DE102023115407A1

DE102023115407A1 - Massenspektrometrische flugzeit-analyse gekennzeichneter analytmoleküle

Info

Publication number: DE102023115407A1
Application number: DE102023115407.9A
Authority: DE
Inventors: Hamish Stewart
Original assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Current assignee: Thermo Fisher Scientific Bremen GmbH
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2023-06-13
Publication date: 2023-12-28
Also published as: GB2619766A; JP2023184506A; GB202208939D0; US20230411138A1; CN117250250A

Abstract

Ein Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytionen umfasst das Fragmentieren gekennzeichneter Analytionen, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren, wobei die Analytfragmentionen unter Verwendung eines Flugzeit-Massenanalysators, der in einem ersten Betriebsmodus betrieben wird, analysiert werden, und die Reporterionen oder die komplementären Ionen unter Verwendung des Flugzeit-Massenanalysators, der in einem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, analysiert werden. In dem ersten Betriebsmodus werden Ionen veranlasst, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen, und in dem zweiten Betriebsmodus werden Ionen veranlasst, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten Länge zu bewegen, wobei die zweite Länge größer als die erste Länge ist.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Analysieren von Ionen und insbesondere Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle und/oder -ionen unter Verwendung von Flugzeit(ToF)-Massenanalysatoren.
STAND DER TECHNIK
Chemisches Markieren ist ein seit langem bestehendes Werkzeug für die Quantifizierung von Analyten, wobei die einfachste Form einen Vergleich von Peakintensität mit der eines gekennzeichneten Standards bekannter Konzentration beinhaltet. Wenn multiple unterschiedliche chemische Markierungen mit sich unterscheidenden Massen verfügbar sind, wie multiple Isotopomere, wird es möglich, mehrere Proben zusammenzumischen und sie in einem einzelnen gemultiplexten Hochdurchsatz-Arbeitsablauf zu analysieren.
Eine wichtige Anwendung innerhalb dieser Gruppe ist das Tandem-Atommassenmarkierungs(TMT)-Verfahren (Thompson et al, Anal. Chem., 2003, 75, 1895-1904), vertrieben als TMT oder iTRAQ (Isobaric Tagging for Relative Quantiation; isobarisches Markieren zur relativen Quantifizierung). Dies ist ein Tandemverfahren, bei dem die gemultiplexten markierten Peptide das gleiche m/z besitzen, somit aus Flüssigchromatographie co-eluieren und durch einen Quadrupol-Massenfilter co-isoliert werden. Bei Fragmentierung werden jedoch charakteristische 1,2,6-Reporterionen mit sich unterscheidenden m/z generiert und zur Quantifizierung detektiert. Gleichzeitige Detektion von Peptidfragmenten erlaubt Peptididentifikation in dem gleichen Schritt.
Es wird angenommen, dass es Möglichkeiten für Verbesserungen an Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle gibt.
KURZDARSTELLUNG
Ein erster Gesichtspunkt stellt ein Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytionen bereit, wobei das Verfahren umfasst:

Fragmentieren gekennzeichneter Analytionen, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren;
Analysieren der Analytfragmentionen unter Verwendung eines Flugzeit-Massenanalysators, der in einem ersten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen; und
Analysieren der Reporterionen oder der komplementären Ionen unter Verwendung des Flugzeit-Massenanalysators, der in einem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten Länge zu bewegen, wobei die zweite Länge größer als die erste Länge ist.

Ausführungsformen stellen Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle, wie Biomoleküle, die mit isobarischen Markierungen gekennzeichnet sind, bereit (z. B. „Tandem-Atommassenmarkierungen“ (TMT) oder „isobarische Markierungen zur relativen und absoluten Quantifizierung“ (iTRAQ). Jede Markierung kann eine Reporterregion und eine Balancerregion derart umfassen, dass jedes gekennzeichnete Analytmolekül eine Reporterregion, eine Balancerregion und ein Analytmolekül umfassen kann. Um die gekennzeichneten Analytmoleküle zu analysieren, können sie zunächst ionisiert werden, um gekennzeichnete Analytionen zu produzieren, und die gekennzeichneten Analytionen werden dann fragmentiert. Wenn gekennzeichnete Analytionen fragmentiert werden, können Reporterionen zusammen mit Analytmolekülfragmentionen produziert werden (wobei ein Reporterion ein Ion einer Reporterregion ist). Zusätzlich oder alternativ können komplementäre Ionen produziert werden (wobei ein komplementäres Ion ein Ion einer Balancerregion und eines Analytmoleküls kombiniert ist).
In dem Verfahren werden die Analytfragmentionen und die Reporterionen oder die komplementären Ionen unter Verwendung eines Massenanalysators analysiert, d. h. um ihre Masse-zu-Ladung-Verhältnisse (m/z) und/oder Intensitäten zu bestimmen. Die resultierenden m/z- und/oder Intensitätsinformationen für die Analytfragmentionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu identifizieren, und die m/z- und/oder Intensitätsinformationen für die Reporterionen oder die komplementären Ionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu quantifizieren.
Bei herkömmlichen massenspektrometrischen (MS) Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle werden Analytfragmentionen und Reporterionen zusammen in dem gleichen Massenanalysatorscan analysiert. Dies kann einen sehr hochauflösenden Massenanalysator erfordern, besonders wenn hochgemultiplexte isobarische Markierungssätze verwendet werden, und besonders an dem unteren Ende des m/z-Spektrums, wo die Reporterionen erscheinen. Daher werden herkömmliche Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle üblicherweise unter Verwendung von hochauflösenden elektrostatischen Ionenfallen-Massenanalysatoren, wie elektrostatischen Orbitalfallen, und spezifischer Orbitrap™-FT-Massenanalysatoren, wie von Thermo Fisher Scientific hergestellt, durchgeführt. Obwohl diese Analysatoren besonders gut für die Analyse gekennzeichneter Analytmoleküle geeignet sind, werden sie im Allgemeinen mit einer relativ langsamen Repetitionsrate betrieben, besonders wenn mit Flugzeit(ToF)-Massenanalysatoren verglichen. Dies resultiert in relativ langsamen experimentellen Zyklen und relativ niedrigem Durchsatz.
Obwohl einige herkömmliche Flugzeit(ToF)-Massenanalysatoren ausreichend hohe Auflösung bereitstellen können, um sowohl Analytfragmentionen als auch die Reporterionen (oder komplementäre Ionen) aufzulösen, sind solche Analysatoren relativ komplex und/oder müssen lange Ionenflugbahnen aufweisen, um dies mit annehmbarer Widerstandsfähigkeit gegenüber Raumladungseffekten tun zu können.
In den Verfahren verschiedener Ausführungsformen werden die Analytfragmentionen und die Reporterionen (oder die komplementären Ionen) unter Verwendung eines Flugzeit(ToF)-Massenanalysators analysiert, der in (mindestens) zwei unterschiedlichen Betriebsmodi betrieben werden kann, nämlich einem ersten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen, und einem zweiten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten, größeren Länge zu bewegen. Steigern der Länge der Ionenflugbahn in dem zweiten Betriebsmodus weist den Effekt auf, die Auflösung des Analysators zu steigern, verringert aber den m/z-Bereich von Ionen, die analysiert werden können. Wenn die gesteigerte Bahnlänge erzielt wird, indem die Anzahl der Durchläufe gesteigert wird, die Ionen durch ein zyklisches Segment einer Ionenbahn absolvieren (wie nachstehend weiter beschrieben wird), ist dies so, weil Ionen von niedrigerem m/z Ionen von höherem m/z derart überholen (d. h. überrunden) können, dass es ungewiss werden kann, wie viele Durchläufe durch das zyklische Segment einige Ionen genommen haben (mit m/z außerhalb eines gewissen eindeutigen m/z-Bereichs), sodass m/z einiger Peaks ungewiss werden. Zusätzlich oder alternativ haben beim Betreiben des Analysators mit einer konstanten Repetitionsrate für längere Ionenflugbahnlängen Ionen mit hohem m/z in einer besonderen Repetition nicht ausreichend Zeit, um den Detektor zu erreichen, bevor die nächste Repetition beginnt. Der zweite Betriebsmodus kann dementsprechend als ein „Zoom“-Betriebsmodus bezeichnet werden (da der Analysator effektiv auf eine schmalere m/z-Region des m/z-Spektrums „einzoomt“).
Obwohl dieser Verlust an m/z-Bereich ein Problem bei herkömmlichen Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle sein würde (da Analytfragmentionen von Interesse relativ hohe m/z aufweisen können, während Reporterionen relativ niedrige m/z aufweisen können), hat der Erfinder nun erkannt, dass durch Analysieren der Analytfragmentionen unter Verwendung des ersten Betriebsmodus und Analysieren der Reporterionen (oder der komplementären Ionen) unter Verwendung des zweiten Betriebsmodus dieses Problem umgangen wird. Dies liegt daran, dass der erste Betriebsmodus mit breitem m/z-Bereich besonders geeignet ist für die Analyse von Analytfragmentionen (die in der Regel über einen relativ breiten Bereich von m/z erscheinen), und dementsprechend ist der zweite („Zoom-“) Betriebsmodus des schmalen m/z-Bereichs, aber höherer Auflösung, besonders geeignet für die Analyse der Reporterionen (die in der Regel innerhalb eines relativ schmalen m/z-Bereichs bei relativ niedrigem m/z erscheinen) oder der komplementären Ionen. Darüber hinaus weist dies den Effekt auf, die erforderliche Auflösung in dem ersten („normalen“) Betriebsmodus zu lockern, da der primäre Grund dafür die Tatsache ist, dass die Reporterionen (und die komplementären Ionen) im m/z sehr eng beabstandet sind.
Daher hat der Erfinder erkannt, dass Flugzeit(ToF)-Massenanalysatoren, die eine variable Bahnlänge aufweisen, besonders gut für die Analyse gekennzeichneter Analytmoleküle geeignet sind. Die Verwendung eines ToF-Analysators zum Analysieren gekennzeichneter Analytionen (z. B. anstelle eines Analysators mit elektrostatischer Ionenfalle) erleichtert wiederum eine gesteigerte Instrumentenrepetitionsrate und einen gesteigerten experimentellen Durchsatz. Es ist deshalb ersichtlich, dass Ausführungsformen ein verbessertes Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle bereitstellen.
Ein weiterer Gesichtspunkt stellt ein Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle bereit, wobei das Verfahren das Ionisieren gekennzeichneter Analytmoleküle, um gekennzeichnete Analytionen zu produzieren, und das Analysieren der gekennzeichneten Analytionen unter Verwendung des/der hierin beschriebenen Verfahren umfasst. Diese Gesichtspunkte und Ausführungsformen können, und in Ausführungsformen tun sie dies, jedes oder mehrere der hierin beschriebenen optionalen Merkmale einschließen.
Die Analytmoleküle, die unter den verschiedenen Gesichtspunkten und Ausführungsformen analysiert werden, können beliebige zur Analyse geeignete Moleküle sein, wie organische Moleküle, Biomoleküle, DNA, RNA, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren und dergleichen. In Ausführungsformen sind die Analytmoleküle Peptide.
Die Analytmoleküle können mit einem Satz chemischer Kennzeichnungen gekennzeichnet werden, wie einem Satz von isobarischen Markierungen. Ein Satz von isobarischen Markierungen ist ein Satz von Markierungsmolekülen, die (etwa) die gleiche Masse aufweisen, aber bei Fragmentierung gekennzeichneter Analytionen charakteristische Reporterionen von sich unterscheidender Masse ergeben. Geeignete isobarische Markierungen schließen Tandem-Atommassenmarkierungen (TMT) und isobarische Markierungen zur relativen und absoluten Quantifizierung (iTRAQ) ein. Jede Markierung kann (mindestens) eine Reporterregion und eine Balancerregion umfassen, z. B. derart, dass jedes gekennzeichnete Analytmolekül (mindestens) eine Reporterregion, eine Balancerregion und ein Analytmolekül (z. B. ein Peptid) umfasst. Ausführungsformen eignen sich besonders für die Analyse von Analytmolekülen, die mit hochgemultiplexten Sätzen isobarischer Markierungen, wie TMT10, 16 oder 18, gekennzeichnet sind, wobei die minimale Beabstandung zwischen Reporterionenkanälen von der Größenordnung einiger weniger mDa, z. B. ~6 mDa, betragen kann. Ausführungsformen können auch für niedriger gemultiplexte isobarische Markierungssätze verwendet werden, wie TMT6 und 8, die Reporterionenkanalbeabstandungen der Größenordnung von ~1 Da aufweisen.
Das/die Verfahren können unter Verwendung eines analytischen Instruments, wie ein Massenspektrometer, durchgeführt werden. Das analytische Instrument kann (mindestens) eine Ionenquelle, einen Massenfilter, eine Fragmentierungsvorrichtung und einen Flugzeit-Massenanalysator umfassen (wie nachstehend ausführlicher beschrieben ist). Das analytische Instrument kann eine Trennungsvorrichtung umfassen, die mit der Ionenquelle gekoppelt ist.
Die gekennzeichneten Analytmoleküle können in Lösung bereitgestellt werden, die Lösung kann unter Verwendung der Trennvorrichtung getrennt werden, und die getrennte Lösung kann der Ionenquelle zur Ionisierung bereitgestellt werden. Die Ionenquelle kann die gekennzeichneten Analytmoleküle ionisieren, um gekennzeichnete Analytionen zu produzieren.
Die gekennzeichneten Analytionen können anfänglich durch das Instrument analysiert werden, das in einem MS1-Betriebsmodus betrieben wird, um MS1-Daten bereitzustellen. Die MS1-Daten können einen oder mehrere Ionenpeaks einschließen, wobei jeder Ionenpeak den gekennzeichneten Analytionen entspricht, die ein besonderes m/z (d. h. einen besonderen Vorläufer) aufweisen.
Die gekennzeichneten Analytionen können dann durch das Instrument analysiert werden, das in einem MS2-Betriebsmodus betrieben wird, um MS2-Daten bereitzustellen. Jeder Vorläufer von Interesse, der aus den MS 1-Daten identifiziert wird, kann verwendet werden, um ein m/z-Fenster für den Massenfilter zu definieren. Der Massenfilter kann dann nacheinander jedes m/z-Fenster durchschreiten, um nacheinander jeden Vorläufer von Interesse auszuwählen. Die Fragmentierungsvorrichtung kann in einem fragmentierenden Betriebsmodus betrieben werden, sodass massengefilterte gekennzeichnete Analytionen fragmentiert werden. Wenn gekennzeichnete Analytionen fragmentiert werden, können Reporterionen zusammen mit Analytmolekülfragmentionen produziert werden (wobei ein Reporterion ein Ion einer Reporterregion ist). Zusätzlich oder alternativ können komplementäre Ionen produziert werden (wobei ein komplementäres Ion ein Ion einer Balancerregion und eines Analytmoleküls kombiniert ist).
Die resultierenden Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen werden dann unter Verwendung des Flugzeitanalysators analysiert. Das resultierende Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) und/oder die Intensitätsinformationen für die Analytfragmentionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu identifizieren, und das Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) und/oder die Intensitätsinformationen für die Reporterionen oder die komplementären Ionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu quantifizieren.
Die Analytfragmentionen werden unter Verwendung des ersten Betriebsmodus analysiert, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen, und die Reporterionen oder die komplementären Ionen werden unter Verwendung des zweiten Betriebsmodus analysiert, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten, größeren Länge zu bewegen.
Der Flugzeit-Massenanalysator kann einen oder mehrere lonenreflektoren umfassen. In dem ersten Betriebsmodus können Ionen veranlasst werden, n Reflexion(en) in dem einen oder den mehreren lonenreflektoren vorzunehmen, wobei n eine ganze Zahl > 0 ist. In dem zweiten Betriebsmodus können Ionen veranlasst werden, m Reflexion(en) in dem einen oder den mehreren lonenreflektoren vorzunehmen, wobei m eine ganze Zahl > n ist. Allgemein kann ein „Ionenreflektor“ zum Beispiel ein Ionenspiegel, ein Reflektron, ein Ionendeflektor, eine Linse oder ähnliches sein.
Der Flugzeit-Massenanalysator kann ein Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator sein, umfassend:

zwei Ionenspiegel, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberstehen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist;
einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und
einen Detektor zum Erfassen von Ionen, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, wobei sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet.

Das Analysieren von Analytfragmentionen unter Verwendung des in dem ersten Betriebsmodus betriebenen Analysators kann umfassen:

Injizieren von Analytfragmentionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem ersten Ende der Ionenspiegel zurückdriften; und dann die Ionen veranlassen, sich zur Detektion zu dem Detektor zu bewegen.

