DE10222845A1 - Klonierung, Expression und Charakterisierung der Gesamtsequenz von Phosphodiesterase 8B - Google Patents

Abstract

Eine Nukleinsäure, welche für humane PDE8B codiert, umfasst DOLLAR A (a) eine DNA-Sequenz gemäß Abb. 10, DOLLAR A (b) eine davon abweichende Sequenz, welche jedoch für die gleiche Aminosäuresequenz codiert, DOLLAR A (c) eine Sequenz, welche für ein Protein mit Mutationen oder Deletionen codiert, welche die Aktivität nicht wesentlich ändern, oder DOLLAR A (d) eine mit der Sequenz nach Abb. 10 hybridisierende Sequenz, solange sie für ein Protein mit PDE8B-Aktivität codiert. DOLLAR A Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor enthält eine derartige Sequenz insertiert in einen geeigneten Vektor.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft die Gesamtsequenz der Phosphodiesterase 8B (PDE8B) aus der Schilddrüse.
• Eine Teilsequenz der humanen PDE8B wurde von Hayashi M. et al. in "Biochem. Biophys. Res. Commun." (1998), 250, 751-756 publiziert und ist u. a. unter der Accession Number AF079529 in Gendantenbanken zugänglich. Die beschriebene Sequenz ist am 5'-Ende jedoch inkomplett. Die Sequenz enthält 2844 Basen, von denen 1980 für 659 Aminosäuren codieren. Allerdings erfüllt erst der dritte Methioninrest an Aminosäureposition 79 im Leserahmen die Bedingungen einer Kozak- Konsensus-Sequenz für den Translationsbeginn in Eukaryonten, weshalb ein N-terminal verkürztes, jedoch dennoch enzymatisch aktives Protein von 584 Aminosäuren entsprechend den Aminosäurepositionen 76-659 bzw. den Basenpositionen 226-1977 exprimiert wurde. Das N-terminal trunkierte Protein hat ein Molekulargewicht von 66 kDa.
• Die Phosphordiesterase 8B spaltet spezifisch cAMP und wird nur durch Dipyridamol, nicht jedoch durch Rolipram, IMBX, Vinpocetin, cGMP und Milrinon gehemmt. Eine besonders hohe Expression des Enzyms findet sich in der Schilddrüse.
• Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die komplette, codierende Sequenz für PDE8B bereitzustellen und damit die Expression eines vollständigen Proteins zu ermöglichen.
• Die Aufgabe wurde gelöst durch Bereitstellung der kompletten DNA- Sequenz, welche für humanes PDE8B codiert. Die erfindungsgemäße neue, komplette Sequenz ist in Abb. 10 gezeigt.
• Mithilfe der 5'-RACE-Methode von Mayurama et al., "Nucleic Acids Research" (1995), 23, 3736-3797 ist es geglückt, die komplette Sequenz des Proteins mit einem Kozak-Startcodon im richtigen Leseraster mit der bekannten Sequenz aufzufinden. Die full length-Sequenz von PDE8B enthält 3270 bp, coding sequence 64-2418, codiert für ein Protein von 784 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 89 kDa. Die Gesamtsequenz von PDE8B wurde zur Transfektion von COS1-Zellen und von Insektenzellen verwendet. In beiden Fällen wurde eine Überexpression von cAMP-spezifischer Phosphatdiesterase im Bereich von 17- bis 900-fach festgestellt. In einem Western Blot mit PDE8B-spezifischen Antipeptidantikörpern konnte das Protein mit der korrekten Größe detektiert werden. Das PDE8B-Gen ist auf dem Chromosom 5q 13.3 lokalisiert. Ein Alignment der hier vorgestellten Sequenz mit genomischer DNA unter Verwendung des blastp-Programms war nur teilweise erfolgreich. Eine gute Übereinstimmung konnte innerhalb der 3'-Sequenzregion erzielt werden, wogegen am 5'-Ende und in der Mitte keine Resultate erhalten wurden. Eine Analyse ohne ein solches Programm führte zu der Vermutung, dass die für PDE8B codierende Sequenz im Genom aus 29 Exons bestehen dürfte. In der Mitte der Sequenz ist eine Serie von sehr kurzen Exons vorhanden. Außerdem existiert ein Intron von mehr als 133 kbp zwischen dem ersten und dem zweiten Exon. Die Auffindung der kompletten PDE8B- Sequenz war daher äußerst schwierig.
• Mithilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz ist es erstmals möglich, rekombinant die intakte und vollständige, humane PDE8B herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist daher eine rekombinant hergestellte PDE8B. Widerum weitere Gegenstände sind Expressionsvektoren, welche die erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthalten und damit zur Expression des kompletten PDE8B eingesetzt werden können. Ein besonders bevorzugter Vektor, enthaltend die Gesamtsequenz für PDE8B, ist der Vektor pCMV5, welcher in Übereinstimmung mit Beispiel 3 hergestellt wurde.
• Das Insert dieses Vektors wurde sequenziert und ist in Abb. 8 gezeigt.
• Auch Wirtszellen, welche mit einem entsprechenden Expressionsvektor transfiziert sind, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Kultivierung und die Gewinnung von PDE8B aus diesen Wirtszellen wird gemäß dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen.
• Das erfindungsgemäß erzeugte Protein kann u. a. zur Untersuchung von Substanzen auf ihre Fähigkeit, PDE8B zu beeinflussen, eingesetzt werden. Insbesondere ist die Untersuchung von Substanzen auf ihre Fähigkeit, PDE8B zu inhibieren, von besonderem Interesse. Außerdem können Sequenz- und auch Strukturinformationen aus dem rekombinant hergestellten, erfindungsgemäßen Protein gewonnen werden, welche es ermöglichen, Teilbereiche des Proteins aufzufinden, welche für die Wirksamkeit des Proteins von essentieller Bedeutung sind. So können zur Erzeugung und zum Design von Wirkstoffen die notwendigen Grundlagen geliefert werden. Dabei können Wirkstoffe sowohl die Enzymaktivität vermindern, blockieren oder aber auch positiv beeinflussen. Die Bereitstellung des vollständigen PDE8B-Proteins ermöglicht es auch erstmals, die Wechselwirkungen mit zellulären Komponenten ausführlich zu studieren.
• Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms wurden bereits verschiedene PDE-Inhibitoren getestet. Momentan gibt es keinen artspezifischen PDE8B-Inhibitor. Den stärksten Effekt zur Inhibition von PDE8B zeigte die Substanz EHNA und Dipyridamol bei einer Konzentration von 100 µM (siehe Abb. 11). Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des erfindungsgemäßen, kompletten PDE8B-Enzyms zur Untersuchung von Substanzen auf ihre Fähigkeit, die Aktivität des Enzyms zu modulieren, insbesondere zu verringern bzw. zu inhibieren. Derartige Substanzen können dann im Zusammenhang mit der Behandlung von Erkrankungen der Schilddrüse von besonderem Interesse sein. Jedoch auch im Zusammenhang mit Erkrankungen von anderen Organen, in denen die PDE8B eine Rolle spielt, können diese Substanzen Anwendung finden.
• Mithilfe der heute verfügbaren Computerprogramme ist es leicht möglich, für ein rekombinant exprimierbares und zur Verfügung stehendes Protein ein Screening nach potenziell inhibierenden Substanzen durchzuführen. Solche Substanzen dann noch in vitro oder auch in vivo auf ihre Wirksamkeit zu untersuchen, ist für den Fachmann Stand der Technik. Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1 Generation des PDE8B-PCR-Amplifikats
• Mittels reverser Transkriptase wurde unter Verwendung von total-RNA aus Schilddrüse (Stratagene) cDNA synthetisiert. Die cDNA diente als Template für die PCR. Das Design PDE8B-typspezifischer Primer erfolgte mit dem Programm Oligo, Medporbe. Am 5'-Ende fand sich erst in Basenposition 12 ein geeigneter upper Primer. Mit der Primerkombination 12 upper und 2030 lower konnte kein Amplifikat erhalten werden (Abb. 1). Es wurden deshalb weitere Primerkombinationen ausgetestet. Die Primerkombination 249 upper - 2030 lower ergab das längste Fragment (Abb. 1). Mit der Primerkombination 12 upper und 691 lower wurde der größte Teil der restlichen 5'-Sequenz separat dargestellt (Abb. 1).
Beispiel 2 5'-RACE zur Ermittlung des kompletten 5'-Endes
• Das 5'-RACE erfolgte nach der Methodik von Maruyama, I. N. et al., "Nucleic Acids Research" (1995), 23, 3736-3797, die für unsere Anwendung gering modifiziert worden ist. Diese Methode ist auch Grundlage des 5'-RACE-Kits von Takara. Mittels reverser Transkriptase wurde unter Verwendung von total-RNA aus Schilddrüse (Stratagene) und des 5'-phosphorylierten lower Primers 691 cDNA synthetisiert. Die cDNA-Einzelstränge wurden mit T4- RNA-Ligase ligiert und das Ligationsprodukt als PCR-Template eingesetzt. Als PCR-Primer wurde eine Primerkombination (532 upper/351 lower) gewählt, die gewährleistet, dass sich die Ligationsstelle im Amplifikat befindet. Die Methodik ist in Abb. 2 schematisch dargestellt. Es konnnte ein Amplifikat von ca. 1000 bp erhalten werden (Abb. 3). Die Primerkombiantion 532 upper/351 lower ergibt ein Amplifikat über die Ligationsstelle von minimal 498 bp. Es konnte also eine Sequenzverlängerung von ca. 500 bp erzielt werden. Das 1000-bp- Amplifikat wurde durch TA-Cloning in den Vektor pCRII-TOPO (Invitrogen) kloniert (Abb. 4) und anschließend sequenziert. Die Ergebnisse zeigen eine Sequenzverlängerung im Leserahmen, ausgehend von der bekannten Sequenz mit einem Startcodon im ORF (Abb. 5). Das Startcodon erfüllt alle Anforderungen einer Kozak-Konsensus-Sequenz für den Translationsbeginn in Eukaryonten. Somit kann geschlussfolgert werden, dass das komplette 5'-Ende der PDE8B dargestellt werden konnte.
Beispiel 3
• Klonierung, Sequenzierung und Einbau des PDE88-PCR-Amplifikats in einen Transfektionsvektor
• Die beiden Fragmente wurden ligiert und das "full length"-PCR-Amplifikat in den TA-cloning-Vektor pCRII-TOPO (Invitrogen) eingebaut und durch Restriktionsverdau die erfolgreiche Klonierung bestätigt (Abb. 6). Nach Umklonierung in den pCMV5-Vektor (Abb. 7) wurde das Insert komplett sequenziert (Abb. 8). Die erhaltenen Sequenzdaten zeigen eine hundertprozentige Homologie zur veröffentlichten PDE8B-Sequenz von Hayashi M. et al. in "Biochem. Biophys. Res. Commun." (1998), 250, 751-756 und enthielten darüber hinaus das 5'-Ende mit dem Startcodon im Leserahmen. Alte bekannte und neue bisher unbekannte "full length"- Sequenz sind in Abb. 9 und Abb. 10 dargestellt. Die Funktionsfähigkeit des pCMV5-Vektors mit dem PDE8B-Insert wurde durch transiente Transfektion von COS-Zellen getestet. Es konnte in ersten orientierenden Versuchen im Zytosol eine etwa fünfzigfache Überexpression nachgewiesen werden (Abb. 11 und Abb. 12). Der K_M-Wert beträgt 0,5 pM.
• Für eine Expression des neuen PDE8B-Proteins in Sf9-Insektenzellen wurde das Bac to bac-System (Invitrogen) verwendet. Hierzu wurde die neue bisher unbekannte "full length"-PDE8B-Sequenz nach der oben beschriebenen Methode in einem pFASTBAC1-Vektor umkloniert. Die Proteinexpression wurde mittels Western Blot analysiert (Abb. 12). In den nicht transfizierten Zellen konnte in den Fraktionen von Membran und Cytosol keine PDE-Aktivität bestimmt werden. Im Vergleich hierzu konnte in den transfizierten Sf9-Zellen eine mindestens 400-fache Überexpression des PDE8B-Proteins nachgewiesen werden (Abb. 11). Der bestimmte K_M- Wert für die Cytosol-Fraktion beträgt 0,5 µM.
• Abb. 13 zeigt die Sequenzen new hPDE8B, human clone 787CIPZC 53, human Incyte clone 2284925, human Incyte clone 464655 extended isoenzyme 8B und hPDE8B (AAC69564.1) sowie die Consensus-Sequenz. SEQUENZPROTOKOLL
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

