Carboxyl- und Aminogruppen bedingt sind. Die Nachteile zeigen sich besonders bei der Herstellung von höheren Peptiden; sollen z. B. die in einer ersten Stufe gebildeten Dipeptidderivate I und II

35

R—NHCHCO—NHCHCO —R'

R—NHCHCO—NHCHCO —R'

Ein Überblick über die innerhalb dieser Reaktionstypen möglichen Variationen findet sich z. B. in der Zu- 40
sammenfassung von Th. Wieland, Angewandte Chemie,
66, S. 507 (1954). Auch die neueren Synthesen von
Peptiden, bei denen die Kupplung einer N-substituierten
Aminosäure mit einem Aminosäureester formal direkt
erfolgt (vgl. z. B. J. C. Sheehan, Journal of the American 45 knüpfung zu den Tetrapeptidderivaten III oder IV er-Chemical Society, 77, S. 1067 [1955], und 78, S. 1367 folgen kann.

in einer zweiten Stufe zu einem Tetrapeptid gekuppelt werden, so müssen mindestens ein N-Substituent R und eine Estergruppe R' abgespalten werden, bevor die Ver-

R,

R4

R —NHCHCO —NHCHCO —NHCHCO —NHCHCO—

R₃

R₁

R₂

R —NHCHCO —NHCHCO —NHCHCO —NHCHCO —R'

705 877/288

Gleichermaßen ist bei der sukzessiven Verlängerung einer Peptidkette um je eine Aminosäure bei jedem Schritt die Entfernung eines N-Substituenten oder die Spaltung einer Estergruppe notwendig, bevor die zusätzliche Peptidbindung gebildet werden kann.

Die Literatur ist reich an Beispielen, in denen die Abspaltung von N-Substituenten oder von Estergruppen zu Komplikationen führte, die nur auf Umwegen überwunden werden konnten. Es bestand daher schon lange das Bedürfnis nach einer prinzipiell neuen Synthese von Peptiden.

Das neue Verfahren zur Herstellung von Peptiden durch eine Umlagerungsreaktion besteht nun darin, daß man Aminosäure- oder Peptidderivate, welche in der endständigen Aminogruppe einen Acylrest der Formel V

tragen .X-CO-R-NH₂

Ar

C —

worin Ar einen höchstens zweikernigen Rest einer Verbindung aromatischen Charakters bedeutet, an dem sich die beiden Substituenten in ortho-Stellung befinden, und worin X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bezeichnet und R für den zweiwertigen Rest einer a-Aminocarbonsäure, besonders einer natürlichen Aminosäure, steht, oder Salze dieser Verbindungen mit basischen Mitteln behandelt.

Der Rest ,X—

o-Oxy- oder o-Mercapto-carbonsäure, wie z. B. der Salicylsäure oder der Thiosalicylsäure.
R bezeichnet speziell den Rest

R'

-CH-

worin R' Wasserstoff oder einen organischen Rest, besonders den Rest einer in natürlichen Aminosäuren vorhandenen Seitenkette, bedeutet.

Die Umlagerung der obengenannten Verbindungen erfolgt formal so, daß der Rest — C O — R — N H₂ von X gelöst, gedreht und zwischen die Gruppe

-C-

Il ο

und den ursprünglich damit verknüpften Aminosäurebzw. Peptidrest eingeschoben wird, wobei Peptide der folgenden allgemeinen Formel VI entstehen;

Ar

Ar

XH C —NH- R-CO-

-Aminosäure- bzw.Peptidrest VI

"C-

'; 35 Der Mechanismus der Umlagerung läßt sich — etwa

O im Fall der Synthese von Salicoyl-alanyl-glycin-methyl-

bedeutet gemäß der obigen Definition den Rest einer ester — durch folgendes Schema wiedergeben:

.ΟΧ

Il ο

C-CH(CH₃)NH₂

N-CH₂-COOCH₃
H

.0.

CH-,

C-OH

'X.

c'-H N-CH₉-COOCH,

OH

■n

I CH₃

C-OH "C-OH

! CH_n

HN-

.c-H N-CH₂-COOCH,

.c-h| N-CH₂-COOCH₃

PH
OH

P = Protonen-Akzeptor PH" = Protonen-Donator

.NH-CH(CH₃)-CO—NH-CH₂-COOCH₃

I: O

Durch mehrfache Wiederholung der Umlagerung lassen sich nach dieser Methode Peptidketten aufbauen, beispielweise entsprechend dem folgenden Schema:

C H₂---ν'
.0-COCHNH₂

CO-NHCH₂COOCh₃

„Ο —COCH₂NH₂
CH,-

Base

OH

CO — NHCHCO — NHCHXOOCH,

CO NHCHCO-NHCh₂COOCH

Base

Wie aus obigem Reaktionsschema hervorgeht, schiebt sich die neu zu addierende Aminosäure bei jedem Schritt zwischen die Acylgruppe und den damit verbundenen Aminosäure- bzw. Peptidrest ein. Nach dem neuen Verfahren ist es also möglich, beim Aufbau einer Peptidkette den gleichen N-Substituenten und die gleiche Estergruppe über sämtliche Reaktionsstufen beizubehalten.