Das Analysieren von Reporterionen oder komplementären Ionen unter Verwendung des in dem zweiten Betriebsmodus betriebenen Analysators kann umfassen:

(i) Injizieren von Reporterionen oder komplementärem Ion aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y in Richtung des ersten Endes der Ionenspiegel zurückdriften;
(ii) Umkehren die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel derart, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y in Richtung des ersten Endes der Ionenspiegel zurückdriften;
(iii) optional Wiederholen von Schritt (ii) ein oder mehrere Male; und dann
(iv) Veranlassen der Ionen, sich für zur Detektion zu dem Detektor zu bewegen.

Der Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysator kann ferner einen Deflektor oder eine Linse umfassen, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet. Der Deflektor oder die Linse kann ungefähr äquidistant (in der X-Richtung) zwischen dem ersten und dem zweiten Ionenspiegel angeordnet sein. Der Deflektor oder die Linse kann entlang des Ionenpfads nach der ersten Ionenspiegelreflexion (in dem ersten Ionenspiegel) angeordnet sein, die der Ionenstrahl nach dem Injizieren von dem Injektor, aber vor seiner zweiten Ionenspiegelreflexion (in dem zweiten Ionenspiegel), erfährt. Dementsprechend kann der Deflektor oder die Linse entlang des Ionenpfads vor der endgültigen Ionenspiegelreflexion (in dem zweiten Ionenspiegel) angeordnet sein, die der Ionenstrahl vor dem Erreichen des Detektors, aber nach seiner vorletzten Ionenspiegelreflexion (in dem ersten Ionenspiegel) erfährt.
Das Analysieren von Analytfragmentionen unter Verwendung des in dem ersten Betriebsmodus betriebenen Analysators kann umfassen:

Injizieren von Analytfragmentionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem Deflektor oder der Linse zurückdriften; und dann die Ionen veranlassen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen.

(i) Injizieren von Reporterionen oder komplementären Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
(ii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen derart umzukehren, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
(iii) optional Wiederholen von Schritt (ii) ein oder mehrere Male; und dann
(iv) Veranlassen der Ionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen.

Der Mehrfachreflexions-Flugzeit- (ToF) Massenanalysator kann jede geeignete Art von MR-ToF umfassen. Zum Beispiel kann der Analysator einen MR-ToF mit einem Satz periodischer Linsen umfassen, die dafür konfiguriert sind, um den Ionenstrahl entlang seiner Flugbahn fokussiert zu halten, z. B. wie in dem Artikel A. Verenchikov et al., Journal of Applied Solution Chemistry and Modelling, 2017, 6, 1-22, beschrieben.
In besonderen Ausführungsformen ist der Analysator jedoch ein Mehrfachreflexions-Flugzeit-Massenanalysator des Typs mit geneigtem Spiegel, z. B. der in US-Patent Nr. 9,136,101 beschriebenen Art, dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Daher können die Ionenspiegel, entlang mindestens eines Abschnitts, des größten Teils oder alles ihrer Längen in der Driftrichtung Y, in der X-Richtung einen nicht konstanten Abstand zueinander aufweisen. Der Driftrichtungsgeschwindigkeit von Ionen in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel kann durch ein elektrisches Feld entgegengetreten werden, das aus dem nicht konstanten Abstand der zwei Spiegel voneinander resultiert. Dieses elektrische Feld kann veranlassen, dass die Ionen ihre Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und entlang der Driftrichtung in Richtung des Deflektors zurückdriften.
Alternativ kann der Analysator ein Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysator der Art mit einzelner fokussierender Linsen sein, z. B. der in UK-Patent Nr. 2,580,089 beschriebenen Art, dessen Inhalte hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Somit kann der Deflektor ein erster Deflektor sein, und der Analysator kann einen zweiten Deflektor umfassen, der sich in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel befindet. Der zweite Deflektor kann dafür konfiguriert sein, um die Ionen zu veranlassen, ihre Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umzukehren und entlang der Driftrichtung in Richtung des ersten Deflektors zurückzudriften. Dazu kann eine geeignete Spannung an den zweiten Deflektor angelegt werden, z. B. auf die im UK-Patent Nr. 2,580,089 beschriebene Weise.
Der Schritt des Analysierens der Analytfragmentionen kann Analysieren eines oder mehrerer erster Ionenpakete umfassen, z. B. durch Injizieren jedes ersten Ionenpakets in den ToF-Analysator. Der Schritt des Analysierens der Reporterionen oder der komplementären Ionen kann Analysieren eines oder mehrerer zweiter, unterschiedlicher Ionenpakete umfassen, z. B. durch Injizieren jedes zweiten Ionenpakets in den ToF-Analysator. Daher kann der Analysator für jeden Vorläufer von Interesse zwei (oder mehr) Scans durchführen, d. h. derart, dass die Analytfragmentionen gegenüber den Reporterionen oder den komplementären Ionen unter Verwendung eines unterschiedlichen Analysatorscans oder mehrerer unterschiedlicher Analysatorscans analysiert werden.
In diesen Ausführungsformen kann jedes erste Ionenpaket nur Analytfragmentionen umfassen oder kann Analytfragmentionen zusammen mit Reporterionen und/oder komplementären Ionen umfassen. Wenn ein erstes Ionenpaket Reporterionen und/oder komplementäre Ionen einschließt, können diese Ionen optional durch den Deflektor abgelenkt werden, sodass sie den Detektor nicht erreichen (wohingegen die meisten von allen der Analytfragmentionen den Detektor erreichen). Jedes zweite Ionenpaket kann nur Reporterionen und/oder komplementäre Ionen umfassen oder kann Reporterionen und/oder komplementäre Ionen zusammen mit Analytfragmentionen umfassen. Wenn ein zweites Ionenpaket Analytfragmentionen einschließt,
können diese Ionen optional durch den Deflektor abgelenkt werden, sodass sie den Detektor nicht erreichen (wohingegen die meisten von allen der Reporterionen oder komplementären Ionen den Detektor erreichen).
Das Verfahren kann Generieren und/oder Verarbeiten und/oder Analysieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung eines ersten Satzes von einem oder mehreren Instrumentparametern, und Generieren und/oder Verarbeiten und/oder Analysieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung eines zweiten, unterschiedlichen Satzes von einem oder mehreren Instrumentparametern umfassen. Der erste Satz von einem oder mehreren Instrumentparametern kann dafür konfiguriert sein, um verbesserte Empfindlichkeit und/oder Auflösung bereitzustellen, wenn die Analytfragmentionen (in Bezug zu den Reporterionen oder den komplementären Ionen) generiert und/oder verarbeitet und/oder analysiert werden, und der zweite Satz von einem oder mehreren Instrumentparametern kann dafür konfiguriert sein, um verbesserte Empfindlichkeit und/oder Auflösung bereitzustellen, wenn die Reporterionen oder die komplementären Ionen (in Bezug zu den Analytfragmentionen) generiert und/oder verarbeitet und/oder analysiert werden.
Der Satz von einem oder mehreren Instrumentparametern kann zum Beispiel eine oder mehrere (HF- oder DC-) Spannungen einschließen, die an eine beliebige oder mehrere der Komponenten des Instruments angelegt werden, wie zum Beispiel: die Ionenquelle, den Ioneneinlass, eine beliebige oder mehrere Ionentransfervorrichtungen, den Massenfilter, die Fragmentierungsvorrichtung und/oder den Analysator (z. B. seinen Ioneninjektor, seine Ionenreflektoren und/oder seinen Detektor) usw. In besonderen Ausführungsformen schließen der Satz von einem oder mehreren Instrumentparametern (i) einen oder mehrere Fragmentierungsparameter, wie eine Kollisionsenergie, der Fragmentierungsvorrichtung; und/oder (ii) eine Breite des Übertragungsfensters des Massenfilters ein.
Daher kann das Verfahren zum Beispiel Generieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung einer ersten Übertragungsfensterbreite des Massenfilters (d. h. wobei der Massenfilter verwendet wird, um einen besonderen Vorläufer von Interesse auszuwählen, der fragmentiert ist, und wobei die resultierenden Fragmentionen verwendet werden, um jedes erste Ionenpaket zu bilden); und Generieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung einer zweiten, unterschiedlichen Übertragungsfensterbreite des Massenfilters (d. h. wobei der Massenfilter verwendet wird, um den besonderen Vorläufer von Interesse auszuwählen, der fragmentiert ist, und wobei die resultierenden Fragmentionen verwendet werden, um jedes zweite Ionenpaket zu bilden), z. B. wobei die erste Übertragungsfensterbreite des Massenfilters breiter als die zweite Übertragungsfensterbreite des Massenfilters ist, umfassen. Das Verwenden einer breiteren Übertragungsfensterbreite des Massenfilters stellt vorteilhafterweise gesteigerte Empfindlichkeit zur Analyse der Analytfragmentionen bereit, während Verwenden einer schmaleren Übertragungsfensterbreite des Massenfilters vorteilhafterweise Interferenzen zur Analyse der Reporterionen oder der komplementären Ionen reduziert. Stattdessen wäre es möglich, dass die erste Übertragungsfensterbreite des Massenfilters schmaler als die zweite Übertragungsfensterbreite des Massenfilters ist.
Das Verfahren kann das Generieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung eines oder mehrerer erster Fragmentierungsparameter, wie einer ersten Kollisionsenergie (d. h. wobei ein besonderer Vorläufer von Interesse unter Verwendung des einen oder der mehreren ersten Fragmentierungsparameter,
wie die erste Kollisionsenergie, fragmentiert wird, und wobei die resultierenden Fragmentionen verwendet werden, um jedes erste Ionenpaket zu bilden); und das Generieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung eines oder mehrerer zweiter Fragmentierungsparameter, wie einer zweiten, unterschiedlichen Kollisionsenergie (d. h., wobei der besondere Vorläufer von Interesse unter Verwendung des einen oder der mehreren zweiten Fragmentierungsparameter, wie der zweiten Kollisionsenergie, fragmentiert wird, und wobei die resultierenden Fragmentionen verwendet werden, um jedes zweite Ionenpaket zu bilden) umfassen. Der eine oder die mehreren ersten Fragmentierungsparameter, wie die erste Kollisionsenergie, können dafür konfiguriert sein, um Analytfragmentionen (in Bezug zu Reporterionen oder komplementären Ionen) effizient zu produzieren, und der eine oder die mehreren zweiten Fragmentierungsparameter, wie die zweite Kollisionsenergie, können dafür konfiguriert sein, um Reporterionen oder komplementäre Ionen (in Bezug zu Analytfragmentionen) effizient zu produzieren. Höhere Kollisionsenergien sind in der Regel vorteilhaft zum Generieren von Fragmentionen mit niedrigem m/z, wie Reporterionen, während niedrigere Kollisionsenergien in der Regel zum Generieren von Fragmentionen mit mittlerem oder hohem m/z, wie Analytfragmentionen, vorteilhaft sind. Daher kann die erste Kollisionsenergie niedriger sein als die zweite Kollisionsenergie, z. B. wenn Reporterionen generiert und analysiert werden. Andererseits werden relativ niedrigere Kollisionsenergien in der Regel dafür verwendet, um komplementäre Ionen zu generieren, verglichen mit den Kollisionsenergien, die verwendet werden, um Analytfragmentionen zu generieren. Daher kann die erste Kollisionsenergie höher sein als die zweite Kollisionsenergie, z. B. wenn komplementäre Ionen generiert und analysiert werden.
In alternativen Ausführungsformen können die Schritte des Analysierens der Analytfragmentionen und des Analysierens der Reporterionen oder der komplementären Ionen das Analysieren eines oder mehrerer einzelner Ionenpakete umfassen, z. B. durch Injizieren jedes Ionenpakets in den ToF-Analysator. Daher kann der Analysator für jeden Vorläufer von Interesse einen einzelnen Scan durchführen, d. h. derart, dass die Analytfragmentionen unter Verwendung des gleichen Scans wie die Reporterionen oder die komplementären Ionen analysiert werden. In diesen Ausführungsformen kann jedes Ionenpaket Analytfragmentionen zusammen mit Reporterionen und/oder komplementären Ionen umfassen.
Der Analysator kann eine Ionenbahn umfasst, die ein zyklisches Segment, einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn, mindestens einen Ionenreflektor, der entlang der Ionenbahn angeordnet ist, und einen Detektor umfasst, der an dem Ende der Ionenbahn angeordnet ist.
Das Verfahren kann umfassen:

(i) Injizieren eines Ionenpakets, das Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen umfasst, aus dem Ioneninjektor in die Ionenbahn, derart, dass sowohl die Analytfragmentionen als auch die Reporterionen oder die komplementären Ionen sich entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen;
(ii) Veranlassen (nur) der Analytfragmentionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen;
(iii) Verwenden des Ionenreflektors, um (nur) die Reporterionen oder die komplementären Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann
(iv) Veranlassen der Reporterionen oder der komplementären Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.

Das Verfahren kann umfassen:

(i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
(ii) Veranlassen (nur) der Analytfragmentionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen;
(iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit von (nur) den Reporterionen oder den komplementären Ionen derart umzukehren, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
(iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann
(v) Veranlassen der Reporterionen oder der komplementären Ionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen.

Gemäß einem anderen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zum Betreiben eines Flugzeit-Massenanalysators bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

Ionenbahn, umfassend ein zyklisches Segment;
Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn;
mindestens einen Ionenreflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn; und
Detektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn;
wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
- (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen, aus dem Ioneninjektor in die Ionenbahn, derart, dass sich die ersten Ionen und die zweiten Ionen entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen;
- (ii) Veranlassen (nur) der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen;
- (iii) Verwenden des Ionenreflektors, um (nur) die zweiten Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere (z. B. weitere) Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann
- (iv) Veranlassen der zweiten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.

Diese Gesichtspunkte und Ausführungsformen können, und in Ausführungsformen tun sie dies, jedes oder mehrere der hierin beschriebenen optionalen Merkmale einschließen.
Unter diesen Gesichtspunkten und Ausführungsformen kann der ToF-Analysator ein zyklischer Analysator sein. Die Ionenbahn schließt ein zyklisches Segment ein, wobei Ionen entweder null oder mehrfache (wiederholte) Durchläufe des zyklischen Segments beim Bewegen entlang der Ionenbahn von dem Ioneninjektor zu dem Detektor vornehmen können. Zum Beispiel kann die Ionenbahn ein erstes nicht zyklisches Segment, ein zyklisches Segment, das stromabwärts des ersten nicht zyklischen Segments angeordnet ist, und ein zweites nicht zyklisches Segment umfassen, das stromabwärts des zyklischen Segments angeordnet ist. Der ToF-Analysator umfasst mindestens einen Ionenreflektor, wie einen Deflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn. Der Ionenreflektor kann verwendet werden, um Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere (weitere) Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen, z. B. durch geeignete Anlegung von (z. B. gepulster/gepulsten) Spannung(en) an den/die Ionenreflektor(en).
In dem Verfahren wird ein Ionenpaket, umfassend erste Ionen und zweite Ionen, in die Ionenbahn derart injiziert, dass sich die Ionen entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen. Vor dem Ankommen an dem Ionenreflektor können die ersten und zweiten Ionen der gleichen Ionenbahn folgen und können entweder null oder einen oder mehrere Durchläufe des zyklischen Segments der Ionenbahn vornehmen. Dann werden (nur) die ersten Ionen veranlasst, sich von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen, während der Ionenreflektor verwendet wird, um zu bewirken, dass (nur) die zweiten Ionen einen oder mehrere (z. B. weitere) Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abschließen, bevor sie veranlasst werden, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen. Dies kann durch geeignetes Pulsen der Magnitude von an den Ionenreflektor angelegter/angelegten Spannung(en) mit geeignetem/geeigneten Takt(en) derart erfolgen, dass nur die zweiten Ionen veranlasst werden, einen oder mehrere (z. B. weitere) Zyklen abzuschließen, wohingegen die ersten Ionen dies nicht werden.
Die ersten Ionen können Ionen mit m/z innerhalb eines ersten relativ ausgedehnten Bereichs sein. Die zweiten Ionen können Ionen mit m/z innerhalb eines zweiten, unterschiedlichen, relativ schmalen Bereichs sein. Der zweite Bereich kann mit dem ersten Bereich überlappen und kann durch diesen umschlossen sein.
Gemäß einem anderen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zum Betreiben eines Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysators bereitgestellt, das Folgendes umfasst:

zwei Ionenspiegel, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberstehen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist;
einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet;
einen Detektor zum Erfassen von Ionen, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, wobei sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und
einen Deflektor oder eine Linse, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet;
wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
- (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
- (ii) Veranlassen (nur) der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen;
- (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit (nur) der zweiten Ionen derart umzukehren, dass die zweiten Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die zweiten Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
- (iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann
- (v) Veranlassen, dass sich die zweiten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen.