Claims (8)

1. Nukleinsäure, welche für humane PDE8B codiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie:

a) eine DNA-Sequenz gemäß Abb. 10 umfasst,

b) eine von Abb. 10 abweichende Sequenz umfasst, welche jedoch für die gleiche Aminosäuresequenz codiert,

c) eine Sequenz aufweist, welche für ein Protein mit Mutationen oder Deletionen codiert, welche die Aktivität nicht wesentlich ändern,

d) eine mit der Sequenz nach Abb. 10 hybridisierende Sequenz aufweist, solange sie für ein Protein mit PDE8B-Aktivität codiert.

2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie innerhalb der Sequenz gemäß Abb. 10 Introns aufweist.

3. Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, insertiert in einen zur Expression eines Proteins geeigneten Vektor, enthält.

4. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 oder 2 in exprimierbarer Form umfasst.

5. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 3 transfiziert ist.

6. Rekombinant hergestellte, humane PDE8B, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 oder 2, eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 3 oder mithilfe einer Wirtszelle gemäß Anspruch 4 oder 5 erhältlich ist.

7. Verwendung einer humanen PDE8B zur Gewinnung von Strukturinformationen sowie zur Auffindung von für die Wirkung des Enzyms essentiellen Teilbereichen desselben.

8. Verwendung einer humanen PDE8B zur Untersuchung und Auffindung von Substanzen, welche die Enzymaktivität modulieren, insbesondere inhibieren.