Dies bedeutet einen großen Fortschritt gegenüber allen bekannten Peptidsynthesen, bei denen auf jeder Reaktionsstufe ein N-Substituent und/oder eine Estergruppe abgespalten werden muß, wie dies eingangs beschrieben worden ist.

Bei der verfahrensgemäßen Umsetzung können als basische Mittel sowohl anorganische Basen, wie Alkalibicarbonat, Alkalicarbonat oder Alkalihydroxyd, oder organische Basen, insbesondere tertiäre organische Basen, z. B. Triäthylamin, Tributylamin, N-Alkylpiperidin oder Pyridin, verwendet werden. Gegebenenfalls genügt bereits die Eigenbasizität des Ausgangsmaterials für die Auslösung der Umlagerung.

Wenn anorganische Basen verwendet werden, so erfolgt die Umsetzung zweckmäßig in hydroxylhaltigen Lösungsmitteln, z. B. in Wasser, Alkoholen oder Phenolen; bei Verwendung von organischen Basen werden hydroxylfreie Lösungsmittel, wie Chloroform, Dioxan, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, bevorzugt.

Die Reaktionstemperatur kann in weiten Grenzen variiert werden. Vorzugsweise arbeitet man bei Temperaturen um oder unterhalb 25°.

Ein großer Vorzug dieses Verfahrens besteht darin, daß unter den milden Bedingungen, unter denen die Umlagerungsreaktion stattfindet, keine Racemisierung optisch aktiver Aminosäurereste eintritt.

Die N-Acylgruppe der bei der verfahrensgemäßen Umlagerung gewonnenen N-acylierten Peptide läßt sich, gegebenenfalls nach hydrolytischer Abspaltung von voi-

CH₉

CH₉

CO-NHCH₂CO-NHCHCO-NHCH₂COOCh₃

handenen Estergruppen und/oder Verätherung der Gruppe — XH, z. B. durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak, abspalten, wobei die entsprechenden freien Peptide entstehen. Die verfahrensgemäß erhältlichen Stoffe können somit z. B. als Zwischenprodukte für die Herstellung von natürlichen Peptiden, wie von therapeutisch oder antibakteriell wirksamen Peptiden, oder von Peptiden mit Hormonwirkung verwendet werden. Die als Ausgangsstoffe verwendeten Aminosäure- bzw. Peptidderivate, welche am Aminoende durch einen Acylrest der Formel V substituiert sind, lassen sich z. B. durch Hydrierung der entsprechenden Azidoverbindungen, die einen Acylrest der Formel VII aufweisen, gewinnen oder durch Decarbobenzoxylierung der entsprechenden Carbobenzoxyverbindungen mit einem Acylrest der Formel VIII.

Ar

Ar

X —CO-R —

C —

X — CO — R — NH — COOCH,

VII

VIII

. O -COCHNH-COOCh₂-

CO-NHCh₂COOCH₃
IX

Bei vorsichtiger Einwirkung von Alkali auf Aminosäure- bzw. Peptidderivate, die durch einen Acylrest der Formel VIII (s. oben) substituiert sind, werden Harnstoffderivate gebildet, so z. B. aus dem O-(Carbobenzoxy-DL - phenylalanyl) - salicoyl - glycin - methylester IX der Harnstoff X:

CH₂-
0 COCH^

NH

CO- N — CO'

CH₂COOCH₃
X

Aus Harnstoffderivaten dieses Typs entstehen bei weiterer alkalischer Behandlung die als Ausgangsstoffe für das Verfahren beschriebenen, durch einen Acylrest der Formel V substituierten Aminosäure- bzw. Peptidderivate, welche im alkalischen Medium direkt in die verfahrensgemäßen Reaktionsprodukte umgelagert werden.

In den nachstehenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Man löst 1,5 g Perchlorat von O-(DL-Phenylalanyl)-salicoyl-glycin-methylester der Formel

CH,

C₆H₅

OC-CH-NH₂ NH-CHp-COOCH,

in SO ml absolutem Tetrahydrofuran und gibt diese Lösung zu einer auf —5° gekühlten 2normalen Lösung von Triäthylamin in 150 ml Methanol, rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur, verdampft am Vakuum zur Nacht bei dieser Temperatur stehen. Aus der orangegelb gewordenen Mischung werden Äther und Pyridin im Vakuum bei 35° Badtemperatur eingedampft und der Rückstand zwischen 2 n-Salzsäure und Essigester verteilt. Dieser wird anschließend mit 2 n-Salzsäure, 10%iger Kaliumbicarbonatlösung, dann abwechslungsweise mit 2 n-Natriumcarbonat und Wasser, schließlich mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Es bleiben 2,39 g eines

ίο gelblichen öligen Rückstandes übrig, aus dem unter Äther 1,9 g (64% der Theorie) farbloser O-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-salicoyl-glycin-methylester kristallisiert. Zur Reinigung kristallisiert man aus Methanol— Wasser um. F. 124 bis 124,5^C.