Diese Gesichtspunkte und Ausführungsformen können, und in Ausführungsformen tun sie dies, jedes oder mehrere der hierin beschriebenen optionalen Merkmale einschließen.
Ein weiterer Gesichtspunkt stellt ein nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium bereit, das einen Computersoftwarecode speichert, der, wenn er auf einem Prozessor ausgeführt wird, das/die vorstehend beschriebene(n) Verfahren ausführt.
Ein weiterer Gesichtspunkt stellt ein Steuerungssystem für ein analytisches Instrument wie ein Massenspektrometer bereit, wobei das Steuerungssystem dafür konfiguriert ist, um das analytische Instrument zu veranlassen, das/die vorstehend beschriebene(n) Verfahren durchzuführen.
Ein weiterer Aspekt stellt ein Analyseinstrument, wie etwa ein Massenspektrometer, bereit, das das vorstehend beschriebene Steuersystem umfasst.
Ein weiterer Aspekt stellt ein Analyseinstrument, wie etwa ein Massenspektrometer, bereit, umfassend:

eine Fragmentierungsvorrichtung; und/oder
einen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator, der in einem ersten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen, und einem zweiten Betriebsmodus betreibbar ist, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten Länge zu bewegen, wobei die zweite Länge größer als die erste Länge ist; und
ein Steuerungssystem, das, wenn das Instrument verwendet wird, um gekennzeichnete Analytionen zu analysieren, konfiguriert ist zum:
- Veranlassen der Fragmentierungsvorrichtung, die gekennzeichneten Analytionen zu fragmentieren, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren;
- Veranlassen des Flugzeit-Massenanalysators, die Analytfragmentionen unter Verwendung des ersten Betriebsmodus zu analysieren; und
- Veranlassen des Flugzeit-Massenanalysator, die Reporterionen oder die komplementären Ionen unter Verwendung des zweiten Betriebsmodus zu analysieren.

Ein weiterer Gesichtspunkt stellt einen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator bereit, umfassend:

eine Ionenbahn, umfassend ein zyklisches Segment;
einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn;
mindestens einen Ionenreflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn; und
einen Detektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn;
wobei der Analysator dafür konfiguriert ist, um Ionen zu analysieren durch:
- (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen, aus dem Ioneninjektor in die Ionenbahn, derart, dass sich die ersten Ionen und die zweiten Ionen entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen;
- (ii) Veranlassen (nur) der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen;
- (iii) Verwenden des Ionenreflektors, um (nur) die zweiten Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere (z. B. weitere) Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann
- (iv) Veranlassen der zweiten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.

Ein weiterer Gesichtspunkt stellt einen Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator bereit, umfassend:

zwei Ionenspiegel, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberstehen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist;
einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet;
einen Detektor zum Erfassen von Ionen, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, wobei sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und
einen Deflektor oder eine Linse, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und wobei der Analysator dafür konfiguriert ist, um Ionen zu analysieren durch:
- (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
- (ii) Veranlassen (nur) der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen;
- (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit (nur) der zweiten Ionen derart umzukehren, dass die zweiten Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die zweiten Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse;
- (iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann
- (v) Veranlassen, dass sich die zweiten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen.

Ein weiterer Gesichtspunkt stellt ein analytisches Instrument, wie ein Massenspektrometer, bereit, das den vorstehend beschriebenen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator oder den vorstehend beschriebenen Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator umfasst.
Diese Gesichtspunkte und Ausführungsformen können, und in Ausführungsformen tun sie dies, jedes oder mehrere der hierin beschriebenen optionalen Merkmale einschließen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Verschiedene Ausführungsformen werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren ausführlicher beschrieben, in denen:

1 schematisch das Basis-TMT C8H16N⁺-Reporterion mit m/z 126 zeigt;
2 schematisch ein analytisches Instrument gemäß Ausführungsformen zeigt;
3 schematisch ein analytisches Instrument gemäß Ausführungsformen zeigt;
4 schematisch einen Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysator gemäß Ausführungsformen zeigt;
5 schematisch einen Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysator gemäß Ausführungsformen zeigt;
6 schematisch ein Verfahren zum Betreiben eines Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysators gemäß Ausführungsformen veranschaulicht;
7 ein DDA-Verfahren gemäß Ausführungsformen veranschaulicht;
8 ein Verfahren mit 5x-Zoom von TMT-Reporterionen und nicht herangezoomten Peptidfragmentionen gemäß Ausführungsformen veranschaulicht;
9 ein DDA-Verfahren gemäß Ausführungsformen veranschaulicht;
10A eine graphische Darstellung von Auflösung gegenüber Ionenanzahl für einen regulären Einzeldurchlaufmodus eines Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysators zeigt, und 10B eine graphische Darstellung von Auflösung gegenüber Ionenanzahl für einen 3x-Zoom-Betriebsmodus des Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysators zeigt; und
11 graphische Darstellungen von Auflösung und Signal gegenüber Anzahl von Durchläufen durch einen Multireflexions-Flugzeit-Massenanalysator zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Chemisches Markieren ist ein seit langem bestehendes Werkzeug für die Quantifizierung von Analyten, wobei die einfachste Form einen Vergleich von Peakintensität mit der eines gekennzeichneten Standards bekannter Konzentration beinhaltet. Wenn multiple unterschiedliche chemische Markierungen mit sich unterscheidenden Massen verfügbar sind, wie multiple Isotopomere, wird es möglich, mehrere Proben zusammenzumischen und sie in einem einzelnen gemultiplexten Hochdurchsatz-Arbeitsablauf zu analysieren.
Eine wichtige Anwendung innerhalb dieser Gruppe ist das Tandem-Atommassenmarkierungs(TMT)-Verfahren (Thompson et al, Anal. Chem., 2003, 75, 1895-1904), vertrieben als TMT oder iTRAQ (Isobaric Tagging for Relative Quantiation; isobarisches Markieren zur relativen Quantifizierung). Dies ist ein Tandemverfahren, bei dem die gemultiplexten markierten Peptide das gleiche m/z besitzen, somit aus Flüssigchromatographie co-eluieren und durch einen Quadrupol-Massenfilter co-isoliert werden. Bei Fragmentierung werden jedoch charakteristische 1,2,6-Reporterionen mit sich unterscheidenden m/z generiert und zur Quantifizierung detektiert. Gleichzeitige Detektion von Peptidfragmenten erlaubt Peptididentifikation in dem gleichen Schritt. Ein großer Vorteil dieses Verfahrens ist die Vereinfachung des vollständigen Massenspektrums und die Empfindlichkeit der Co-Isolation um einen Faktor des Niveaus des Multiplexens.
Die frühere kommerzielle Implementierung von TMT6-plex produzierte Reporterionen, gezeigt in 1, von m/z 126-131 mit isotopischer Massentrennung, die durch Substitutionen mit ¹³C generiert wurden. Ein neuerer Fortschritt war das 10-plex-Verfahren, das Substitution von Stickstoff mit ¹⁵N, was einen winzigen 6,32 mDa-Massenfehler gegenüber nur-¹³C-Reporter ergab, Multiplizieren der Anzahl von zugänglichen substituierten Markierungen und Aufteilen der Reporterregion in eine Reihe von isobarischen Dubletts hinzufügte (McAlister et al, Anal. Chem., 2012, 84, 7469-7478). Noch größere Niveaus an Multiplexen, wie 18-plex, wurden auch demonstriert.
Es gibt jedoch charakteristische Nachteile zu dem Verfahren. Interferenzen zwischen co-isolierten isobarischen Peptiden können die Reporterionenkanäle kontaminieren, genaue Quantifizierung behindern und schnelle experimentelle Zyklen mit kürzeren, schlechter trennenden LC-Gradienten verhindern. Eine zusätzliche Isolations- und Fragmentierungsstufe (MS3) kann verwendet werden, um Interferenzen zu entfernen, aber dies beeinflusst auch die Schnelligkeit und die Empfindlichkeit. Hochauflösende Isolation, wie von spezialisierten Flugzeiten(ToF)-Instrumenten bereitgestellt, wäre eine optimalere Lösung, besonders wenn in Sequenz mit Quadrupol-Isolation angewendet.
Ein zweites Problem besteht darin, dass die Reporterionendubletts der Verfahren mit 10-plex und größer bei m/z 127 ~50K Auflösung erfordern, um zu unterscheiden und zu messen. Dies liegt außerhalb des Bereichs der meisten Flugzeit(ToF)-Analysatordesigns und erlegt den fortgeschrittenen ToF-Analysatoren, die in der Lage sind, eine solche Auflösung zu liefern, hartnäckige, raumladungsbezogene Begrenzungen des dynamischen Bereichs auf.
Bisher wurde das TMT10-plex-Verfahren auf Orbitrap™-FT-Instrumenten laufen gelassen, die beim Liefern hoher Auflösung bei niedrigem m/z glänzen. Die zum Erzielen solcher Auflösung erforderliche Erfassungszeit schränkt jedoch die Erfassungsrate ein und begrenzt die Anzahl der Messungen. Im Fall von Orbitrap™-Analysatoren wurden verbesserte Datenverarbeitungsverfahren, wie Phi-SDM, verwendet, um die Auflösung bei Schnelligkeit stark zu verbessern (Bekker-Jenson et al, Mol. Cell. Proteomics, 2020, 14, 716-729). Raumladungseffekte können auch ein Zusammenführen/Koaleszenz der Reporterionendubletts in Orbitrap™-Instrumenten veranlassen, obwohl dies hohe Ionenlasten erfordert, die normalerweise durch automatische Verstärkungssteuerungs(AGC)-Prozeduren begrenzt sind (Werner et al, Anal. Chem., 2014, 86, 3594-3601).
Eine wichtige Modifikation an dem TMT-Verfahren ist TMT-Quantifizierung komplementärer Ionen (Johnson et al, J. Proteome Res., 2021,20, 3043-3052). Hier wird, anstatt von den Reporterionen zu quantifizieren, das markierte Peptid abzüglich des Reporterions bei einer niedrigen Fragmentierungsenergie generiert und gemessen. Nach der Trennung des Reporters enthält die Markierung noch eine „Balancer“-Komponente, die normalerweise dazu dient, die Masse aller markierten Ionen ins Gleichgewicht zu bringen, aber ohne die Reporterkomponente erzeugt dies eine gespiegelte Verteilung komplementärer Ionenkanäle. Diese Kanäle können relative Intensitäten ähnlich der Reporterionenverteilung aufweisen und können so zur Quantifizierung verwendet werden. Ein Vorteil ist, dass sie, da sie noch das ursprüngliche Peptid gebunden aufweisen, robuster gegenüber Interferenzen aus co-isolierten Peptiden sind. Die Kosten bestehen jedoch darin, dass, da das komplementäre Ion viel schwerer als der Reporter ist, aber mit der gleichen Massendifferenz zwischen Kanälen, eine erheblich höhere Auflösung erforderlich ist, um die Kanäle aufzulösen. Bisher war dieser Prozess auf 8-Kanal-TMT-Verfahren mit Beabstandung von 1 Da begrenzt, während die äquivalente 16-Kanal-Beabstandung, die normalerweise 50K-Auflösung erfordert, leicht 500K erfordern könnte, wenn auf ein 10x schwereres Ion angewendet.
Wenige Flugzeit(ToF)-Analysatoren liefern ausreichende Auflösung, um mit höher gemultiplexten TMT-Verfahren kompatibel zu sein. Die Auflösung in solchen Analysatoren ist in der Regel durch die Länge der Ionenflugbahn und die Breite des Peaks begrenzt, die sowohl aus der Ankunftszeitstreuung der Ionen an dem Detektor als auch der eigenen Zeitantwort des Detektors resultiert. Diese letztere feste Antwort erzeugt eine Massenabhängigkeit in der Analysatorauflösung und behindert eine Messung von niedrigem m/z wie von der TMT-Reporterregion (ein invertierter Trend gegenüber Orbitrap™-Analysatoren).
Herkömmliche ToF-Analysatoren inkorporieren in der Regel eine Ioneninjektionsvorrichtung, wie eine orthogonale Beschleuniger- oder Extraktionsfalle, einen Detektor und einen Ionenspiegel, der dazu dient, Ionen auf die Detektoroberfläche zu fokussieren. Sie können üblicherweise auch Linsen oder Deflektoren einschließen, nachdem die Ionenquelle dafür konfiguriert ist, um den Strahl angemessen zu formen und zu richten.
Ein fortgeschrittenerer ToF-Analysator mit sehr hoher Auflösung wurde durch Wollnik ( DE3025764C2 ) eingeführt, der ein Paar Ionenspiegel inkorporieren, zwischen denen eingefangene Ionen multiple Oszillationen durchlaufen können, bevor sie gegenüber einem Detektor freigesetzt werden. Ein Nachteil dieses Systems war, dass, da leichtere Ionen schwerere Ionen überholen/überrunden, die Massenanalyse stark verkompliziert wurde. Allgemein kann Steigern von Auflösung für Zielionen über gesteigerte Verweilzeit, auf Kosten des Einschränkens des Massenbereichs, als „Zoomen“ bezeichnet werden.
Verlängerung der Ionenspiegel durch Nazarenki (SU1725289) produzierte einen „offene Falle“- oder einen „Multireflexion-Flugzeit(MR-ToF)“-Analysator mit einer festen Zickzack-Flugbahn, die das Überrundungsproblem eliminiert. Verbesserungen und Kommerzialisierung wurden von Verentchikov vorgenommen, indem periodische Linsen zwischen den Spiegeln inkorporiert wurden, die Ionendispersion orthogonal zu der Ionenoszillation regelmäßig korrigierten ( UK-Patent Nr. 2,403,063 ).
Spätere Verfahren zum Steuern dieser Ionendispersion wurden von Sudakov ( WO2008/047891 ), Stewart ( US-Patent Nr. 10,964,520 ) und vor allem durch Grinfeld in US-Patent Nr. 9,136,101 vorgeschlagen. Dieses letztere Verfahren beinhaltet das geringfügige Kippen der Ionenspiegel, sodass injizierte Ionen ausgebreitet werden können, wenn sie in einer Driftrichtung zwischen den verlängerten Spiegeln driften. Mit jedem Durchgang durch die gekippten Spiegel und stützenden Streifenelektroden werden die Ionen zurück abgelenkt, die schließlich ihre Driftgeschwindigkeit vollständig umgekehrt aufweisen und auf einen Detektor an der Ausgangsseite des Spiegelsystems fokussiert werden. Ein schematisches Diagramm dieses Analysators ist in 4 gezeigt (und ist nachstehend ausführlicher beschrieben).
Solche Analysatoren sind in der Lage, TMT-Reporter aufzulösen, müssen aber relativ groß sein (~1 m²), um dies mit annehmbarer Raumladungswiderstandsfähigkeit zu tun. Da die Basislinienauflösung von Peaks aufgrund von Tailing oder weiteren Effekten weniger leicht erzielbar ist, kann das detektierbare Verhältnis der zwei Peaks in dem Dublett immer noch begrenzt sein.
Ein spezieller Betriebsmodus, der diese ausgedehnt Familie von Analysatoren abdeckt, wurde zuvor von Verenchikov et al. berichtet, genannt „Zoom-Modus“ (Verenchikov et al., Journal of Applied Solution Chemistry und Modelling, 2017, 6, 1-22). Hier könnte ein Deflektor, der früh in der Ionenbahn platziert ist, in eine Einfangsspannung geschaltet werden, wodurch Ionen gezwungen werden, multiple Durchläufen die Spiegel auf und ab zu durchlaufen, die jeweils die gleiche Anzahl von Oszillationen zwischen den Spiegeln enthalten. Die große Verlängerung der Flugbahn demonstrierte daher eine erheblich gesteigerte Auflösung, bis zu 500.000, induzierte aber, wie der Name nahelegt, einen starken Verlust an Massenbereich.
Hierin beschriebene Ausführungsformen adressieren die Schwierigkeit, Peaks innerhalb von TMT-Reporterdubletts oder ähnlichen isobarischen Fragmentmarkierungen aufzulösen und somit genau zu quantifizieren, besonders wie auf Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysatoren (und weiteren ToF-Analysatoren) angewendet.
Wie vorstehend erwähnt werden Orbitrap™-Instrumente normalerweise für TMT-Verfahren verwendet, aber diese Instrumente können etwas unter der langsamen Repetitionsrate leiden, die zum Betreiben mit einer solchen hohen Auflösung erforderlich ist. Dies erzwingt auch langsamere experimentelle Zyklen und niedrigeren Durchsatz, obwohl es nicht immer klar ist, ob dies oder eine Kontamination von Vorläuferzielen durch co-eluierende und co-isolierende Peptide dominieren.
Die meisten ToF-Analysatoren sind zu schlecht auflösend, um überhaupt mit höher gemultiplexten TMT-Verfahren kompatibel zu sein, und sogar relativ große MR-ToF-Systeme können Mühe haben mit dem Aufrechterhalten dieser Auflösung bei höheren Ionenlasten, dem begrenzenden dynamischen Bereich und dem Verhältnis von Dublett-Peaks, die charakterisiert werden können. Injektionsvorrichtungen mit hoher Repetitionsrate, wie orthogonale Beschleuniger, reduzieren die Raumladungsbelastung pro Schuss, aber diese können mit beträchtlichen Empfindlichkeitskosten gegenüber Extraktionsfallen einhergehen, und fortschrittliche Betriebsverfahren mit Dekonvolution (wie über codiertes häufiges Pulsieren) können erforderlich sein, um solche Quellen mit den langen Flugzeiten von Multireflexions-ToF Analysatoren kompatibel zu machen. Raumladungstolerante Analysatoren, wie der in 4 dargestellte Analysator mit gekippten Spiegeln, können mit diesen Verfahren kompatibel sein, aber verbesserte Leistung ist immer noch wünschenswert.
Daher sind besondere Ausführungsformen darauf gerichtet, die Auflösung und die Raumladungswiderstandsfähigkeit und daher den dynamischen Bereich eines Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysators gegenüber den TMT-Reporterionen zu verbessern, die zur Quantifizierung verwendet werden, wobei die Peptidfragmente, die zur Identifikation verwendet werden, minimal beeinflusst werden.
Gemäß hierin beschriebenen Ausführungsformen wird ein Zoom-Modus ausschließlich für die TMT-Reporterionen (oder komplementäre Ionen) verwendet, und ein regulärer Betriebsmodus wird zur Peptidfragmentidentifikation verwendet, z. B. innerhalb eines datenabhängigen TMT-Verfahrens. Wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, können die Reporterionen (oder die komplementären Ionen) und die Fragmentionen entweder in getrennten Scans oder in einem einzelnen zusammengeführten Scan analysiert werden. Der Zoom-Modus multipliziert die erzielbare Auflösung der TMT-Reporter und verbessert folglich auch die Raumladungswiderstandsfähigkeit und den dynamischen Bereich des Analysators.
2 veranschaulicht schematisch ein analytisches Instrument, wie ein Massenspektrometer, das verwendet werden kann, um das Verfahren gemäß Ausführungsformen durchzuführen. Wie in 2 gezeigt, schließt das analytische Instrument eine Ionenquelle 10, einen Massenfilter 20, eine Fragmentierungsvorrichtung 30 und einen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator 40 ein.
Die Ionenquelle 10 ist dafür konfiguriert, um Ionen aus einer Probe zu erzeugen. Die Ionenquelle 10 kann mit einer Trennvorrichtung, wie einer Flüssigchromatographie-Trennvorrichtung oder einer Kapillarelektrophorese-Trennvorrichtung (nicht gezeigt), gekoppelt sein, sodass die in der Ionenquelle 10 ionisierte Probe von der Trennvorrichtung stammt. Die Ionenquelle 10 kann eine beliebige geeignete Ionenquelle sein, wie eine Ionenquelle, die mit der Trennvorrichtung kompatibel ist. In Ausführungsformen ist die Ionenquelle 10 eine Elektrosprayionisations(ESI)-Ionenquelle, eine Atmosphärendruckionisations(API)-Ionenquelle, eine Ionenquelle für chemische Ionisation, eine Elektronenstoß(EI)-Ionenquelle oder ähnliches.
Der Massenfilter 20 ist stromabwärts der Ionenquelle 10 angeordnet und kann dafür konfiguriert sein, um Ionen aus der Ionenquelle 10 zu empfangen. Der Massenfilter 20 kann dafür konfiguriert sein, um das empfangene Ion gemäß ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) zu filtern, z. B. derart, dass nur Ionen innerhalb eines m/z-Fensters von dem Massenfilter 20 fortschreitend übertragen werden, während Ionen außerhalb des m/z-Fensters des Massenfilters durch den Massenfilter 20 aussortiert werden und nicht fortschreitend übertragen werden. Die m/z-Breite und das Mittelpunkt-m/z des Übertragungsfensters des Massenfilters sind steuerbar (variabel), z. B. durch geeignete Steuerung von HF- und DC-Spannungen, die an den Massenfilter 20 angelegt werden. Daher kann zum Beispiel der Massenfilter in einem Übertragungs-Betriebsmodus, wobei die meisten oder alle Ionen innerhalb eines relativ breiten m/z-Fensters durch den Massenfilter 20 fortschreitend übertragen werden, und einem Filter-Betriebsmodus betreibbar sein, wobei nur Ionen innerhalb eines relativ schmalen m/z-Fensters (zentriert bei einem gewünschten m/z) durch den Massenfilter 20 fortschreitend übertragen werden. Der Massenfilter 20 kann eine beliebige geeignete Art von Massenfilter sein, wie ein Quadrupol-Massenfilter.
Die Fragmentierungsvorrichtung 30 ist stromabwärts des Massenfilters 20 angeordnet und kann dafür konfiguriert sein, um die meisten oder alle durch den Massenfilter 20 übertragenen Ionen zu empfangen. Die Fragmentierungsvorrichtung 30 kann dafür konfiguriert sein, um einige oder alle der empfangenen Ionen selektiv zu fragmentieren, d. h. um Fragmentionen zu produzieren. Die Fragmentierungsvorrichtung 30 kann in einem Fragmentierungs-Betriebsmodus, wobei die meisten oder alle empfangenen Ionen fragmentiert werden, um Fragmentionen zu produzieren (die dann von der Fragmentierungsvorrichtung 30 fortschreitend übertragen werden können) und einem Nicht-Fragmentierungs-Betriebsmodus betreibbar sein, wobei die meisten oder alle empfangenen Ionen ohne (bewusst) fragmentiert zu werden, fortschreitend übertragen werden. Es wäre für einen Nicht-Fragmentierungs-Betriebsmodus auch möglich, implementiert zu werden, indem veranlasst wird, dass
Ionen die Fragmentierungsvorrichtung 30 umgehen. Die Fragmentierungsvorrichtung 30 kann auch in einem oder mehreren Zwischenbetriebsmodi betreibbar sein, z. B. wobei der Grad der Fragmentierung steuerbar (variabel) ist. Die Fragmentierungsvorrichtung 30 kann auch in Fragmentierungsmodi höherer Ordnung betreibbar sein (MS^N), z. B. wodurch Fragmentionen durch die Fragmentierungsvorrichtung 30 weiter ein oder mehre Male fragmentiert werden.
Die Fragmentierungsvorrichtung 30 kann eine beliebige geeignete Art von Fragmentierungsvorrichtung sein, die zum Fragmentieren gekennzeichneter Analytionen verwendet werden kann, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren, wie zum Beispiel eine kollisionsinduzierte Dissoziations(CID)-Fragmentierungsvorrichtung, eine elektroneninduzierte Dissoziations(EID)-Fragmentierungsvorrichtung, eine Photodissoziations-Fragmentierungsvorrichtung und so weiter. Zahlreiche weitere Arten der Fragmentierung sind möglich.
In Ausführungsformen ist die Fragmentierungsvorrichtung 30 eine Fragmentierungsvorrichtung mit kollisionsinduzierter Dissoziation (CID). Daher kann die Fragmentierungsvorrichtung eine Kollisionszelle einschließen, die mit einem Kollisionsgas gefüllt sein kann, z. B. aufrechtgehalten bei einem relativ hohen Druck. Ionen können selektiv in der Kollisionszelle fragmentiert werden, indem die kinetische Energie gesteuert (variiert) wird, mit der Ionen veranlasst werden, in die Kollisionszelle einzutreten. In einem Fragmentierungsbetriebsmodus können Ionen beschleunigt werden, sodass sie mit einer relativ hohen kinetischen Energie in die Kollisionszelle eintreten, was die meisten oder alle der beschleunigten Ionen veranlassen kann, fragmentiert zu werden. In einem Nicht-Fragmentierungs-Betriebsmodus können Ionen dazu veranlasst werden, mit einer relativ niedrigen kinetischen Energie in die Kollisionszelle einzutreten, die unzureichend sein kann, um die meisten oder alle Ionen zu veranlassen, fragmentiert zu werden. In Zwischenmodi können Ionen dazu veranlasst werden, mit zwischenliegenden kinetischen Energien in die Kollisionszelle einzutreten.
Der ToF-Analysator 40 kann stromabwärts der Fragmentierungsvorrichtung 30 angeordnet sein und kann dafür konfiguriert sein, um die meisten oder alle Ionen, die aus der Fragmentierungsvorrichtung 30 fortschreitend übertragen werden, zu empfangen. Es wäre auch möglich, dass das Instrument derart konfiguriert ist, dass der ToF-Analysator 40 Ionen von dem Massenfilter 20 empfangen kann, z. B. wenn das Instrument derart konfiguriert ist, dass in dem Nicht-Fragmentierungsbetriebsmodus Ionen veranlasst werden, die Fragmentierungsvorrichtung 30 zu umgehen. Somit kann allgemein der ToF-Analysator 40 dafür konfiguriert sein, um Ionen aus den verschiedenen stromaufwärtigen Stufen des Instruments zu empfangen, die unfragmentierte Ionen („Vorläufer“- oder „Stamm“-Ionen), Fragmentionen („Produkt“- oder „Tochter“-Ionen), fragmentierte Fragmentionen („Enkel“)-Ionen und so weiter einschließen können.
Der ToF-Analysator 40 ist dafür konfiguriert, um empfangene Ionen zu analysieren, um ihr Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) zu bestimmen. Um dies zu tun, ist der ToF-Analysator 40 dafür konfiguriert, um Ionen entlang einer Ionenbahn innerhalb einer Driftregion des Analysators 40 zu leiten (wobei die Driftregion bei Hochvakuum aufrechtgehalten wird (z. B. < 1×10^-5 mbar), und um die Zeit (die Driftzeit) zu messen, die Ionen benötigen,
um entlang der Ionenbahn zu passieren. Ionen können durch ein elektrisches Feld in den Driftbereich beschleunigt werden und können durch einen Ionendetektor erfasst werden, der am Ende des Ionenpfads angeordnet ist. Die Beschleunigung kann veranlassen, dass Ionen mit einem relativ niedrigen m/z eine relativ hohe Geschwindigkeit erzielen und den Ionendetektor vor Ionen mit einem relativ hohen m/z erreichen. Daher kommen Ionen nach einer durch ihre Geschwindigkeit und die Länge der Ionenbahn bestimmten Zeit an dem Ionendetektor an, was dem m/z der Ionen ermöglicht, bestimmt zu werden. Jedes Ion oder jede Gruppe von Ionen, die am Detektor ankommt, kann durch den Detektor abgetastet werden, und das Signal aus dem Detektor kann digitalisiert werden. Ein Prozessor kann dann einen Wert bestimmen, der für die Flugzeit und/oder das m/z des Ions oder der Gruppe von Ionen indikativ ist. Daten für mehrere Ionen können gesammelt und kombiniert werden, um ein Flugzeit- („ToF“) Spektrum und/oder ein Massespektrum zu erzeugen.
Der ToF-Massenanalysator 40 kann ein beliebiger geeigneter ToF-Analysator sein. Der Ionenanalysator 40 kann allgemein einen Ioneninjektor, angeordnet an dem Beginn einer Ionenbahn, und einen Ionendetektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn, umfassen. Der Analysator 40 kann dafür konfiguriert sein, um Ionen durch Bestimmen von Ankunftszeiten von Ionen an dem Detektor zu analysieren (d. h. die Zeit, die von Ionen benötigt wird, um sich von dem Injektor über die Ionenbahn zu dem Detektor zu bewegen).
Der Ioneninjektor kann in beliebiger geeigneter Form vorliegen, wie zum Beispiel eine oder mehrere (z. B. orthogonale) Beschleunigungselektroden. In besonderen Ausführungsformen umfasst der Ioneninjektor jedoch eine Ionenfalle. Die Ionenfalle kann dafür konfiguriert sein, um Ionen (von der Fragmentierungsvorrichtung 30) zu empfangen, und kann dafür konfiguriert sein, um ein Ionenpaket zu akkumulieren (z. B. durch Akkumulieren von Ionen im Laufe eines Akkumulationszeitraums). Die Ionenfalle kann dafür konfiguriert sein, um jedes akkumulierte Ionenpaket in die Ionenbahn zu injizieren (z. B. durch Beschleunigen des Ionenpakets entlang der Ionenbahn), woraufhin die Ionen des Pakets sich entlang der Ionenbahn zu dem Detektor bewegen.
Der Detektor kann ein beliebiger geeigneter Ionendetektor sein, wie etwa ein oder mehrere Umwandlungsdynoden, optional gefolgt von einem oder mehreren Elektronenvervielfachern, einem oder mehreren Szintillatoren und/oder einem oder mehreren Photonenvervielfachern und dergleichen. Der Detektor kann dafür konfiguriert sein, um an dem Detektor empfangene Ionen zu erfassen, und kann dafür konfiguriert sein, um ein Signal zu erzeugen, das eine Intensität von Ionen angibt, die in Abhängigkeit von der (Ankunfts)zeit am Detektor empfangen werden. Das m/z der Ionen kann dann aus der gemessenen Ankunftszeit bestimmt werden.
Die Ionenbahn kann eine beliebige geeignete Form aufweisen, wie im Fall eines linearen ToF-Analysators linear sein, oder einschließlich einer oder mehrerer Reflexionen im Falle eines ToF-Analysators, der ein Reflektron oder einen Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysator umfasst. Die Ionenbahn kann ein zyklisches Segment einschließen.
In besonderen Ausführungsformen ist der Analysator 40 ein Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysator. Daher kann der Analysator 40 zwei Ionenspiegel umfassen, die beabstandet sind; und
einander in einer ersten Richtung X gegenüberliegen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist. Ein Ioneninjektor kann sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befinden und kann dafür konfiguriert sein, um Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln zu injizieren. Ein Detektor kann sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befinden und kann dafür konfiguriert sein, um Ionen zu detektieren, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben. Der Analysator kann dafür konfiguriert sein, um Ionen durch Injizieren von Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln zu analysieren, wobei die Ionen eine Zickzack-Ionenbahn annehmen können, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y in Richtung des ersten Endes der Ionenspiegel zurückdriften. Die Ionen können dann veranlasst werden, sich zur Detektion zu dem Detektor zu bewegen.
Es ist zu beachten, dass 2 lediglich schematisch ist und dass das analytische Instrument eine beliebige Anzahl von einer oder mehreren zusätzlichen Komponenten einschließen kann und dies in Ausführungsformen tut. Zum Beispiel umfasst das Instrument in der Regel eine oder mehrere Ionentransferstufe(n), die zwischen den verschiedenen veranschaulichten Komponenten 10, 20, 30, 40 angeordnet und dafür konfiguriert sind, um Ionen von einer Komponente zu der nächsten zu transferieren. Die eine oder mehreren lonentransferstufe(n) können beliebige geeignete Anordnung(en) von einer oder mehreren Ionenführungen, Linsen und/oder weiteren ionenoptischen Vorrichtungen einschließen.
Wie in 2 veranschaulicht, kann das Instrument unter der Steuerung einer Steuereinheit 50 vorliegen, wie einem angemessen programmierten Computer, der dafür konfiguriert sein kann, um den Betrieb verschiedener Komponenten des Instruments, einschließlich des Massenfilters 20, der Fragmentierungsvorrichtung 30 und des Analysators 40 zu steuern, z. B. um zu veranlassen, dass das Instrument in einem besonderen Betriebsmodus betrieben wird, und/oder das/die hierin beschriebene(n) Verfahren durchzuführen. Die Steuereinheit 50 kann auch Daten von verschiedenen Komponenten empfangen und verarbeiten, z. B. einschließlich spektraler Massendaten von dem Analysator 40 usw., gemäß den hierin beschriebenen Ausführungsformen.
Das Instrument kann in verschiedenen Betriebsmodi betreibbar sein, einschließlich eines MS1-Betriebsmodus und eines MS2-Betriebsmodus.
In dem MS1-Betriebsmodus (oder „vollständiger Massenscan“-Betriebsmodus) wird der Massenfilter 20 in seinem Übertragungsbetriebsmodus betrieben und die Fragmentierungsvorrichtung 30 wird in ihrem Nicht-Fragmentierungsbetriebsmodus betrieben, z. B. so, dass ein breiter m/z-Bereich (z. B. vollständiger Massenbereich) nicht fragmentierter („Vorläufer“- oder „Stamm“-) Ionen durch den Analysator 40 analysiert werden.
In dem MS2-Betriebsmodus wird der Massenfilter 20 in seinem Filterbetriebsmodus betrieben und die Fragmentierungsvorrichtung 30 wird in ihrem Fragmentierungsbetriebsmodus betrieben,
z. B. so, dass ein ausgewählter schmaler m/z-Bereich von Vorläuferionen fragmentiert werden und die resultierenden Fragmentionen („Produkt“- oder „Tochter“-Ionen) durch den Analysator 40 analysiert werden. In dem MS2-Betriebsmodus kann die Mitte des (schmalen) m/z-Fensters des Massenfilters zwischen jedem von einer Vielzahl von unterschiedlichen m/z-Werten nacheinander geändert werden, z. B. um jedes von einer Vielzahl von unterschiedlichen Vorläuferionen nacheinander mit jeweils unterschiedlichen m/z auszuwählen (und zu fragmentieren). In einem datenabhängigen Erfassungs(DDA)-MS2-Betriebsmodus kann die Vielzahl von unterschiedlichen m/z-Werten einer Vielzahl von unterschiedlichen Vorläuferionen entsprechen, die aus entsprechenden MS 1-Daten (d. h. einem vollständigen Massenscan) identifiziert werden. In einem datenunabhängigen Erfassungs(DIA)-MS2-Betriebsmodus kann die Vielzahl von unterschiedlichen m/z-Werten aus einer vorbestimmten (festen) Liste entnommen werden, d. h. ohne Bezugnahme auf MS 1-Daten.
Das Instrument kann auch in einem oder mehreren Fragmentierungsbetriebsmodi höherer Ordnung (MS^N) betreibbar sein, wie zum Beispiel einem MS3-Betriebsmodus, wobei Vorläuferionen fragmentiert werden, wobei mindestens einige der resultierenden Fragmentionen selbst fragmentiert werden und die Fragmentionen zweiter Generation („Enkelionen“) durch den Analysator 40 analysiert werden.
Der ToF-Analysator 40 ist in mindestens zwei Betriebsmodi betreibbar, nämlich einem ersten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn (zwischen dem Ioneninjektor und dem Ionendetektor) mit einer ersten Länge zu bewegen, und einem zweiten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn (zwischen dem Ioneninjektor und dem Ionendetektor) mit einer zweiten, größeren Länge zu bewegen. Steigern der Länge der Ionenflugbahn in dem zweiten Betriebsmodus weist den Effekt auf, die Auflösung des Analysators zu steigern, verringert aber den m/z-Bereich von Ionen, die analysiert werden können. Der zweite Betriebsmodus kann dementsprechend als ein „Zoom“-Betriebsmodus bezeichnet werden (da der Analysator effektiv auf eine schmalere m/z-Region des m/z-Spektrums „einzoomt“). Der ToF-Analysator 40 kann optional in einem oder mehreren weiteren Betriebsmodi betreibbar sein, in denen Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn (zwischen dem Ioneninjektor und dem Ionendetektor) zu bewegen, die eine oder mehrere unterschiedliche Längen aufweist.
Der Flugzeit(ToF)-Massenanalysator kann dafür konfiguriert sein, um eine variable Bahnlänge auf beliebige geeignete Weise aufzuweisen. Allgemein kann der ToF-Analysator 40 einen oder mehrere Ionenreflektoren (wie einen oder mehrere Ionenspiegel und/oder einen oder mehrere Reflektrons) aufweisen, dafür konfiguriert, um Ionen zu reflektieren. Die Ionenbahn kann verlängert werden, indem die Anzahl an Reflexionen in dem einen oder den mehreren lonenreflektoren gesteigert wird, die die Ionen absolvieren, bevor sie detektiert werden.
Somit können zum Beispiel in dem ersten Betriebsmodus Ionen möglicherweise nicht von einem Ionenreflektor reflektiert werden, bevor sie detektiert werden, und in dem zweiten Betriebsmodus können Ionen ein oder mehrere Male durch einen oder mehrere Ionenreflektoren reflektiert werden, bevor sie detektiert werden. Alternativ können die Ionen in dem ersten Betriebsmodus ein oder mehrere Male durch ein oder mehrere Ionenreflektoren reflektiert werden,
bevor sie detektiert werden, und in dem zweiten Betriebsmodus können Ionen durch den einen oder die mehreren Ionenreflektoren (als in dem ersten Modus) mehrere Male reflektiert werden, bevor sie detektiert werden. Zum Beispiel kann der ToF-Analysator zwischen einem ersten („V“) Betriebsmodus, in dem Ionen einmal in einem Ionenreflektor (Reflektron) reflektiert werden, bevor sie detektiert werden, und einem zweiten („W“) Betriebsmodus schaltbar sein, in dem Ionen drei Reflexionen (in zwei Ionenreflektoren) durchlaufen, bevor sie detektiert werden.
Die Ionenbahn kann auch oder stattdessen verlängert werden, indem die Anzahl der Durchläufe in einem zyklischen Segment der Ionenbahn, die Ionen absolvieren, gesteigert wird, bevor sie detektiert werden.
In besonderen Ausführungsformen ist der Analysator 40 ein multireflektierender Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator, der in einem Einzeldurchlauf-Betriebsmodus „Normalbetriebsmodus“ und einem Multidurchlauf-Betriebsmodus „Zoom-Betriebsmodus“ (wie nachstehend ausführlich beschrieben wird) betreibbar ist.
3 zeigt schematisch detaillierter ein Massenspektrometer, das zum Durchführen der Verfahren verschiedener Ausführungsformen geeignet ist. Das Instrument ist ein Hybridinstrument, das einen MR-ToF-Analysator 40 (von der in US-Patent Nr. 9,136,101 beschriebenen Art), einen Quadrupol-Massenfilter 20 und einen Orbitrap™-Analysator 60 inkorporiert. Das Instrument schließt auch eine Elektrospray-Quelle 10, eine Kollisionszelle 30 und die verschiedenen Ionenführungen usw. für ein komplettes Massenspektrometer ein. Es versteht sich, dass das in 3 gezeigte Instrument ein nicht einschränkendes Beispiel ist und dass zahlreiche Variationen möglich sind.
In der in 3 dargestellten Ausführungsform ist die Ionenquelle 10 des Instruments eine Elektrosprayionisations(ESI)-Ionenquelle. Das Instrument schließt eine Vakuumschnittstelle ein, die ein Transferrohr 21, einen Ionentrichter 22, eine Quadrupol-Vorfilter-Ionenführung 23 und eine sogenannte „gebogene Flatapol“-Ionenführung 24 enthält. Die Ionenführung 24 kann von dem in US-Patent Nr. 9,536,722 beschriebenen Design sein.
Das Instrument schließt auch einen Massenfilter in Form eines Quadrupol-Massenfilters 20, eine Ionenfalle 31 in Form einer gekrümmten linearen Ionenfalle („C-Falle“) und eine Kollisionszelle 30 in Form einer lonenweiterleitungs-Multipol-Kollisionszelle („IRM“) ein. Ionen von der Ionenquelle 10 können in der C-Falle 31 und/oder Kollisionszelle 30 akkumuliert werden, indem eine Gating-Elektrode, die sich in einer Ladungsdetektorbaugruppe 26 befindet, die zwischen der C-Falle 31 und dem Massenfilter 20 angeordnet ist, geöffnet und geschlossen wird.
Das Instrument schließt einen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator 40 in Form eines Multireflexions-Flugzeit(ToF)-Massenanalysators ein. Bei dem in 3 abgebildeten Instrument ist der Analysator von der Art mit gekipptem Spiegel, beschrieben in US-Patent Nr. 9,136,101 , aber es versteht sich, dass beliebige Art von ToF-Analysator verwendet werden könnte.
Wie in 3 gezeigt, schließt das Instrument eine Multipol-Ionenführung 32 ein, um zu erlauben, dass Ionen von der Kollisionszelle 30 an den Flugzeit-Massenanalysator 40 transferiert werden. Der Flugzeit-Massenanalysator 40 schließt eine Extraktionsfalle 41 ein, wodurch Ionen von der Kollisionszelle 30 über die Multipol-Ionenführung 32 an die Extraktionsfalle 41 geliefert werden. Die Ionen werden in der Extraktionsfalle 41 akkumuliert und gekühlt.
Die Extraktionsfalle 41 kann zwei Einfangregionen inkorporieren, eine bei einem relativ höheren Druck zur schnellen Ionenkühlung und eine zweite Niederdruckregion zur Ionenextraktion. Ionen werden in der Hochdruckregion gekühlt und dann in die Niederdruckregion transferiert, wo sie über ein Paar Deflektoren 42 impulsartig in den ToF-Analysator ausgestoßen werden. Ionen oszillieren zwischen einem Paar Spiegel 43, die in Bezug zueinander gekippt sind, sodass die Ionenbahn langsam abgelenkt und zu einem Detektor 44 zurückgelenkt wird. Korrigierende Streifenelektroden 45 wirken dem Verlust des Ionenfokus entgegen, der andernfalls durch die Nichtparallelität der Spiegel induziert wird.
Wie auch in 3 gezeigt, kann das Instrument optional einen zweiten Massenanalysator in Form eines elektrostatischen Massenanalysators 60 einschließen, wie einen Orbitalionenfallen-Massenanalysator, und spezifischer einen Orbitrap™-FT-Massenanalysator wie hergestellt von Thermo Fisher Scientific. Dieses hybridisierte Instrument wird in US-Patent Nr. 10,699,888 ausführlicher beschrieben, dessen Inhalte hierin durch Bezugnahme inkorporiert werden.
Ionen können in der Ionenfalle 31 gesammelt werden und können dann entweder orthogonal in den Orbitrap™-Analysator 60 zur Analyse ausgestoßen werden, ohne in die Kollisions- oder Reaktionszelle 30 einzutreten, oder die Ionen können axial in die Kollisions- oder Reaktionszelle 30 übertragen werden. In die Kollisions- oder Reaktionszelle 30 übertragene Ionen können entweder durch Kollisionen mit einem Kollisionsgas und/oder einem Reagenz in der Kollisionszelle 30 fragmentiert werden, oder lediglich durch Kollisionen mit einem Gas bei niedrigeren Energien gekühlt werden, die die Ionen veranlassen, zu fragmentieren. Sobald in der Kollisionszelle 30 akkumuliert, können Ionen entweder zur Analyse (über die Multipol-Ionenführung 32) in den Massenanalysator 40 ausgestoßen werden oder zur Analyse in den Orbitrap™-Analysator 60 ausgestoßen werden (über die C-Falle 31).
4 und 5 veranschaulichen schematisch Detail von beispielhaften Ausführungsformen des Analysators 40 mit variabler Bahnlänge. In diesen Ausführungsformen ist der Analysator 40 ein multireflektierender Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator, der in einem Einzeldurchlauf-Betriebsmodus „Normal-Betriebsmodus“ und einem Multidurchlauf-Betriebsmodus „Zoom-Betriebsmodus“ betreibbar ist.
Wie in den 4 und 5 gezeigt, schließt der Multireflexions-Flugzeitanalysator 40 ein Paar Ionenspiegel 43a, 43b ein, die in einer ersten Richtung X voneinander beabstandet und einander zugewandt sind. Die Ionenspiegel 43a, 43b sind entlang einer orthogonalen Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert.
Eine Ionenquelle (Injektor) 41, die in Form einer Ionenfalle vorliegen kann, ist an einem Ende (dem ersten Ende) des Analysators angeordnet. Die Ionenquelle 41 kann angeordnet und dafür konfiguriert sein, um Ionen von der Fragmentierungsvorrichtung 30 zu empfangen. Ionen können in der Ionenquelle 41 akkumuliert werden, bevor sie in den Raum zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b injiziert werden. Wie in den 4 und 5 gezeigt, können Ionen aus der Ionenquelle 41 mit einem relativ kleinen Injektionswinkel oder einer relativ kleinen Driftrichtungsgeschwindigkeit injiziert werden, wodurch unterschiedliche Oszillationen zwischen den Spiegeln 43a, 43b räumlich getrennt werden.
Ein(e) oder mehrere Linsen und/oder Deflektoren können entlang der Ionenbahn zwischen der Ionenquelle 41 und dem Ionenspiegel 43b angeordnet sein, dem die Ionen zuerst begegnen. Zum Beispiel können, wie in den 4 und 5 gezeigt, eine erste Linse 46 außerhalb der Ebene, ein Injektionsdeflektor 42a und eine zweite Linse 47 außerhalb der Ebene entlang der Ionenbahn zwischen der Ionenquelle 41 und dem Ionenspiegel 43b, dem die Ionen zuerst begegnen, angeordnet sein. Andere Anordnungen wären möglich. Im Allgemeinen können die eine oder die mehreren Linsen und/oder Deflektoren dafür konfiguriert sein, um den Ionenstrahl angemessen zu konditionieren, zu fokussieren und/oder abzulenken, d. h. derart, dass er veranlasst wird, die gewünschte Bahn durch den Analysator anzunehmen.
Der Analysator 40 schließt auch einen anderen Deflektor 42b ein, der entlang der Ionenbahn zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b angeordnet ist. Wie in den 4 und 5 gezeigt kann der Deflektor 42b etwa äquidistant zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b, entlang der Ionenbahn nach seiner ersten lonenspiegelreflexion (in Ionenspiegel 43b) und vor seiner zweiten Ionenspiegelreflexion (in dem weiteren Ionenspiegel 43a) angeordnet sein.