1,5 g (3,1 mMol) O-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-salicoyl-glycin-methylester werden in 50 ml Eisessig gelöst, 3,1 ml 1 n-Perchlorsäure in Eisessig und 1 g 10°/₀ige Palladiumkohle zugefügt und Wasserstoff bei Zimmertemperatur durchgeleitet. Nach 30 Minuten ist im entweichenden Gas mit Bariumhydroxydlösung kein CO₂ mehr nachzuweisen. Die Palladiumkohle wird daraufhin abfiltriert, mit Eisessig nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum bei 40° eingedampft. Der glasige farblose Rückstand wird in Tetrahydrofuran aufgenommen und etwa die dreifache Menge Benzol zugegeben, worauf das O-iDL-PhenylalanylJ-salicoyl-glycin-methylester-perchlorat nach Anreiben zu kristallisieren beginnt. Man erhält 1,15 g (80°/₀ der Theorie). Zur Analyse wird aus Tetra

hydrofuran—Benzol umkristallisiert. F. 162 bis 165° Trockne, verteilt zwischen Essigester und 2 n-Salzsäure, 30 (zersetzt). Weiteres Umkristallisieren führt zum Sinken trennt, wäscht mit 10°/₀igem Kaliumbicarbonat und des Schmelzpunktes.
Wasser, trocknet und erhält nach dem Verdampfen des
Essigesters 1,12 g (95% der Theorie) kristallisierten
Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester der Formel

35 OH

Beispiel 2

Die Lösung von 5 g O-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-salicoyl-glycin-methylester der Formel

NH-CH-CO-NH-CH₁,- COOCH, O CH,

C₆H₅

,0.

CH₉

C₆H₅

C · CH · NH — COOCH₂ · C₈H₆ NH-CHo-COOCHo

Die Substanz schmilzt nach Kristallisation aus Methanol—Wasser bei 165 bis 166°.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Perchlorat kann wie folgt hergestellt werden:

2,9g Saücoyl-glycin (Bondi, Z. physiol. Chem., 52 [1907], S. 172) werden in 100 ml Methanol bei 0° mit

in 200 ml absolutem Eisessig und 10 ml 1 n-Perchlorsäure in Eisessig wird in Gegenwart von 5 g 10%iger Palladium-Chlorwasserstoff behandelt und die Lösung über Nacht 50 kohle in einer Wasserstoffatmosphäre geschüttelt, bis stehengelassen. Nach dem Abdampfen des Methanols kein CO₂ mehr gebildet wird. Man verdampft bei 40° wird der ölige Rückstand zwischen Natriumbicarbonat Badtemperatur zur Trockne, löst in 200 ml absolutem und Essigester verteilt, die Essigesterlösung getrocknet Tetrahydrofuran und läßt diese Lösung in 400 ml einer und im Vakuum zur Trockne verdampft. Durch Um- auf —5° gekühlten 2 η-Lösung von Triäthylamin in abkristallisieren aus wenig Methanol—Wasser oder aus Benzol 55 solutem Methanol einlaufen. Die Aufarbeitung nach den erhält man den Salicoyl-glycin-methylester. F. 79°. Aus- Angaben im Beispiel 1 liefert 3 g (85 % der Theorie) kribeute 86%.

Carbobenzoxy-DL-phenylalanylchlorid (Bergmann et al., Z. physiol. Chem., 224 [1934], S. 37) aus 3 g (10 mMol) Carbobenzoxy-DL-phenylalanin werden in 25 ml absolutem Äther aufgeschlämmt und auf —70° gekühlt. Dann wird 1 g O-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-salicoyl-glycinmethylester (Herstellung und Formel vgl. Beispiele 1 und 2) wird in 20 ml Äthylenglykol-monomethylester in Gegenwart von 10 Äquivalenten Triäthylamin der Hydrogenolyse unterworfen. Als Katalysator dient Palladiumkohle. Man erhält nach Eindampfen und Aufarbeitung wie im Beispiel 1 den erwarteten Salicoyldipeptidester vom F. 165°. Seine Formel ist im Beispiel 1

stallisierten Salicoyl-dipeptidester der im Beispiel ί angebenen Formel.

Beispiel 3

unter starkem Rühren eine auf —15° vorgekühlte Mischung von 10 ml Pyridin und 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin zugetropft, so daß die Temperatur nicht über —60° steigt.

Bei —70° läßt man sodann eine Lösung von 1,2 g (5,7 mMol) Salicoyl-glycin-methylester in 30 ml absolutem Äther wiederum unter starkem Rühren zutropfen. Aus dem Reaktionsgemisch fällt dabei ein feiner weißer Nieder

schlag aus. Man läßt auf —15° erwärmen und über 70 angegeben.

	4	ρ	O	CH
Beispiel	1 g Harnstoffderivat der Formel		;!
	"^" ^C"	^Q	CH
		,-N —	CO
	1 i|	ι
1	CH2

:nh

COOCH₃

¹I ο

, NH-CH- CO-NH-CH₂COOH CH₂ · C₆H₅

10

wird in 75 ml Aceton gelöst, die Lösung mit 75 mln/10-Natronlauge versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur sich selbst überlassen. Der ρκ-Wert fällt dabei auf 7, und die Eisenchloridreaktion auf phenolisches Hydroxyl wird positiv. Man säuert an, nimmt in Essigester auf, wäscht die organische Phase mit 2 η-Salzsäure, extrahiert erschöpfend und abwechselnd mit 10%igem Kaliumbicarbonat und Wasser und erhält aus dem Bicarbonat-Wasser-Auszug in der üblichen Weise 0,86 g (97 % der Theorie) einer zunächst öligen Säure, die auf Anreiben mit Äther kristallisiert und dann bei 210 bis 211 ° schmilzt. Sie besitzt die folgende Formel:

^\ .OH

35

Das als Ausgangsmaterial verwendete Harnstoffderivat kann wie folgt hergestellt werden:

Man schüttelt die Lösung von 2,8 g (5,7 mMol) O - (Carbobenzoxy - dl - phenylalanyl) - salicoyl - glycinmethylester in 100 ml Essigester kurze Zeit mit 20 ml eiskalter 2 n-Na O H. Neben sauren Verseifungsprodukten entsteht dabei das Harnstoffderivat, das als Neutralkörper im Essigester zurückbleibt. Nach Neutralwaschen, Trocknen und Eindampfen der Essigesterlösung erhält man 1,1 g öligen Rückstand, der in Aceton aufgenommen wird. Bei Zugabe von Äther kristallisieren auf Anreiben farblose 670 mg (30 °/₀) des obengenannten Harnstoffderivates. Die Ausbeuten sind nicht reproduzierbar und schwanken zwischen 20 und 40%. Zur Reinigung und Analyse kristallisiert man den Harnstoff aus Aceton— Äther um. Tafeln vom F. 158,5 bis 160°.

Beispiel 5

1 g des Perchlorates von O-(L-Phenylalanyl)-salicoylglycin-methylester (Formel vgl. Beispiel 1) werden in 100 ml einer 2 η-Lösung von Triäthylamin in absolutem Chloroform bei Raumtemperatur gelöst. Man läßt 2 Stunden stehen, verdampft am Vakuum zur Trockne, arbeitet nach Beispiel 1 auf und erhält quantitativ Salicoyl-L-phenylalanyl-glycin-methylester (Formel wie im Beispiel 1) vom F. 70,5 bis 71,5° [a]%° = - 54,7° ±1° (c = 1 in Dioxan).

Das als Ausgangsmaterial dienende Perchlorat kann gemäß dem im Beispiel 1 für die DL-Form beschriebenen Verfahren hergestellt werden. O-(Carbobenzoxy-L-phenylalanylj-salicoyl-glycin-methylester: Kristalle aus Essigester—Petroläther. F. 109°. Reinausbeute 78%. O-(L-Phenylalanyl) -salicoyl-glycin-methylester-perchlorat, Kristalle aus Tetrahydrofuran—wenig Petroläther. F. 175 bis 179° (zersetzt). Reinausbeute: 65%.

Beispiel 6

3,5 g des Perchlorates von O-(Glycyl)-salicoyl-L-phenylalanin-methylester der Formel

CO-CH₂-NH₂

CH-COOCH₃

CH₂ · C₆H₅ O

werden mit 350 ml einer 2n-Lösung von Triäthylamin in absolutem Chloroform versetzt. Man läßt 2 Stunden bei 25° stehen, arbeitet nach Beispiel 1 auf und erhält nach Kristallisation aus Methanol—Wasser in mäßiger Ausbeute Salicoyl-glycyl-i-phenylalaninmethylester der Formel