Der Analysator schließt auch einen Detektor 44 ein. Der Detektor 44 kann ein beliebiger geeigneter Ionendetektor sein, dafür konfiguriert, um Ionen zu detektieren und um z. B. eine Intensität und eine Ankunftszeit aufzuzeichnen, die der Ankunft des Ions/der Ionen an dem Detektor zugeordnet sind. Geeignete Detektoren schließen zum Beispiel einen oder mehrere Konversionsdynoden ein, optional gefolgt von einem oder mehreren gefolgt von einem oder mehreren Elektronenmultiplikatoren und dergleichen.
In seinem „normalen“ Betriebsmodus werden Ionen aus der Ionenquelle 41 in den Raum zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b auf eine solche Weise injiziert, dass die Ionen eine Zickzack-Ionenbahn mit mehrfachen Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b in der X-Richtung annehmen, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor 42b in Richtung des gegenüberliegenden (zweiten) Endes der Ionenspiegel 43a, 43b driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel 43a, 43b umkehren und dann (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem Deflektor 42b zurückdriften. Die Ionen können dann veranlasst werden, sich zur Detektion von dem Deflektor 42b zu dem Detektor 44 zu bewegen.
In dem Analysator von 4 sind die Ionenspiegel 43a, 43b in Bezug auf die X- und/oder Y-Driftrichtung beide gekippt. Es wäre stattdessen möglich, dass nur einer der Ionenspiegel 43a,
43b gekippt wird, und z. B. für den weiteren der Ionenspiegel 43a, 43b, parallel zu der Y-Driftrichtung angeordnet zu werden. Allgemein liegen die Ionenspiegel in einem nicht konstanten Abstand voneinander in der X-Richtung entlang des meisten oder von allem ihrer Längen in der Driftrichtung Y vor. Der Driftrichtungsgeschwindigkeit von Ionen in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel wird von einem elektrischen Feld entgegengetreten, das aus dem nicht konstanten Abstand der beiden Spiegel voneinander resultiert, und dieses elektrische Feld veranlasst, dass die Ionen ihre Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und entlang der Driftrichtung in Richtung des Deflektors zurückdriften.
Der in 4 dargestellte Analysator umfasst ferner ein Paar korrigierender Streifenelektroden 45. Ionen, die sich die Driftlänge herunterbewegen, werden mit jedem Durchlauf durch die Spiegel 43a, 43b leicht abgelenkt, und die zusätzlichen Streifenelektroden 45 werden dafür verwendet, um den Flugzeitfehler zu korrigieren, der durch den variierenden Abstand zwischen den Spiegeln erzeugt wird. Zum Beispiel können die Streifenelektroden 45 elektrisch derart vorgespannt sein, dass die Periode der Ionenoszillation zwischen den Spiegeln entlang der ganzen Driftlänge im Wesentlichen konstant ist (trotz des nicht konstanten Abstands zwischen den zwei Spiegeln von). Die Ionen werden schließlich selbst zurück in den Driftraum reflektiert und an dem Detektor 44 fokussiert.
Weitere Details des Mehrfachreflexions-Flugzeit-Massenanalysators des Typs mit geneigtem Spiegel von 4 sind in US-Patent Nr. 9,136,101 beschrieben, dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
In dem Analysator von 5 sind die Ionenspiegel 43a, 43b parallel zueinander. Um zu veranlassen, dass die Ionen ihre Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und entlang der Driftrichtung in Richtung des Deflektors zurückdriften, schließt der Analysator in dieser Ausführungsform einen zweiten Deflektor 48 an dem zweiten Ende der Ionenspiegel 43a, 43b ein.
Wie auch in 5 gezeigt, kann in dieser Ausführungsform eine Linse in dem Injektionsdeflektor 42a und/oder in dem Deflektor 42b eingeschlossen sein. Somit wird es dem Ionenstrahl ermöglicht, sich ein kurzes Stück in den Analysator auszubreiten, bevor er auf eine Linse mit langer Brennweite trifft, was bewirkt, dass der Ionenstrahl entlang seiner Länge fokussiert. Die Linse kann eine elliptische driftfokussierende (konvergierende) Linse sein, die innerhalb des Deflektors 42b montiert ist. Der zweite Deflektor 48, der auch eine Linse einschließen kann, wird verwendet, um die Strahlrichtung umzukehren, während Steuerung der Fokuseigenschaften aufrechterhalten wird.
Weitere Details des Mehrfachflexions-Flugzeit-Massenanalysators des Typs mit einzelner Linse von 5 sind in dem UK- Patent Nr. GB 2,580,089 beschrieben, dessen Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Bei den in den 4 und 5 dargestellten Analysatoren kann der Ionenstrahl relativ weit (in der Driftrichtung Y) für den größten Teil seiner Flugbahn gestreut werden. Dies steht zum Beispiel im Gegensatz zu multireflektierenden Flugzeit(ToF)-Massenanalysatoren, die einen Satz von periodischen Linsen verwenden, um den Ionenstrahl entlang seiner gesamten Flugbahn zu fokussieren, z. B. wie in dem Artikel A. Verenchikov et al., Journal of Applied Solution Chemistry and Modelling, 2017, 6, 1-22 beschrieben. Ein bedeutender Vorteil, dem Ionenstrahl zu erlauben, sich für den Großteil seiner Flugbahn ausgedehnt auszubreiten, besteht darin, dass Raumladungseffekte reduziert werden, was ein bedeutendes Problem für Flugzeitanalysatoren sein kann, besonders wenn gekennzeichnete Analytionen analysiert werden. Nichtsdestotrotz sind hierin beschriebene Ausführungsformen auch auf andere MR-ToF-Analysatordesigns anwendbar, wie den MR-ToF-Analysator des Typs Verenchikov.
In den in den 4 und 5 dargestellten Ausführungsformen bedeutet die Tatsache, dass der Ionenstrahl in der Driftdimension Y relativ ausgedehnt ist, dass der Deflektor 42b in der Lage sein sollte, einen solchen breiten Strahl aufzunehmen, ohne dass eine Beschneidung oder eine ungleichmäßige Ablenkung eingeführt wird. Ein geeignetes Deflektordesign ist ein trapezförmiger oder prismenartiger Deflektor.
Daher kann der Deflektor 42b eine trapezförmige oder prismenartige Elektrode, die über dem Ionenstrahl angeordnet ist, und eine andere trapezförmige oder prismenartige Elektrode umfassen, die unterhalb des Ionenstrahls angeordnet ist. Die Elektroden können sich außerhalb der Ebene der Ablenkung befinden, wodurch ermöglicht wird, dass sie leicht genug einen breiten Ionenstrahl aufnehmen (zumindest im Vergleich zu herkömmlichen Ablenkplatten, die auf beiden Seiten des Strahls sitzen würden). Die Elektroden können in Bezug auf den Ionenstrahl derart abgewinkelt sein, dass, wenn (eine) geeignete (DC-)Spannung(en) an die Elektrode(n) angelegt wird (werden), das resultierende elektrische Feld eine Ablenkung in dem Ionenstrahl induziert. Ionen können einem relativ starken elektrischen Feld an den Kanten der abgewinkelten Elektroden ausgesetzt sein, was eine Ablenkung induziert. Geeignete Ablenkspannungen liegen in der Größenordnung von ± einigen Volt, ± einigen zehn Volt oder ± einigen hundert Volt vor. Der Deflektor sollte so konfiguriert sein (und ist so in Ausführungsformen), dass er veranlassen kann, dass der Ionenstrahl um einen gewünschten (ausgewählten) Winkel abgelenkt wird. Der Winkel, um den der Ionenstrahl durch den Deflektor abgelenkt wird, kann einstellbar sein, z. B. durch Anpassen der Größe einer oder mehrerer (DC-) Spannung(en), die an den Deflektor angelegt werden.
In Ausführungsformen ist der multireflektierende Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator in einem Multidurchlauf-„Zoom“-Betriebsmodus betreibbar. In diesem Betriebsmodus werden Ionen veranlasst, multiple Zyklen innerhalb des Analysators in der Driftrichtung Y vorzunehmen. Steigern der Anzahl von Zyklen N steigert die Länge der Ionenbahn, die die Ionen innerhalb des Analysators (zwischen dem Injektor 41 und dem Detektor 44) nehmen, wodurch die Auflösung des Analysators gesteigert wird. In dem Verenchikov-Analysator kann dies durch Steuern einer Spannung an einer Eintrittslinse erfolgen. Für die in den 4 und 5 dargestellten Analysatoren kann der Deflektor 42b an der Vorderseite des Analysators, die normalerweise verwendet wird, um den Injektionswinkel zu reduzieren und/oder die Anzahl von Oszillationen innerhalb eines einzelnen Driftdurchlaufs zu optimieren, (auch) verwendet werden, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit
der Ionen derart umzukehren, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus durch den Analysator abzuschließen.
Daher werden in einem Multidurchlauf-„Zoom“-Betriebsmodus Ionen veranlasst, mehrfache (N) Zyklen innerhalb des Analysators 40 abzuschließen, wobei die Ionen in jedem Zyklus in der Driftrichtung Y von dem Deflektor 42b (oder Eintrittslinse) in Richtung des gegenüberliegenden (zweiten) Endes der Ionenspiegel 43a, 43b und dann zurück zu dem Deflektor 42b (oder der Eintrittslinse) driften. In jedem Zyklus schließen die Ionen auch mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der X-Richtung ab. Daher nehmen die Ionen in jedem Zyklus eine Zickzack-Ionenbahn durch den Raum zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b an.
Bei den in den 4 und 5 dargestellten Analysatoren kann ein Anfangszyklus initiiert werden, indem die Ionen von dem Injektor 41 in den Raum zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b injiziert werden. Die Ionen können in einem der Ionenspiegel 43b reflektiert werden und können sich dann zu dem Deflektor 42b bewegen. An den Deflektor 42b kann eine angemessene (z. B. relativ kleine) Spannung derart angelegt werden, dass die Ionen veranlasst werden, den Deflektor 42b in einer Richtung in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel zu verlassen. Beim Vorhandensein des Deflektors 42b nehmen die Ionen eine Zickzack-Ionenbahn mit mehrfachen Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b in der Richtung X an, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor 42b in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem Deflektor 42b zurückdriften.
Nachdem die Ionen diesen Anfangszyklus abgeschlossen haben, wird jeder weitere Zyklus durch Verwenden des Deflektors initiiert, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen (in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel) umzukehren. Dazu kann eine geeignete Spannung an den Deflektor 42b angelegt werden, die Ionen veranlasst, den Deflektor 42b mit einer Driftrichtungsgeschwindigkeit zu verlassen, die der Driftrichtungsgeschwindigkeit entgegengesetzt ist, mit der die Ionen ursprünglich in den Deflektor 42b eingetreten sind. Diese Spannung kann im Laufe eines Zeitraums angelegt werden, in dem erwartet wird, dass die Ionen zurück an dem Deflektor 42b ankommen. Geeignete Ablenkspannungen zum Umkehren der Driftrichtung der Ionen liegen in der Größenordnung von einigen hundert Volt.
Der Deflektor kann verwendet werden, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen ein oder mehrere Male umzukehren. Daher kann das Verfahren umfassen, die Ionen zu veranlassen, (N) Zyklen innerhalb des Analysators abzuschließen, wobei der erste Zyklus initiiert wird, indem die Ionen in den Raum zwischen den Ionenspiegeln injiziert werden, und nachdem die Ionen den ersten Zyklus abgeschlossen haben, kann jeder weitere Zyklus durch Verwenden des Deflektors initiiert werden, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen umzukehren.
Nachdem die Ionen die gewünschte (mehrfache) Anzahl (N) von Zyklen innerhalb des Analysators abgeschlossen haben, werden die Ionen sich zur Detektion von dem Deflektor 42b zu dem Detektor 44 bewegen gelassen. Dazu kann eine angemessene Spannung an den Deflektor 42b derart angelegt werden, dass
die Ionen veranlasst werden, den Deflektor 42b in einer Richtung in Richtung des Detektors 44 zu verlassen. Die Ionen können in einem (dem weiteren) der Ionenspiegel 43a reflektiert werden, bevor sie sich zu dem Detektor 44 bewegen (und von ihm detektiert werden).
6 veranschaulicht schematisch diesen Zoom-Betriebsmodus. Wie in 6 gezeigt, werden Ionen aus der Ionenfallenquelle 41 durch einen Deflektor 42a und zwischen den Spiegeln in einem relativ hohen Winkel injiziert. Nach der ersten Halboszillation durchlaufen Ionen einen zweiten prismenförmigen Deflektor 42b, der den Injektionswinkel um fast die Hälfte reduziert. Oszillierende Ionen driften dann die längliche Spiegellänge hinauf und werden zurückgedreht, z. B., im Fall des Analysators von 4, durch die eingestellte Neigung des Spiegels. Zu dem Zeitpunkt, an dem Ionen zu diesem zweiten Deflektor 42b zurückkehren, kann die Spannung von einem Injektions-/Extraktionspotenzial von etwa -150 V zu einem Einfangpotential von etwa +350 V umgeschaltet werden, was den Ionenstrahl für einen zweiten Durchlauf zurück in den Analysatorkörper reflektiert. Nachdem eine gewünschte Anzahl von Durchläufen (N) von den Ionen durchwandert wurde, wird der Deflektor 42b auf das Injektions-/Extraktionspotenzial zurückgeschaltet und Ionen entweichen zu dem Detektor 44.
Ausführungsformen sind auf Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle gerichtet, wie Peptide, die mit isobarischen Markierungen gekennzeichnet sind. Die Analytmoleküle können mit einem Satz isobarischer Markierungen gekennzeichnet werden. Isobarische Markierungen und ihre Verwendungen sind in der Literatur beschrieben (siehe z. B. Thompson et al, Anal. Chem., 2003, 75, 1895-1904). Ein Satz von isobarischen Markierungen ist ein Satz von Markierungsmolekülen, die (etwa) die gleiche Masse aufweisen, aber bei Fragmentierung gekennzeichneter Analytionen charakteristische Reporterionen von sich unterscheidender Masse ergeben. Geeignete isobarische Markierungen schließen Tandem-Atommassenmarkierungen (TMT) und isobarische Markierungen zur relativen und absoluten Quantifizierung (iTRAQ) ein. Jede Markierung kann (mindestens) eine Reporterregion und eine Balancerregion umfassen, z. B. derart, dass jedes gekennzeichnete Analytmolekül (mindestens) eine Reporterregion, eine Balancerregion und ein Analytmolekül (z. B. ein Peptid) umfasst.
Die gekennzeichneten Analytmoleküle können in Lösung bereitgestellt werden, die Lösung kann unter Verwendung der Trennvorrichtung getrennt werden, und die getrennte Lösung von der Trennungsvorrichtung kann der Ionenquelle 10 zur Ionisierung bereitgestellt werden. Die Ionenquelle 10 kann die gekennzeichneten Analytmoleküle ionisieren, um gekennzeichnete Analytionen zu produzieren.
Die gekennzeichneten Analytionen können optional anfänglich in einem MS1-Betriebsmodus analysiert werden, um MS1-Daten bereitzustellen. Die MS1-Daten können einen oder mehrere Ionenpeaks einschließen, wobei jeder Ionenpeak den gekennzeichneten Analytionen entspricht, die ein besonderes m/z (d. h. einen besonderen Vorläufer) aufweisen.
Die gekennzeichneten Analytionen können dann in dem MS2-Betriebsmodus analysiert werden, um MS2-Daten bereitzustellen. Jeder Vorläufer von Interesse, der aus den MS1-Daten identifiziert wird, kann verwendet werden, um ein m/z-Fenster für den Massenfilter 20 zu definieren. Der Massenfilter 20 kann dann nacheinander
durch jedes m/z-Fenster schreiten, das jedem Vorläufer von Interesse entspricht. In diesem MS2-Betriebsmodus arbeitet die Fragmentierungsvorrichtung 30 in einem fragmentierenden Betriebsmodus. Daher werden die massengefilterten gekennzeichneten Analytionen nacheinander in der Fragmentierungsvorrichtung 30 fragmentiert. Wenn gekennzeichnete Analytionen fragmentiert werden, können Reporterionen zusammen mit Analytmolekülfragmentionen produziert werden (wobei ein Reporterion ein Ion einer Reporterregion ist).
Zusätzlich oder alternativ können komplementäre Ionen produziert werden (wobei ein komplementäres Ion ein Ion einer Balancerregion und eines Analytmoleküls kombiniert ist). Die Produktion von komplementärem Ion erfordert eine sorgfältige Steuerung der Kollisionsenergie, z. B. auf einen relativ niedrigen Wert. Diese niedrige Kollisionsenergie kann auch einige Peptidfragmente produzieren (aber weniger effizient als bei relativ hohen Kollisionsenergien). Alternativ können zwei unterschiedliche Kollisionsenergien verwendet werden, d. h. eine niedrige Kollisionsenergie kann verwendet werden, um komplementäre Ionen zu produzieren, und eine hohe Kollisionsenergie kann verwendet werden, um Peptidfragmente zu produzieren. Daher können für jeden Vorläufer von Interesse zwei Injektionen in die Fragmentierungsvorrichtung 30 bei unterschiedlichen Kollisionsenergien bereitgestellt werden. Die resultierenden Fragmentionen können entweder in einer einzelnen Injektion (als ein einzelnes Ionenpaket) oder zwei Injektionen (als zwei Ionenpakete) in den Analysator 40 injiziert (und analysiert) werden.
Die Analytfragmentionen und die Reporterionen oder die komplementären Ionen werden unter Verwendung des Analysators 40 analysiert.
Unter Bezugnahme auf das in 3 dargestellte Instrument werden in Ausführungsformen gemultiplexte und markierte Proben aus einer Flüssigchromatographie(LC)-Trennungsvorrichtung an die Elektrospray-Ionenquelle 10 geliefert, ionisiert und im Vakuum zu dem Quadrupol 20 geleitet.
Um einen vollständigen Massenscan (MS1) durchzuführen, ist der Quadrupol 20 dafür konfiguriert, um sein Isolationsniveau zu minimieren, und überträgt Ionen zur Analyse entweder an die C-Falle 31 und den Orbitrap™-Analysator 60 oder zu dem MR-ToF-Analysator 40.
Um einen Fragmentscan (MS2) durchzuführen, wird ein geeigneter Vorläufer, der entweder aus dem MS1-Scan identifiziert wurde (datenabhängige Erfassung (DDA), oder aus einer festen Liste laufen gelassen wird (datenunabhängige Erfassung (DIA), mit verstärkter Energie an die Kollisionszelle 30 gesendet und fragmentiert. Die Fragmente werden dann zur Analyse an den MR-ToF-Analysator 40 geliefert, wobei TMT-Reporterionenpeaks zur Quantifizierung gemessen und Peptidfragmente zur Identifikation des Vorläufers detektiert werden.
7 veranschaulicht diesen DDA-Prozess. Wie in 7 gezeigt, wird zunächst ein MS1-Scan unter Verwendung entweder des Orbitrap™-Analysators 60 oder des ToF-Analysators 40 durchgeführt (Schritt 60). Für das Instrumentdesign von 3 kann der Orbitrap™-Analysator 60 zum Durchführen von MS 1-Vorläufer-Identifikation vorteilhaft sein, aber es wäre möglich, den ToF-Analysator 40 allein zu verwenden, und der Orbitrap™-Analysator 60 ist kein essentieller Teil des Instruments.
Als Nächstes wird ein Vorläuferion aus dem MS1-Scan ausgewählt (Schritt 62), und ein MS2-Scan wird für dieses Vorläuferion unter Verwendung des ToF-Analysators 40 durchgeführt (Schritt 64). Wie durch Schritt 66 veranschaulicht, wird dieser Prozess dann wiederholt, bis die Liste von Vorläuferionen, die aus dem MS 1-Scan identifiziert wurden, erschöpft ist. Sobald die Liste von Vorläuferionen erschöpft ist, wird ein neuer MS1-Scan durchgeführt, und der Prozess wiederholt sich selbst.
Dieser DDA-Prozess ist vorteilhaft (und ein DIA-Prozess kann nachteilig sein) für die hierin beschriebenen TMT-Verfahren. Dies liegt daran, dass Quadrupol-Isolationsbreiten dazu neigen, zu breit zu sein, um einen -300-1100-Massenbereich mit ausreichender Schnelligkeit blind abzudecken (wie in der Regel in DIA-Verfahren erfolgt), um mit der Zeitskala von chromatographischen Peaks von der Trennungsvorrichtung kompatibel zu sein, während sehr schmale Isolationsfenster bevorzugt werden, um Interferenzen zwischen co-isolierten Peptiden zu minimieren. Das komplementäre Ionenverfahren weist jedoch weniger Schwierigkeiten mit solchen Interferenzen auf und ist mit DIA viel kompatibler.
In Ausführungsformen kann der vorstehend beschriebene Zoom-Modus innerhalb des/der MS1-Scans angewendet werden oder nicht. Gemäß Ausführungsformen wird der Zoom-Modus jedoch auf den/die MS2-Scan(s) angewendet.
In dieser Hinsicht wird darauf hingewiesen, dass die Reporterionen in dem Massenspektrum sehr früh erscheinen, tatsächlich niedriger als das Instrument normalerweise eingestellt werden kann, um Fragmentionen der meisten Vorläufer nachzuweisen. Sie sind auch über wenige m/z-Einheiten eng beabstandet. Eine Folge davon ist, dass der Zoom-Modus vorteilhafterweise nur auf die Reporterionen angewendet werden kann und die verbleibenden Fragmentionen ohne Unterbrechung durch das Instrument durchlaufen können. Es wäre auch möglich, den Zoom-Modus nur auf die komplementären Ionen anzuwenden, die auch über wenige m/z-Einheiten eng beabstandet sind.
Daher werden in Ausführungsformen die Analytfragmentionen unter Verwendung des Flugzeit-Massenanalysators 40 analysiert, der in dem ersten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen. Die Reporterionen oder die komplementären Ionen werden unter Verwendung des Flugzeit-Massenanalysators 40 analysiert, der in dem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit der zweiten, größeren Länge zu bewegen. Es wurde erkannt, dass der normale Betriebsmodus des Analysators mit breitem m/z-Bereich besonders für die Analyse von Peptidfragmentionen geeignet ist (die in der Regel über einen relativ breiten Bereich von m/z erscheinen), und der Zoom-Betriebsmodus mit engem m/z-Bereich, aber höherer Auflösung besonders für die Analyse der Reporterionen (die in der Regel innerhalb eines relativ engen m/z-Bereichs bei relativ niedrigen m/z erscheinen) oder komplementären Ionen geeignet ist.
Die resultierenden m/z- und/oder Intensitätsinformationen für die Analytfragmentionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu identifizieren, und die m/z- und/oder Intensitätsinformationen für die Reporterionen oder die komplementären Ionen können verwendet werden, um die Analytmoleküle zu quantifizieren.
Bei dem MR-ToF-Instrument von 3 und 4 mit einer 20-25 m Flugbahn durchlaufen alle injizierten Ionen den zweiten Deflektor 42b relativ schnell innerhalb ~100ps. TMT-Reporterionen bei m/z ~128 kehren nach ~250ps zu dem Deflektor 42b zurück, wodurch eine große Overhead-Zeit für den Deflektor 42b gelassen wird, um in den internen Einfangs-Zoom-Modus umgeschaltet zu werden. Die Reporterionen können dann innerhalb weniger Mikrosekunden zurück in das Instrument reflektiert werden, und der Deflektor 42b kann in seinen Übertragungsmodus zurückgeschaltet werden, woraufhin Peptidfragmentionen erlaubt werden, das System zusammen mit den TMT-Reporterionen zu verlassen, die aus ihrem zweiten Durchlauf zurückkehren. Dies weist den Effekt auf, die Reporterregion irgendwo über 500ps zu verschieben (570 ps in einem realen Experiment, obwohl dies wesentlich mit der Analysatorfeinabstimmung variiert), was von der Datenanalysesoftware verstanden werden sollte.
In einigen Ausführungsformen können multiple kurze Deflektorspannungsimpulse mit der Rückkehr der TMT-Reporterionen derart ausgerichtet sein, dass diese Ionen für noch größere Leistungsniveaus mehrfache Durchläufe durch den Analysator vornehmen.
8 veranschaulicht ein Schema, bei dem die Reporterionen für fünf Durchläufe durch den Analysator 40 gesendet werden. Wie von 8 veranschaulicht, wird die an den Deflektor 42b angelegte Spannung von ihrem Injektions-/Extraktionspotenzial (—150 V) zu ihrem Einfangpotential (~350 V) rechtzeitig mit der Rückkehr der TMT-Reporterionen gepulst, sodass nur die Reporterionen für fünf Durchläufe durch den Analysator 40 gesendet werden, während die Peptidfragmentionen einem normalen Einzeldurchlauf durch den Analysator 40 unterzogen werden.
Daher umfasst das Verfahren in Ausführungsformen das Injizieren eines Ionenpakets, das Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen aus dem Ioneninjektor 41 umfasst, in den Raum zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b. Die Ionen werden dazu veranlasst, einen ersten Zyklus abzuschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrere Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor 42b oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem Deflektor 42b oder der Linse zurückdriften. Dann dürfen sich nur die Analytfragmentionen zur Detektion von dem Deflektor 42b oder der Linse zu dem Detektor 44 bewegen. Der Deflektor 42b oder die Linse wird dazu verwendet, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit (nur) der Reporterionen oder der komplementären Ionen derart umzukehren, dass diese Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, in dem diese Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln 43a, 43b in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor 42b oder der Linse in Richtung des
zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem Deflektor 42b oder der Linse zurückdriften. Dieser Schritt kann optional wiederholt werden, z. B. derart, dass die Reporterionen oder die komplementären Ionen veranlasst werden, eine gewünschte Anzahl N von Durchläufen in dem Analysator 40 abzuschließen. Schließlich werden die Reporterionen oder die komplementären Ionen dazu veranlasst, sich zur Detektion von dem Deflektor 42b oder der Linse zu dem Detektor 44 zu bewegen.
Während dieser Betriebsmodus in Bezug auf TMT-Auflösung immer größere Vorteile aufweist, wurde experimentell ein Signalverlust für mehrere Durchläufe festgestellt (siehe 11), und die Kerben der Deflektorspannung werden Kerben in dem Massenspektrum. Obwohl die Auflösung mit der Anzahl von Durchläufen ansteigt, steigt auch der Signalverlust an, und es wird zunehmend wahrscheinlich, dass die Kerben Peptidfragmentionen fangen und falsch positive Peaks generieren. Ein relativ schnelles Deflektorschalten wird für diesen Vorgang benötigt, genau wie eine minimale Verweilzeit innerhalb des Deflektors 42b selbst, obwohl, da dies normalerweise in der Größenordnung von ~1ps liegt, angenommen wird, dass die Schnelligkeit des Stromversorgungsschaltens signifikanter ist. Die Zeitsteuerungen des Prismenspannungsschalters können auf einer Pro-Instrument-Basis kalibriert und optimiert werden.
Die Fokusebenenposition von Ionen, die an dem Detektor ankommen, sollte zur besten Auflösung mit der Detektoroberfläche ausgerichtet sein. Die Fokusebenenposition kann jedoch für den Zoom-Modus gegenüber dem nicht gezoomten regulären Modus verschoben werden. Normalerweise kann Anpassung der Fokusebene durch leichte Störungen der Spiegelspannungen ausgeführt werden, dies ist aber im Allgemeinen nicht machbar, wenn Ionen mit gemischten Trajektorien zusammen durch den Analysator fliegen.
In dieser Hinsicht wird angemerkt, dass ein Vorteil dieses Verfahrens darin besteht, dass nur die herangezoomten Reporterionen die höchste Auflösung erfordern, wohingegen die Auflösung, die für die Peptidfragmentionen benötigt wird, weitaus weniger anspruchsvoll ist. Daher kann in einigen Ausführungsformen die Fokusebene nur für die herangezoomten Ionen optimiert werden. Es ist auch oder stattdessen möglich, die Tatsache auszunutzen, dass die Reporterionen die Ionen mit niedrigstem m/z in dem Spektrum, die frühesten, die aus der Falle 41 austreten, sind, und somit innerhalb der Falle 41 innerhalb der Injektionsoptik 46, 42a, 47, 42b, Randbereichen der Spiegel 43a, 43b und/oder an dem Detektor 44 sich unterscheidenden gesteuerten Spannungen (wie zum Beispiel einem langsam ansteigenden Extraktionsimpuls) ausgesetzt werden können, um die Fokusebene anzupassen, ohne weitere Ionen zu beeinflussen. Es wäre auch oder stattdessen möglich, ein m/z-abhängiges Ionenenergiekorrekturverfahren einzusetzen, z. B. wie in US-Patent Nr. 10,727,039 beschrieben, dessen Inhalte hierin durch Bezugnahme inkorporiert werden. Es wäre auch oder stattdessen möglich, eine kleine oszillierende Spannung von gesteuerter Frequenz und Phase an die Spiegel 43a, 43b in Resonanz mit der Oszillation der Reporterionen mit niedrigem m/z anzulegen, was eine Fokusebenenanpassung ergibt, die ausschließlich die Reporterionen beeinflusst.
9 zeigt einen Arbeitsablauf gemäß weiteren Ausführungsformen, wobei anstatt die Reporterionenmessung in dem gleichen Scan wie die Peptidfragmente vorzunehmen, sie stattdessen in einem getrennten Scan gemessen werden.
Wie in 9 gezeigt, wird zunächst ein vollständiger MS 1-Massenscan durchgeführt (Schritt 70), und aus dem MS1-Scan wird ein Vorläuferion ausgewählt (Schritt 72). Als Nächstes wird ein erster MS2-Scan unter Verwendung des Zoom-Modus durchgeführt, um die TMT-Reporterionen zu detektieren (Schritt 74), und dann wird ein zweiter MS2-Scan unter Verwendung des regulären Betriebsmodus durchgeführt, um die Peptidfragmentionen zu detektieren (Schritt 76). Die Reihenfolge der Schritte 74 und 76 könnte umgekehrt werden. Wie durch Schritt 78 veranschaulicht, wird dieser Prozess dann wiederholt, bis die Liste von Vorläuferionen, die aus dem MS 1-Scan identifiziert wurden, erschöpft ist. Sobald die Liste von Vorläuferionen erschöpft ist, wird ein neuer MS1-Scan durchgeführt, und der Prozess wiederholt sich selbst.
Somit werden in Ausführungsformen die Analytfragmentionen als ein oder mehrere erste Ionenpakete analysiert, die in den Analysator 40 injiziert werden, und die Reporterionen oder die komplementären Ionen werden als ein oder mehrere zweite, unterschiedliche Ionenpakete analysiert, die in den Analysator 40 injiziert werden.
Dieses Verfahren weist den Vorteil auf, dass Instrumenteinstellungen für jeden der zwei MS2-Scans optimiert werden können, zum Beispiel durch Feinabstimmen der Spiegel 43a, 43b auf Auflösung und/oder Optimierungen von HF-und DC-Spannungen für die sich unterscheidenden Zielmassenbereiche von Reporterionen und Peptidfragmentionen, z. B. um die Kollisionsenergie für jeden der zwei Scans zu optimieren, um die an die Ionenfalle 41 angelegten Injektionsspannungen für jeden der zwei Scans zu optimieren und/oder um das Isolationsfenster des Massenfilters für jeden der zwei Scans zu optimieren.
In diesen Ausführungsformen kann ein gekerbtes Verfahren, ähnlich dem von 8 veranschaulichten Verfahren, optional noch für den TMT-Scan verwendet werden, außer dass der Deflektor 42b, wenn er eingestellt ist, um Ionen zwischen Kerben zu übertragen, stattdessen auf eine extreme Spannung eingestellt wird, um alle Peptidfragmentionen aus dem Spektrum zu entfernen.
Diese Ausführungsformen weisen zusätzliche Kosten hinsichtlich der Rohempfindlichkeit und der Erfassungsschnelligkeit auf, jedoch ist die maximale Erfassungsschnelligkeit des MR-ToF-Analysators 40 viele Male höher als ein Orbitrap™-Analysator, der bei 50 Hz betrieben wird, und etwas Empfindlichkeit kann durch getrennte Optimierung der Kollisionsenergien (höhere Energie ist für Ionen mit niedrigem m/z wie Reporterionen besser, aber weniger bevorzugt für Fragmentionen mit mittlerem/hohem m/z), Einfangs-HF usw. wiedergewonnen werden. Vorteilhafterweise kann das Isolationsfenster des Quadrupol 20 für den TMT-Scan geschmälert werden, um Störungen zu entfernen, und für den Peptidscan erweitert werden, um Empfindlichkeit zu maximieren. Im Allgemeinen werden -10.000 detektierte Ionen zur Peptididentifikation bevorzugt, aber zur Reporterionenquantifizierung werden weit weniger benötigt, vor allem bei der durch ToF-Analysatoren bereitgestellten Einzelionenniveaudetektion.
10 zeigt experimentelle Ergebnisse für den raumladungsinduzierten Auflösungsverlust des Analysators von 4 für die Einzeldurchlauf- und Zoom-Modi unter Verwendung von MRFA-Ionen, die aus einer Flexmix™-Probe generiert werden. Es ist ersichtlich, dass nicht nur die obere Spitzenauflösung in dem Zoom-Modus annähernd verdoppelt wird, sondern auch die Widerstandsfähigkeit gegenüber Raumladung nahezu verdoppelt wird (das heißt, die Anzahl an Ionen in einem Peak, bei dem der 50K-Auflösungsbedarf erzielt wird, beträgt nahezu zweimal so viel).
11 zeigt graphische Darstellungen von Experimenten, bei denen das Niveau des Zoom-Modus (d. h. die Anzahl von Durchläufen, bei denen Ionen den Analysator nach oben und unten driften) variiert werden. Es ist ersichtlich, dass 3 Durchläufe optimal sind, um bei diesem Analysatordesign eine hohe Auflösung und minimalen Signalverlust zu erzielen. Weitere MR-ToF-Analysatordesigns verhalten sich jedoch wahrscheinlich unterschiedlich, zum Beispiel wurde eine Auflösung von 500 K zuvor bei Analysatoren beobachtet, die periodische Linsen inkorporieren (z. B. wie in UK-Patent Nr. 2,403,063 beschrieben).
Aus dem Vorstehenden ist es ersichtlich, dass die Ausführungsformen ein Verfahren bereitstellen, in dem ein Zoom-Modus verwendet wird, um Detektion einer TMT-Reporterregion (oder komplementärer Ionenregion) zu verstärken. Dies kann entweder als sein eigener Scan mit einem optimierten Isolationsfenster, einer optimierten Kollisionsenergie usw. erfolgen oder kann in einen breiteren Scan integriert werden, z. B. über gekerbtes Schalten der Deflektor 42b-Spannung.
Gemäß Ausführungsformen können TMT-Reporterionen über den Zoom-Modus unter Verwendung eines MR-ToF-Analysators identifiziert werden, der ansonsten nicht die Anforderung für > 50 K-Auflösung in dem gewünschten Dynamikbereich erfüllt. Die Reporterregion enthält oft Tausende von Ionen, wohingegen ein MR-ToF-Analysator in der Lage sein kann, ein 100 : 1-TMT-Dublett mit nur tausend Ionen insgesamt zu trennen. Dies führt zu einem eher begrenzten Dynamikbereich, über den der kleinere Peak zu beobachten ist. 10 und 11 zeigen die intrinsischen Vorteile des Verwendens des Zoom-Modus, um diesen Einschränkungen zu entkommen.
Wie vorstehend beschrieben, bedeutet das Integrieren des Zoom-Modus-TMT-Scans in den Standard-Hauptscan, dass kein Verlust an Repetitionsrate oder Empfindlichkeit erlitten wird. Dies ist jedoch optional, und es kann vorteilhaft sein, diese Scans getrennt vorzunehmen, da der ToF-Analysator bereits viel schneller als erforderlich ist. Experimentelle Zyklen mit relativ langem/langsamen Durchsatz können aufgrund der Notwendigkeit an qualitativ hochwertigen chromatographischen Trennung durchgeführt werden. Dies kann verbessert werden, indem Reporterionenscans mit getrenntem schmalen Isolationsfenster mit niedrigeren Interferenzen erzeugt werden. Empfindlichkeit wird dann ein bedeutenderes Thema, aber dies kann durch optimale Instrumenteinstellungen gerettet werden.
Der Zoom-Modus kann die Auflösung auch ausreichend steigern, damit 16- oder 18-plex-TMT-Verfahren komplementärer Ionen möglich werden. Diese Verfahren sind derzeit in keinem ToF-System möglich. Auflösungsverbesserungen sind auch wertvoll für niedriger gemultiplexte komplementäre Ionen, z. B. um chemisches Rauschen und co-isolierte Peptide herauszulösen, was größere Isolationsbreiten und sogar höhere Durchsätze erlaubt. Obwohl vorstehend verschiedene besondere Ausführungsformen beschrieben wurden, sind verschiedene alternative Ausführungsformen möglich.
Zum Beispiel können die hierin beschriebenen Verfahren an jedem Instrument ausgeführt werden, das einen ToF-Analysator enthält, der in der Lage ist, die Ionenflugbahnlänge zu ändern, z. B. durch Ändern der Anzahl an Reflexionen, die von Ionen durch den Analysator genommen werden. Dies könnte zum Beispiel von null (lineare ToF-) Reflexionen bis eine einzelne Reflexion betragen. Dies könnte auch eine Schaltung zwischen einer W-förmigen Ionenflugbahn niedriger Empfindlichkeit und einer V-förmigen Ionenflugbahn hoher Empfindlichkeit mit niedriger Auflösung beinhalten. Allgemein können alle Multireflexions- und Multidrehung-ToFs verwendet werden, um die hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen.
Unter Bezugnahme auf die in Bezug auf 9 beschriebenen Ausführungsformen kann anstelle der verschachtelten Sequenz von Reporterionenscans und Peptidfragmentionenscans, die in 9 gezeigt sind, eine Sequenz von TMT-Reporterionenscans vorgenommen werden, gefolgt von einer Sequenz von Peptidfragmentionenscans. Dies kann vorteilhaft sein, wenn eine relativ langsame Spannungsverschiebung vorliegt, die beim Schalten von dem regulären Modus in den Zoom-Modus vorgenommen werden muss. Zum Beispiel können stabilisierte Stromversorgungen viele Millisekunden brauchen, um sich anzupassen.
Es können effizientere Verfahren durchgeführt werden, bei denen ein markierter Analyt durch einen MS2-Scan identifiziert wird, und dann wird ein zweiter MS2-Scan vorgenommen, um die Markierungen zu quantifizieren.
Ein ähnliches Niveau an Interferenz könnte aus dem MS 1-Scan detektiert werden. Chemische Interferenz in den Reporterionen kommt aus der Fragmentierung co-isolierter markierter Peptide. Grundsätzlich sollte es möglich sein, diese Interferenz-Peptidpeaks in dem MS1-Scan innerhalb des gleichen Massenisolationsfensters wie das Zielpeptid zu sehen. Basierend auf dem MS1-Scan (oder Analyt-MS2-Scan, der normalerweise noch wesentliche Mengen an nicht fragmentierten Vorläuferionen zeigt), kann das Isolationsfenster dynamisch eingestellt werden, um die Übertragung auszugleichen und Interferenzen zu minimieren.
Der MS2-TMT-Scan (oder der kombinierte TMT/Vorläufer-Scan) kann durch einen MS3-Scan ersetzt werden, der weniger empfindlich, aber für eine Quantifizierung bei niedriger Interferenz besser ist. Ein solches Verfahren kann durch ein Instrument durchgeführt werden, das eine Vorrichtung zur weiteren Isolation und Fragmentierung, wie eine lineare Ionenfalle enthält, oder durch Leiten von Ionen zurück durch den Quadrupol 20. Auch hier gibt es einen Vorteil beim Verwenden des empfindlicheren Verfahrens zur Fragmentionendetektion und des saubereren Verfahrens zur verbesserten Reporterionenquantifizierung.
Das vorstehend beschriebene gekerbte Schaltverfahren kann in breiterem Umfang anwendbar sein, um Zielanalyten, die eine hohe Auflösung erfordern, in einem Bereich weiterer Anwendungen auszusuchen.
Zum Beispiel kann der gekerbte Schaltmodus dazu verwendet werden, um ein Ziel aus einem Hintergrund von Unbekannten auszusuchen. Dies kann für Protein-DIA/DDA nützlich sein, wobei ein Vorläufer in dem Zoom-Modus analysiert werden kann, um die Isotopenhülle optimal aufzulösen (was eine hohe Auflösung erfordert), während die Fragmentionen mit niedrigerem m/z (mit niedrigeren Auflösungsanforderungen) normal detektiert werden können. Auch DDA/DIA für Standardpeptid und/oder Ionen mit regulärem m/z können hiervon profitieren, da eine bessere Massengenauigkeit und Trennung unterschiedlicher Vorläufer in dem MS2-Spektrum erhalten wird. Gezielte Anwendungen wie SIM-Scannen können auch hiervon profitieren, wenn es gewünscht ist, dass das Zielion mit maximaler Leistung detektiert wird, aber Massen von beliebigen Fragmenten auch erwünscht sind.
Allgemein können diese Verfahren auf jede Anwendung angewendet werden, bei der ein oder mehrere Zielionen (bekannt oder durch einen vorherigen Scan bestimmt) einen hohen Auflösungs-/Dynamikbereich erfordern, gegenüber einem Hintergrund von unbekannten oder Ionen geringer Häufigkeit, für die gewünscht wird, nicht unter der m/z-Messunsicherheit oder den durch den Zoom-Modus induzierten Empfindlichkeitsverlust zu leiden.
Obwohl die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf verschiedene Ausführungsformen beschrieben wurde, versteht es sich, dass verschiedene Änderungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung, wie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt, abzuweichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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A. Verenchikov et al., Journal of Applied Solution Chemistry and Modelling, 2017, 6, 1-22 [0123]