OH

NH-CH₂- CO — NH · CH-COOCH₃

C₁₅H=

150°

= +42,5° ±1° (c = 1,052

F. 148 bis
Dioxan).

Der Ausgangsstoff wird wie folgt erhalten: Man löst 2 g (13,2 mMol) Salicylsäurehydrazid in 14 ml 1 n-HNO_s und 20 ml Wasser, fügt bei 0° 14 ml 1 n-NaNO₂-Lösung zu, rührt 30 Minuten, saugt ab und wäscht mit kaltem Wasser. Das Azid wird unter Rühren zu einer Lösung von 4,4 g (26,4 mMol) L-Phenylalanin in 26,4 ml 1 n-Na O H und 20 ml Wasser gegeben, worauf nochmals 17 ml 1 n-NaOH zugesetzt werden. Nach 2^x/₂ Stunden erfolgt völlige Lösung. Man extrahiert mit Essigester , säuert die wäßrige Lösung mit 20%iger Salzsäure an und nimmt die Fällung in Essigester auf. Übliche Aufarbeitung liefert 2,73 g (73% der Theorie) Salicoyl-L-phenylalanin als farbloses Öl, das auf Anreiben kristallisiert. Kristalle aus Benzol—wenig Petroläther. F. 117 bis 118°.

Man löst 1 g Salicoyl-L-phenylalanin in 50 ml wasserfreiem Methanol, sättigt mit Chlorwasserstoff und läßt über Nacht stehen. Die übliche Aufarbeitung liefert 1 g öligen Salicoyl-L-phenylalanin-methylester.

350 mg (1,17 mMol) Salicoyl-L-phenylalanin-methylester werden mit 320 mg (1,4 mMol) Carbobenzoxyglycylchlorid (M. Bergmann, L.Zervas,Ber.,65[1932], S. 1195) nach dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren acyliert. Man erhält 496 mg FeCl₃-negativen öligen O- (Carbobenzoxy-glycyl) - salicoyl-L-phenylalanin-methylester.

Die Hydrogenolyse der Carbobenzoxyverbindung nach dem Verfahren im Beispiel 1 gibt 443 mg öliges O-Glycylsalicoyl-L-phenylalanin-methylester-perchlorat, das ohne weitere Reinigung der Umlagerung unterworfen wird.

Beispiel 7

1,23 g des Perchlorates von O-(Glycyl)-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester der Formel

	CO-	CH2	-NH2	NH	-CH2	• COOCH3
C	,NH	•CH- I	CO-
O		CH2	• C0H5			703 877/288

werden in 120 ml Methanol gelöst. Man versetzt sofort mit 0,32 ml (entsprechend 0,95 Äquivalenten) Triäthylamin, schüttelt über Nacht bei 20°, versetzt mit 5 ml 2 η-Schwefelsäure, engt ein, nimmt in Essigester und 2 η-Schwefelsäure auf, trennt, wascht den Essigester mit 2 η-Schwefelsäure, dann abwechslungsweise mit 10°/_Digem

,OH Kaliumbicarbonat und Wasser, schließlich mit Wasser, trocknet und dampft am Vakuum zur Trockne ein. Es hinterbleiben 0,94 g (95% der Theorie) eines farblosen Öls, das unter Methanol kristallisiert und dann bei 157 bis 158° schmilzt. Es handelt sich um Salicoyl-glycyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester der Formel

,.NH · CHo · CO -NH · CH · CO — NH · CH₀ · COOCH,

CH₂C₆H₅

Beispiel 10

Das als Ausgangsmaterial verwendete Perchlorat kann wie folgt dargestellt werden:

SaKcoyl-Di-phenylalanyl-glycin-methylester kann nach 1 g Perchlorat des 0-(Glvcyl)-salicoyl-L-phenylalanyl-

dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren hergestellt glycin-methylesters (Formel im Beispiel 7) wird nach den werden. Angaben in den Beispielen 8 und 9 mit 3 Äquivalenten

Carbobenzoxy-glycylchlorid (M. Bergmann, L. Zer- 20 Triäthylamin behandelt, wobei in theoretischer Ausbeute

Salicoyl-glycyl-L-phenylalanyl-glycin-methylester erhalten wird. Er kristallisiert aus Methanol—Wasser mit 1 Mol Kristallwasser und schmilzt bei 92 bis 93°; Wd = -16,7° ±2° (c = 1,02 in Dioxan). Zur Formel und 1,4 ml (10 mMol) Triäthylamin zulaufen gelassen, 25 vgl. Beispiel 7. wobei die Temperatur — 60° nicht übersteigt. Anschlie- Das als Ausgangsmaterial dienende Perchlorat kann

ßend wird eine Lösung von 2,1 g = 5,9 mMol Salicoyl- gemäß dem im Beispiel 7 für die DL-Form beschriebenen

Verfahren hergestellt werden. O-(Carbobenzoxy-glycyl)-salicoyl-L-phenylalanyl-glycin-methylester: Kristalle aus Essigester—Petroläther vom F. 157 bis 159°. O-Glycylsalicoyl - s. - phenylalanyl - glycin - methylester - perchlorat: mikrokristallines Pulver vom F. 110 bis 120° (zersetzt) nach Verreiben mit Chloroform. Dieses Perchlorat muß

vas, Ber., 65 [1932], S. 1195) aus 2,1 g (10mMol) Carbobenzoxy-glycin werden in 25 ml Äther aufgeschlämmt und auf — 70° gekühlt. Dann wird unter starkem Rühren eine auf —15° gekühlte Mischung von 10 ml Pyridin

30

DL-phenylalanyl-glycin-methylester in Tetrahydrofuran zugetropft, wobei ein pulveriger weißer Niederschlag entsteht. Die Mischung läßt man auf —15° erwärmen und über Nacht bei dieser Temperatur stehen. Man entfernt Pyridin und Tetrahydrofuran im Vakuum, nimmt in 2 η-Salzsäure und Essigester auf, wäscht diesen mit 2 n-Salzsäure, 10% KHCO₃-Lösung, dann abwechslungsweise mit 2 n-Natriumcarbonat und Wasser, schließlich mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein. Man erhält 3 g farblosen Rückstand (91% der Theorie), der sich aber nur durch mehrfaches Umkristallisieren aus Chloroform—Äther reinigen läßt. Man erhält den analysenreinen O-(Carbobenzoxy-glycyl) -salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin -methylester vom F. 141,5 bis 143,5° in Form sehr feiner Nädelchen.

725 mg (1,33 mMol) O-^Carbobenzoxy-glycy^-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester werden in 25 ml Eisessig in Gegenwart von 1,33 ml 1 n-Perchlorsäure in Eisessig und 300 mg 10%iger Palladiumkohle der Hydrogenolyse unterworfen. Nach beendeter Reaktion wird von der Kohle abfiltriert und das Filtrat im Vakuum bei 40° Badtemperatur eingedampft. Der Rückstand kristallisiert aus Eisessig—Äther. Man erhält so O-(Glycyl)-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester-perchlorat in Form feiner Nädelchen vom F. 184° (zersetzt). Beim Umkristallisieren aus Eisessig—Äther zur Reinigung und Analyse sinkt der Schmelzpunkt auf 180° (zersetzt). in dieser Form verwendet werden.

Beispiel 11

1 g Perchlorat des O-(Di,-Phenylalanyl)-salicoyl-i>L-phenylalanyl-glycin-methylesters der Formel

CH₂ · C₆H₅

"Y CO-CH-NH₂

I NH-CH-CO-NH-CHo-COOCH,

CeH₅

wird

a) in 100 ml einer 2 η-Lösung von Triäthylamin in Chloroform oder Phenol gelöst, und die so erhaltene Lösung wird 14 Stunden bei 21° sich selbst überlassen;

b) in 100 ml Methanol oder Chloroform oder Tetrahydrofuran suspendiert, die Suspension mit 3 Äquivalenten Triäthylamin versetzt und 14 Stunden bei 21° sich selbst überlassen;

in 80 bis 100 ml Chloroform oder Tetrahydrofuran

Beispiel 8

1 g 0-(Glycyl)-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester-perchlorat wird in 100 ml Chloroform oder Tetrahydrofuran suspendiert, die Suspension mit einem Äqui- 60 suspendiert, die Suspension mit 1 Äquivalent Triäthylvalent Triäthylamin versetzt und 12 Stunden bei einer amin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur Temperatur von 20° stehengelassen. Einengen, Aufnehmen aufbewahrt;

in Essigester und 2 η-Salzsäure liefert neben Glycin und d) in 80 bis 100 ml Chloroform oder Tetrahydrofuran

Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylester den oben be- suspendiert, die Suspension mit 0,95 Äquivalenten

schriebenenSalicoyl-glycyl-DL-phenylalanyl-glycin-methyl- 65 Triäthylamin versetzt und über Nacht bei Raumtem-

ester. . . peratur aufbewahrt;

Beispiel y ^ _{in 1Q}q _{ml wasser}f_reiem p_yridin gelöst und die

Man verfährt wie im Beispiel 8, verwendet aber Lösung über Nacht bei 21° sich selbst überlassen.

3 Äquivalente Triäthylamin und erhält so den erwarteten Man erhält in allen Fällen Salicoyl-BL-phenylalanyl-

Salicoyltripeptidester in reiner Form. 70 DL-phenylalanyl-glycin-methylester der Formel

OH

NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CHo-COOCH,

CH₂ · C₆H₅

Er kristallisiert aus Methanol und wenig Wasser und schmilzt bei 181 bis 184°.