Claims

Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytionen, wobei das Verfahren umfasst: Fragmentieren gekennzeichneter Analytionen, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren; Analysieren der Analytfragmentionen unter Verwendung eines Flugzeit-Massenanalysators, der in einem ersten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen; und Analysieren der Reporterionen oder der komplementären Ionen unter Verwendung des Flugzeit-Massenanalysators, der in einem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten Länge zu bewegen, wobei die zweite Länge größer als die erste Länge ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei: der Flugzeit-Massenanalysator einen oder mehrere Ionenreflektoren umfasst; in dem ersten Betriebsmodus Ionen veranlasst werden, n Reflexion(en) in dem einen oder den mehreren Ionenreflektoren vorzunehmen, wobei n eine ganze Zahl > 0 ist; und in dem zweiten Betriebsmodus Ionen veranlasst werden, m Reflexion(en) in dem einen oder den mehreren Ionenreflektoren vorzunehmen, wobei m eine ganze Zahl > n ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Flugzeit-Massenanalysator ein Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator ist, umfassend: zwei Ionenspiegel, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberstehen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist; einen Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und einen Detektor zum Erfassen von Ionen, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, wobei sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; wobei das Analysieren von Analytfragmentionen unter Verwendung des Analysators, der in dem ersten Betriebsmodus betrieben wird, umfasst: Injizieren von Analytfragmentionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y zu dem ersten Ende der Ionenspiegel zurückdriften; und dann Veranlassen, dass sich die Ionen zur Detektion zu dem Detektor bewegen.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Analysieren von Reporterionen oder komplementären Ionen unter Verwendung des Analysators, der in dem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, umfasst: (i) Injizieren von Reporterionen oder komplementärem Ion aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y in Richtung des ersten Endes der Ionenspiegel zurückdriften; (ii) Umkehren die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel derart, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) sie entlang der Driftrichtung Y in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel driften, (b) die Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel umkehren und (c) entlang der Driftrichtung Y in Richtung des ersten Endes der Ionenspiegel zurückdriften; (iii) optional Wiederholen von Schritt (ii) ein oder mehrere Male; und dann (iv) Veranlassen der Ionen, sich für zur Detektion zu dem Detektor zu bewegen.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei: der Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Analysator ferner einen Deflektor oder eine Linse umfasst, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und Analysieren von Reporterionen oder komplementären Ionen unter Verwendung des Analysators, der in dem zweiten Betriebsmodus betrieben wird, umfasst: (i) Injizieren von Reporterionen oder komplementären Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer (ii) Zickzack-Ionenbahn mit mehrfachen Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X folgen, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Ionen derart umzukehren, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (iv) Schritt (ii) optional ein oder mehrere Male wiederholt wird; und dann (v) Veranlassen, dass sich die Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Schritt des Analysierens der Analytfragmentionen das Analysieren eines oder mehrerer erster Ionenpakete umfasst, und der Schritt des Analysierens der Reporterionen oder der komplementären Ionen das Analysieren eines oder mehrerer zweiter, unterschiedlicher Ionenpakete umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, ferner umfassend das Generieren und/oder Verarbeiten und/oder Analysieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung eines ersten Satzes von einem oder mehreren Instrumentparametern und Generieren und/oder Verarbeiten und/oder Analysieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung eines zweiten, unterschiedlichen Satzes von einem oder mehreren Instrumentparametern.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, ferner umfassend das Generieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung einer ersten Massenfilter-Übertragungsfensterbreite und Generieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung einer zweiten, unterschiedlichen Massenfilter-Übertragungsfensterbreite.
Verfahren nach Anspruch 6, 7 oder 8, ferner umfassend das Generieren jedes ersten Ionenpakets unter Verwendung einer ersten Kollisionsenergie und das Generieren jedes zweiten Ionenpakets unter Verwendung einer zweiten, unterschiedlichen Kollisionsenergie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die Schritte des Analysierens der Analytfragmentionen und des Analysierens der Reporterionen oder der komplementären Ionen das Analysieren eines oder mehrerer einzelner Ionenpakete umfassen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Analysator umfasst: Ionenbahn, umfassend ein zyklisches Segment; Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn; mindestens einen Ionenreflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn; und Detektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn; wobei das Verfahren umfasst: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen aus dem Ioneninjektor, in die Ionenbahn derart, dass die Analytfragmentionen und die Reporterionen oder die komplementären Ionen sich entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen; (ii) Veranlassen, dass sich die Analytfragmentionen zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor bewegen; (iii) Verwenden des Ionenreflektors, um die Reporterionen oder die komplementären Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann (iv) Veranlassen der Reporterionen oder der komplementären Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wenn abhängig von Anspruch 5, weiter umfassend: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (ii) Veranlassen, dass sich die Analytfragmentionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen; (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der Reporterionen oder der komplementären Ionen derart umzukehren, dass die Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann (v) Veranlassen der Reporterionen oder der komplementären Ionen, sich zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor zu bewegen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren umfasst: Analysieren gekennzeichneter Analytionen in einem MS 1-Betriebsmodus, um MS1-Daten zu produzieren, und Identifizieren eines oder mehrerer Vorläufer von Interesse in den MS1-Daten; wobei der Schritt des Fragmentierens gekennzeichneter Analytionen das sequenzielle Auswählen und Fragmentieren jedes identifizierten Vorläufers von Interesse umfasst.
Verfahren zum Analysieren gekennzeichneter Analytmoleküle, wobei das Verfahren das Ionisieren gekennzeichneter Analytmoleküle, um gekennzeichnete Analytionen zu produzieren, und Analysieren der gekennzeichneten Analytionen unter Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend das Verwenden von Masse-zuLadung-Verhältnis(m/z)- und/oder Intensitätsinformationen aus der Analyse der Analytfragmentionen, um die Analytmoleküle zu identifizieren, und Verwenden von Masse-zu-Ladung-Verhältnis(m/z)- und/oder Intensitätsinformationen aus der Analyse der Reporterionen oder der komplementären Ionen, um die Analytmoleküle zu quantifizieren.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gekennzeichneten Analytionen Ionen von Peptiden sind, die mit isobarischen Markierungen gekennzeichnet sind.
Verfahren zum Betreiben eines Flugzeit(ToF)-Massenanalysators, der Folgendes umfasst: Ionenbahn, umfassend ein zyklisches Segment; Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn; mindestens einen Ionenreflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn; und Detektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen, aus dem Ioneninjektor in die Ionenbahn, derart, dass sich die ersten Ionen und die zweiten Ionen entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen; (ii) Veranlassen der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen; (iii) Verwenden des Ionenreflektors, um die zweiten Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann (iv) Veranlassen der zweiten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Flugzeit(ToF)-Massenanalysator ein Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator ist, der Folgendes umfasst: zwei Ionenspiegel, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberstehen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist; wobei der Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln dafür konfiguriert ist und sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; wobei der Detektor zum Detektieren von Ionen dafür konfiguriert ist, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, und sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und wobei der Ionenreflektor einen Deflektor oder eine Linse umfasst, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; wobei das Verfahren umfasst: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (ii) Veranlassen, dass sich die ersten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen; (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der zweiten Ionen derart umzukehren, dass die zweiten Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die zweiten Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann (v) Veranlassen, dass sich die zweiten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen.
Nichtflüchtiges computerlesbares Speichermedium, das Computerprogrammcode speichert, der, wenn auf einem Prozessor ausgeführt, ein analytisches Instrument veranlasst, das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche durchzuführen.
Steuerungssystem für ein analytisches Instrument, wobei das Steuerungssystem dafür konfiguriert ist, um das analytische Instrument zu veranlassen, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18 durchzuführen.
Analytisches Instrument, wie ein Massenspektrometer, umfassend das Steuerungssystem nach Anspruch 20.
Analytisches Instrument, wie ein Massenspektrometer, umfassend: eine Fragmentierungsvorrichtung; und/oder einen Flugzeit(ToF)-Massenanalysator, der in einem ersten Betriebsmodus, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer ersten Länge zu bewegen, und einem zweiten Betriebsmodus betreibbar ist, in dem Ionen veranlasst werden, sich entlang einer Flugbahn mit einer zweiten Länge zu bewegen, wobei die zweite Länge größer als die erste Länge ist; und ein Steuerungssystem, das, wenn das Instrument verwendet wird, um gekennzeichnete Analytionen zu analysieren, konfiguriert ist zum: Veranlassen der Fragmentierungsvorrichtung, die gekennzeichneten Analytionen zu fragmentieren, um Analytfragmentionen und Reporterionen oder komplementäre Ionen zu produzieren; Veranlassen des Flugzeit-Massenanalysators, die Analytfragmentionen unter Verwendung des ersten Betriebsmodus zu analysieren; und Veranlassen des Flugzeit-Massenanalysator, die Reporterionen oder die komplementären Ionen unter Verwendung des zweiten Betriebsmodus zu analysieren.
Flugzeit(ToF)-Massenanalysator, umfassend: Ionenbahn, umfassend ein zyklisches Segment; Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in die Ionenbahn; mindestens einen Ionenreflektor, angeordnet entlang der Ionenbahn; und Detektor, angeordnet an dem Ende der Ionenbahn; wobei der Analysator dafür konfiguriert ist, um Ionen zu analysieren durch: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen, aus dem Ioneninjektor in die Ionenbahn, derart, dass sich die ersten Ionen und die zweiten Ionen entlang der Ionenbahn zu dem Ionenreflektor bewegen; (ii) Veranlassen der ersten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen; (iii) Verwenden des Ionenreflektors, um die zweiten Ionen zu veranlassen, einen oder mehrere Zyklen entlang des zyklischen Segments der Ionenbahn abzuschließen; und dann (iv) Veranlassen der zweiten Ionen, sich zur Detektion von dem Ionenreflektor zu dem Detektor zu bewegen.
Analysator nach Anspruch 23, wobei: der Flugzeit(ToF)-Massenanalysator ein Multireflexions-Flugzeit(MR-ToF)-Massenanalysator ist, der zwei Ionenspiegel umfasst, die voneinander beabstandet sind und sich in einer ersten Richtung X gegenüberliegen, wobei jeder Spiegel im Allgemeinen entlang einer Driftrichtung Y zwischen einem ersten Ende und einem zweiten Ende verlängert ist, wobei die Driftrichtung Y orthogonal zu der ersten Richtung X ist; der Ioneninjektor zum Injizieren von Ionen in einen Raum zwischen den Ionenspiegeln dafür konfiguriert ist, und sich der Ioneninjektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; wobei der Detektor zum Detektieren von Ionen dafür konfiguriert ist, nachdem sie eine Vielzahl von Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln abgeschlossen haben, und sich der Detektor in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; und der Ionenreflektor ein Deflektor oder eine Linse ist, der/die sich in der Nähe des ersten Endes der Ionenspiegel befindet; wobei der Analysator dafür konfiguriert ist, um Ionen zu analysieren durch: (i) Injizieren eines Ionenpakets, umfassend erste Ionen und zweite Ionen aus dem Ioneninjektor in den Raum zwischen den Ionenspiegeln, wobei die Ionen einen ersten Zyklus abschließen, in dem die Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (ii) Veranlassen, dass sich die ersten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen; (iii) Verwenden des Deflektors oder der Linse, um die Driftrichtungsgeschwindigkeit der zweiten Ionen derart umzukehren, dass die zweiten Ionen veranlasst werden, einen weiteren Zyklus abzuschließen, bei dem die zweiten Ionen einer Zickzack-Ionenbahn folgen, die mehrfache Reflexionen zwischen den Ionenspiegeln in der Richtung X aufweist, während: (a) Driften entlang der Driftrichtung Y von dem Deflektor oder der Linse in Richtung des zweiten Endes der Ionenspiegel, (b) Umkehren der Driftrichtungsgeschwindigkeit in der Nähe des zweiten Endes der Ionenspiegel und (c) Zurückdriften entlang der Driftrichtung Y zum Deflektor oder zur Linse; (iv) optional Wiederholen von Schritt (iii) ein oder mehrere Male; und dann (v) Veranlassen, dass sich die zweiten Ionen zur Detektion von dem Deflektor oder der Linse zu dem Detektor bewegen.