Das als Ausgangsmaterial verwendete Perchlorat des O - (dl - Phenylalanyl) - salicoyl - dl - phenylalanyl-glycinmethylesters kann auf folgende Art dargestellt werden:

0,299 g Carbobenzoxy-DL-phenylalanin (1 mMol) wird gemäß Beispiel 1 in das Chlorid übergeführt und mit 450 mg (1,25 mMol) Salicoyl-dl-phenylalanyl-glycinmethylester in 2 ml Pyridin umgesetzt. Die Aufarbeitung gestaltet sich gleich, wie im Beispiel 1 angegeben. Der resultierende O-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-salicoyl-Di-phenylalanyl-glycin-methylester ist ein öliges Diastereomerengemisch. Die Hydrogenolyse nach den Angaben im Beispiel 1 liefert in quantitativer Ausbeute ein teilweise kristallisierendes Gemisch von stereoisomeren Perchloraten des O-(DL-Phenylalanyl)-salicyl-DL-phenylalanyl-glycin-methylesters, das direkt in dieser Form zur Verwendung gelangt.

CH₂ · C₆H₅

Beispiel 12

1 g Hydrojodid von S-(DL-Phenylalanyl)-thiosalicoylglycin-anilid (F. 190 bis 196° unter Zersetzung) der Formel

CH₂ · C₆H₅

"" "^CO-CH-NH₂

.NH ■ CH₂ -CO-NH- C_fiH,

wird in 100 ml Chloroform suspendiert, die Suspension mit 3 Äquivalenten Triäthylamin versetzt und 12 Stunden bei 22° aufbewahrt. Man erhält Thiosalicoyl-DL-phenylalanyl-glycin-anilid der Formel

NH ■ CH · CO — NH · CH₂

C_fiH_s CO-NH- C₆H₅

Das als Ausgangsmaterial verwendete Hydrojodid kann wie folgt dargestellt werden:

1 g (2,91 mMol) Disulfid-dichlorid der Thiosalicylsäure (Hilditch, Soc, 99 [1911], S. 1099) und 1,50 g (10 mMol) Glycinanilid (Hill, Kelsey, Am. Soc, 42, S. 1706) in 10 ml Tetrahydrofuran werden bei 0° mit 10 ml Pyridin versetzt und 14 Stunden bei 0° stehengelassen. Nach dem Eindampfen im Vakuum, Verteilen zwischen Essigester und Salzsäure, anschließender Extraktion der Essigesterlösung mit Bicarbonatlösung und Abdampfen des Essigesters im Vakuum isoliert man rohes Disulfid des Thiosalicoyl-glycin-anilides: Kristalle aus Eisessig— Wasser. F. 208 bis 210°. Ausbeute 1 g (61% der Theorie).

1 g (1,75 mMol) Disulfid wird in 100 ml Äthanol und _20 ml Wasser suspendiert. Die kochende Suspension wird mit 2 g Zn-Staub langsam mit 20 ml 2 n-Salzsäure versetzt, wobei man in Stickstoff- oder Kohlensäureatmosphäre arbeitet. Wenn alles in Lösung gegangen ist, versetzt man noch heiß mit 200 ml Wasser und läßt 14 Stunden bei 0° stehen. Die ausgefallenen Kristalle des Thiosalicoyl-glycin-anilids werden abfiltriert, getrocknet und aus Essigester—Benzin umkristallisiert. F. 177 bis 179°. Ausbeute 860 mg (86% der Theorie).

600 mg (2 mMol) Carbobenzoxy-DL-phenylalanin werden, wie im Beispiel 1 angeführt, in das Säurechlorid übergeführt und dasselbe in 10 ml Pyridin mit 286 mg Thiosalicoyl-glycin-anilid (1 mMol) umgesetzt. Nach dem Eindampfen des Pyridine im Vakuum wird der Rückstand zwischen Essigester und Salzsäure verteilt, die Essigesterlösung erschöpfend mit Bicarbonatlösung extrahiert, neutral gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol— wenig Wasser erhält man 350 mg (62 % der Theorie) S - (Carbobenzoxy -dl - phenylalanyl) - thiosalicoyl - glycinanilid vom F. 149°.

400 mg S-(Carbobenzoxy-DL-phenylalanyl)-thiosalicoylglycin-anilid (0,71 mMol) werden in 20 ml Eisessig gelöst und bei 60° Badtemperatur während 3 Stunden mit 500 mg Phosphoniumjodid behandelt. Nach Abfiltrieren des unverbrauchten Phosphoniumjodids wird der Eisessig im Vakuum entfernt und der spontan kristallisierende Rückstand aus Eisessig—wenig Petroläther umkristallisiert. Man erhält 200 mg (50% der Theorie) S- (DL-Phenylalanyl) -thiosalicoyl-glycin-anilid-hydroj odid vom F. 190 bis 196° (zersetzt) bei Sintern ab 176°.

Die Abspaltung der N-Acylgruppe in den gemäß obigen Beispielen erhaltenen Verbindungen läßt sich z. B. wie folgt durchführen:

I. DL-Phenylalanyl-glycin
1. Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin

100 mg (0,28 mMol) Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycinmethylester, erhalten nach den Angaben im Beispiel 1, werden in 1,2 ml 0,5n-NaOH (0,6 mMol) gelöst und 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man säuert mit 2 η-Salzsäure an, extrahiert mit Essigester, wäscht diesen neutral, trocknet, dampft im Vakuum ein und erhält Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin in einer Ausbeute von 85 mg (90% der Theorie) farblosen Schaums; Kristalle aus Alkohol—Wasser. F. 212 bis 214°.

2. O-Methyl-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin

535 mg (1,5 mMol) Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycinmethylester werden in 12 ml Dioxan gelöst und mit 5 mMol Diazomethan in Äther versetzt. Nach 6 stündigem Stehen wird die immer noch gelbe Lösung im Vakuum zur Trockne verdampft und der Rückstand direkt mit 1,8 ml In-NaOH in 10 ml Aceton verseift. Nach

2 Stunden wird angesäuert, das Aceton im Vakuum entfernt, die Fällung in Essigester aufgenommen, die Essigesterlösung neutral gewaschen, getrocknet und zur Trockne verdampft. Man erhält so 360 mg (67°/₀ der Theorie) O-Methyl-salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin, das direkt weiterverarbeitet wird.

3. Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak

a) 3,42 g (10 mMol) Salicoyl-DL-phenylalanyl-glycin oder 3,56 g (10 mMol) O-Methyl-salicoyl-DL-phenylalanylglycin löst man in 70 ml flüssigem Ammoniak und versetzt mit 1,84 g Natrium. Wenn alles Natrium verbraucht ist, wird der Ammoniak verdampft und der Rückstand in 50 ml 2 η-Salzsäure aufgenommen. Nach dem Extrahieren mit Essigester verdampft man die saure wäßrige Lösung zur Trockne, nimmt den Rückstand in absolutem Alkohol auf, filtriert und dampft den Alkohol im Vakuum ein. Zurück bleibt DL-Phenylalanyl-glycin-hydrochlorid.

b) Man verfährt gleich wie bei a) unter Anwendung von 0,92 g Natrium.

c) Man verfährt gleich wie bei a) unter Anwendung von 0,46 g Natrium.

II. Glycyl-DL-phenylalanyl-glycin

1. Sahcoyl-glycyl-DL-phenylalanyl-glycin

413 mg (1 mMol) Salicoyl-glycyl-ni-phenylalanylglycin-methylester aus Beispiel 7 werden in 6 ml 0,5 n-NaOH gelöst und 16 Stunden bei 20° stehengelassen. Nach Ansäuern wird mit Essigester extrahiert, dieser neutral gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält 330 mg (83 % der Theorie) farblosen kristallinen Rückstand, der zur Reinigung und Analyse aus Alkohol—Wasser umkristallisiert wird. F. 203 bis 205°.

2. Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak

1 g Salicoyl-glycyl-DL-phenylalanyl-glycin (2,5 mMol) löst man in 20 ml flüssigem Ammoniak und versetzt mit 0,46 g Natrium. Wenn alles Natrium verbraucht ist, wird der Ammoniak verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen. Nach Einstellen auf pn 6 bis 7 mit saurem Ionenaustauscher, Filtrieren und Extrahieren mit Essigester verdampft man die wäßrige Lösung zur Trockne und erhält im Rückstand Glycyl-DL-phenylalanyl-glycin.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man Aminosäure- oder Peptidderivate, welche in der endständigen Aminogruppe einen Acylrest der folgenden Formel tragen

Ar

X —CO — R-NHo

! O

worin Ar einen höchstens zweikernigen Rest einer Verbindung aromatischen Charakters bedeutet, an dem sich die beiden Substituenten in ortho-Stellung befinden, und worin X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom bezeichnet und R für den zweiwertigen Rest einer ct-Aminocarbonsäure, besonders einer natürlichen Aminosäure, steht, oder Salze dieser Verbindungen mit basischen Mitteln behandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Verbindungen als Ausgangsverbindungen verwendet, in denen die Gruppe

Ar

XH

C —

den Rest der Salicylsäure oder der Thiosalicylsäure bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Verbindungen als Ausgangsverbindungen verwendet, in denen R für den Rest der Formel

R'

— CH-

steht, worin R' Wasserstoff oder einen organischen Rest bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man solche Verbindungen als Ausgangsverbindungen verwendet, in denen R' in der Formel des Anspruches 3 den Rest einer in natürlichen Aminosäuren vorhandenen Seitenkette bedeutet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als basisches Mittel Alkalihydroxyd oder eine tertiäre organische Base, vorzugsweise Triäthylamin, verwendet.

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